Модифицированная мышиная модель повторяющейся легкой черепно-мозговой травмы, включающей истонченное окно черепа и жидкостную перкуссию

Краткое содержание

В этом протоколе представлена модифицированная мышиная модель повторяющейся легкой черепно-мозговой травмы (ЧМТ), индуцированной методом закрытой черепно-мозговой травмы (ЧС). Этот подход включает в себя утонченное окно черепа и перкуссию жидкости для уменьшения воспаления, обычно вызванного воздействием мозговых оболочек, а также улучшенную воспроизводимость и точность в моделировании rmTBI у грызунов.

Аннотация

Легкая черепно-мозговая травма является клинически высокогетерогенным неврологическим расстройством. Для изучения механизмов невропатологии после легкой ЧМТ и тестирования методов лечения крайне необходимы высоковоспроизводимые животные модели черепно-мозговой травмы (ЧМТ) с четко определенными патологиями. Воспроизведение всех последствий ЧМТ на животных моделях оказалось сложной задачей. Таким образом, наличие нескольких животных моделей ЧМТ необходимо для учета различных аспектов и тяжестей, наблюдаемых у пациентов с ЧМТ. CHI является одним из наиболее распространенных методов изготовления моделей rmTBI у грызунов. Тем не менее, этот метод подвержен влиянию многих факторов, включая используемый метод воздействия, толщину и форму кости черепа, апноэ у животных, а также тип используемой поддержки головы и иммобилизации. Целью данного протокола является демонстрация комбинации методов «окна истонченного черепа» и жидкостной перкуссионной травмы (FPI) для создания точной мышиной модели RMTBI, связанной с CHI. Основная цель этого протокола — свести к минимуму факторы, которые могут повлиять на точность и согласованность моделирования CHI и FPI, включая толщину костей черепа, форму и поддержку головы. Использование метода «окна истонченного черепа» сводит к минимуму потенциальное воспаление из-за трепанации черепа и FPI, что приводит к улучшению мышиной модели, которая воспроизводит клинические особенности, наблюдаемые у пациентов с легкой ЧМТ. Результаты поведенческого и гистологического анализа с использованием окрашивания гематоксилином и эозином (ПЭ) позволяют предположить, что ЧМТ может привести к кумулятивному повреждению, которое приводит к изменениям как в поведении, так и в общей морфологии мозга. В целом, модифицированный ЦИ, ассоциированный с ЧМЧ, представляет собой полезный инструмент для исследователей для изучения основных механизмов, которые способствуют фокальным и диффузным патофизиологическим изменениям при ЧМТ.

Введение

Легкая ЧМТ, включая сотрясение мозга и подсотрясение мозга, составляет большинство всех случаев ЧМТ (>80% всех ЧМТ)¹. Легкая ЧМТ обычно возникает в результате падений, дорожно-транспортных происшествий, актов насилия, контактных видов спорта (например, футбола, бокса, хоккея) и военных боев ^2,3. Легкая ЧМТ может привести к нейробиологическим событиям, которые влияют на нейроповеденческие функции на протяжении всей жизни пациента и увеличивают риск нейродегенеративных заболеваний ^4,5,6. Животные модели обеспечивают эффективные и контролируемые средства для изучения легкой ЧМТ с надеждой на дальнейшее улучшение диагностики и лечения легкой ЧМТ. Были разработаны различные модели для легкой ЧМТ, такие как модели контролируемого кортикального воздействия (CCI), падения веса (WD), жидкостной перкуссионной травмы (FPI) и модели^{blast-TBI 7,8}. Ни одна экспериментальная модель не может имитировать всю сложность патологии, вызванной ЧМТ ^9,10. Гетерогенность этих моделей является преимуществом для рассмотрения различных особенностей, связанных с пациентами с легкой ЧМТ, и исследования соответствующих клеточных и молекулярных механизмов. Тем не менее, каждая животная модель ЧМТ имеет^{свои ограничения3}, ограничивающие наши текущие знания о легкой ЧМТ у животных и их клинической значимости.

Модели WD и CCI используются для воспроизведения клинических состояний, таких как потеря мозговой ткани, острая субдуральная гематома, аксональная травма, сотрясение мозга, дисфункция гематоэнцефалического барьера и даже кома после ЧМТ ^3,11,12. Модель WD включает в себя индуцирование повреждения мозга путем удара по твердой мозговой оболочке или черепу свободно падающими грузами. Воздействие утяжеленного объекта на неповрежденный череп может воспроизводить смешанные очаговые/диффузные травмы; Тем не менее, этот метод связан с низкой точностью и повторяемостью места травмы, рикошетной травмой и более высокой смертностью из-за переломов черепа ^3,11,12. Модель CCI включает в себя применение металла с пневматическим приводом для прямого воздействия на открытую твердую мозговую оболочку. По сравнению с моделью WD, модель CCI является более точной и воспроизводимой, но она не приводит к диффузным травмам из-за малого диаметра ударного наконечника¹¹. Во время моделирования FPI ткань мозга кратковременно смещается и деформируется под действием перкуссии. FPI может вызывать смешанное очаговое/диффузное повреждение и воспроизводить внутричерепное кровоизлияние, отек мозга и прогрессирующее повреждение серого вещества после ЧМТ. Тем не менее, FPI имеет высокий уровень смертности из-за повреждения ствола мозга и длительного апноэ ^3,12. Трепанация черепа, используемая в обычных моделях WD, CCI и FPI, может привести к кортикальной контузии, геморрагическим поражениям, повреждению гематоэнцефалического барьера, инфильтрации иммунных клеток, активации глиальных клеток, увеличению времени моделирования и возможным летальным исходам ^3,12.

