Методическая статья

Идентификация биомаркеров гендерной специфичности болезни Альцгеймера на основе профилей глиального транскриптома

2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66552

⸱

20 мая 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Chengdu Shuangliu Hospital of Traditional Chinese Medicine, 3Department of Automation, Tsinghua University, 4Affiliated Reproductive & Women-Children Hospital, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5Department of Neurology, Dalian Municipal Central Hospital, Central Hospital of Dalian University of Technology

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании были проанализированы одноядерные транскриптомы тридцати трех человек с болезнью Альцгеймера (БА), в результате чего были выявлены специфичные для пола ДЭГ в глиальных клетках. Анализ функционального обогащения выявил синаптические, нервные и гормональные пути. Были идентифицированы ключевые гены, а именно NLGN4Y и его регуляторы, а также предложены потенциальные терапевтические кандидаты для гендерно-специфичной БА.

Аннотация

При болезни Альцгеймера (БА) в последнее время было выявлено множество биомаркеров, специфичных для пола; Тем не менее, о глиальных клетках головного мозга сообщалось редко. В этом исследовании было проанализировано 220 095 одноядерных транскриптомов из лобной коры тридцати трех человек с болезнью Альцгеймера в базе данных GEO. Специфичные для пола дифференциально экспрессируемые гены (DEG) были идентифицированы в глиальных клетках, в том числе 243 в астроцитах, 1154 в микроглии и 572 в олигодендроцитах. Анализ функциональных аннотаций Gene Ontology (GO) и анализ обогащения путей Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) выявили функциональную концентрацию в синаптических, нервных и гормональных путях. Сеть белок-белковых взаимодействий (PPI) идентифицировала MT3, CALM2, DLG2, KCND2, PAKACB, CAMK2D и NLGN4Y в астроцитах, TREM2, FOS, APOE, APP и NLGN4Y в микроглии, а также GRIN2A, ITPR2, GNAS и NLGN4Y в олигодендроцитах в качестве ключевых генов. NLGN4Y был единственным общим геном для трех глий и был идентифицирован как биомаркер гендерной специфичности AD. Корегуляторная сеть ген-фактор транскрипции (TF)-miRNA идентифицировала ключевые регуляторы NLGN4Y и его целевых ТКМ. Были идентифицированы Ecklonia kurome Okam (Kunbu) и Herba Ephedrae (Mahuang), а также было показано влияние активных ингредиентов на AD. Наконец, обогащенный анализ Кунбу и Махуанга показал, что они могут выступать в качестве терапевтических кандидатов на предмет гендерной специфичности болезни Альцгеймера.

Введение

Болезнь Альцгеймера (БА) — это глобальное заболевание с высокой заболеваемостью, на долю которого приходится 60%-80% деменции1. Несмотря на высокую распространенность, механистический патогенез БА четко не очерчен, и до настоящего времени не существовало эффективных методов лечения2. Основными патологиями при БА были выявлены атрофия нейронов и накопление патологического мусора, в основном ассоциированного с микротрубочками белка Tau и β-амилоида (Aβ)3,4. Патогенез БА связан с аномальной аутофагией, окислительным стрессом, митохондриальной дисфункцией, воспалением и нарушением энергетического обмена5. Обследования распространенности показали, что две трети пациентов с болезнью Альцгеймера составляли женщины6. Половые различия при БА существуют в этиологии, клинических проявлениях, профилактике и лечении. Таким образом, выявление биологического механизма, вызывающего половые различия при болезни Альцгеймера, и нацеливание на традиционную китайскую медицину (ТКМ) потенциально может обеспечить более всестороннюю теоретическую основу для понимания патогенеза болезни Альцгеймера и дальнейшего руководства точной стратегией лечения.

Нейроглиальные клетки, особенно микроглии, астроциты и олигодендроциты, потенциально вносят свой вклад в патогенез БА. При БА микроглия активируется и генетически изменяется, что способствует воспалительной реакции, фагоцитозу и клиренсу Aβ 7,8; астроциты генетически изменены, что влияет на синаптическую активность, ионный гомеостаз, энергетический и липидный обмен9; Олигодендроциты генетически изменены с учетом половой специфичности, что способствует потере нейронов, нейрофибриллярным клубкам и поражениям белого вещества10,11.

В этом исследовании мы использовали секвенирование одноядерных РНК (snRNA-seq) в качестве превосходного метода. По сравнению с секвенированием РНК одиночных клеток (scRNA-seq), snRNA-seq имеет преимущества с точки зрения богатства образцов, целостности типа клеток и надежности данных12,13. SnRNA-seq широко используется в исследованиях, посвященных болезни Альцгеймера и изучающим роль глиальных клеток 14,15,16. Его широкое применение в этих областях исследований подчеркивает его эффективность в получении ценной информации о транскрипционных характеристиках глиальных клеток при болезни Альцгеймера. Используя преимущества snRNA-seq, исследователи смогли раскрыть важную информацию об участии глиальных клеток в патологии болезни Альцгеймера и определить потенциальные терапевтические мишени. Чтобы изучить специфичные для пола нейроглиальные транскрипционные характеристики при БА и потенциальные ТКМ для половой специфичности БА, в этом исследовании были проанализированы данные snRNA-seq из лобной коры пациентов с БА из общедоступной базы данных NCBI GEO. Специфичные для пола дифференциально экспрессируемые гены (DEGs), онтология генов (GO), Киотская энциклопедия генов и геномов (KEGG), сеть белок-белковых взаимодействий (PPI) и сеть ген-TF-miRNA дополнительно анализируются для выявления ключевых биомаркеров и потенциального патогенеза. Наконец, были предложены потенциальные ТКМ, а их активные ингредиенты были отображены в виде таблиц путем поиска в базах данных Coremine Medical, TCMIP и TCMSP.

