В этом протоколе описываются экстрахромосомные негомологические тесты на соединение концов (NHEJ) и гомологичные рекомбинационные анализы (HR) для количественной оценки эффективности NHEJ и HR в клетках HEK-293T.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Анализ эффективности негомологичного соединения концов и гомологичной рекомбинации в клетках HEK-293T с использованием репортерных систем на основе GFP
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Двухцепочечные разрывы ДНК (DSB) представляют собой наиболее опасные повреждения ДНК, способные вызвать значительную потерю генетической информации и гибель клеток. В ответ на это клетки используют два основных механизма репарации DSB: негомологичное соединение концов (NHEJ) и гомологичную рекомбинацию (HR). Количественная оценка эффективности NHEJ и HR по отдельности имеет решающее значение для изучения соответствующих механизмов и факторов, связанных с каждым из них. Анализ NHEJ и анализ HR являются установленными методами, используемыми для измерения эффективности соответствующих путей восстановления. Эти методы основаны на тщательно спроектированных плазмидах, содержащих разрушенный ген зеленого флуоресцентного белка (GFP) с сайтами узнавания эндонуклеазы I-SceI, которая индуцирует DSB. В данной работе мы описываем внехромосомный анализ NHEJ и анализ HR, которые включают совместную трансфекцию клеток HEK-293T с плазмидами EJ5-GFP/DR-GFP, экспрессирующую плазмиду I-SceI и экспрессирующую плазмиду mCherry. Количественные результаты эффективности NHEJ и HR получены путем расчета соотношения GFP-положительных клеток к mCherry-положительным клеткам, подсчитанным с помощью проточной цитометрии. В отличие от хромосомно-интегрированных анализов, эти внехромосомные анализы больше подходят для проведения сравнительных исследований с участием нескольких установленных стабильных клеточных линий.
Введение
Двухцепочечный разрыв ДНК (DSB) является наиболее опасной формой повреждения ДНК, потенциально приводящей к нестабильности генома, хромосомным перестройкам, клеточному старению и гибели клеток, если его своевременно не восстановить. Два хорошо установленных пути, негомологичное соединение концов (NHEJ) и гомологичная рекомбинация (HR), признаны эффективными в работе с DSB ДНК 2,3. HR считается безошибочным механизмом репарации DSB, использующим гомологичные последовательности в сестринской хроматиде в качестве матрицы для восстановления исходной конфигурации поврежденной молекулы ДНК3. NHEJ, с другой стороны, представляет собой подверженный ошибкам путь репарации DSB, который соединяет поврежденные концы ДНК, не полагаясь на какой-либо шаблон2.
Анализ NHEJ и анализ HR являются классическими методами, первоначально разработанными в лаборатории Ясина в Мемориальном онкологическом центре им. Слоуна-Кеттеринга и используемыми для количественной оценки эффективности NHEJ и HR соответственно 4,5,6,7. Эти анализы играют решающую роль в исследовании соответствующих механизмов и факторов, связанных с NHEJ и HR 8,9,10,11,12,13,14. Оба анализа основаны на использовании двух нарушенных репортеров GFP, EJ5-GFP и DR-GFP, для мониторинга репарации DSB, индуцированной эндонуклеазой I-SceI. Репортер EJ5-GFP используется в анализе NHEJ, в то время как репортер DR-GFP используется в анализе HR. Каждый репортер тонко спроектирован таким образом, что индуцированные I-Sce I-индуцированныеDSB могут быть восстановлены только с помощью определенного пути репарации для восстановления кассеты с экспрессией GFP 4,5.