Легкая ЧМТ характеризуется оценкой по шкале GCS (шкала комы Глазго, GCS) в диапазоне от 13 до 15². Легкая ЧМТ может быть как очаговой, так и диффузной и связана как с острыми травмами, такими как нарушение клеточного гомеостаза, эксайтотоксичность, истощение глюкозы, митохондриальная дисфункция, нарушение кровотока и повреждение аксонов, так и с подострыми травмами, включая повреждение аксонов, нейровоспаление и глиоз ^2,3. Несмотря на значительный прогресс в описании сложной патофизиологии ЧМТ, основные механизмы легкой ЧМТ/ЧМТ остаются неясными и требуют^{дальнейшего изучения}. Учитывая, что ЧН является наиболее распространенным типом ЧМТ¹², этот протокол представляет собой новый подход к созданию более точно контролируемой мышиной модели ЧМТ с использованием модифицированного устройства FPI для выполнения удара в окне¹³ с истонченным черепом. Избегая травм, вызванных трепанацией черепа, переменной толщины черепа и неточностей, вызванных формой, а также рикошетной травмы, этот подход направлен на преодоление основных недостатков, связанных с моделями WD, CCI и FPI. Применение воздействия FPI на окно истонченного черепа удобно для оценки повреждения сосудов головного мозга после ЧМТ и помогает свести к минимуму высокие показатели смертности в некоторых моделях, что приводит к более близкому сходству с клиническими особенностями пациентов с ЧМТ.

Протокол

Все процедуры, включенные в этот протокол, были выполнены с одобрения Комитета по уходу за животными и их использованию (Чжэцзянский педагогический университет, номер разрешения, dw2019005) и в соответствии с ARRIVAL и Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных. С техническими характеристиками можно ознакомиться в Таблице материалов.

1. Порядок обращения с животными

1. Домашние мыши в контролируемой среде с температурой 22-24 °C, влажностью в пределах 40%-60%, 12-часовым циклом свет/темнота, а также обеспечивают свободный доступ к воде и стандартному мышиному чау. Для проведения эксперимента было использовано 25 самцов мышей ICR (25-30 г, возраст 8 недель).
2. Случайным образом распределите мышей либо в контрольную группу (n=12), либо в группу rmTBI (n=13). Чтобы предотвратить потенциальную агрессию со стороны фиктивных мышей по отношению к мышам, перенесшим ЧМТ, разделите их по отдельным клеткам.
3. Дайте мышам не менее 1 недели на акклиматизацию к условиям клетки перед началом эксперимента. Этот период акклиматизации гарантирует, что мыши привыкнут к окружающей среде и сводит к минимуму потенциальное воздействие стресса или тревоги на физиологические или поведенческие реакции во время исследования.

2. Подготовка аппарата ЧМТ

1. Изготовьте модель rmTBI на мышах с использованием модифицированного устройства FPI (см. Таблицу материалов; Рисунок 1А) ¹³. Перед использованием устройства FPI внимательно осмотрите все соединения на наличие признаков утечки или растрескивания, уделяя особое внимание местам соединения между цилиндром и трубкой, а также между трехконтактным соединителем и трубкой. Для точного определения давлений удара был установлен преобразователь давления в точке удара на устройстве 13 ударной травмы^{жидкостью}.
2. Проведите тщательный осмотр устройства FPI, чтобы убедиться, что поршень плавно движется внутри цилиндра и что удары могут быть эффективными (Рисунок 1B). Убедитесь, что в системе нет пузырьков воздуха. При обнаружении пузырьков воздуха осторожно добавьте в систему дистиллированную воду с помощью шприца объемом 50 мл и удалите пузырьки воздуха, быстро протолкнув стержень цилиндра через ближайший 3-ходовой разъем и/или через шприц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Система FPI состоит из дистиллированной воды внутри цилиндра и подсоединенных трубок. Крайне важно откалибровать устройство перед началом работы, чтобы обеспечить точность и надежность результатов.

3. Подготовка истонченного черепа

ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургическое вмешательство на животных и подготовка истонченного черепа не должны проводиться в присутствии других мышей. Окно истонченного черепа полезно для оценки повреждения сосудов головного мозга после процедуры FPI.