Протокол

Шаги со 2 по 9 анализа были реализованы с использованием программного обеспечения R (см. Дополнительный рисунок 1 и Дополнительный файл 1), в то время как остальные шаги были выполнены на онлайн-платформах. Подробная информация о базах данных, используемых в этом протоколе (вместе с веб-ссылками), представлена в Таблице материалов.

1. Сбор данных

  1. Получите доступ к общедоступной базе данных Gene Expression Omnibus (GEO) в Национальном центре биотехнологической информации.
  2. Выполните поиск по данным GEO под названием болезнь Альцгеймера в поле поиска.
  3. Выберите Топ Организмов как Homo sapiens с правой стороны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты поиска представляли собой данные о болезни Альцгеймера у Homo sapiens.
  4. После фильтрации искомой информации загрузите файлы данных GSE167490 и GSE183068 , которые включают features.tsv, barcode.tsv и matrix.mtx для каждого отдельного образца ядра. Наборы данных включали 34 образца БА, происходящих из лобной коры, с равным распределением 17 мужских образцов и 17 женских образцов (дополнительная таблица 1).

2. Слияние образцов

  1. Настройте пути к данным и имена образцов на компьютере в соответствии с требованиями. Импортируйте 34 загруженных образца и присвойте им гендерные имена с помощью имен функций.
  2. Сгенерируйте объекты Seura для всех образцов в пакетном режиме с помощью функций list и Read10X, указав параметры как min.cells = 3 и min.features = 200.
  3. Используйте функцию RenameCells для добавления образцов идентификаторов в качестве префиксов к штрих-кодам ячеек, чтобы сохранить штрих-коды ячеек в процессе объединения. Это гарантировало, что каждая клетка сохранила свою уникальную идентичность и могла быть прослежена до исходного источника образца после объединения.

3. Контроль качества (QC)

  1. Используйте функцию PercentageFeatureSet для вычисления соотношений митохондриальных генов, эритроцитов и рибосом для каждой клетки.
  2. Сохраните эти вычисленные коэффициенты в метаданных с помощью оператора [[ ]], чтобы прикрепить эту информацию непосредственно к метаданным каждой ячейки.
  3. Используйте функцию subset для проведения фильтрации ячеек, указав следующие параметры : nFeature_RNA > 200, nFeature_RNA < 10000, nCount_RNA < 60000, percent.mt < 10, percent.rb < 5 и percent. HB < 75.
  4. Исключите GSM5106107 из анализа.

4. Проверка пакетных эффектов

  1. Выполнение обработки данных.
    1. Нормализуйте данные с помощью функции NormalizeData .
    2. Определите 2000 основных переменных объектов в наборе данных с помощью функции FindVariableFeatures .
    3. Проведите анализ главных компонент (PCA)17 на данных с помощью RunPCA, сохранив 50 главных компонент.
    4. Создайте график изгиба с помощью функции ElbowPlot, чтобы определить оптимальное количество размеров для последующего анализа. Рассмотрим первые 50 измерений.
    5. Масштабируйте данные с помощью ScaleData , чтобы обеспечить сопоставимый масштаб всех функций.
    6. Определите ближайших соседей с помощью функции FindNeighbors на основе 30 измерений.
    7. Примените алгоритм UMAP с помощью RunUMAP, чтобы уменьшить размерность данных до 30 измерений.
  2. Визуализируйте обработанные данные с помощью функции DimPlot с параметром reduce в umap и параметром group.by в orig.ident.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом шаге можно создать график, визуализирующий данные в уменьшенном пространстве UMAP, сгруппированные по исходным идентичностям ячеек. При изучении графиков UMAP стало очевидно, что существует наличие пакетного эффекта. Отчетливая кластеризация или разделение клеток на основе их партийного или экспериментального происхождения позволяет предположить, что экспериментальные партии повлияли на профили экспрессии генов.

5. Интеграция данных

  1. Нормализация и стандартизация данных с помощью функции SCTransform .
  2. Примените алгоритм гармонии18 для интегрирования оставшихся 33 одноядерных данных. Используйте анализ SCT для интегрирования и установите максимальное количество итераций гармонии равным 20.
  3. Используйте функцию FindClusters с параметром разрешения 0,07 для идентификации отдельных кластеров в данных.
  4. Используйте функцию RunUMAP с заданным числом измерений (dims = 30) для дальнейшего уменьшения размерности данных и визуализации кластеров в пространстве меньшей размерности.

6. Аннотация типа ячейки

  1. Соберите маркерные гены (Дополнительная таблица 2) клеток путем обширного обзора существующей литературы.
  2. После определения гетерогенности клеточного кластера классифицируйте тип каждой клетки кластера по специфически экспрессируемым маркерным генам.
  3. Представьте различные типы клеток с помощью UMAP визуализации с использованием пакета ggplot2, где олигодендроцит выделен цветовым кодом #DB7093, возбуждающий нейрон — #FF69B4, астроцит — #1874CD, микроглия — #63B8FF, клетка-предшественник олигодендроцитов — #DB7093, тормозной нейрон — #FFC0CB, эндотелиальная клетка — #FF69B4.
  4. Рассчитайте пропорции каждого типа клеток, стратифицированные по полу.

7. Извлечение данных глиальных клеток

  1. Извлекайте данные об астроцитах из интегрированных массивных данных с помощью функции подмножества.
  2. Извлекайте данные о микроглии из интегрированных массивных данных с помощью функции подмножества.
  3. Извлечение данных об олигодендроцитах из интегрированных объемных данных с помощью функции подмножества.

