Здесь мы представляем протокол фибриноген-полиакриламидного гель-электрофореза (PAGE) для быстрого разделения и отображения фибриногенолитических агентов Sipunculus nudus.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Быстрое разделение и отображение активных фибриногенолитических агентов в Sipunculus nudus с помощью электрофореза в фибриноген-полиакриламидном геле
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Фибриногенолитические агенты, которые могут растворять фибриноген напрямую, широко используются в антикоагулянтной терапии. Как правило, идентификация новых фибриногенолитических агентов требует сначала разделения каждого компонента, а затем проверки их фибриногенолитической активности. В настоящее время на стадии разделения в основном используются электрофорез в полиакриламидном геле (PAGE) и хроматография. Между тем, анализ фибриногенных пластин и продукты реакции на основе PAGE обычно используются для демонстрации их фибриногенолитической активности. Однако из-за пространственно-временного разделения этих двух стадий невозможно разделить и отобразить активные фибриногенлитические агенты с одним и тем же гелем. Чтобы упростить процессы разделения и отображения идентификации фибриногенолитических агентов, мы разработали новый метод fibrinogen-PAGE для быстрого разделения и отображения фибриногенолитических агентов арахисовых червей (Sipunculus nudus) в этом исследовании. Этот метод включает в себя получение фибриногена-PAGE, электрофорез, ренатурацию, инкубацию, окрашивание и обесцвечивание. Фибриногенолитическая активность и молекулярная масса белка могут быть обнаружены одновременно. С помощью этого метода мы успешно обнаружили более одного активного фибриногенолитического агента гомогената арахисового червя в течение 6 ч. Кроме того, этот метод fibrinogen-PAGE экономит время и деньги. Кроме того, этот метод может быть использован для изучения фибриногенлитических агентов других организмов.
Введение
В последние годы, в связи с продолжающимся ростом тромботических заболеваний, тромботические заболевания стали новойсерьезной глобальной проблемой здравоохранения1. В настоящее время антитромботические препараты классифицируются на три группы: антитромбоцитарные агрегирующие препараты, антикоагулянты и тромболитические препараты. Среди них тромболитические препараты, такие как урокиназа (Великобритания), тканевый активатор плазминогена (tPA) и др., являются единственными клинически применяемыми препаратами, способными гидролизовать тромб2. Между тем, разрабатываются более безопасные и эффективные тромболитические препараты путем идентификации новых тромболитических агентов3.
Тем не менее, идентификация новых тромболитических агентов является трудоемкой и трудоемкой процессией, которая в основном включает в себя этапы разделения/очистки и характеристики/проверки. Первый заключается в разделении каждого компонента, а второй в проявлении их фибрино(гено)литической активности 4,5. В предыдущих исследованиях, несмотря на то, что мы успешно выделили новый фибрино(гено)литический фермент (sFE) из арахисового червя (Sipunculus nudus) с помощью аффинной хроматографии и анализа фибрина (огена) 6,7,8, эти процессы являются очень трудоемкими и трудоемкими. Во-первых, необходимо определить, обладают ли гомогенаты арахисового червя фибрино(гено)литической активностью методом фибриновой пластины и продуктами реакции на основе стр.9. Затем необходимо провести серию хроматографий, таких как ионообменная хроматография, гель-фильтрационная хроматография, аффинная хроматография и другие методы для разделения и очистки10,11. Затем снова проводится анализ фибриновой пластины для проверки фибриногенолитической активности каждого выделенного компонента. Наконец, для определения молекулярной массы активных фибриногенолитическихагентов проводят native-PAGE и додецилсульфат натрия (SDS)-PAGE. Поэтому крайне важно быстро отделять и выводить активные фибриногенолитические агенты.
Для быстрого разделения и отображения активных фибриногенолитических агентов в гомогенатах арахисового червя был разработан новый метод фибриноген-ПЕЙДЖ, сочетающий методы ПЕЙДЖ и фибриногенной пластины, т.е. субстраты фибриногенолитических агентов фибриногена были добавлены в нативный гель ПЕЙДЖ. После native-PAGE компоненты были разделены по их молекулярной массе. Между тем, каждый активный фибриногенолитический компонент может быть отображен путем окрашивания. С помощью этого метода мы успешно обнаружили более одного активного фибриногенлитического агента гомогената арахисового червя в течение 6 ч. Кроме того, этот метод fibrinogen-PAGE экономит время и деньги. Кроме того, этот метод может быть использован для изучения фибриногенлитических агентов других организмов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Гомогенат арахисового червя
- Добавьте в гомогенизатор 50 г арахисовых червей и 150 мл физиологического раствора.
- Гомогенизация при 24000 об/мин в течение 60 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите 3 раза. - Центрифугируйте гомогенат при 9710 x g в течение 30 минут при 4 °C.
- Соберите надосадочную жидкость в виде гомогената арахисового червя для дальнейшего изучения.