1. Придерживайтесь требований центра для животных, проинструктировав оператора экспериментатора о необходимости носить стерильный халат и маску во время всех процедур обращения с животными.
2. Перед началом эксперимента продезинфицируйте столешницу лабораторного стола, устройство FPI, анестезиологическую трубку и прилегающее противостоечное пространство с помощью спрея с использованием 70% этанола.
3. Взвесьте мышей в обеих группах перед операцией и сравните их вес с весом, зарегистрированным за 1 неделю до эксперимента. Исключите из исследования мышей с плохим здоровьем, такими как грубая шубка, диарея, потеря веса или вялость. Кроме того, исключите мышей весом менее 20 г, чтобы обеспечить их способность переносить повторные удары. Эти меры имеют решающее значение для поддержания благополучия животных и обеспечения надежных результатов экспериментов.
4. Обезболивайте мышей 4%-5% изофлураном (в 100% кислороде со скоростью потока 1 л/мин) в течение 3-4 мин в индукционной камере. Введите офтальмологическую смазку (см. Таблицу материалов) в глаза животного для поддержания смазки на протяжении всей операции. Чтобы уменьшить боль, вводите бупренорфин подкожно (0,05 мг/кг) в середину между ушами за 20 минут до анестезии, а затем каждые 6 часов в течение 24 часов. Кроме того, в конце анестезии введите каждому животному однократную подкожную дозу 5 мг/кг карпрофена.
5. Дезинфицируйте голову после того, как мышь потеряла рефлексы выпрямления и отвода педалей. Подстригите шерсть на голове мыши с помощью хирургических ножниц и с помощью бритвы удалите остатки шерсти. Продезинфицируйте кожу головы тремя последовательными применениями 2% хлоргексидина, вперемешку с 75% этанолом.
6. Положите одноразовую стерильную хирургическую прокладку под животное и прилегающую территорию, чтобы обеспечить надлежащую гигиену. Сделайте разрез 1,5 см с помощью тонких маленьких хирургических ножниц вдоль средней линии кожи головы мыши, чтобы полностью обнажить место операции (рисунок 2A).
7. Закрепите мышь с помощью нетерминальных ушных накладок в обычной стереотаксической раме (см. Таблицу материалов). Отрегулируйте положение головки мыши в стереотаксической рамке на ровном уровне или под небольшим углом наклона в зависимости от конкретной целевой области, которая будет исследоваться. Очистите область операции от шерсти, чтобы избежать воспаления в дальнейшем.
8. Поддерживайте температуру тела мыши на уровне 37 °C с помощью обычной изотермической грелки (см. Таблицу материалов).
9. Во время установки хирургического и ударного концентратора (женского замка Luer Lock) поддерживайте мышиную анестезию (без реакции на защемление пальца ноги или хвоста) с помощью носового конуса, который обеспечивает непрерывную концентрацию изофлурана 2%, регулируемую откалиброванным испарителем.
10. Осторожно очистите операционную область вокруг истонченного окна с помощью стерильного ватного тампона, смоченного в физрастворе.
11. Создайте окно с утонченным черепом, примерно 2,5 мм в диаметре и 20 мкм в толщине, в правой лобной моторной коре с помощью микросверла с плоским наконечником (см. Таблицу материалов, рис. 2B) и микрохирургического лезвия. Расположите операционное поле на расстоянии 1,5 мм от брегмы и на 1,3-2,0 мм латеральнее от средней линии (рис. 2C).
    1. Чтобы предотвратить проникновение микросверла в череп во время создания окна истонченного черепа, периодически смачивайте череп физиологическим раствором во время шлифовки микродрели.
    2. Подтвердите толщину черепа, осторожно прощупав истонченный череп уплощенным кончиком тонкой иглы шприца и оценив его мягкость. Оцените чистоту обнаженных корковых микрососудов визуально, чтобы определить толщину черепа.
    3. Чтобы проверить толщину черепа, нанесите стерильный физиологический раствор на истонченный участок и визуально осмотрите с помощью обычного препарирующего микроскопа (см. Таблицу материалов). Этот метод может помочь убедиться, что череп был адекватно истончен.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Смазывайте мышиный глаз на протяжении всей процедуры подготовки истонченного черепа и моделирования rmTBI, чтобы предотвратить высыхание. Истончение черепа до менее чем 15 мкм сопряжено с риском легкой корковой травмы, которая может привести к легкому воспалению коры головного мозга¹⁴.
12. Прикрепите отрегулированный внутренний замок Luer Lock (внутренний диаметр 2,2 мм, созданный из ступицы иглы 19G, как показано на рисунке 2D) к участку истонченного черепа. Закрепите замок Люэра с помощью клея и стоматологического цемента (Рисунок 2E).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании клея для крепления женского замка Люэра к области вокруг истонченного окна с черепом, крайне важно тщательно высушить область черепа и предотвратить попадание клея внутрь самого окна. Клей внутри окна может значительно снизить силу удара FPI.

4. Процедура моделирования rmTBI, ассоциированной с CHI

1. Введение rmTBI с использованием метода латеральной перкуссии жидкости с модифицированным устройством FPI, как описано ранее^13,15.
2. После завершения процедур с утонченным окном черепа и ударным концентратором перенесите мышь из стереотаксического аппарата на платформу ударного устройства.
3. Учитывая потенциальное влияние анестезии на время рефлекса выпрямления животных и тяжесть травмы после перкуссии ^9,16, контролируйте глубину анестезии, оценивая глазные рефлексы и рефлексы отведения лапы (рис. 2F).
4. Подсоедините замок Люэра с внутренней резьбой, который был наклеен на окно с утонченным черепом, к замку Люэра с внутренней резьбой на конце трубки устройства FPI (рис. 2G).
   Примечание: При моделировании rmTBI индуцированная изофлураном анестезия у мышей была продлена из-за индукции апноэ и потери сознания при перкуссии.
5. Введите две легкие ЧМТ (интервал 48 часов) с помощью модифицированного устройства. Нанесите первый удар FPI сразу после завершения операции по установке окна с истонченным черепом и установки замка Люэра. Применяйте воздействие FPI только после того, как мышь каждый раз демонстрирует возврат рефлекса отвода при щиплении лапы (рисунок 2H). Применение воздействия FPI на мышей с глубоким наркозом может вызвать длительное апноэ и смерть.
   1. Для приложения удара FPI необходимо поднять маятник на заданный градус вдоль транспортира на устройстве и отпустить маятник с помощью программного управления^13,15. Удар должен достигать интенсивности удара 2,0 ± 0,1 атм, в соответствии с установленными протоколами, используемыми в исследованиях на грызунах 10,17,18. Исключить животных из дальнейших испытаний, если удар не был зарегистрирован в диапазоне от 1,9 до 2,1 атм или если во время FPI произошло перелом черепа.
   2. Для бутафорских мышей закрепите их на аппарате, но не наносите удар.
6. После удара немедленно отсоедините соединение замка Люэра и переложите мышей на изотермическую грелку для восстановления. После того как мышь восстановит бдительность и сознание, верните ее в домашнюю клетку, не снимая замок Луэра самки. Выполните второе воздействие FPI таким же образом, через 48 часов.
7. После ЧМТ осторожно удалите женский замок Люэра и стоматологический цемент. Наложите швы на кожу головы с помощью тканевого клея и используйте плоские щипцы для ущипывания кожи головы, чтобы облегчить процесс склеивания (см. Таблицу материалов; Рисунок 2I).
8. Чтобы предотвратить воспаление, инфекцию и облегчить послеоперационную боль и дискомфорт, нанесите на рану смесь мази эритромицина и диклофенака натрия в соотношении 1:1 (см. Таблицу материалов). Перенесите мышей на изотермическую грелку для восстановления.
9. Запишите продолжительность рефлекса выпрямления, который начинается, когда мышь извлекается из стереотаксического аппарата и помещается латерально на ударную платформу для FPI, и продолжается до тех пор, пока мышь не сможет самостоятельно стоять в вертикальном положении.
10. После того как мышь восстановит бдительность и сознание, верните ее в домашнюю клетку. Мыши, как правило, находятся в полном сознании и могут ходить в течение 1,5 ч после травмы.
11. В течение нескольких дней после моделирования ЧМТ наблюдайте за мышами на предмет различных признаков, включая характер дыхания, наличие слизи вокруг носа и рта, а также покраснение, отек, экссудат или повторное открытие области раны. Исключите из исследования животных с одним или несколькими из вышеперечисленных аномальных симптомов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительная микроинъекция AAV-GCaMP6s позволяет наблюдать за основным нейронным гомеостазом Ca2+ и возбудимостью в поврежденной коре через окно истонченного черепа с помощью двухфотонной лазерной сканирующей микроскопии¹⁵.