8. Захват глиальных специфичных для пола дифференциально экспрессируемых генов (DEGs)

  1. Идентификация специфичных для пола DEG астроцитов с помощью функции FindMarkers (ident.1 = male, ident.2 = female, group.by = group.sum, assay = RNA) с пороговыми значениями: p-value < 0,05 и |avg_log2FC| 30 >. Пометьте ДЭГ с повышенным регулированием как «Вверх», с пониженным регулированием ДЭГ как «Вниз», а остальные — как «Стабильные».
    1. Визуализируйте DEG с помощью функции ggplot , где ось x представляет разницу в процентах между двумя условиями (pct.1 - pct.2), а ось y - avg_log2FC. Гены с повышенной регуляцией были выделены с помощью цвета PaleVioletRed, гены с подавленной регуляцией — розовым, а стабильные гены — с помощью DodgerBlue3.
  2. Идентификация специфичных для пола ДЭГ микроглии с помощью функции FindMarkers (ident.1 = самец, ident.2 = самка, group.by = group.sum, assay = РНК) с пороговыми значениями: p-значение < 0,05 и |avg_log2FC| > 1. Пометьте ДЭГ с повышенным регулированием как «Вверх», с пониженным регулированием ДЭГ как «Вниз», а остальные — как «Стабильные».
    1. Визуализируйте DEG с помощью функции ggplot , где ось x представляет разницу в процентах между двумя условиями (pct.1 - pct.2), а ось y - avg_log2FC. Гены с повышенной регуляцией были выделены с помощью цвета OrangeRed, гены с подавленной регуляцией — с помощью LightSalmon, а стабильные гены — с помощью SteelBlue1.
  3. Идентификация специфичных для пола DEGs олигодендроцитов с помощью функции FindMarkers (ident.1 = самец, ident.2 = самка, group.by = group.sum, assay = RNA) с пороговыми значениями: p-значение < 0,05 и |avg_log2FC| > 10. Пометьте ДЭГ с повышенным регулированием как «Вверх», с пониженным регулированием ДЭГ как «Вниз», а остальные — как «Стабильные».
    1. Визуализируйте DEGs с помощью функции ggplot , где ось x представляет разницу в процентах между двумя условиями (pct.1 - pct.2), а ось y отображает avg_log2FC. Гены с повышенной регуляцией были выделены с помощью цвета DeepPink, гены с подавленной регуляцией — с помощью HotPink, а стабильные гены — с помощью DeepSkyBlue3.

9. Анализ функционального обогащения ДЭГ, специфичных для пола

  1. Выполните анализ обогащения онтологии генов (GO) на специфичных для пола DEGs для каждого типа глиальных клеток с помощью функции enrichGO . Установите следующие параметры: OrgDb = org. Hs.eg.db, keyType = SYMBOL, ont = ALL, pAdjustMethod = BH, pvalueCutoff = 0.01 и qvalueCutoff = 0.05.
  2. Преобразуйте символы генов в соответствующие идентификаторы генов с помощью функции bitr. Проведите анализ обогащения Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) на специфичные для пола DEGs для каждого типа глиальных клеток с использованием функции enrichKEGG . Настройте параметры следующим образом: organism = has, keyType = kegg, pAdjustMethod = BH, pvalueCutoff = 0.01 и qvalueCutoff = 0.05.

10. Частотная статистика глиальных ДЭГ в путях го и кегга, диаграммы Венна каждого глиального ДЭГ, специфичных для пола, и построение сети ИПП

  1. Рассчитайте частоту глиальных ДЭГ, специфичных для пола, в путях GO и KEGG с помощью частотной гистограммы.
  2. Доступ к базе данных STRING для создания сетей PPI.
  3. Выберите несколько белков. Найдите список имен в поле поиска. Установите "Организмы" как Homo sapiens.
  4. Просмотрите список белков, полученных в результате поиска. Нажмите « Продолжить », чтобы продолжить.
  5. Экспортируйте сети PPI, выбрав опцию загрузки , предпочтительно в формате PNG с более высоким разрешением.
  6. Визуализируйте распределение коэкспрессии для основных генов, специфичных для пола, с помощью диаграмм Венна.
  7. Определите общий ген (гены) в качестве ключевого гена (генов) в исследовании на основе анализа диаграммы Венна.

11. Построение многофакторной регулирующей сети

  1. Получите доступ к программе NetworkAnalyst.
  2. Нажмите на кнопку «Ввод списка генов » и укажите организм как H. sapiens (человек). Установите тип ID в качестве официального символа гена. Введите название гена в поле поиска, а затем нажмите « Загрузить » и «Продолжить».
  3. Выберите Gene-miRNA Interactions и выберите miRTarBase v8.0. Подтвердите выбор, нажав на кнопку OK.
  4. Перейдите к TF-gene Interactions и выберите базу данных ENCODE . Нажмите OK, чтобы подтвердить выбор.
  5. Затем перейдите в раздел Корегуляторная сеть TF-miRNA и нажмите OK, чтобы продолжить.
  6. Наконец, выберите «Продолжить », чтобы создать многофакторную регуляторную сеть, включающую взаимодействия ген-микроРНК и взаимодействия TF-гена.

12. Анализ генов и мишеней ТКМ

  1. Получите доступ к онлайн-базе данных Coremine Medical.
  2. Введите конкретное имя гена и выберите соответствующий ген с суффиксом ген/белок, человек в поле поиска в разделе «Исследовать ».
  3. Перейдите в раздел «Наркотики » и определите ТКМ, связанные с искомыми препаратами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Статистически значимые препараты были отмечены синим цветом.
  4. Определите пять основных ТКМ на основе их «значимости» в качестве терапевтических ТКМ.

13. Резюме исследований ингредиентов ТКМ в нацеливании на ключевой ген

  1. Получите доступ к Интегративной фармакологической исследовательской платформе традиционной китайской медицины (TCMIP) и Фармакологической базе данных и аналитической платформе систем традиционной китайской медицины (TCMSP). Введите названия трав в строку поиска, чтобы получить соответствующие ингредиенты.
  2. Получите ингредиенты из базы данных PubMed с ограничением по времени до 10 апреля 2023года. Используемые поисковые термины включали название молекулы в TCMSP и химические компоненты в TCMIP в качестве поисковых терминов и были ограничены статьями, опубликованными на английском языке.
  3. Обобщите и проанализируйте травы и соответствующие им ингредиенты, действующие на болезнь Альцгеймера.

