Мы описываем протокол экстракции высококачественных ядер из криоконсервированных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных из стромальных/эндотелиальных клеток и клеток крови, для поддержки одноядерных анализов секвенирования нового поколения. Производство высококачественных, неповрежденных ядер является обязательным условием для экспериментов по мультиомике, но для некоторых лабораторий может стать препятствием для входа в эту область.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение ядра из криоконсервированных клеток крови, полученных in vitro
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Модели на основе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) являются отличными платформами для понимания развития крови, а клетки крови, полученные из ИПСК, имеют трансляционную полезность в качестве реагентов для клинических испытаний и трансфузионной клеточной терапии. Появление и расширение мультиомного анализа, включающего, помимо прочего, одноядерное секвенирование РНК (snRNAseq) и анализ на транспозазо-доступное секвенирование хроматина (snATACseq), открывает возможности для революции в нашем понимании развития клеток. Это включает в себя биологию развития с использованием гемопоэтических моделей in vitro . Тем не менее, может быть технически сложно выделить неповрежденные ядра из культивируемых или первичных клеток. Различные типы клеток часто требуют индивидуальной подготовки ядра в зависимости от жесткости и содержания клеток. Эти технические трудности могут ограничивать качество данных и выступать в качестве барьера для исследователей, заинтересованных в проведении исследований мультиомики. Криоконсервация образцов часто необходима из-за ограничений по сбору и/или обработке клеток, а замороженные образцы могут представлять дополнительные технические проблемы для изоляции неповрежденных ядер. В данной рукописи мы подробно описываем метод выделения высококачественных ядер из клеток, полученных из iPSC, на разных стадиях развития гемопоэза in vitro для использования в рабочих процессах многоядерной мультиомики. Мы сосредоточили разработку метода на выделении ядер из адгезивных стромальных/эндотелиальных клеток, полученных из iPSC, и неадгезивных клеток-предшественников, поскольку они представляют собой очень разные типы клеток с точки зрения структурной и клеточной идентичности. Описанные шаги по устранению неполадок ограничили образование комков ядер и мусора, что позволило восстановить ядра в достаточном количестве и качестве для последующего анализа. Подобные методы могут быть адаптированы для выделения ядер из других типов криоконсервированных клеток.
Введение
Кроветворение является относительно хорошо охарактеризованной системой развития, но неспособность воспроизводить образование клеток крови in vitro демонстрирует неполное понимание связанных с этим факторов. Модели гемопоэза на основе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) могут помочь пролить свет на ключевые факторы развития и связанную с ними биологию. Система iPSC также предлагает отличную модель для изучения заболеваний крови, а клетки крови на основе iPSC были разработаны для производства трансляционных и терапевтически значимых реагентов 1,2,3,4. Исследования на отдельных клетках широко использовались для изучения биологии развития на основе ИПСК, включая типы клеток, которые образуются во время кроветворения5. По сравнению с объемным секвенированием РНК, которое не может вывести родство междусубпопуляциями клеток6, одноклеточные модальности позволяют оценить гетерогенность клеток и могут облегчить идентификацию и характеристику развитияклеток6,7.
Образование гемопоэтических клеток из ИПСК требует последовательной дифференцировки через примитивную полосу, мезодерму и эндотелиальные состояния для формирования гемогенных эндотелиальных клеток. Гемогенные эндотелиальные клетки являются прямыми предшественниками гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников8. Эти типы клеток имеют удивительно разные морфологические и клеточные свойства. Существует ограниченное понимание эпигенетического ландшафта и динамики развития моделей гемопоэтических клеток, полученных in vitro, хотя это важные знания для раскрытия полного терапевтического потенциала системы iPSC. Во многих случаях только методы анализа отдельных клеток позволяют идентифицировать клеточные популяции, транскрипционную активность, хроматиновые ландшафты и регуляторные механизмы, которые управляют развитием среди гетерогенных клеточных препаратов.