5. Испытание водного лабиринта Морриса (MWM)

ПРИМЕЧАНИЕ: MWM (см. Таблицу материалов) является широко признанным методом оценки пространственного обучения и дефицита памяти у мышей после ЧМТ.

1. Проводите тест MWM, начиная с 7 дня после травмы (DPI). Круглый бассейн MWM имел диаметр 120 см и высоту 50 см, температура воды поддерживалась на уровне 25 °C. Разделите круглый бассейн на четыре квадранта, с аварийной платформой, круглой платформой диаметром 6 см и высотой 30 см, погруженной на глубину 1 см под поверхность воды в северо-восточном квадранте.
2. Расположите камеру прямо над круглым бассейном, чтобы зафиксировать траекторию движения мышей. Пометьте мышей черной лентой на спине, чтобы облегчить распознавание с помощью программного обеспечения для получения изображений и для записи данных, включая задержку, расстояние плавания и траекторию движения.
3. Поместите мышей в воду лицом к внутренней стенке каждого из четырех квадрантов, по одному разу для каждого квадранта. Как только мыши найдут платформу, дайте им отдохнуть там в течение 10 секунд. Если мышь не может найти платформу в течение 60 секунд, попросите оператора направить мышь к платформе, дайте ей отдохнуть на платформе в течение 10 секунд, а затем верните мышь в исходную клетку для отдыха.
4. Повторяйте для каждой мыши пробную попытку получения 4 раза в день. После испытаний на 12 DPI проведите эксперимент с пространственным зондом с длительностью 60 с и запишите количество раз, когда мыши пересекали исходную область платформы, и продолжительность пребывания мыши в квадранте, где была расположена платформа.
5. После каждого испытания быстро вытирайте мышей полотенцем или подкладывайте под нагревательную лампу, чтобы поддерживать температуру их тела и предотвратить переохлаждение во время 60-секундного исследования с DPI 7 до DPI 11.
6. После завершения описанных выше экспериментальных процедур обезболить мышей пентобарбиталом (45 мг/кг, в/в) в дозе 13 DPI. Перфузируйте изотонический физиологический раствор транскардиально с последующей перфузией 4% параформальдегидом в фосфатно-солевом буфере (pH 7,2). Извлеките мозг для традиционного окрашивания HE, чтобы оценить грубые изменения морфологии коры головного мозга и гиппокампа. Подробное описание протокола окрашивания ПЭ можно найти в предыдущих публикациях^13,15.
7. После завершения всех экспериментов усыпить мышей путем введения передозировки пентобарбитала (≥100 мг/кг, внутримышечно), если нет необходимых образцов мыши. Прежде чем собирать ткани или утилизировать тушку, следите за мышью до тех пор, пока сердцебиение не исчезнет в течение как минимум 60 секунд.

Результаты

Протокол, описанный в этом исследовании, описывает метод индуцирования rmTBI через окно с истонченным черепом, который предлагает решение для травмы головного мозга, вызванной подготовкой к трепанации черепа во время традиционного моделирования перкуссии ЧМТ. Использование этой модифицированной процедуры перкуссии жидкости с модифицированным устройством позволило добиться повышенной точности и воспроизводимости воздействия FPI¹³. Модифицированный импактор обладает универсальностью для использования как для моделирования CHI, так и для FPI, с трепанацией черепа или без нее. Кроме того, тяжесть травмы модулируется путем регулировки параметров травмы, таких как угол падения ударного маятника, или путем добавления дополнительных пенопластовых прокладок из этиленвинилацетата с закрытыми порами различной твердости к торцевой пластине поршневого полюса.

Модифицированная модель rmTBI обеспечивает значительные преимущества, такие как продукция фокальной и диффузной патологии без обнажения кортикального пояса, что сводит к минимуму воспаление от менингеального воздействия и/или прямого FPI на паренхиму. Кроме того, эта модель уменьшает различия в толщине и форме костей черепа, чтобы обеспечить надежные результаты травм. Таким образом, модифицированная модель rmTBI эффективна и надежна для моделирования клинически значимых нейропатологических и поведенческих дефицитов, связанных с постконтузионными симптомами (ЧЛС), при различных степенях травмы. В частности, эта модель полезна для исследования патологических механизмов ЧМТ, которые полагаются на точность и воспроизводимость моделей ЧМТ на животных, особенно для исследования легких механизмов, связанных с ЧМТ.