Анализ NHEJ и анализ HR могут быть проведены с использованием либо хромосомно-интегрированного, либо внехромосомного подхода15,16. Хромосомно-интегрированный подход требует интеграции нарушенных репортеров GFP в геном, что позволяет анализировать репарацию DSB в хромосомном контексте 6,15. Тем не менее, этот подход требует длительного пассирования клеток и не подходит для сравнительных исследований с участием нескольких клеточных линий из-за произвольной хромосомной интеграции, что вносит дополнительный искажающий фактор, помимо присущих ему различий. В этом протоколе мы описываем внехромосомный анализ NHEJ и анализ HR, включающий транзиторную трансфекцию разрушенных плазмид GFP и I-SceI в клетки HEK-293T с последующим анализом проточной цитометрии (рабочий процесс эксперимента показан на рисунке 1). Эти неинтегрированные репортерные анализы были первоначально представлены лабораторией Джасина для изучения репарации межцепочечных связей ДНК16 и использовались для оценки эффективности NHEJ и эффективности HR несколькими лабораториями 9,10,11,12,13,14,17,18,19, включая нашу 11. Эти экстрахромосомные подходы облегчают анализ репарации DSB в сравнительных исследованиях с участием нескольких установленных стабильных клеточных линий.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Выделение плазмид
- Трансформируйте компетентную E. coli с плазмидами EJ5-GFP, DR-GFP, pCBASceI (экспрессирующая плазмида I-SceI) и PCI2-HA-mCherry (экспрессирующая плазмида mCherry) (см. Таблицу материалов) в соответствии со стандартным протоколом трансформации20.
Примечание: PCI2-HA-mCherry может быть заменен другими экспрессирующими mCherry или DsRed плазмидами. - Трансформированную кишечную палочку культивируют в 500 мл жидкой среды LB с добавлением 100 мкг/мл ампициллина в течение ночи при 37 °С с встряхиванием.
- Изолируйте плазмиды с помощью имеющегося в продаже набора для макси-изоляции плазмид, не содержащего эндотоксинов, в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
- Количественное определение концентраций плазмид с помощью нанокапельных микрообъемных спектрофотометров. Отрегулируйте концентрацию плазмид до 1 мкг/л.
2. Клеточный препарирование и трансфекция
- Культура клеток HEK-293T в среде DMEM дополнена 10% фетальной бычьей сывороткой. Убедитесь, что клетки HEK-293T или стабильные клетки HEK-293T находятся в хорошем состоянии роста.
Примечание: Замороженные клетки должны пройти не менее двух раундов расщепления перед трансфекцией. - За день до трансфекции засейте клетки HEK-293T в 6-луночный планшет с концентрацией 2 × 105 клеток/лунку, чтобы достичь около 60% конфлюенции на следующий день.
- В день трансфекции подтвердите слияние клеток, стремясь примерно к 60%. Для проведения анализа NHEJ трансфицируют клетки экспериментального образца в 6-луночный планшет 1 г EJ5-GFP, 1 г pCBASceI и 1 г плазмид PCI2-HA-mCherry с использованием коммерческого реагента для трансфекции в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). Для анализа HR замените плазмиду EJ5-GFP на плазмиду DR-GFP.
- Для контроля калибровки FACS оставьте лунку с клетками нетрансфицированной в качестве отрицательного контроля. Трансфектируйте клетки в 6-луночном планшете либо (1) 1 мкг EJ5-GFP (для анализа NHEJ), либо 1 мкг DR-GFP (для анализа HR), вместе с 1 мкг pCBASceI в качестве одноцветного контроля GFP, либо (2) 1 мкг PCI2-HA-mCherry в качестве одноцветного контроля mCherry.
3. Анализ GFP-положительных и mCherry-положительных клеток методом проточной цитометрии
- Через два дня после трансфекции подтвердите экспрессию белков GFP и mCherry с помощью флуоресцентного микроскопа.
- Через три дня после трансфекции удалите среду из лунок, промойте один раз PBS и добавьте в каждую лунку по 500 мкл трипсина. Инкубировать в течение 5 минут при 37 °C, чтобы отделить все клетки от планшета. На протяжении этого и последующих этапов защищайте клетки от прямого света.
- Добавьте 500 мкл полной среды DMEM в каждую лунку, повторно суспендируйте клетки, убедившись, что комки не видны.
- Переложите все ячейки из каждой лунки в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл, затем центрифугируйте ячейки в течение 2 минут при 1000 × г при комнатной температуре.
- Осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетирования и промойте один раз 1,0 мл PBS.
- Снова осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетирования, повторно суспендируйте клетки в 500 мкл PBS и переведите клетки в трубки FACS (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения оптимальных результатов начните анализ проточной цитометрии сразу после забора клеток. Как вариант, клетки можно хранить на льду в течение нескольких часов. - Откалибруйте FACS с нетрансфицированными клетками (отрицательный контроль), EJ5-GFP/DR-GFP и pCBASceI-трансфицированными клетками (одноцветный контроль GFP) и mCherry-трансфицированными клетками (одноцветный контроль mCherry). Отрегулируйте напряжение и компенсацию, чтобы свести к минимуму переток флуоресценции между GFP и mCherry.