Две методологии, секвенирование РНК одной клетки (scRNAseq) и секвенирование РНК отдельных ядер (snRNAseq), могут выявить транскрипционные идеина уровне отдельных клеток9. Основным фактором, определяющим достоверность и надежность данных, является бескомпромиссная потребность в образцах, отвечающих строгим критериям качества. К ним относятся точные требования к плотности ячеек/ядер, оптимальной жизнеспособности и минимальному комкованию. Получение одиночных ядер может быть технически сложным. Могут возникнуть дополнительные проблемы, связанные с использованием ранее криоконсервированных клеток.
Мы отмечаем четыре важных потенциальных ограничения для стандартных подходов scRNAseq. Во-первых, стандартные протоколы получения клеточных суспензий часто ссылаются на препараты из свежих клеток или тканей, а не на те, которые были полученыпосле криоконсервации. Это может снизить полезность потенциально ценных ресурсов. Во-вторых, эффективность диссоциации различных типов клеток варьируется. Например, многие типы иммунных клеток подвергаются диссоциации с относительной легкостью. Напротив, стромальные клетки, фибробласты и эндотелиальные клетки, которые обычно встроены во внеклеточный матрикс и базальную мембрану, обладают уникальными клеточными свойствами, которые могут осложнить выделение ядер11,12. Эти свойства могут потребовать агрессивных протоколов диссоциации, что может поставить под угрозу структурную целостность более чувствительных клеточных популяций. В-третьих, некоторые клетки (например, мегакариоциты) могут превышать 100 мкм в диаметре и создавать трудности для нескольких существующих коммерческих одноклеточных платформ13. Кроме того, неправильное обращение может привести к повреждению клеток и стрессовым реакциям на начальных этапах выделения клеток, включая ферментативный гидролиз и механическую диссоциацию, что может повлиять на профили экспрессии генов11,14.
По этим и другим причинам одноклеточный подход может быть предпочтительной альтернативой методам с использованием одногоядра15. Учитывая превосходную стабильность ядерной мембраны по сравнению с клеточной мембраной, ядерная оболочка может оставаться неповрежденной даже после криоконсервациитканей16. Это может облегчить извлечение ядер и увеличить разнообразие типов образцов, пригодных для методов секвенирования следующего поколения. Во-вторых, ядра проявляют повышенную устойчивость к механическим возмущениям и, как правило, проявляют меньше транскрипционных сдвигов во время диссоциации. Таким образом, ядра могут обеспечить большую стабильность РНК и более воспроизводимые транскрипционные профили. Третьим заслуживающим внимания преимуществом одноядерных методов является отсутствие ограничений по размеру клеток и применимость для более крупных клеток, таких как кардиомиоциты или мегакариоциты12. В-четвертых, ядра служат подходящими субстратами для мультиомных анализов, которые позволяют получить расширенное представление о экспрессии генов, доступных областях хроматина идругих параметрах, что позволяет глубже понять гетерогенность, развитие ифункциональные состояния клеток.
Профилируя ИПСК во время развития кроветворения, мультиомные подходы могут помочь определить процессы развития в моделях нормальных или патологических заболеваний. Сравнение клеток, полученных из ИПСК, с первичными клетками или тканями также может обеспечить оценку точности модели ИПСК биологии in vivo , способствуя улучшению модели ИПСК и открытию новых клеточных популяций и факторов, способствующих кроветворению.
Несмотря на то, что многие группы успешно справились с выделением ядер и последующим анализом секвенирования нового поколения, выделение высококачественных ядер остается препятствием для некоторых лабораторий, заинтересованных в проведении анализов на основе одного ядра. В данной рукописи подробно описан протокол выделения качественных ядер из ранее криоконсервированных клеток, полученных из iPSC. Мы сосредоточились на адгезивных стромальных/эндотелиальных клетках и неадгезивных клетках-предшественниках, поскольку они представляют собой очень разные типы клеток с точки зрения структуры и содержания, которые требуют индивидуальных модификаций и устранения неполадок для повышения восстановления высококачественных ядер, пригодных для секвенирования следующего поколения или других экспериментов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Криоконсервация клеток
- Замораживание >1 x 106 изолированных клеток, полученных из iPSC, на мл в 1 мл 90% FBS и 10% ДМСО. Поместите криовиалы в контейнер для заморозки при температуре -80°C, чтобы снизить скорость замораживания и оптимизировать восстановление жизнеспособных клеток (Таблица материалов). Ожидайте значительной потери клеток, которая может варьироваться в зависимости от условий культивирования и идентичности клеток.