Лобная боковая ветвь средней мозговой артерии мыши и каудальная ринальная вена¹⁹, расположенные под истонченным черепом, обеспечивали четкую визуализацию под камерой. После двух перкуссий rmTBI, каждая при давлении около 2,0 атм, у всех мышей наблюдались субдуральные гематомы при 0 DPI. Хотя целостность истонченного черепа, по-видимому, не была нарушена; тем не менее, наряду с изменениями морфологии микроциркуляторного русла наблюдалось уменьшение числа микрососудов (рисунок 2H), о чем сообщалось ранее¹⁵. К 2 DPI гематомы в значительной степени рассосались. Смертность в первую очередь наступает в результате удара, когда мышь находится под глубокой анестезией, что может значительно продлить апноэ. Регулярная оценка глубины анестезии перед воздействием с помощью глазного рефлекса и рефлекса отведения лапы может существенно снизить смертность. Дополнительные факторы, которые могут повлиять на уровень смертности после жидкостной перкуссии, включают напряжение мыши, твердость черепа, пол и возраст. В предыдущем исследовании с использованием того же протокола rmTBI одна мышь C57BL/6J умерла¹⁵ лет. В этом протоколе только самцы мышей ICR использовались для введения всех процедур.

Исследования на людях и животных показали, что даже повторяющиеся субконтузионные удары головой могут вызвать обширные микроструктурные травмы белого вещества 20,21,22, которые связаны с ухудшением когнитивных способностей ^21,22. При 7-12 DPI rmTBI может приводить к нарушениям пространственного обучения и памяти, которые были изучены с использованием парадигмы MWM. На рисунке 4 показаны результаты, полученные в результате этой оценки.

Анализ последнего исследования в MWM показал значительное увеличение (p< 0,05) задержки мышей rmTBI для достижения погруженной платформы по сравнению с контрольной группой. В исследовании исследования анализ процента времени, проведенного в исходном квадранте платформы, продемонстрировал значительное снижение (p<0,01) в группе rmTBI по сравнению с контрольной группой, что указывает на снижение возможностей обучения и памяти в пространственной привязке у мышей с rmTBI.

Описанный здесь метод был использован в более ранней публикации¹⁵ с использованием мышей C57BL/6J. Помимо MWM, были проведены три дополнительных анализа, как описано ниже.

OFT использовался для оценки возможностей передвижения и исследования путем измерения средней скорости передвижения, общего пройденного расстояния и процента пройденного расстояния в центральных зонах. Проведите тест в открытом поле (OFT) с разрешением 6 DPI для оценки локомоции, исследования и тревожности у мышей. Тестовое устройство размером 40 х 40 х 40 см, которое было разделено на 16 зон (каждая размером 18 х 18 см). Мышь была помещена в центр устройства и позволяла свободно исследовать его в течение 5 минут. Был проведен учет пройденного расстояния в центральных 4 зонах, общего пройденного расстояния, средней скорости передвижения и времени пребывания в приграничных зонах. Уровень тревожности оценивался на основе процента пройденного расстояния в центральных зонах и времени, проведенного грызунами в пограничных зонах в течение 5-минутного периода наблюдения. При 6 DPI rmTBI может не оказывать существенного влияния на общие двигательные способности мышей, он может вызывать значительную тревогу и изменять исследовательское поведение, как показано на рисунке 4¹⁵. Кроме того, модифицированная модель rmTBI вызывает диффузные аксональные повреждения, которые могут быть оценены с помощью дополнительных поведенческих тестов, таких как тест на когнитивные способности, описанный в этом протоколе.

Было показано, что RmTBI ухудшает пространственную рабочую и референсную память у мышей, как показано на рисунке 5¹⁵. Эти когнитивные функции оценивались с помощью теста Y-образного лабиринта. Тест проводился при 8 DPI для измерения дефицита кратковременной рабочей памяти у мышей. Для спонтанного чередования поведения: использовалось акриловое устройство Y-образного лабиринта (высотой 20 см, длиной 50 см и шириной внизу 10 см). После того, как мышь была помещена в центр устройства и она могла исследовать в течение 8 минут, были записаны записи рук. Поведение спонтанного чередования определяется как последовательное вхождение мыши в три руки в триплетных наборах. Рассчитайте частоту спонтанного чередования (%) как (последовательные тройные сеты / общее количество входов в руки минус 2) x 100. Для пространственной опорной памяти во время 8-минутной тренировки случайным образом закройте одну руку устройства Y-лабиринта. Через 1 час после первоначального воздействия мышь снова вводится в лабиринт с открытыми всеми тремя руками и позволяет ей свободно исследовать его в течение 3 минут. Записывается время, затраченное на изучение новой руки по сравнению с двумя другими. Рассчитайте индекс предпочтений как время, проведенное в новой группе, по сравнению со временем, проведенным во всех трех группах.

Кроме того, мы предлагаем оценить грубые структурные поражения головного мозга с помощью простого окрашивания HE (Рисунок 6)¹⁵ после завершения всех поведенческих тестов. Используйте корональную область коры головного мозга, разрезанную от 1 мм до места поражения до заднего края поражения, и корональную область гиппокампа, разрезанную в типичной серповидной зоне (Bregma: от -1,7 до -2,2 мм). Подсчет нейронов на каждом слайде из шести рандомизированных полей с использованием глазной сетки (увеличение 400x) и усреднение числа нейронов обеспечили плотность чисел на поле зрения (плотность чисел). Было обнаружено, что области мозга, пораженные rmTBI, демонстрируют различную степень повреждения нейронов¹⁵. В частности, моторная кора головного мозга продемонстрировала более мощную и разнообразную степень таких повреждений, чем гиппокамп. Окрашивание HE показало значительный сдвиг в сторону пикнотической морфологии от нормальных нейронов (рис. 6A, B, E, F). Кроме того, наблюдалось ослабление внеклеточного матрикса в области поражения (рис. 6F). Помимо наблюдаемых областей с ослаблением матрицы, мыши rmTBI также показали значительное увеличение гиперхромного окрашивания, видимого как более темный красный цвет, в значительном числе субгранулярных нейронов в зубчатой извилине и некоторых корковых нейронах и нейронах CA1. Интересно, что эти узоры окрашивания не имели каких-либо сопутствующих признаков цитоплазматического сжатия или пикнотического ядра (рис. 6C, D, G, H, K)¹⁵. Упомянутые выше поведенческие (за исключением теста WMM) и HE методы окрашивания были подробно описаны в недавней публикации, в которой была представлена модифицированная модель rmTBI¹⁵.