14. Подтверждение целевой лечебной функции ТКМ в зависимости от половой специфичности БА

  1. Импортируйте травы в TCMIP и перейдите на соответствующую страницу описания.
  2. Используйте функцию «Экспорт данных » и выберите формат CSV , чтобы загрузить условия обогащения GO — Biological Process, GO — Cellular Component, GO — Molecular Function и Reactome Pathway.
  3. Визуализируйте загруженные условия обогащения для каждой травы с помощью гистограмм.

Результаты

SnRNA-seq анализ профилей фронтального глиального транскриптома и аннотация типов клеток
Всего было получено 220 095 ядер и 32 077 генов в лобной коре 17 мужчин с БА и 17 женщин с БА (рис. 1А). График UMAP визуализировал общее количество одноядерных фронтальных транскриптомов, отображающих различные типы ядер после анализа уменьшения размерности (рис. 1B). Было показано общее количество аннотированных ядер, захваченных по полу, что в сумме включало 58 902 астроцита, 14 265 микроглий, 77 466 олигодендроцитов, 3 520 эндотелиальных, 25 252 возбуждающих нейронов, 31 268 тормозных нейронов и 9 422 клеток-предшественников олигодендроцитов (рисунок 1C). Средние экспрессии известных маркеров типа клеток для каждой глии были спроецированы на графики UMAP для идентификации клеточных популяций (рис. 1D).

Специфичные для пола ДЭГ в астроцитах
Было проанализировано 58 902 астроцитарных ядра (рис. 2A), из них 27 504 с мужской болезнью Альцгеймера (46,69%) и 31 398 с женской болезнью Альцгеймера (53,31%). Специфичные для пола ДЭГ выявили повышение регуляции 138 генов, включая DST, CACNA2D3 и AC016831.7, подавление 105 генов, включая CNTN5, RORA, RASSF8 и CADM2, и неизменность 4995 генов (рис. 2B). Кроме того, анализ GO и KEGG показал, что эти ДЭГ в основном концентрируются в путях нейронов, синапсов и гормонов, причем нейронные пути включают регуляцию развития нейронных проектов, нейронный позвоночник и т. д., синаптические пути включают синаптическую организацию и глутаматергические/холинергические синапсы, а гормональные пути включают синтез гормонов щитовидной железы и секрецию инсулина (рис. 2C, D). Было получено тридцать генов с максимальной частотой (рисунок 2E), при этом PLCB1 занял первое место. Сети PPI были построены для изучения взаимосвязи между этими генами (рис. 2F) и идентифицировали DLG2, CAMK2D, CALM2 и PRKACB в качестве основных генов. Графики UMAP показали различия между выбранными DEG: KCND2, CAMK2D, MT3, LINC00278 и XIST были выше при БА у женщин и ниже при БА у мужчин, в то время как NLGN4Y, DLG2, PRKACB, CALM2, UTY и TTTY14 были противоположными (рис. 2G). MT3, CALM2, DLG2, KCND2, PRKACB, CAMK2D и NLGN4Y были окончательно определены как специфичные для пола DEG астроцитов, как показано в таблице 1.

Специфичные для пола ДЭГ в микроглии
Было проанализировано 14 265 ядер микроглии (рис. 3A), из них 5 327 (37,34%) от мужчин с болезнью Альцгеймера и 8 938 (62,66%) от женщин с болезнью Альцгеймера. Специфичные для пола ДЭГ выявили повышение регуляции 224 генов, включая KCNIP4 и LRRTM4, и подавление 930 генов, включая APOE, MT-CO3 и FTL, а также неизменные 13 111 генов (рис. 3B). Кроме того, анализы GO и KEGG показали, что эти ДЭГ в основном концентрируются в путях нейронов, фагосомах, гормонах и других, при этом нейронные пути включают синапс нейрон-нейрон, фагоцитарные пути, включая фагосому и регуляцию фагоцитоза, гормональные пути, включая сигнальный путь эстрогена, сигнальный путь окситоцина и т.д., и другие, включая регуляцию воспалительной реакции, обучение или память, клиренс бета-амилоида, и т.д. (Рисунок 3C, D). Было получено 30 генов с максимальной частотой, при этом TLR2 и TREM2 заняли второе место (рис. 3E). Сети PPI были построены для изучения взаимосвязи между этими генами (рис. 3F) и определили ACTB, APP и FYN в качестве основных генов. Графики UMAP показали различия между выбранными DEG: APP, FOS, XIST и CTSD были выше при БА у женщин и ниже при БА у мужчин, в то время как NLGN4Y, TREM2, LINC0028, APOE, UTY и TTTY14 были противоположными (рис. 3G). TREM2, FOS, APOE, APP и NLGN4Y были окончательно определены как специфичные для пола DEGs микроглии, как показано в таблице 2.

Специфичные для пола ДЭГ в олигодендроцитах
Было проанализировано 77 466 олигодендроцитарных ядер (рис. 4A), из которых 42 469 — у мужчин с болезнью Альцгеймера (54,82%) и 34 997 — у женщин с болезнью Альцгеймера (45,18%). Специфичные для пола ДЭГ выявили повышение регуляции 384 генов, включая PCDH9, MT-CO1, NEAT1 и NPAS3, подавление 188 генов, включая FRMD4A, PLP1 и LSAMP, а остальные 76 894 гена остались без изменений (рисунок 4B). Кроме того, анализы GO и KEGG показали, что эти ДЭГ в основном концентрируются в путях нейронов, синапсов и гормонов, причем нейронные пути включают нейронный позвоночник, синаптические пути, включая нейрон-нейронный синапс и глутаматергический/дофаминергический синапс, и гормональные пути, включая сигнальный путь нейротрофина, синтез и секрецию альдостеронов, сигнальный путь кальция и т. д. (рис. 4C, D). Было получено тридцать генов с максимальной частотой (рис. 4E), при этом GRIN2A и PSEN1 заняли второе место. Сети ИПП были построены для изучения взаимосвязи между этими генами (рис. 4F) и идентифицировали GRIN2A и GRIA2 в качестве основных генов. Графики UMAP показали различия в выбранных DEG: GRIN2A, ITPR2, GNAS и XIST были выше при БА у женщин и ниже при БА у мужчин, в то время как NLGN4Y, UTY и TTTY14 были противоположными (рис. 4G). GRIN2A, ITPR2, GNAS и NLGN4Y были окончательно определены как специфичные для пола DEGs олигодендроцитов, как показано в таблице 3.