- Получите и зарегистрируйте не менее 10 000 неповрежденных клеток из каждой пробирки.
4. Анализ данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги выполняются с помощью программного обеспечения FlowJo (см. Таблицу материалов) для анализа данных FACS. Аналогичные процедуры могут быть выполнены в альтернативном аналитическом программном обеспечении.
- Перетащите все файлы FACS на панель управления. Дважды щелкните один из файлов, чтобы отобразить график FSC/SSC.
- Создайте полигональный ворот для выбора неповрежденных ячеек, исключив мусор в левом нижнем углу. Назовите эту субпопуляцию "Intact Cells" и перетащите этот элемент на панель "All Samples". Прокрутите каждый образец с помощью кнопки «Следующий образец», чтобы убедиться в подходящем стробировании для каждого образца (рисунок 2A).
- Дважды щелкните по субпопуляции «Интактные клетки » отрицательного контрольного образца (нетрансфицированные клетки), чтобы открыть новый график. Измените оси на FL1-H (ось x, GFP) и FL2-H (ось y, mCherry).
- Выберите инструмент Quad Gating и щелкните по верхнему правому крайнему значению популяции отрицательных клеток (Рисунок 2B). Перетащите четыре прямоугольных ворота на панель «Неповрежденные клетки». Прокрутите образцы одноцветного элемента управления GFP или одноцветного элемента управления mCherry с помощью кнопки «Следующий образец», чтобы обеспечить соответствующее стробирование для различения GFP-положительных или mCherry-положительных клеток от отрицательных контрольных клеток (рис. 2C, D). При необходимости настройте стробирование квадранта и примените это стробирование ко всем популяциям «Интактных клеток».
- Нажмите на редактор макетов. Щелкните правой кнопкой мыши на репрезентативных графиках и выберите «Копировать в редактор компоновок». Выберите все репрезентативные графики, затем дважды щелкните, чтобы открыть окно «Определение графика». При необходимости настройте метку оси, аннотацию и легенду.
- Процент mCherry-положительных клеток в экспериментальных образцах служит для контроля эффективности трансфекции. Рассчитайте относительную эффективность репарации ДНК, сравнив количество GFP-положительных клеток с количеством mCherry-положительных клеток на том же графике.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для обеспечения точности анализа NHEJ и HR необходимо внедрить подходящую стратегию корректировки компенсации и стробирования. Как правило, флуоресценция mCherry не проявляется в детекторе GFP при использовании фильтра 530 нм. Однако в тех случаях, когда клетки демонстрируют чрезвычайно высокую экспрессию GFP, флуоресценция GFP может загрязнять детектор mCherry при использовании фильтра с длиной волны 575 нм. Чтобы решить эти проблемы, для компенсации и регулирования стратегии стробирования были использованы образцы нега...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Описанный здесь метод был использован в нескольких работах для оценки эффективности NHEJ и эффективности управления персоналом 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19. Этот метод имеет отношение к в...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет никаких конфликтов интересов, которые можно было бы раскрыть.
Благодарности
Это исследование финансировалось Фондом естественных наук провинции Хэйлунцзян в Китае (YQ2022C036) и Фондом инноваций для выпускников Медицинского университета Цицикар (QYYCX2022-06). Рисунок 1 получен с использованием MedPeer.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Посуда 6 см | BBI | F611202-9001 | |
| 6-луночные планшеты | Corning | 3516 | |
| Ампициллин | Beyotime | ST007 | Рабочая концентрация: 100 μ г/мл |
| DH5&альфа; Компетентные клетки | TIANGEN | CB101 | |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | |
| DR-GFP | Addgene | 26475 | |
| EJ5-GFP | Addgene | 44026 | |
| EndoFree Maxi Plasmid kit | TIANGEN | DP117 | альтернативный набор для экстракции плазмид без эндотоксинов можно использовать |
| FACS tubes | FALCON | 352054 | |
| Фетальная бычья сыворотка | CLARK | FB25015 | |
| Проточный цитометр | BD Biosciences | BD FACSCalibur | |
| FlowJo V.10.1 | Treestar | можно использовать альтернативное программное обеспечение для анализа | |
| HEK-293T клетки Национальная | инфраструктура клеточной линии Ресурс | 1101HUM-PUMC000091 | |
| Lipo3000 | Invitrogen | L3000015 | Можно использовать альтернативные трансфекционные регенты |
| PBS | Biosharp | BL601A | |
| pCBASceI | Addgene | 26477 | I-SceI экспрессирующие плазмиды |
| PCI2-HA-mCherry | альтернативные плазмиды, содержащие DsRed, можно использовать | ||
| Trypsin | Gibco | 25200-056 |
Ссылки
- Huang, R., Zhou, P. K. DNA damage repair: historical perspectives, mechanistic pathways and clinical translation for targeted cancer therapy. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 254(2021).
- Pannunzio, N. R., Watanabe, G., Lieber, M. R. Nonhomologous DNA end-joining for repair of DNA double-strand breaks. J Biol Chem. 293 (27), 10512-10523 (2018).
- Wright, W. D., Shah, S. S., Heyer, W. -D. Homologous recombination and the repair of DNA double-strand breaks. J Biol Chem. 293 (27), 10524-10535 (2018).
- Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).
- Bennardo, N., Cheng, A., Huang, N., Stark, J. M. Alternative-NHEJ Is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair. PLoS Genet. 4 (6), e1000110(2008).
- Gunn, A., Stark, J. M. I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks. Methods Mol Biol. 920, 379-391 (2012).
- Zuo, N., et al. Detection of alternative end-joining in HNSC cell lines using DNA Double-strand break reporter assays. Bio Protoc. 12 (17), 4506(2022).
- Schrank, B. R., et al. Nuclear ARP2/3 drives DNA break clustering for homology-directed repair. Nature. 559 (7712), 61-66 (2018).
- Lu, H., Saha, J., Beckmann, P. J., Hendrickson, E. A., Davis, A. J. DNA-PKcs promotes chromatin decondensation to facilitate initiation of the DNA damage response. Nucleic Acids Res. 47 (18), 9467-9479 (2019).
- Xu, R., et al. hCINAP regulates the DNA-damage response and mediates the resistance of acute myelocytic leukemia cells to therapy. Nat Commun. 10 (1), 3812(2019).
- Wang, T., et al. WASH interacts with Ku to regulate DNA double-stranded break repair. iScience. 25 (1), 103676(2022).
- Guo, G., et al. Reciprocal regulation of RIG-I and XRCC4 connects DNA repair with RIG-I immune signaling. Nat Commun. 12 (1), 2187(2021).
- Watkins, J., et al. Genomic complexity profiling reveals that HORMAD1 overexpression contributes to homologous recombination deficiency in triple-negative breast cancers. Cancer Discov. 5 (5), 488-505 (2015).
- Chen, Y., et al. USP44 regulates irradiation-induced DNA double-strand break repair and suppresses tumorigenesis in nasopharyngeal carcinoma. Nat Commun. 13 (1), 501(2022).
- Seluanov, A., Mao, Z., Gorbunova, V. Analysis of DNA double-strand break (DSB) repair in mammalian cells. JoVE. (43), e2002(2010).
- Nakanishi, K., Cavallo, F., Brunet, E., Jasin, M. DNA recombination: Methods and Protocols. Tsubouchi, H. , Humana Press. Totowa, NJ. 283-291 (2011).
- Cavallo, F., et al. Reduced proficiency in homologous recombination underlies the high sensitivity of embryonal carcinoma testicular germ cell tumors to cisplatin and poly (ADP-Ribose) polymerase inhibition. PLoS One. 7 (12), e51563(2012).
- Unfried, J. P., et al. Long noncoding RNA NIHCOLE promotes ligation efficiency of DNA double-strand breaks in hepatocellular carcinoma. Cancer Res. 81 (19), 4910-4925 (2021).
- Cavallo, F., Caggiano, C., Jasin, M., Barchi, M. Testicular Germ Cell Tumors: Methods and Protocols. Bagrodia, A., Amatruda, J. F. , Springer US. New York, NY. 113-123 (2021).
- Green, M. R., Sambrook, J. The Hanahan method for preparation and transformation of competent Escherichia coli: high-efficiency transformation. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (3), 101188(2018).
- Stark, J. M., Pierce, A. J., Oh, J., Pastink, A., Jasin, M. Genetic steps of mammalian homologous repair with distinct mutagenic consequences. Mol Cell Biol. 24 (21), 9305-9316 (2004).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