Рисунок 1: Модифицированное устройство FPI и скриншот программного обеспечения. (A) Модифицированное устройство FPI. (B) На снимке экрана отображается форма волны давления FPI, а также автоматическое измерение и экспорт параметров ударного давления в режиме реального времени, таких как время нарастания, время падения и продолжительность половинной ширины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Модифицированная мышиная модель rmTBI у мышей ICR. (A) Делается разрез по средней линии, чтобы обнажить операционную область. (Б) На моторной коре было изготовлено окно в виде утонченного черепа. Прозрачность обнаженных корковых микрососудов используется для определения толщины черепа. (C) Толщину черепа также можно проверить, осторожно прощупав истонченный череп уплощенным кончиком тонкой иглы шприца и оценив его мягкость. (D) Самка Луэра Лока была приклеена к окошку с утонченным черепом. (E) Прикрепленная самка Luer Lock была закреплена путем наложения стоматологического цемента. (F) Глубину анестезии контролировали путем проверки глазного рефлекса и рефлекса отведения лапы. (G) Удар FPI был нанесен после возвращения рефлекса отхода к зажатию лапы. (H) Изображение окна истонченного черепа после RMTBI при 0 DPI. (I) Кожа головы была сшита тканевым клеем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Влияние rmTBI на обучение и память у мышей ICR. (A) Навигационный след мышей во время последнего испытания сбора данных был зафиксирован на уровне 11 DPI, (B) маршрут пространственного зонда в исследовании был зафиксирован на уровне 12 DPI, и (C) время побега, которое потребовалось мышам для определения местоположения платформы во время последнего испытания по сбору данных. Результаты показали, что группе rmTBI потребовалось значительно больше времени, чтобы достичь скрытой платформы, чем контрольной группе (p<0,05). (D) Процент времени, проведенного мышами в исходном квадранте платформы, по отношению к общему времени навигации во время испытания зонда был значительно ниже в группе rmTBI, чем в контрольной группе (p<0,01). n=8. *p<0,05, **p<0,01 по сравнению с контролем по непарному t-критерию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Влияние rmTBI на локомоцию, исследование и тревожность у мышей C57BL/6J. (A) Репрезентативные следы движения мышей в контрольной группе и rmTBI в течение 5-минутного OFT. (В-Е) Обобщенные данные показывают пройденное расстояние в центральных зонах, общее пройденное расстояние, среднюю скорость передвижения и время, проведенное в периферийных зонах соответственно. Контроль, n=13; rmTBI, n =12. стр<. 01 по сравнению с контролем по непарному t-критерию. Эта цифра была изменена с¹⁵. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Влияние rmTBI на пространственную рабочую и референсную память у мышей C57BL/6J. (А, Б) Репрезентативные следы движения контрольных мышей и мышей rmTBI во время пространственной рабочей и референсной оценки памяти в лабиринте Y. Тест спонтанного чередования Y-образного лабиринта является широко используемым методом оценки кратковременной памяти в моделях грызунов¹⁵. (C) Краткая информация о частотах спонтанного чередования мышей контрольной группы и rmTBI во время пространственной оценки работы. Грызуны обычно предпочитают исследовать новую ветвь лабиринта, а не возвращаться к тому, что они уже исследовали. Индекс предпочтений рассчитывается на основе времени, проведенного грызуном в новой руке, по сравнению со временем, проведенным во всех трех группах, и этот индекс затем анализируется. (D) Краткое изложение индекса предпочтения контрольных мышей и мышей rmTBI во время пространственной рабочей оценки. Контроль, n=13; rmTBI, n=12. стр<. 01 по сравнению с контролем по непарному t-критерию. Эта цифра была изменена с¹⁵. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 6: Сравнение окрашивания HE ипсилатеральной поврежденной моторной коры и подобласти зубчатой извилины гиппокампа между контролем и rmTBI у мышей C57BL/6J. (А, Б) Нормальная моторная кора; и (C, D) область гиппокампа контрольных мышей в различных увеличениях. (Е, Ж) Повреждение моторной коры и (G, H) гиппокампальных областей мышей с rmTBI. Гиперхромные нейроны в коре головного мозга и CA1 могли быть незначительно затронуты либо подготовкой к операции, либо длительной ЧМТ; тем не менее, гипохромные (возможно, промежуточные поврежденные) и пикнотические (апоптотические нейроны) нейроны наблюдались в моторной коре мышей rmTBI по сравнению с нормальными нейронами у контрольных мышей. Эти особенности апоптоза нейронов включали в себя цитоплазматическое сжатие нейронов и ядра, сопровождающееся явной вакуолацией. Примечательно, что демаркационная белая линия в точке (E) представляет собой границу между пораженным и окружающими тканями. Кроме того, гиперхромные нейроны в субобласти DG (H), возможно, относятся к вновь сгенерированным незрелым и зрелым зернистым нейронам. На приведенных ниже гистограммах показано распределение нормальных и пораженных rmTBI нейронов в (I) моторной коре и гиппокампе (J), CA1 и (K) DG. Контроль, n=13; rmTBI, n=12, ***p<. 001 в сравнении с контролем с помощью непарного t-критерия. Эта цифра была изменена с¹⁵. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

ЧМТ относится к двум основным типам: закрытым и проникающим, причем последний характеризуется разрушением черепа и твердой мозговой оболочки. Клинические данные свидетельствуют о том, что ЦИ более распространены, чем проникающие ранения ^1,2. После одной легкой ЧМТ большинство пациентов испытывают симптомы ЧЛС, которые обычно проходят в течение короткого периода времени, и существуют разногласия относительно доли пациентов, у которых ЧЛС развивается в долгосрочные последствия^23,24. Следовательно, исследователи переключили свое внимание на повторяющиеся модели ЦИ, чтобы лучше понять кумулятивные^{эффекты} множественных сотрясений мозга, которые обычно происходят при падениях, дорожно-транспортных происшествиях и контактных видах спорта. Эти повторяющиеся воздействия могут привести к более серьезным и долгосрочным последствиям^26,27. Используя повторяющиеся модели ЧС, исследователи могут изучить потенциальные аддитивные или синергетические эффекты множественных сотрясений мозга и лучше понять основные механизмы, которые способствуют ЧЛС. Такие модели могут способствовать разработке целенаправленных терапевтических вмешательств для смягчения долгосрочных последствий повторных ударов головой.

Несмотря на то, что некоторые модели CHI пытаются имитировать как фокальную одиночную, так и rmTBI с учетом как линейных, так и вращательных сил, эти модели могут привести к травме при рикошете и неточностям в тяжести травмы из-за таких факторов, как перелом черепа, морфология и толщина черепа, продолжительное апноэ у животных^и вариабельность механических входных параметров, особенно когда включается вращательное движение головы⁹. Методы поршневого управляемого удара и падения веса обычно используются для индуцирования RMTBI на животных моделях CHI²⁵. Управляемый поршнем удар позволяет точно и регулировать параметры удара с помощью электромагнитных или пневматических ударных устройств, что обеспечивает высокую воспроизводимость удара. Тем не менее, использование управляемого поршнем удара, будь то на открытую кору головного мозга, как при ЧМТ, или на закрытый череп, по-прежнему требует строгой иммобилизации головы животного в стереотаксической системе во время удара. И наоборот, методы снижения веса требуют простых и экономичных материалов, которые легко настроить, но компромиссом является несколько высокая вариабельность тяжести травмы^.

Модель FPI обычно вызывает смешанные очаговые и диффузные повреждения, что позволяет изготавливать ЧМТ различной степени тяжести. Несмотря на свои преимущества, модель FPI также имеет потенциальные ограничения. Как и модель CCI, FPI по-прежнему требует трепанации черепа, хирургической процедуры, которая может вызвать воспаление^{в тканях} мозга. Более того, даже слабый FPI часто проникает в твердую мозговую оболочку на разной глубине, что может внести путаницу в интерпретацию данных. Таким образом, модели CCI и FPI имеют ограничения в воспроизведении клинических особенностей, наблюдаемых у пациентов с легкой ЧМТ⁹. Таким образом, мы представляем протокол, который сочетает в себе метод «утонченного черепа» и методы FPI, которые могут быть использованы для создания более точной мышиной модели RMTBI, связанной с CHI. Цель этого протокола состоит в том, чтобы точно отразить клинические особенности пациентов с легкой ЧМТ. Высоковоспроизводимая модель была бы бесценным инструментом для исследования механизмов, лежащих в основе патофизиологии легкой ЧМТ, и оценки потенциальных терапевтических вмешательств.

Результаты наших исследований по ЧМТ согласуются с предыдущими публикациями, в которых для исследований легкой ЧМТ использовались окна истонченного черепа^28,29. Например, Ren et al. создали окно в виде истонченного черепа толщиной около 30 мкм в коре ассоциации левой теменной области, индуцируя легкую ЧМТ путем осторожного нажатия на окно тупым концом диаметром 1 мм с помощью хирургического стереотаксического инструмента²⁹. Их исследование показало заметное увеличение клеточной гибели и экспрессии реактивных окислительных видов (АФК) в поврежденной коре головного мозга²⁹. Для исследования rmTBI Nguyen et al. нанесли три CCI с модифицированным импакторным наконечником (круглый силиконовый наконечник диаметром 3 мм и толщиной 1,5 мм) на окно утонченного черепа мыши (толщиной 20-40 мкм) в теменной ассоциативной коре²⁸. Чтобы защитить и сохранить прозрачность участка истонченного черепа для долговременной визуализации, они покрыли окно истонченного черепа тонким слоем цианоакрилатного клея. Три ЧМЛ проводились один раз в неделю в течение 3 недель, с параметрами удара 4 м/с по скорости и 2 мм в глубину. В результате трех ЧМТ у мышей наблюдался выраженный астроглиоз и активация микроглии²⁸. Учитывая, что использование окна истонченного черепа в качестве модели для легкой ЧМТ/ЧМТ является относительно недавним, необходимы дальнейшие исследования для изучения взаимосвязи между тяжестью/прогрессированием травмы и различными методами воздействия. Например, в предыдущем исследовании мы смогли наблюдать очевидные изменения в морфологии клеток после двух FPI, которые были введены с интервалом^{2 дня 15}. Между тем, в других исследованиях одно мягкое сжатие окна истонченного черепа вызывало легкую ЧМТ с очевидной гибелью клеток и экспрессией реактивных окислительных видов²⁹, а три еженедельных ЧМТ приводили к сильному астроглиозу и активации микроглии²⁸.

