Методическая статья

Быстрое разделение и отображение активных фибриногенолитических агентов в Sipunculus nudus с помощью электрофореза в фибриноген-полиакриламидном геле

DOI:

10.3791/66536

⸱

19 апреля 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University, 2Medicine School, Huaqiao University, 3Department of Laboratory Medicine, Hospital of Huaqiao University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол фибриноген-полиакриламидного гель-электрофореза (PAGE) для быстрого разделения и отображения фибриногенолитических агентов Sipunculus nudus.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фибриногенолитические агенты, которые могут растворять фибриноген напрямую, широко используются в антикоагулянтной терапии. Как правило, идентификация новых фибриногенолитических агентов требует сначала разделения каждого компонента, а затем проверки их фибриногенолитической активности. В настоящее время на стадии разделения в основном используются электрофорез в полиакриламидном геле (PAGE) и хроматография. Между тем, анализ фибриногенных пластин и продукты реакции на основе PAGE обычно используются для демонстрации их фибриногенолитической активности. Однако из-за пространственно-временного разделения этих двух стадий невозможно разделить и отобразить активные фибриногенлитические агенты с одним и тем же гелем. Чтобы упростить процессы разделения и отображения идентификации фибриногенолитических агентов, мы разработали новый метод fibrinogen-PAGE для быстрого разделения и отображения фибриногенолитических агентов арахисовых червей (Sipunculus nudus) в этом исследовании. Этот метод включает в себя получение фибриногена-PAGE, электрофорез, ренатурацию, инкубацию, окрашивание и обесцвечивание. Фибриногенолитическая активность и молекулярная масса белка могут быть обнаружены одновременно. С помощью этого метода мы успешно обнаружили более одного активного фибриногенолитического агента гомогената арахисового червя в течение 6 ч. Кроме того, этот метод fibrinogen-PAGE экономит время и деньги. Кроме того, этот метод может быть использован для изучения фибриногенлитических агентов других организмов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В последние годы, в связи с продолжающимся ростом тромботических заболеваний, тромботические заболевания стали новойсерьезной глобальной проблемой здравоохранения1. В настоящее время антитромботические препараты классифицируются на три группы: антитромбоцитарные агрегирующие препараты, антикоагулянты и тромболитические препараты. Среди них тромболитические препараты, такие как урокиназа (Великобритания), тканевый активатор плазминогена (tPA) и др., являются единственными клинически применяемыми препаратами, способными гидролизовать тромб2. Между тем, разрабатываются более безопасные и эффективные тромболитические препараты путем идентификации новых тромболитических агентов3.

Тем не менее, идентификация новых тромболитических агентов является трудоемкой и трудоемкой процессией, которая в основном включает в себя этапы разделения/очистки и характеристики/проверки. Первый заключается в разделении каждого компонента, а второй в проявлении их фибрино(гено)литической активности 4,5. В предыдущих исследованиях, несмотря на то, что мы успешно выделили новый фибрино(гено)литический фермент (sFE) из арахисового червя (Sipunculus nudus) с помощью аффинной хроматографии и анализа фибрина (огена) 6,7,8, эти процессы являются очень трудоемкими и трудоемкими. Во-первых, необходимо определить, обладают ли гомогенаты арахисового червя фибрино(гено)литической активностью методом фибриновой пластины и продуктами реакции на основе стр.9. Затем необходимо провести серию хроматографий, таких как ионообменная хроматография, гель-фильтрационная хроматография, аффинная хроматография и другие методы для разделения и очистки10,11. Затем снова проводится анализ фибриновой пластины для проверки фибриногенолитической активности каждого выделенного компонента. Наконец, для определения молекулярной массы активных фибриногенолитическихагентов проводят native-PAGE и додецилсульфат натрия (SDS)-PAGE. Поэтому крайне важно быстро отделять и выводить активные фибриногенолитические агенты.