2. Препарат геля Fibrinogen-PAGE
- Свесьте 0,01 г фибриногена в стеклянный стакан объемом 50 мл.
- Добавьте в стакан 1,9 мл DDH2O, 1,3 мл Tris-HCl (1,5 M, pH 8,8) и 0,05 мл SDS (10%, w/v); Хорошо перемешайте с помощью пипетки.
- Поместите стакан при температуре 37 °C на 30 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг предназначен для растворения фибриногена. - Добавить 1,7 мл акриламида (30%, по массе), 0,05 мл персульфата аммония (APS; 10%, по массе), 0,002 мл TEMED; Хорошо перемешайте с помощью пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это разделительный гель. - Вылейте разделительный гель в 10-луночную форму для геля.
- Добавьте 2 мл DDH2O в форму для геля; Ждем 30 мин.
- Тщательно удалите воду, перевернув форму вверх дном.
- Добавьте в стакан 1,4 мл DDH2O, 0,25 мл Tris-HCl (1,0 М, pH 6,8), 0,02 мл SDS (10%, w/v), 0,33 мл акриламида (30%, w/v), 0,02 мл APS (10%, w/v), 0,002 мл тетраметилэтилендамина (TEMED); Хорошо перемешайте с помощью пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это загружающий гель. - Вылейте загружаемый гель в ту же форму для геля, что и шаг 2.5; Вставьте расческу сразу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используемый здесь гель fibrinogen-PAGE состоял из фибриногена (0,2%), содержащего разделительный гель и загружающий гель. Концентрацию фибриногена можно регулировать по мере необходимости.
3. Электрофорез
- Поместите приготовленный гель fibrinogen-PAGE вместе с клеевой формой в емкость для электрофореза; налить в бак 1300 мл раствора электрофореза (1,963 г Tris, 12,22 г глицина, 0,65 г SDS и 1300 мл DDH2O); Выньте расческу.
- Добавьте 5 мкл 5-кратного неденатурирующего загрузочного буфера к 20 мкл sFE и 20 мкл гомогената арахисового червя; хорошо перемешать с помощью пипетирования; Загрузите их в приготовленный гель фибриноген-ПЕЙДЖ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не кипятите смесь. sFE является фибрино(гено)литическим ферментом, идентифицированным ранее 6,7,8 и используемым в качестве положительного контроля в данном исследовании. Гомогенат арахисового червя является образцом, который необходимо обнаружить. Неденатурирующий загрузочный буфер без бромфенолового синего, β-меркаптоэтанола и SDS по сравнению с загрузочным буфером SDS-PAGE. Каждая полоса образца разделена с помощью загрузочного буфера SDS-PAGE 1x для четкого обнаружения движения белка. - Проведите электрофорез при напряжении 80 В в течение 30 мин или 120 В в течение 20 мин.
- Удалите гель fibrinogen-PAGE из клеевой формы.
4. Ренатурация
- Переложите гель fibrinogen-PAGE в пластиковую коробку.
- Добавьте в коробку 100 мл Tris-HCl (0,05 М, pH 7,4) и 2 мл Triton X-100. Поместите его на шейкер при 60-70 оборотах в минуту на 10 минут.
- Снимите буфер для промывки с помощью пипетирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите три раза.
5. Инкубация
- Добавьте в пластиковую коробку 50 мл Tris-HCl (0,05 М, pH 7,4).
- Выдерживать при 37 °C в течение 4 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации может быть скорректировано в зависимости от силы фибриногенолитической активности.
6. Окрашивание
- Удалите инкубационный буфер с помощью пипетирования.
- Добавьте в коробку 50 мл раствора Coomassie Brillant Blue Staining и поставьте коробку на шейкер при 60-70 об/мин на 30 минут.
7. Обесцвечивание
- Удалите окрашивающий раствор с помощью пипетирования.
- Добавьте в коробку 50 мл DDH2O.
- Поместите коробку на шейкер при 60-70 об/мин на 30 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве раствора для задержания здесь использовался DDH 2O. Время встряхивания может быть скорректировано в зависимости от силы фибриногенолитической активности.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
После электрофореза все полосы маркера были четко отображены. На 1x полосах загрузки SDS-PAGE была только полоса 10 кДа (бромфенольный синий). В образцах sFE и арахисового червя не было обнаружено каких-либо наблюдаемых полос (Рисунок 1). Несмотря на то, что полосы образцов не видны, эффективность маркера и бромфенольного синего указывала на то, что электрофорез прошел успешно, и образцы были разделены в соответствии с их молекулярной массой.