Взаимодействие между ключевыми генами и топ-30 генами глиальных клеток, а также NLGN4Y в качестве общего общего гена
Диаграммы Венна и сети ИПП предоставили обзор тесного взаимодействия между ключевыми генами (рис. 5A, B) и топ-30 генами (рис. 5C, D) каждой глиальной клетки. Результаты показали, что ACYB, APP, JUN, PRKACB и DLG2 были в основе сети PPI, а NLGN4Y был общим общим геном для специфичных для пола DEGs во всех глиальных клетках.

Построение сети ген-TF-микроРНК
Сеть NLGN4Y-TF-miRNA содержала 13 узлов и 12 ребер (рис. 6A). NLGN4Y регулировался 1 TF, а именно CTCF, и 11 микроРНК, включая has-miR-185, has-miR-137 и has-miR-9.

Отображение целевого препарата и ТКМ NLGN4Y с помощью сети
В общей сложности 1 целевой препарат NLGN4Y и 64 непрямой мишени TCM были получены в Coremine Medical. ТКМ, имеющие статистическую значимость в результатах, были отмечены синим цветом. Был визуализирован препарат Antithrombin III и пять ТКМ с сетью, а именно Heikunbu, Wulingzhi, Xiazhicao, Shuizhi и Mahuang, которые были признаны статистически значимыми (рис. 6B).

Влияние целевых ТКМ и соответствующих активных ингредиентов на болезнь Альцгеймера
Для Кунбу было извлечено 10 ингредиентов в TCMIP и 48 ингредиентов в TCMSP. С помощью поиска в базе данных PubMed было извлечено 5 ингредиентов, связанных с болезнью Альцгеймера: фукостерин, сарингостерол, тиамин, стеаридоновая кислота и флорофуроэкол-А, из которых пероральная биодоступность (OB) первых двух составила ≥30% и аналогична половой принадлежности препарата (DL) — ≥0,18. Подробная информация представлена в таблице 4. Что касается Махуанга, то было извлечено 28 ингредиентов в TCMIP и 363 ингредиента в TCMSP. С помощью того же метода, что и в Кунбу, было получено 25 ингредиентов, связанных с болезнью Альцгеймера. Среди них 6 ингредиентов с OB ≥30% и DL ≥0,18: кверцетин, эриодиктиол, нарингенин, таксифолин, стигмастерол и лютеолин, перечислены в верхней части таблицы 5.

Сеть Hurb-ген-болезнь и анализ обогащения
Сеть Hurb-ген-болезнь показана на рисунке 6C. Общим целевым геном Кунбу и Махуанга был ACHE, ассоциированными заболеваниями которого были болезнь Альцгеймера и когнитивный дефицит. Генами-мишенями только Kunbu были ALKBH3 и ELOVL4, заболеваниями, связанными со старением и атрофией мозга соответственно.

Результаты обогащения ГО (АД, МФ и СС) для Кунбу (Рисунок 7А, Рисунок 8А, Рисунок 9А) и Махуанга (Рисунок 7Б, Рисунок 8Б, Рисунок 9Б) отображаются в виде гистограмм. Также показаны реактомные пути для Кунбу (Рисунок 10A) и Махуанга (Рисунок 10B). Обогащенные термины, отмеченные стрелками, были связаны с осью «гормон-синапс-нейрон», такой как активность рецептора стероидного гормона, проекция нейронов и опосредованный стероидными гормонами сигнальный путь в Кунбу и химическая синаптическая передача, эстроген-зависимая экспрессия генов и процессы нервной системы в Махуанге.