Следует осторожно выполнить несколько шагов для создания согласованной модели травмы с использованием описанного метода. Во время операции с окном утонченного черепа, исходя из различной целевой области (например, мы сосредоточились на моторной коре), головка мыши должна быть зафиксирована в стереотаксической рамке на горизонтальном уровне или под небольшим боковым углом к противоположной стороне окна утонченного черепа в этом протоколе. Такое специфическое расположение может способствовать созданию окна истонченного черепа в области, соответствующей моторной коре. Точное размещение ушных планок является одним из самых сложных аспектов этой процедуры, и для ее освоения может потребоваться время и практика. Прежде чем приступать к операции по коррекции окна истонченного черепа или вызывать ЦИ, важно убедиться, что череп находится на одном уровне. Если череп расположен неправильно, голова должна быть отрегулирована соответствующим образом. Из-за неравномерной формы и толщины кости черепа, рост черепа варьируется даже в пределах конкретной кости³⁰, поэтому крайне важно скорректировать положение головы перед проведением процедуры «окна истонченного черепа» или ЧС. Невыполнение этого требования увеличивает риск переломов черепа, что может значительно повлиять на точность и надежность ЧС. Для получения более полного руководства по процедуре «окна истонченного черепа» обратитесь к протоколу, описанному Guang et ^al.14.

Выбор области моделирования ЧМТ варьируется среди исследователей в зависимости от их исследовательской направленности. Учитывая значительную вариабельность фактической локализации повреждения при ОМС, несмотря на то, что в большинстве исследований сообщается, что место удара находится в центре между брегмой и лямбдой, рекомендуется варьировать место удара в будущих экспериментальных исследованиях, как отмечено в обзоре животных моделей ОМС²⁵. Для валидации модифицированной модели травмы истонченного черепа CHI мы рекомендуем начать с моторной коры головного мозга, как описано в этом протоколе. ЧМТ может привести к фокальным повреждениям моторной коры, которые можно легко оценить с помощью подходов к оценке опорно-двигательного аппарата, таких как OFT в этом протоколе. Разрез, сделанный во время этой процедуры, требует времени для заживления, и это потенциально может вызвать периферический иммунный ответ, в конечном итоге внося вариабельность в эксперимент. Чтобы свести к минимуму риск воспаления, инфекции, послеоперационной боли и дискомфорта, мы рекомендуем нанести на рану мазь местного действия, содержащую комбинацию эритромицина и диклофенака натрия. Этот подход показал свою эффективность в уменьшении воспаления и боли, связанных с хирургическими процедурами у животных.

Протокол перкуссии жидкости на основе истонченного черепа является многообещающим методом моделирования rmTBI у грызунов, поскольку он уменьшает воспаление, обычно вызванное воздействием на мозговые оболочки FPI. Этот метод, представленный в окне истонченного черепа, может эффективно генерировать клинически значимые ЧЛС в различных степенях, обеспечивая потенциальную альтернативу для исследователей, изучающих rmTBI. Кроме того, окно с истонченным черепом облегчает наблюдение гомеостаза Ca²⁺ и гипервозбудимости нейронов в коре головного мозга in vivo¹⁵. Использование этой методики может улучшить наше понимание основных механизмов прогрессирования ЧЛС в краткосрочной/умеренной/долгосрочной перспективе, тем самым повышая способность прогнозировать его развитие и разрабатывать более эффективные терапевтические методы лечения.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
75% этанола	Шаньдун Секан Медикал Технолоджи Ко., Лтд.
Бупренорфина гидрохлорид	Тяньцзиньский фармацевтический научно-исследовательский институт Pharmaceutical Co., Ltd	H12020272	раствор, анальгетик
карпрофен	Shanghai Guchen Biotechnology Co., Ltd	53716-49-7	порошок, анальгетик
хлоргексидина диглюконат	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd.	18472-51-0	19%-21% водный раствор, антимикробный
стоматологический цемент и набор растворителей	Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd.	20220405, 3 #	Порошок восстановлен в соответствующем растворителе
Препарирующий микроскоп	Шэньчжэнь RWD Life Science Inc.	77019
Эритромициновая мазь	Ухань Майинглун Фармацевтическая группа Ко., Лтд.	220412
Антибиотик Волоконно-оптический источник холодного света	Шэньчжэнь RWD Life Science Inc.	F-150C
Микросверло с плоскими наконечниками	Шэньчжэнь RWD Life Science Inc.	HM31008	2 мм, стальной
FPI прибор программное обеспечение	Jiaxing Bocom Biotech Inc.	Biocom Animal Brain Impactor V1.0
ICR	Центр лабораторных животных Цзиньхуа	Stock#2023091	25 самцов мышей, 25-30 г, 8 недель
Isoflurane	Shandong Ante Animal Husbandry Technology Co., Ltd.
Изотермическая грелка	Вэньчжоу Репшоп Зоотовары Ко., Лтд.
Хуп			Изготовлен на заказ с использованием ступицы иглы 19G
Микроручная дрель для черепа	Shenzhen RWD Life Science Inc.	78001	Макс.: 38 000 об/мин
Модифицированное устройство FPI	Jiaxing Bocom Biotech Inc.
Водный лабиринт Моррис	Шэньчжэнь RWD Life Science Inc.	63031	Оценка способностей мыши к пространственному обучению и памяти
Открытое поле	Шэньчжэнь RWD Life Science Inc.	63008	Оценка опорно-двигательного аппарата и тревожности мышей
Офтальмологическая смазка	Сучжоу Тяньлун Фармацевтическая Компания, Лтд.
Мазь с диклофенаком натрия	Ухань Майинглун Фармацевтическая группа Ко., Лтд.	221207	нестероидный противовоспалительный препарат
Система анестезии для мелких животных-Enhanced	Шэньчжэнь RWD Life Science Inc.	R530IP
Интеллектуальная система слежения	за видео Panlab Harvard Apparatus Inc., MA, США	V3.0	Отслеживание и анализ животных
Стереотаксическая рамка	Шэньчжэнь RWD Life Science Inc.	68043
Vetbond Tissue Adhesive	3M, Сент-Пол, Миннесота, США	202402AX	Шовный материал для животной раны
Y maze	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63005	Оценка пространственной рабочей памяти мыши