Для быстрого разделения и отображения активных фибриногенолитических агентов в гомогенатах арахисового червя был разработан новый метод фибриноген-ПЕЙДЖ, сочетающий методы ПЕЙДЖ и фибриногенной пластины, т.е. субстраты фибриногенолитических агентов фибриногена были добавлены в нативный гель ПЕЙДЖ. После native-PAGE компоненты были разделены по их молекулярной массе. Между тем, каждый активный фибриногенолитический компонент может быть отображен путем окрашивания. С помощью этого метода мы успешно обнаружили более одного активного фибриногенлитического агента гомогената арахисового червя в течение 6 ч. Кроме того, этот метод fibrinogen-PAGE экономит время и деньги. Кроме того, этот метод может быть использован для изучения фибриногенлитических агентов других организмов.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Гомогенат арахисового червя

  1. Добавьте в гомогенизатор 50 г арахисовых червей и 150 мл физиологического раствора.
  2. Гомогенизация при 24000 об/мин в течение 60 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите 3 раза.
  3. Центрифугируйте гомогенат при 9710 x g в течение 30 минут при 4 °C.
  4. Соберите надосадочную жидкость в виде гомогената арахисового червя для дальнейшего изучения.

2. Препарат геля Fibrinogen-PAGE

  1. Свесьте 0,01 г фибриногена в стеклянный стакан объемом 50 мл.
  2. Добавьте в стакан 1,9 мл DDH2O, 1,3 мл Tris-HCl (1,5 M, pH 8,8) и 0,05 мл SDS (10%, w/v); Хорошо перемешайте с помощью пипетки.
  3. Поместите стакан при температуре 37 °C на 30 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг предназначен для растворения фибриногена.
  4. Добавить 1,7 мл акриламида (30%, по массе), 0,05 мл персульфата аммония (APS; 10%, по массе), 0,002 мл TEMED; Хорошо перемешайте с помощью пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это разделительный гель.
  5. Вылейте разделительный гель в 10-луночную форму для геля.
  6. Добавьте 2 мл DDH2O в форму для геля; Ждем 30 мин.
  7. Тщательно удалите воду, перевернув форму вверх дном.
  8. Добавьте в стакан 1,4 мл DDH2O, 0,25 мл Tris-HCl (1,0 М, pH 6,8), 0,02 мл SDS (10%, w/v), 0,33 мл акриламида (30%, w/v), 0,02 мл APS (10%, w/v), 0,002 мл тетраметилэтилендамина (TEMED); Хорошо перемешайте с помощью пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это загружающий гель.
  9. Вылейте загружаемый гель в ту же форму для геля, что и шаг 2.5; Вставьте расческу сразу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используемый здесь гель fibrinogen-PAGE состоял из фибриногена (0,2%), содержащего разделительный гель и загружающий гель. Концентрацию фибриногена можно регулировать по мере необходимости.

3. Электрофорез

  1. Поместите приготовленный гель fibrinogen-PAGE вместе с клеевой формой в емкость для электрофореза; налить в бак 1300 мл раствора электрофореза (1,963 г Tris, 12,22 г глицина, 0,65 г SDS и 1300 мл DDH2O); Выньте расческу.
  2. Добавьте 5 мкл 5-кратного неденатурирующего загрузочного буфера к 20 мкл sFE и 20 мкл гомогената арахисового червя; хорошо перемешать с помощью пипетирования; Загрузите их в приготовленный гель фибриноген-ПЕЙДЖ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не кипятите смесь. sFE является фибрино(гено)литическим ферментом, идентифицированным ранее 6,7,8 и используемым в качестве положительного контроля в данном исследовании. Гомогенат арахисового червя является образцом, который необходимо обнаружить. Неденатурирующий загрузочный буфер без бромфенолового синего, β-меркаптоэтанола и SDS по сравнению с загрузочным буфером SDS-PAGE. Каждая полоса образца разделена с помощью загрузочного буфера SDS-PAGE 1x для четкого обнаружения движения белка.
  3. Проведите электрофорез при напряжении 80 В в течение 30 мин или 120 В в течение 20 мин.
  4. Удалите гель fibrinogen-PAGE из клеевой формы.