- Перейдите от -80 °C к хранилищу жидкого азота в течение 24 часов.
2. Размораживание клеток
- Извлеките криовиал из хранилища жидкого азота и разморозьте на водяной бане при температуре 37 °C в течение 2 минут. Снимите с водяной бани, пока еще видны мелкие кристаллы льда.
- Переложите клетки из криовиальной камеры в пустую пробирку объемом 15 мл и медленно добавьте 10 мл предварительно подогретой среды (RPMI 1640 + 10% FBS), тщательно перемешивая. Центрифугируйте при 400 x g в течение 3 мин при 25 °C.
- Аспирируйте надосадочную жидкость и восстановите в 1 мл DPBS с добавлением 2% FBS и 1 мМ CaCl2 (Таблица материалов). Тщательно перемешайте с помощью пипетирования 3 раза с помощью микропипетки объемом 1000 мкл. Переложите в полистирольную пробирку с круглым дном объемом 5 мл.
3. Удаление омертвевших клеток
- Добавьте 50 мкл коктейля для удаления мертвых клеток (Таблица материалов) в 1 мл клеточной суспензии. Добавьте в клеточную смесь 50 μл отборочного коктейля биотина. Выдерживать при комнатной температуре в течение 3 минут. Эти шаги обозначают мертвые клетки аннексина V+, содержащиеся в клеточной суспензии, биотином.
- Энергично вихревые в течение 30 с, шарики декстрана предназначены для истощения нежелательных типов клеток, меченных биотином (Таблица материалов). Добавьте 100 μL гранул декстрана в клеточную суспензию и перемешайте, осторожно пипетируя вверх и вниз 2 раза с помощью микропипетки объемом 1000 μL (Таблица материалов).
- Добавьте 1,3 мл DPBS, содержащего 2% FBS и 1 мМ CaCl2 , в клеточную суспензию и перемешайте, осторожно пипетируя вверх и вниз 2 раза с помощью микропипетки объемом 1000 мкл. Поместите трубку в магнит (Таблица материалов) и выдерживайте при комнатной температуре в течение 3 минут.
- Переверните магнит и пробирку, чтобы залить обогащенную суспензию живых клеток в новую коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте при 400 x g в течение 3 минут при 4°C. Удалите большую часть надосадочной жидкости и повторно суспендируйте в 1 мл DPBS + 0,04% BSA. Аккуратно перемешайте с помощью пипетки 3 раза с помощью микропипетки объемом 1000 мкл.
4. Выделение ядер
- Центрифугируйте суспензию живых клеток при давлении 460 x g в течение 5 мин при 4 °C, а затем аспирируйте надосадочную жидкость, гарантируя, что клеточный гранула не нарушится.
- Добавьте 100 мкл свежеприготовленного 0,5-кратного лизисного буфера, охлажденного на льду (табл. 1), и аккуратно перемешайте пипеткой 10x с помощью микропипетки объемом 100 мкл. Выдерживать 3 минуты на льду.
- Добавьте в пробирку 500 μл охлажденного буфера для промывки (Таблица 2), не перемешивая. Центрифуга при 600 x g в течение 5 мин при 4 °C.
5. Промывка и оценка ядер
- Аспиратируйте надосадочную жидкость и добавьте 500 мкл охлажденного буфера для промывки, чтобы растворить оставшуюся неповрежденную гранулу без смешивания. Центрифуга при 600 x g в течение 5 мин при 4 °C. Удалите всю надосадочную жидкость, не нарушая ядра гранул.
- Ресуспендируйте в 120 мкл охлажденного буфера разбавленных ядер (табл. 3). Отфильтруйте клеточную суспензию с помощью клеточного сетчатого фильтра 40 мкм (Таблица материалов).