Хотя весь гель стал с...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
sFE - это новый фибрино(гено)литический фермент, выделенный из арахисовых червей нашей командой ранее 3,6,8,13. Тем не менее, процессы идентификации sFE были трудоемкими и трудоемкими, включая определение фибриногенолитической активности, разделение белковых компонентов и этапы подтверждения активности. В качестве простого метода анализ фибриногенной пластины в...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Благодарности
Это исследование финансировалось Научно-техническим бюро города Сямынь (No 3502Z20227197), Бюро науки и технологий провинции Фуцзянь (No 2019J01070; No 2022J01311) и проект «Инновации и предпринимательство высокого уровня» Плана науки и техники Цюаньчжоу (No 2022C015R). Мы благодарим Фуцай Вана (Университет Хуацяо) и Лэй Туна (Университет Хуацяо) за их техническую помощь.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl (pH 6,8) | Solarbio | T1020 | |
| 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) | Solarbio | T1010 | |
| 30% акриламид/бис-акриламид | Biosharp | BL513B | |
| Персульфат аммония | XiLONG SCIENTIFIC | 7727-54-0 | |
| Стакан | PYREX | 2-9425-02 | |
| Центрифуга для пробирки (1,5 мл) | Biosharp | BS-15-M | |
| Инкубатор с постоянной температурой | JINGHONG | JHS-400 | |
| Coomas Brillant Blue Stainning Solution | Beyotime | P0017F | |
| Электронные аналитические весы | DENVER | TP-213 | |
| Fibrinogen | Solarbio | F8051 | |
| Гелевые наконечники для пипеток, Bulk | Biosharp | BS-200-GTB | |
| Гомогенизатор | AHS | ATS-1500 | |
| Осциллятор горизонтального вращения | NuoMi | NMSP-600 | |
| Milli-Q Референсный | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | BIO-RAD | 165-8000~165-8007 | |
| N,N,N',N'-Тетраметилэтилендиамин | Sigma | T9281 | |
| Наконечник для пипетки (1 мл) | Наконечник для дозатора Axygene | T-1000XT-C | |
| (10 & микро; L) | Axygene | T-10XT-C | |
| Наконечник для пипетки (200 &; L) | Пипеттор Axygene | T-200XT-C | |
| (1 мл) | Пипеттор Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| (10&микро; L) | Thermo Fisher Scientific | ZX98775 | |
| Pipettor (200 &микро; L) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| Pipettor (50 & микро; L) | Thermo Fisher Scientific | ZY15331 | |
| Охлаждаемая центрифуга | H1650R | ||
| Додецилсульфат натрия | Sigma-Aldrich | V900859 | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| Tris-HCl | Solarbio | T8230 | |
| Triton X-100 | Solarbio | T8200 |
Ссылки
- Bikdeli, B., et al. COVID-19 and thrombotic or thromboembolic disease: Implications for prevention, antithrombotic therapy, and follow-up. J Am Coll Cardiol. 75 (23), 2950-2973 (2020).
- Tsivgoulis, G., et al. Thrombolysis for acute ischaemic stroke: current status and future perspectives. Lancet Neurol. 22 (5), 418-429 (2023).
- Tang, M., Hu, C., Lin, H., Yan, H. Fibrinolytic drugs induced hemorrhage: mechanisms and solutions. Blood Coagul Fibrinolysis. 34 (5), 263-271 (2023).
- Lu, M., et al. Purification, characterization, and chemical modification of Bacillus velezensis SN-14 fibrinolytic enzyme. Int J Biol Macromol. 177, 601-609 (2021).
- Abu-Tahon, M. A., Abdel-Majeed, A. M., Ghareib, M., Housseiny, M. M., Abdallah, W. E. Thrombolytic and anticoagulant efficiencies of purified fibrinolytic enzyme produced from Cochliobolus hawaiiensis under solid-state fermentation. Biotechnol Appl Biochem. 70 (6), 1954-1971 (2023).
- Lin, W., Lin, H., Xin, P., Yan, H., Kang, B., Tang, M. A Comprehensive approach to analyze the cell components of cerebral blood clots. J Vis Exp. (197), e65791(2023).
- Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus. J Vis Exp. (196), e65631(2023).
- Tang, M., Lin, H., Huang, Y., Xu, R., Cui, X., Yan, H. Plasmin affinity purification method based on agarose gel and plasmin and application thereof. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN116103270A/en?oq=CN202310108470 (2023).
- Walton, P. L. An improved fibrin plate method for the assay of plasminogen activators. Clinica Chimica Acta. 13 (5), 680-684 (1966).
- Ngere, J. B., Ebrahimi, K. H., Williams, R., Pires, E., Walsby-Tickle, J., McCullagh, J. S. O. Ion-exchange chromatography coupled to mass spectrometry in life science, environmental, and medical research. Anal Chem. 95 (1), 152-166 (2023).
- Kato, S., Takeuchi, K., Iwaki, M., Miyazaki, K., Honda, K., Hayashi, T. Chitin- and streptavidin-mediated affinity purification systems: A screening platform for enzyme discovery. Angew Chem Int Ed Engl. 62 (31), e202303764(2023).
- Sharma, N., Sharma, R., Rajput, Y. S., Mann, B., Singh, R., Gandhi, K. Separation methods for milk proteins on polyacrylamide gel electrophoresis: Critical analysis and options for better resolution. International Dairy Journal. 114, 104920(2021).
- Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