4. Ренатурация

  1. Переложите гель fibrinogen-PAGE в пластиковую коробку.
  2. Добавьте в коробку 100 мл Tris-HCl (0,05 М, pH 7,4) и 2 мл Triton X-100. Поместите его на шейкер при 60-70 оборотах в минуту на 10 минут.
  3. Снимите буфер для промывки с помощью пипетирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите три раза.

5. Инкубация

  1. Добавьте в пластиковую коробку 50 мл Tris-HCl (0,05 М, pH 7,4).
  2. Выдерживать при 37 °C в течение 4 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации может быть скорректировано в зависимости от силы фибриногенолитической активности.

6. Окрашивание

  1. Удалите инкубационный буфер с помощью пипетирования.
  2. Добавьте в коробку 50 мл раствора Coomassie Brillant Blue Staining и поставьте коробку на шейкер при 60-70 об/мин на 30 минут.

7. Обесцвечивание

  1. Удалите окрашивающий раствор с помощью пипетирования.
  2. Добавьте в коробку 50 мл DDH2O.
  3. Поместите коробку на шейкер при 60-70 об/мин на 30 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве раствора для задержания здесь использовался DDH 2O. Время встряхивания может быть скорректировано в зависимости от силы фибриногенолитической активности.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После электрофореза все полосы маркера были четко отображены. На 1x полосах загрузки SDS-PAGE была только полоса 10 кДа (бромфенольный синий). В образцах sFE и арахисового червя не было обнаружено каких-либо наблюдаемых полос (Рисунок 1). Несмотря на то, что полосы образцов не видны, эффективность маркера и бромфенольного синего указывала на то, что электрофорез прошел успешно, и образцы были разделены в соответствии с их молекулярной массой.

Хотя весь гель стал синим из-за окрашивания, обесцвечивание сделало область, где фибриноген разлагался фибринолитическими агентами, прозрачной. По сравнению с маркером, sFE показал активную фибриногенолитическую полосу около 25 кДа. Гомогенат арахисового червя показал 25 кДа, 33 кДа, 43 кДа и ряд полос более 70 кДа (рис. 2). Результаты показали, что sFE содержал только фибриногенолитический компонент с массой 25 кДа, но гомогенат арахисового червя содержал компоненты sFE и другие фибриногенолитические агенты. На дополнительном рисунке 1 показан пример изображения геля, на котором маркер окрашен в темно-синий цвет, а целевые образцы — в виде ярких полос.

figure-results-1
Рисунок 1: Гель после электрофореза. М: Маркер; Полоса 1: 1x буфер загрузки SDS-PAGE; Полоса 2: sFE; Полоса 3: 1x буфер загрузки SDS-PAGE; Дорожка 4: гомогенат арахисовых червей; Полоса 5: 1x буфер загрузки SDS-PAGE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Гель после обесцвечивания. М: Маркер; Полоса 1: 1x буфер загрузки SDS-PAGE; Полоса 2: sFE; Полоса 3: 1x буфер загрузки SDS-PAGE; Дорожка 4: гомогенат арахисовых червей; Полоса 5: 1x буфер загрузки SDS-PAGE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный рисунок 1: Изображение геля, показывающее маркер темно-синим цветом и целевые образцы в виде ярких полос. М: Маркер; Полоса 1: 1x буфер загрузки SDS-PAGE; Полоса 2: sFE; Полоса 3: 1x буфер загрузки SDS-PAGE; Дорожка 4: гомогенат арахисовых червей; Полоса 5: 1x буфер загрузки SDS-PAGE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