- Окрашивают 0,4% трипановым синим и визуально оценивают качество выделенных ядер под 10-кратным микроскопом (Таблица материалов).
6. Обработка изолированных ядер
- Держите ядра на льду. Немедленно приступайте к дальнейшей обработке, так как со временем может произойти слипание ядер, что потребует дополнительных этапов фильтрации.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
С помощью вышеупомянутого протокола мы выделили ядра из криоконсервированных адгезивных стромальных/эндотелиальных клеток, полученных из iPSC, и неадгезивных (плавающих) гемопоэтических клеток-предшественников. Подробное схематическое изображение процедуры ядерной изоляции можно найти на рисунке 1.
Для морфологического исследования выделенные ядра окрашивали трипановым синим и визуализировали под микроскопом. Ядерно-морфологическое исследование имеет решающее знач...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Критические шаги в рамках протокола
Выделение высококачественных ядер имеет важное значение для успешной реализации современных методов секвенирования следующего поколения на основе одного ядра, которые быстро развиваются. Признавая существующие барьеры для лабораторий, заинтересованных в этих подходах, особенно для криоконсервированных образцов, мы намеревались разработать метод ядерной изоляции, адаптированный для ранее замороженных клеток. Выделение ядер из криоконсервированных образцов часто необх...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Благодарности
Авторы благодарят Джейсона Хатакеяму (10x Genomics) и Диану Слейтер (Diana Slater) (Детская больница Филадельфийского центра прикладной геномики) за рекомендации и предложения. Это исследование было поддержано Национальными институтами здравоохранения (HL156052 к CST).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильно>Реагенты для клеточных культур | |||
| раствор диметилсульфоксида (ДМСО) | Sigma | 673439 | |
| фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS) | Corning | 21031CV | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | GeminiBio | 100106 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875093 | |
| Cells | |||
| Induced pluripotent stem | N/A | N/A | IPSCs, использованные в этом исследовании, были получены с помощью CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core |
| FacilityCell Staining Reagents | |||
| Трипановый синий раствор | Corning | 25900CI | |
| >Реагенты для удаления мертвых клеток | |||
| Хлорид кальция (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| EasySep Удаление мертвых клеток (Аннексин V) Набор | StemCell Technologies | 17899 | Этот набор предназначен для истощения нежелательных типов клеток, меченных биотином. В набор входит коктейль для удаления мертвых клеток (аннексин V), коктейль для выбора биотина и бусины декстрана. Этот набор нацелен на фосфатидилсерин на внешнем листке клеточной мембраны апоптотических клеток с помощью аннексина V. Нежелательные клетки помечаются аннексином V, биотинилированными антителами и магнитными частицами и разделяются без колонок с помощью магнита EasySep. Нужные клетки просто выливаются в новую пробирку. |
| <прочные>Материалы | |||
| 10 и микро; l Микропипетки | Wards science | 470231606 | |
| 100 & микро; l Микропипетки | Wards science | 470231598 | |
| 1000 & микро; l Расширенный универсальный наконечник | Oxford Lab Products | OAR-1000XL-SLF | |
| 1000 &; l Микропипетки | Wards science | 470231602 | |
| 2,0 мл Криогенные флаконы | Corning | 431386 | |
| 20 &микро; l Микропипетки | Wards science | 470231608 | |
| 200 & микро; l Микропипетка | Wards science | 470231600 | |
| 5 мл полистирольная трубка с круглым дном | Falcon | 352063 | |
| Corning DeckWork 0,1-10 &; l Наконечник для дозатора | Corning | 4143 | |
| Corning DeckWork 1-200 &микро; l Пипетка Tip Station | Corning | 4144 | |
| Счетная камера | CytoSMART | 699910591 | |
| Flowmi Cell Sither, 40 & микро; М | Bel-Art | H136800040 | |
| Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| NALGENE Cryo 1° C Контейнер для заморозки | Nalgene | 51000001 | |
| <сильно>Ядра Изолирующие реагенты | Ядра Реагенты включают Лизис Буфер, Буфер для промывки, буфер для разбавленных ядер и буфер для разведения лизиса. Состав этих буферов приведен в таблицах 1, 2 и 3. Наш метод выделения ядер улучшил выделение по сравнению со стандартными протоколами набора (например, 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide [CG000338]). Этот протокол может быть использован с несколькими коммерческими наборами, включая Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxn (PN-1000283). | ||
| Набор для удаления мертвых клеток | STEMCELL | 17899 | |
| Digitonin | Thermo Fisher Scientific | BN2006 | |
| DL-раствор дитиотреитола (DTT) | Sigma | 646563 | |
| Flowmi Cell Strainer, 40 & микро; m | Bel-Art | H136800040 | |
| MACS бычий сывороточный альбумин (БСА) стоковый раствор | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
| Магния хлорид (MgCl2) | Sigma | 7786303 | |
| раствор хлорида магния, 1 м Sigma | M1028 | ||
| Nonidet P40 Substitute | Sigma | 74385 | |
| Nuclease-Free Вода | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| Буфер ядер (20X) | 10X Genomics | 2000153 | |
| Протектор РНКазы | Sigma | 3335399001 | |
| хлорида натрия (NaCl) | Sigma | S7653-250G | |
| раствор хлорида натрия, 5 М | Сигма | 59222C | |
| Тризма гидрохлорид Soultion, pH 7,4 | сигма | T2194 | |
| Тризма гидрохлорид (Tris-HCl) (pH7.4) | Sigma | T3252-500G | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| Другое оборудование | |||
| Автоматический счетчик клеток | CytoSMART | 699910591 | |
| Микроскоп | Zeiss | Primostar 3 |
Ссылки
- Ito, Y., et al. Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production. Cell. 174 (3), 636-648 (2018).
- An, H. H., et al. The use of pluripotent stem cells to generate diagnostic tools for transfusion medicine. Blood. 140 (15), 1723-1734 (2022).
- Zeng, J., Tang, S. Y., Toh, L. L., Wang, S. Generation of "Off-the-Shelf" Natural Killer Cells from Peripheral Blood Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rep. 9 (6), 1796-1812 (2017).
- Pavani, G., et al. Modeling primitive and definitive erythropoiesis with induced pluripotent stem cells. Blood Adv. , (2024).
- Chen, X., et al. Integrative epigenomic and transcriptomic analysis reveals the requirement of JUNB for hematopoietic fate induction. Nat Comm. 13 (1), 3131(2022).
- Yu, X., Abbas-Aghababazadeh, F., Chen, Y. A., Fridley, B. L. Statistical and bioinformatics analysis of data from bulk and single-cell RNA sequencing experiments. Methods Mol Biol. 2194, 143-175 (2021).
- Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clin Transl Med. 12 (3), e694(2022).
- Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
- Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat med. 26 (5), 792-802 (2020).
- Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. J Am Soc Nephrol. 30 (1), 23-32 (2019).
- Nadelmann, E. R., et al. Isolation of nuclei from mammalian cells and tissues for single-nucleus molecular profiling. Curr Protoc. 1 (5), e132(2021).
- Del-Aguila, J. L., et al. A single-nuclei RNA sequencing study of Mendelian and sporadic AD in the human brain. Alzheimer's Res Ther. 11 (1), 71(2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PloS one. 13 (12), e0209648(2018).
- Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. A., Lee, H. O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. J Pathol Transl Med. 57 (1), 52-59 (2023).
- Maciejowski, J., Hatch, E. M. Nuclear membrane rupture and its consequences. Ann Rev Cell Dev Biol. 36, 85-114 (2020).
- Fang, R., et al. Comprehensive analysis of single cell ATAC-seq data with SnapATAC. Nat Comm. 12 (1), 1337(2021).
- Baysoy, A., Bai, Z., Satija, R., Fan, R. The technological landscape and applications of single-cell multi-omics. Nat Rev. Mol Cell Biol. 24 (10), 695-713 (2023).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