figure-results-1
Рисунок 1: Получение данных об экспрессии генов, профилирование одноядерных РНК-секвенирования и характеристика типов клеток. (A) Образцы, полученные из GEO DataSets для подготовки к анализу. (B) 2-мерный UMAP график суммы ядер (N = 116,101 для самца; N = 103 994 для женщин). (C) Пропорции для каждого типа клеток с разбивкой по полу. (D) Средняя экспрессия 5 хорошо укоренившихся маркеров клеточного типа, спроецированная на график UMAP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Астроциты неоднородны и имеют транскриптомные изменения, специфичные для пола при болезни Альцгеймера. (A) UMAP график ядер астроцитов (N = 59,010). (b) DEG по признаку пола. (К,Г) Круговые графики проиллюстрировали значительно функционально обогащенные члены астроцитарных DEG, полученные из баз данных GO и KEGG (GO: C, KEGG: D). (E) Топ-30 наиболее часто встречающихся DEG астроцитарного пола в путях GO и KEGG. (F) Сеть ИПП, состоящая из 30 наиболее часто встречающихся ДЭГ астроцитарного пола в путях ГО и KEGG. (G) Средняя экспрессия замечательных ДЭГ, специфичных для пола, спроецированных на графики UMAP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Микроглия неоднородна и имеет транскриптомные изменения, специфичные для пола при болезни Альцгеймера. (A) График ядер микроглии UMAP (N = 14,265). (b) DEG по признаку пола. (К,Г) Круговые графики проиллюстрировали значительно функционально обогащенные термины микроглиальных DEG, полученные из баз данных GO и KEGG (GO: C, KEGG: D). (E) Топ-30 наиболее часто встречающихся микроглиальных половых DEGs inGO и KEGGpathways. (F) Сеть ИПП, состоящая из 30 наиболее часто встречающихся ДЭГ с микроглией в путях ГО и KEGG. (G) Средняя экспрессия замечательных ДЭГ, специфичных для пола, спроецированных на графики UMAP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Олигодендроциты гетерогены и имеют специфические для пола транскриптомные изменения при болезни Альцгеймера. (A) График олигодендроцитарных ядер UMAP (N = 77,466). (b) DEG по признаку пола. (К,Г) Круговые графики проиллюстрировали значительно функционально обогащенные термины олигодендроцитарных DEG, полученные из баз данных GO и KEGG (GO: C, KEGG: D). (E) Топ-30 наиболее часто встречающихся олигодендроцитарных половых DEG в путях GO и KEGG. (F) Сеть ИПП, состоящая из 30 наиболее часто встречающихся ДЭГ олигодендроцитарного пола в путях ГО и KEGG. (G) Средняя экспрессия замечательных ДЭГ, специфичных для пола, спроецированных на графики UMAP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Перекрытия сетей ДЭГ и ИПП высокочастотных ДЭГ. (A,B) Диаграмма Венна, иллюстрирующая ключевые гены для каждой глии и соответствующей сети ИПП. (К,Г) Диаграмма Венна, иллюстрирующая 30 наиболее часто встречающихся ДЭГ, специфичных для пола, для каждой глии, обогащенной путями GO и KEGG и соответствующей сетью ИПП. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-6
Рисунок 6: Сетевая диаграмма с NLGN4Y и его целевыми ТКМ в качестве ядра. (A) Корегуляторная сеть ген-TF-микроРНК. (B) Сеть «ген-лекарство-ТКМ» для NLGN4Y. (C) Сеть ТКМ-ген-болезнь Кунбу и Махуанга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-7
Рисунок 7: GO (BP) Анализ обогащения для Кунбу и Махуанг. (A) 20 основных обогащенных биологических процессов Кунбу. (B) Топ-20 обогащенных биологических процессов Махуанга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-8
Рисунок 8: GO (MF) Анализ обогащения для Kunbu и Mahuang. (A) 20 основных обогащенных молекулярных функций Kunbu. (B) Топ-20 обогащенных молекулярных функций Mahuang. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-9
Рисунок 9: GO (CC) Анализ обогащения для Кунбу и Махуанга. (A) 20 основных обогащенных клеточных компонентов Кунбу. (B) Топ-20 обогащенных клеточных компонентов Mahuang. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-10
Рисунок 10: Реактомные пути для Кунбу и Махуанга. (A) Реактомные пути для Кунбу. (Б) Реактомные пути Махуанга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Ключевые гены специфичных для пола DEGs в астроцитах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Ключевые гены специфичных для пола DEGs в микроглии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 3: Ключевые гены специфичных для пола DEGs у олигодендроцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 4: Активные ингредиенты Кунбу на AD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 5: Активные ингредиенты Mahuang на AD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительный рисунок 1: Скриншот использования программного обеспечения R. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 1: Образец информации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 2: Маркерные гены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 1: КОД R. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Гендерная специфичность была выявлена в эпидемиологии, патологии и клинических проявленияхБА 19. Здесь мы подтвердили потенциальный патологический механизм «ось гормон-синапс-нейрон» из гендерно-специфических глиальных генов и связанных с ними путей у пациентов с болезнью Альцгеймера. NLGN4Y был единственным общим геном в трех глиях и был выбран в качестве биомаркера гендерной специфичности AD. TF и микроРНК, регулирующие NLGN4Y, были тесно связаны с гендерными различиями и развитием нервной системы. Кроме того, считалось, что целевые ТКМ Кунбу и Махуанг потенциально влияют на ось «гормон-синапс-нейрон» и действуют как терапевтические кандидаты для БА путем регуляции гендерной специфичности.

Алгоритм Harmony обеспечил явные преимущества по сравнению с другими алгоритмами интеграции за счет интеграции данных в редких ячейках, оптимизации использования памяти и скорости вычислений для больших образцов, а также адаптации к сложным экспериментальным конструкциям с различными клеточными источниками и технологическими платформами. Секции контроля качества и интеграции данных были критически важными компонентами в повышении точности и надежности анализа, что позволило исследователям получить более глубокое представление о биологии болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваний. Тщательное выполнение этих этапов имеет решающее значение для достижения общего качества и достоверности результатов, полученных в экспериментах по секвенированию одноядерных РНК.

Одним из изменений, внесенных в этот протокол, было использование функции SCTransform для нормализации и стандартизации данных20. Этот шаг обеспечил сопоставимость данных и стандартизацию для дальнейшего анализа. Чтобы смягчить пакетный эффект, был предпринят дополнительный шаг по интеграции данных, который помог скорректировать пакетный эффект и повысить точность результатов. Устранение неполадок проводилось, когда один из образцов (GSM5106107) демонстрировал необычные характеристики по сравнению с другими образцами, и его исключали из анализа.

Одним из ограничений этого исследования был относительно небольшой размер выборки, что может ограничить репрезентативность результатов для более широкой популяции. Кроме того, использование данных из нескольких лабораторий и исследовательских групп внесло присущую им гетерогенность, потенциально ограничивающую воспроизводимость и обобщенность результатов. Несмотря на то, что идентификация ключевых регуляторных факторов для NLGN4Y была достигнута с помощью корегуляторной сети ген-TF-микроРНК, потребовалась дальнейшая экспериментальная проверка для выяснения функциональных ролей и основных механизмов, приписываемых этим регуляторным факторам. В то время как анализ обогащения показал, что Махуанг и Кунбу являются потенциальными кандидатами для лечения БА с учетом гендерных особенностей, полагаться исключительно на прогнозы биоинформатики было недостаточно для установления их эффективности и безопасности. Дополнительные эксперименты и клинические исследования были необходимы для подтверждения терапевтических эффектов этих многообещающих препаратов.

Подход, описанный в этом исследовании, продемонстрировал значительный потенциал для различных областей исследований, в частности, в различении специфичных для пола DEG в глиальных клетках при болезни Альцгеймера. Такие исследования обещают прояснить нюансы патогенных различий между мужчинами и женщинами, что способствует разработке терапевтических вмешательств, специфичных для пола. Кроме того, применимость метода распространяется и на другие нейродегенеративные состояния, предлагая возможности для идентификации специфичных для пола DEG и улучшения понимания основных механизмов заболевания.

В заключение следует отметить, что в исследовании представлен всеобъемлющий и надежный протокол анализа данных секвенирования одноядерных РНК у пациентов с болезнью Альцгеймера, что потенциально прокладывает путь к разработке индивидуальных терапевтических вмешательств. Кроме того, методология, используемая в этом исследовании, может быть распространена на другие нейродегенеративные состояния, что дает возможность раскрыть специфичные для пола паттерны экспрессии генов и углубить понимание этих сложных заболеваний.

Раскрытие информации

В данной рукописи отсутствует конфликт интересов, и все авторы одобрили представление к публикации.

Благодарности

Авторы выражают благодарность Джессике С. Садик, Майклу Р. О'Ди, Филипу Хейзелу и т. д. за предоставление GSE167490 набора данных. Авторы ценят то, что Фатен А Сайед, Лэй Кодама, Ли Фань и т.д. предлагают GSE183068 набор данных. Авторы благодарят Шуцин Лю за помощь в анализе данных и Вэнь Яна за предоставление платформы для анализа данных. Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (82174511), Университетом традиционной китайской медицины Чэнду Apricot Grove Scholars, Программой повышения квалификации талантов в области дисциплин (QJJJ2022001), Программой возрождения талантов Ляонин (XLYC 1807083), Фондом китайской медицины и трав Сычуаньского административного бюро (2023MS578), Национальным проектом обучения инновациям и предпринимательству для студентов (202310633003X) и Инновационными темами научно-исследовательской практики для студентов колледжа Университета традиционной китайской медицины Чэнду (ky-2023100). Ханьцзе Лю и Хуэй Ян внесли свой вклад в разработку исследования, сбор, интерпретацию данных, составление и редактирование рукописи. Шуцин Лю и Сию Ли участвовали в разработке исследования, сборе данных и составлении рукописи. Вэнь Ян и Анвар Айеша отвечали за сбор и интерпретацию данных. Синь Тан подготовил рисунки и/или таблицы. Цэнь Цзян, И Лю и Лушуан Се задумали исследование и проанализировали/отредактировали рукопись. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленный вариант.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
База данных Database
Coremine Medical Совместноразработана Норвегией, Китайской академией наук, Китайской академией медицинских наук, Национальной медицинской библиотекой США и другими учреждениямиКогда вы изучаете концепции в CoreMine Medical, вы получаете доступ к базе данных, структурированной таким образом, чтобы связать важные концепции, ранжированные по статистической значимости. к вашей теме. Например, если вы введете «болезнь Альцгеймера», то в дополнение к получению документов и ресурсов, в которых обсуждается болезнь, вы сможете просматривать сети и списки, показывающие, как ваша концепция запроса связана с другими биомедицинскими концепциями. Это обеспечивает обзор концепций, которые относятся к вашему поиску, а также является интерфейсом для навигации по информации об этих концепциях.
Weblink: https://coremine.com/medical/
Gene Expression Omnibus (GEO)Национальный центр биотехнологической информации в Соединенных Штатах Америки (NCBI)GEO — это общедоступное функциональное хранилище данных геномики, поддерживающее отправку данных, совместимых с MIAME. Принимаются данные на основе массивов и последовательностей. Предоставляются инструменты, помогающие пользователям запрашивать и загружать эксперименты и курируемые профили экспрессии генов.
Вебссылка: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
Интегративная фармакологическая исследовательская платформа традиционной китайской медицины (TCMIP, версия: 2.0)НетВведение в интегрированную фармакологическую сетевую вычислительную исследовательскую платформу для традиционной китайской медицины [TCMIP v2.0], http://www.tcmip.cn/ ) Это интеллектуальный интеллектуальный анализ данных платформа на основе онлайн-базы данных Энциклопедии традиционной китайской медицины (ETCM), которая интегрирует медицинские сервисы управления большими данными и фармакологические вычислительные сервисы. Его цель – раскрыть научный подтекст теории традиционной китайской медицины и научную ценность оригинального мышления в традиционной китайской медицине, обобщить и передать опыт известных врачей, контролировать качество традиционной китайской медицины, разъяснить принципы действия традиционной китайской медицины, исследования и разработки новой китайской медицины, особенности открытия и оптимизации современных комбинаций лекарственных средств, Обеспечьте надежную базу данных и аналитические инструменты. На основе TCMIP v1.0 реализована комплексная модернизация, включающая пять основных баз данных и семь функциональных модулей. Благодаря системной интеграции и интеграции модулей можно быстро провести всесторонний анализ многоуровневой корреляции сети взаимодействия «рецепт синдрома болезни». Как интеллектуальная платформа интеллектуального анализа данных, TCMIP v2.0 обеспечит прочную основу данных и аналитическую платформу для выявления научной коннотации теории традиционной китайской медицины и научной ценности оригинального мышления в традиционной китайской медицине, обобщения и наследования опыта известных врачей, контроля качества традиционной китайской медицины, разъяснения принципов действия традиционной китайской медицины. исследования и разработка новых препаратов традиционной китайской медицины, особенно открытие и оптимизация современных комбинаций лекарств.
Веб-ссылка: http://www.tcmip.cn/TCMIP 
NetworkAnalystNoneNetworkanalyze — это онлайн-платформа для анализа визуализации и метаанализа экспрессии генов. Он может выполнять сравнительный, количественный, дифференциальный и обогащенный анализ экспрессии генов, анализ белок-белковых взаимодействий, интеграционный анализ нескольких наборов данных, а также может рисовать ценные изображения, такие как PCA, сетевая диаграмма белок-белковых взаимодействий, тепловая карта, диаграмма вулкана, диаграмма Уэйна и т. д.
Веб-ссылка: база
данных https://www.networkanalyst.ca/NetworkAnalyst/ PubMedНациональный центр биотехнологической информации в Соединенных Штатах (NCBI)База данных Pubmed — это база данных биомедицинской литературы, поддерживаемая Национальной медицинской библиотекой (NLM) в Соединенных Штатах и направленная на предоставление новейших результатов медицинских исследований ученым, врачам, исследователям и студентам по всему миру. В этой базе данных собрана биомедицинская литература со всего мира, включая журнальные статьи, документы, книги и т.д. На данный момент база данных Pubmed собрала более 30 миллионов статей и постоянно обновляется каждую неделю.
Weblink: Программное
обеспечение https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/ RРосс Ихака и Роберт ДжентльменR — это язык и среда для статистических вычислений и графики. Это проект GNU, который похож на язык и среду S, которые были разработаны в Bell Laboratories (ранее AT&; T, теперь Lucent Technologies) Джона Чемберса и его коллег. R можно рассматривать как другую реализацию S. Есть
некоторые важные различия, но большая часть кода, написанного для S, работает без изменений под R.
Weblink: https://www.r-project.org/
Платформа фармакологии и анализа систем традиционной китайской медицины (TCMSP)Zhejiang Jiuwei Health Co., LtdTCMSP является не только хранилищем данных, но и аналитической платформой для пользователей, чтобы всесторонне изучать традиционные китайские лекарства (ТКМ): включая идентификацию активных компонентов, скрининг мишеней для лекарств и создание сетей соединений-мишеней-заболеваний, а также подробную фармакокинетическую информацию о лекарственном препарате, включая лекарственную схожесть (DL), пероральную биодоступность (OB), гематоэнцефалический барьер (BBB), проницаемость кишечного эпителия (Caco-2), ALogP, площадь фракционной отрицательной поверхности (FASA-) и количество   H-bond  Донор/Акцептор   (Хдон/Хакк). До сих пор TCMSP привлек широкое внимание, и несколько групп опубликовали более 10 статей, используя нашу базу данных TCMSP, в течение примерно одного года.
Веб-ссылка: https://tcmsp-e.com

Ссылки

  1. Alzheimers Dement. Alzheimer's disease facts and figures. Alzheimers Dement. 19 (4), 1598-1695 (2023).
  2. Xie, L., et al. Electroacupuncture improves M2 microglia polarization and glia anti-inflammation of hippocampus in Alzheimer's disease. Front Neurosci. 15, 689629(2021).
  3. Xie, L., et al. Inflammatory factors and amyloid beta-induced microglial polarization promote inflammatory crosstalk with astrocytes. Aging (Albany NY). 12 (22), 22538-22549 (2020).
  4. Hampel, H., et al. The amyloid-beta pathway in Alzheimer's disease. Mol Psychiatry. 26 (10), 5481-5503 (2021).
  5. Baik, S. H., et al. A breakdown in metabolic reprogramming causes microglia dysfunction in Alzheimer's disease. Cell Metab. 30 (3), 493-507 (2019).
  6. Fisher, D. W., Bennett, D. A., Dong, H. Sexual dimorphism in predisposition to Alzheimer's disease. Neurobiol Aging. 70, 308-324 (2018).
  7. Pan, R. Y., et al. Positive feedback regulation of microglial glucose metabolism by histone h4 lysine 12 lactylation in Alzheimer's disease. Cell Metab. 34 (4), 634-648 (2022).
  8. Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. Microglia in Alzheimer's disease. J Cell Biol. 217 (2), 459-472 (2018).
  9. Brandebura, A. N., Paumier, A., Onur, T. S., Allen, N. J. Astrocyte contribution to dysfunction, risk and progression in neurodegenerative disorders. Nat Rev Neurosci. 24 (1), 23-39 (2023).
  10. Peng, L., Bestard-Lorigados, I., Song, W. The synapse as a treatment avenue for Alzheimer's disease. Mol Psychiatry. 27 (7), 2940-2949 (2022).
  11. Tubi, M. A., et al. White matter hyperintensities and their relationship to cognition: Effects of segmentation algorithm. Neuroimage. 206, 116327(2020).
  12. Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. J Am Soc Nephrol. 30 (1), 23-32 (2019).
  13. Soreq, L., Bird, H., Mohamed, W., Hardy, J. Single-cell RNA sequencing analysis of human Alzheimer's disease brain samples reveals neuronal and glial specific cells differential expression. PLoS One. 18 (2), e0277630(2023).
  14. Sadick, J. S., et al. Astrocytes and oligodendrocytes undergo subtype-specific transcriptional changes in Alzheimer's disease. Neuron. 110 (11), 1788-1805 (2022).
  15. Chen, Y., Colonna, M. Microglia in Alzheimer's disease at single-cell level. Are there common patterns in humans and mice. J Exp Med. 218 (9), e20202717(2021).
  16. Brase, L., et al. Single-nucleus RNA-sequencing of autosomal dominant Alzheimer disease and risk variant carriers. Nat Commun. 14 (1), 2314(2023).
  17. Ringner, M. What is principal component analysis. Nat Biotechnol. 26 (3), 303-304 (2008).
  18. Korsunsky, I., et al. sensitive and accurate integration of single-cell data with harmony. Nat Methods. 16 (12), 1289-1296 (2019).
  19. Vegeto, E., et al. The role of sex and sex hormones in neurodegenerative diseases. Endocr Rev. 41 (2), 273-319 (2020).
  20. Hafemeister, C., Satija, R. Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biol. 20 (1), 296(2019).

Перепечатки и разрешения

Теги

Гендерно-специфические биомаркерытранскриптомы отдельных ядердифференциально экспрессируемые геныбиомаркеры астроцитовбиомаркеры микроглиибиомаркеры олигодендроцитоввизуализация UMAPбиоинформатический анализ
Идентификация биомаркеров гендерной специфичности болезни Альцгеймера на основе профилей глиального транскриптома
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.