sFE - это новый фибрино(гено)литический фермент, выделенный из арахисовых червей нашей командой ранее 3,6,8,13. Тем не менее, процессы идентификации sFE были трудоемкими и трудоемкими, включая определение фибриногенолитической активности, разделение белковых компонентов и этапы подтверждения активности. В качестве простого метода анализ фибриногенной пластины в основном используется на этапе предварительного скрининга для проверки фибриногенолитической активности образцов. Тем не менее, метод анализа фибриногенной пластины не может определить, какой компонент активен. Таким образом, для разделения их компонентов после обнаружения активности необходимо использовать хроматографию и native/SDS-PAGE. Затем продукты реакции снова разрешаются SDS-PAGE для подтверждения деградации субстрата фибриногена. В данной работе субстрат фибриноген был добавлен в гель PAGE для детектирования фибриногенлитического агента. После электрофореза, ренатурации, инкубации, окрашивания и обесцвечивания молекулярная масса и фибриногенолитическая активность активных фибриногенолитических агентов были четко отображены при использовании одного и того же геля. С помощью этого метода мы успешно обнаружили более одного активного фибриногенлитического агента из гомогената арахисового червя в течение 6 ч.

Для достижения оптимальных результатов следует уделять больше внимания приготовлению геля фибриноген-ПЕЙДЖ, ренатурации и инкубации. Вообще говоря, чем ниже концентрация фибриногена, тем более бесцветной является фибриногенолитическая зона, что свидетельствует о фибриногенолитической активности агентов. Однако, чем ниже концентрация фибриногена, тем более бесцветным является фон, и тем сложнее отличить фибриногенолитическую зону от фона. Время ренатурации существенно влияет на фибриногенолитическую активность компонентов. Если это время будет слишком коротким, чтобы смыть SDS в геле PAGE, фибриногенолитическая активность компонентов будет подавляться остаточным SDS. Точно так же, если время инкубации слишком короткое, фибриногенолитическая реакция не является тщательной. Пока время инкубации слишком велико, маркер, используемый для обозначения молекулярной массы, будет смываться. В этом исследовании, несмотря на то, что эти условия были оптимизированы, они были установлены таким образом, чтобы отделить и вывести фибриногенлитические агенты из арахисовых червей. Таким образом, персонализированные условия этих критических этапов должны быть заданы в соответствии с конкретными фибриногенолитическими агентами.

Важно отметить, что этот fibrinogen-PAGE подходит только для скрининга фибриногенолитических агентов с фибриногенолитической активностью, но не для агентов с фибриногенной литической активностью или активацией плазминогена. Если мы хотим отобразить эти активности, метод можно оптимизировать, заменив фибриноген на фибрин или плазминоген. Еще один момент, который стоит отметить, заключается в том, что активные фибриногенолитические агенты, протестированные в этом исследовании, были мономерами, которые не были затронуты в условиях электрофореза SDS. Поэтому, если тестируемые агенты являются полимерами, этот метод должен быть скорректирован до состояния нативного PAGE, которое не может отображать молекулярную массу. Таким образом, представленный здесь метод fibrinogen-PAGE был только общей базовой версией, которая может быть оптимизирована для быстрого скрининга других фибриногенолитических агентов.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование финансировалось Научно-техническим бюро города Сямынь (No 3502Z20227197), Бюро науки и технологий провинции Фуцзянь (No 2019J01070; No 2022J01311) и проект «Инновации и предпринимательство высокого уровня» Плана науки и техники Цюаньчжоу (No 2022C015R). Мы благодарим Фуцай Вана (Университет Хуацяо) и Лэй Туна (Университет Хуацяо) за их техническую помощь.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1  M Tris-HCl (pH 6,8)SolarbioT1020
1,5 M Tris-HCl (pH 8,8)SolarbioT1010
30% акриламид/бис-акриламидBiosharpBL513B
Персульфат аммонияXiLONG SCIENTIFIC7727-54-0
СтаканPYREX2-9425-02
Центрифуга для пробирки (1,5 мл)BiosharpBS-15-M
Инкубатор с постоянной температуройJINGHONGJHS-400
Coomas Brillant Blue Stainning SolutionBeyotimeP0017F
Электронные аналитические весыDENVERTP-213
FibrinogenSolarbioF8051
Гелевые наконечники для пипеток, BulkBiosharpBS-200-GTB
ГомогенизаторAHSATS-1500
Осциллятор горизонтального вращенияNuoMiNMSP-600
Milli-Q РеференсныйMilliporeZ00QSV0CN
Mini-PROTEAN Tetra CellBIO-RAD165-8000~165-8007
N,N,N',N'-ТетраметилэтилендиаминSigmaT9281
Наконечник для пипетки (1 мл)Наконечник для дозатора AxygeneT-1000XT-C
(10 & микро; L)AxygeneT-10XT-C
Наконечник для пипетки (200 &; L)Пипеттор AxygeneT-200XT-C
(1 мл)Пипеттор Thermo Fisher ScientificZY18723
(10&микро; L)Thermo Fisher ScientificZX98775
Pipettor (200 &микро; L)Thermo Fisher ScientificZY20280
Pipettor (50 & микро; L)Thermo Fisher ScientificZY15331
Охлаждаемая центрифугаH1650R
Додецилсульфат натрияSigma-AldrichV900859
TrisSolarbioT8060
Tris-HClSolarbioT8230
Triton X-100SolarbioT8200

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bikdeli, B., et al. COVID-19 and thrombotic or thromboembolic disease: Implications for prevention, antithrombotic therapy, and follow-up. J Am Coll Cardiol. 75 (23), 2950-2973 (2020).
  2. Tsivgoulis, G., et al. Thrombolysis for acute ischaemic stroke: current status and future perspectives. Lancet Neurol. 22 (5), 418-429 (2023).
  3. Tang, M., Hu, C., Lin, H., Yan, H. Fibrinolytic drugs induced hemorrhage: mechanisms and solutions. Blood Coagul Fibrinolysis. 34 (5), 263-271 (2023).
  4. Lu, M., et al. Purification, characterization, and chemical modification of Bacillus velezensis SN-14 fibrinolytic enzyme. Int J Biol Macromol. 177, 601-609 (2021).
  5. Abu-Tahon, M. A., Abdel-Majeed, A. M., Ghareib, M., Housseiny, M. M., Abdallah, W. E. Thrombolytic and anticoagulant efficiencies of purified fibrinolytic enzyme produced from Cochliobolus hawaiiensis under solid-state fermentation. Biotechnol Appl Biochem. 70 (6), 1954-1971 (2023).
  6. Lin, W., Lin, H., Xin, P., Yan, H., Kang, B., Tang, M. A Comprehensive approach to analyze the cell components of cerebral blood clots. J Vis Exp. (197), e65791(2023).
  7. Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus. J Vis Exp. (196), e65631(2023).
  8. Tang, M., Lin, H., Huang, Y., Xu, R., Cui, X., Yan, H. Plasmin affinity purification method based on agarose gel and plasmin and application thereof. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN116103270A/en?oq=CN202310108470 (2023).
  9. Walton, P. L. An improved fibrin plate method for the assay of plasminogen activators. Clinica Chimica Acta. 13 (5), 680-684 (1966).
  10. Ngere, J. B., Ebrahimi, K. H., Williams, R., Pires, E., Walsby-Tickle, J., McCullagh, J. S. O. Ion-exchange chromatography coupled to mass spectrometry in life science, environmental, and medical research. Anal Chem. 95 (1), 152-166 (2023).
  11. Kato, S., Takeuchi, K., Iwaki, M., Miyazaki, K., Honda, K., Hayashi, T. Chitin- and streptavidin-mediated affinity purification systems: A screening platform for enzyme discovery. Angew Chem Int Ed Engl. 62 (31), e202303764(2023).
  12. Sharma, N., Sharma, R., Rajput, Y. S., Mann, B., Singh, R., Gandhi, K. Separation methods for milk proteins on polyacrylamide gel electrophoresis: Critical analysis and options for better resolution. International Dairy Journal. 114, 104920(2021).
  13. Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи