Методическая статья

Роль CD4 Т-клеток в рецидивирующе-ремиттирующем экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите

DOI:

10.3791/66553

⸱

19 января 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Basic Medicine, Ningxia Medical University, 2Preparation Center, General Hospital of Ningxia Medical University, 3Institute of Neurological Diseases, First People's Hospital of Shizuishan, 4Department of Neurology, Xianyang Hospital of Yan’an University, 5Department of Pharmacy, People’s Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, 6Department of Pharmacy, General Hospital of Ningxia Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экспериментальная модель аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ) у мышей была использована для изучения роли CD4 Т-клеток в начале и рецидиве ЭАЭ с точки зрения фазы активации и функции иммунного эффекта.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рассеянный склероз (РС) – аутоиммунное заболевание, характеризующееся инфильтрацией иммунных клеток и демиелинизацией в центральной нервной системе (ЦНС). Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) служит прототипной моделью животных для изучения РС. В этом исследовании мы стремились изучить роль CD4 Т-клеток в инициации и рецидиве EAE, уделяя особое внимание фазе активации и иммунному ответу. Для создания модели мышей EAE самок мышей иммунизировали гликопротеином миелина олигодендроцитов (MOG)35-55, эмульгированным полным адъювантом Фрейнда (CFA). Клинические баллы оценивались ежедневно, и результаты показали, что у мышей в группе EAE наблюдался классический рецидивирующе-ремиттирующий паттерн. Анализ окрашивания гематоксилин-эозином (H&E) и luxol fast blue (LFB) выявил значительную инфильтрацию воспалительных клеток в ЦНС и демиелинизацию у мышей EAE. Что касается фазы активации, то как CD4+CD69+ эффекторные Т-клетки (Teff), так и CD4+CD44+CD62L-эффекторные Т-клетки памяти (Tem) могут вносить свой вклад в инициацию EAE, однако на стадии рецидива, вероятно, преобладали CD4+CD44+CD62L-Tem-клетки. Кроме того, с точки зрения иммунной функции, клетки-хелперы T (Th)1 в первую очередь участвуют в инициировании EAE. Тем не менее, как Th1, так и Th17 клетки вносят свой вклад в стадию рецидива, а иммуносупрессивная функция регуляторных T(Treg) клеток была подавлена в ходе патологического процесса EAE.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рассеянный склероз (РС) – аутоиммунное заболевание, характеризующееся инфильтрацией центральной нервной системы (ЦНС) иммунными клетками и демиелинизацией 1,2. Недавнее исследование показало, что это наиболее распространенное инвалидизирующее заболевание, поражающее молодых людей, и его заболеваемость постояннорастет во всем мире. Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) является прототипной моделью РС на животных, которая моделирует многие аспекты воспалительной фазы РС4 человека. С точки зрения иммунных функций, исходные CD4 Т-клетки, которые еще не столкнулись с антигенами, называются хелперными T(Th)0-клетками. Эти клетки подвергаются процессам созревания и активации для выполнения различных функций. CD4 Т-клетки можно разделить на несколько подгрупп в соответствии с их специфическими функциями, которые включают Th1, Th2, регуляторный T (Treg), фолликулярный хелпер T (Tfh), клетки Th17, Th9 и Th225. Существует общее мнение, что подтипы клеток Th1 и Th17 являются ключевыми факторами патогенеза EAE6. Клетки Th1 могут секретировать интерферон γ (ИФН-γ), а клетки Th17 секретируют интерлейкин (IL)-17 и другие воспалительные факторы, которые могут активировать другие иммунные клетки, такие как клетки микроглии и астроциты. Эти клетки продуцируют воспалительные цитокины7, такие как IL-18, IL-12, IL-23 и IL-1β, которые могут дополнительно индуцировать иммунный ответ клеток Th1/Th17, что приводит к прогрессирующей демиелинизации и повреждению аксонов. С точки зрения фазы активации, CD4 Т-клетки обладают предопределенной судьбой развиваться в различные подмножества клеток и дифференцированные состояния, включая наивные, эффекторныеТ-клетки и Т-клетки памяти. Исходные CD4 Т-клетки пролиферируют и дифференцируются в различные субпопуляции эффекторов с различными функциями в различных условиях9. Большинство эффекторных клеток являются короткоживущими, при этом небольшая популяция Т-клеток развивается в Т-клетки памяти, которые проявляют быстрые эффекторные функции при повторном столкновении с теми же антигенами и обеспечивают хозяину высокоэффективную и долгосрочную защиту10,11.

Хотя современные исследования показывают, что CD4 Т-клетки играют значительную роль в развитии EAE, до сих пор неясно, как различные субпопуляции CD4 T-клеток, классифицируемые на основе их фазы активации и функции иммунного эффекта, способствуют инициации и рецидиву EAE. В настоящем исследовании мы создали модель EAE у мышей C57BL6/J путем иммунизации пептида гликопротеина миелина олигодендроцитов (MOG)35-55 и исследовали инициацию и рецидив EAE, уделяя особое внимание фазе активации и иммунной функции CD4 Т-клеток.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В общей сложности 18 самок мышей C57BL/6J в возрасте от шести до восьми недель были случайным образом разделены на контрольную группу (n = 6) и группу EAE (n = 12) для этого исследования. Мыши были приобретены в центре экспериментальных животных Медицинского университета Нинся. Мыши содержались в помещении с контролируемой температурой и влажностью воздуха с 12-часовым циклом света/темноты и свободным доступом к пресной воде и пище. Этическое одобрение было получено от Комитета по этике экспериментальных животных Медицинского университета Нинся до начала исследования.

1. Разработка рецидивирующей ремиттирующей ЭАЭ у мышей C57BL/6

  1. Растворение реагента
    1. Растворите 5,4 мг MOG35-55 (Таблица материалов) в 1,8 мл раствора фосфатно-солевого буфера (PBS). Взвесьте 12,6 мг Mycobacterium tuberculosis H37RA (Таблица материалов) и добавьте ее в 1,8 мл полного раствора адъюванта Фрейнда (КФА) (Таблица материалов). Растворите 360 мкл коклюшного токсина (PTX; Таблица материалов) в 7,2 мл PBS с помощью пипетки (Таблица материалов).
  2. Приготовление эмульсии МОГ35-55 и КФА
    1. Пипетку раствора MOG35-55 и раствора CFA с помощью двух шприцев объемом 5 мл, приготовленных на шаге 1.1, и соединить их с помощью тройникового клапана. Непрерывно перемешивайте на льду в течение 1 часа до получения молочной эмульсии «вода в масле».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эмульсия успешно готовится, когда она плавает на поверхности воды, не рассеиваясь после падения в воду.
  3. Обезболивание мышей
    1. Открутите крышку заправочного уплотнения на переднем конце испарителя наркозного аппарата. Медленно влейте 20 мл изофлурана по уплотнительному винту в центре и зафиксируйте крышку заливной пломбы. Переключите переключатель тройникового клапана, чтобы убедиться, что поток воздуха из испарителя анестезиологического аппарата передается в индукционную коробку для анестезии (Таблица материалов).
    2. Подключите источник питания воздушного насоса, включите переключатель воздушного насоса, а затем поверните и отрегулируйте клапан источника воздуха на переднем конце расходомера кислорода так, чтобы расход газа на выходе составлял 400 мл/мин. Откройте испаритель, отрегулируйте индукционную концентрацию до 3% и подождите, пока анестетик заполнит индукционную коробку.
    3. Примерно через 1 минуту поместите мышей в индукционную коробку, затем закройте индукционную коробку и подождите, пока мыши войдут в глубокий сон, мышечное расслабление и ровное дыхание; тогда мыши могли быть определены как идеальное состояние анестезии (Таблица материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Переключите переключатель тройникового клапана, чтобы убедиться, что поток воздуха из испарителя анестезиологического аппарата передается с анестезиологической маской до тех пор, пока мыши не будут полностью обезболиваны.
  4. Иммунизация мышей
    1. Подкожно ввести 200 мкл эмульсии, приготовленной на шаге 1.2, с помощью шприца объемом 1 мл с иглой в четыре места на спине мыши, примерно на 0,5 см с обеих сторон позвоночника в подмышечной и паховой плоскости12 у мышей группы EAE. Используйте 50 мкл эмульсии на каждом участке (Таблица материалов).
  5. Впрыск PTX
    1. Выведите мышей из клетки, поймав хвост и поместив его на проволоку клетки. Держите хвост мышей 4-м и 5-м пальцами и аккуратно потяните его вверх, чтобы сохранить наклон тела и конечностей вперед. Возьмитесь за голову мышей и захватите кожу на спине мышей с помощью среднего и безымянного пальцев.
    2. Через 0 ч и 48 ч после иммунизации на этапе 1.4 вводят 200 мкл ПТХ внутрибрюшинно на расстоянии 0,5 см по обе стороны от средней брюшной линии с глубиной проникновения 1-2 см с помощью шприца объемом 1 мл с иглой (Таблица материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед введением PTX через 48 ч после иммунизации MOG35-55 необходимо обезболить мышей с помощью процедур, описанных в шаге 1.3. За мышами следует ухаживать до тех пор, пока они не придут в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине.
    3. Мышей в контрольной группе лечили физиологическим раствором по тому же методу и ежедневно оценивали клиническую оценку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мышей оценивали признаки ЭАЭ по следующей шкале13: 0 = отсутствие симптомов заболевания, 1 = полный паралич хвоста, 2 = частичный паралич задней части тела/слабость, 3 = полный паралич задних конечностей, 4 = паралич передних и задних конечностей и 5 = умирающее состояние.

2. Анализ гистологического окрашивания

  1. Коллекция мозга
    1. Обезболите мышей после шага 1.3. Усыпите мышей при вывихе шейки матки и вскройте грудную клетку, чтобы полностью обнажить сердце. Разрежьте ушную раковину и медленно процедите ее предварительно охлажденным физиологическим раствором с помощью шприца объемом 20 мл с иглой в левом желудочке, пока печень не станет серой и белой.
    2. Медленно обливайте 4% параформальдегидом до тех пор, пока кончик хвоста не подвернется вверх, тело не станет жестким, а печень не станет жесткой. Обезглавьте голову, разрежьте череп, соберите мозг с помощью пинцета и закрепите его в 4% растворе параформальдегида на 24 ч (Таблица материалов).
  2. Подготовка парафиновых срезов
    1. Градиентное обезвоживание: Погрузите ткани мозга из шага 2.1 последовательно в 70% этанол на 1 ч, 80% этанол на 1 ч, 95% этанол на 1 ч, безводный этанол на 1 ч, замените свежим безводным этанолом, продолжайте погружение в течение 1 ч (Таблица материалов).
    2. Прозрачность: Погрузите ткани мозга из шага 2.2.1 в ксилол на 30 минут, замените их свежим ксилолом и продолжайте погружение, пока ткани не станут прозрачными (Таблица материалов).
    3. Закладка: Погрузите ткани мозга из шага 2.2.2 в парафин на 1 ч, замените свежим парафином, продолжайте заделку в течение 1 ч, нарежьте ломтиками по 6 мкм после выпуска формы, поместите предметное стекло в горячую воду, высушите при 37 °C, храните при комнатной температуре (Таблица материалов).
    4. Депарафинизация: Погрузите ткани мозга с шага 2.2.3 в ксилол на 20 минут, замените свежим ксилолом, продолжайте погружение на 20 минут, поместите в безводный этанол на 5 минут, замените свежим безводным этанолом, погрузите на 5 минут, 75% этанол на 5 минут, промойте водопроводной водой (Таблица материалов).
    5. Окрашивание гематоксилин-эозином (H&E): Окрашивание тканей с шага 2.2.4 раствором гематоксилина в течение 3-5 минут, а затем полоскание водопроводной водой. Обработайте ткани раствором для дифференцировки гематоксилина, кратковременно и тщательно промойте водой из-под крана. Обработайте ткани гематоксилином Скотта раствором для воронения, и промойте водопроводной водой. Погрузите в 85% этанол на 5 минут и 95% этанол на 5 минут, а затем запачкайте эозиновым красителем на 5 минут (Таблица материалов).
    6. Обезвоживание: Погрузите ткани из шага 2.2.5 последовательно в безводный этанол на 5 минут, замените свежим безводным этанолом, продолжайте погружение в течение 5 минут, замените свежим безводным этанолом, погрузите на 5 минут, ксилол на 5 минут, замените свежим ксилолом, погрузите на 5 минут, запечатайте нейтральной камедью (Таблица материалов).
    7. Наблюдайте с помощью микроскопа за тканями мозга и выполняйте получение и анализ изображений (Таблица материалов).

3. Анализ окрашивания LFB

  1. Сбор миелиновой оболочки: разрежьте позвоночник мыши от головного окончания на 2 сегмента до хвостового конца на 2 сегмента, продуйте спинной мозг до хвостового конца и зафиксируйте спинной мозг в 4% растворе параформальдегида на 24 часа.
    Примечание: Миелиновая оболочка была собрана у тех же мышей на шаге 2.1, а этапы перфузии сердца те же, что и на этапе 2.1.
  2. Депарафинизация и регидратация парафиновых срезов: Поместите слайды из шага 3.1 последовательно в ксилол на 20 минут, замените свежим ксилолом, продолжайте погружение в течение 20 минут, безводный этанол в течение 5 минут, замените свежим безводным этанолом, погрузите на 5 минут, 75% спирт на 5 минут, промойте водопроводной водой.
  3. Быстрое окрашивание в синий цвет: Поместите раствор для быстрого окрашивания в синий цвет luxol A в духовку при температуре 60 °C и нагревайте в течение 30 минут. Поместите слайды из шага 3.2 в раствор А и накройте их пластиковой пленкой на 1 ч, чтобы предотвратить высыхание срезов, затем выньте слайды и быстро промойте их водопроводной водой.
  4. Дифференциация фона: Поместите слайды из шага 3.3 в раствор для окрашивания В в течение 2 с (пока краситель горячий) и непосредственно погрузите в раствор для окрашивания в синий цвет В в течение 15 с, промойте водой до тех пор, пока миелиновая оболочка не станет синей и фон не станет почти бесцветным.
  5. Окрашивание счетчика эозином: Поставьте стекла из шага 3.4 в духовку при температуре 65 °C для сушки. Как только это будет сделано, выньте их из духовки и дайте остыть. Поместите предметные стекла в 95% этанол и эозин на 1 минуту.
  6. Обезвоживание и запечатывание: Поместите предметные стекла из шага 3,5 последовательно в безводный этанол на 5 минут, замените свежим безводным этанолом, продолжайте погружение на 5 минут, снова замените свежим безводным этанолом, продолжайте погружение на 5 минут, ксилол 5 минут, замените свежим ксилолом, погрузите на 5 минут. Вымойте и высушите образцы и запечатайте их нейтральной резинкой.
  7. Обследование под микроскопом: сбор и анализ изображений с помощью вертикального оптического микроскопа (Таблица материалов).

4. Анализ проточной цитометрии

  1. Вскрыть брюшную полость мышей. Извлеките селезенку с помощью пинцета и пропустите через мясорубку небольшими кусочками по 1,5-2,5 см в ПБС на льду с помощью ножниц. Измельчите селезенку в 10 мл RPMI-1640, содержащего 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS), с помощью поршня шприца объемом 2,5 мл и протолкните его через клеточное ситечко 70 мкм для получения одноклеточной суспензии (Таблица материалов).
    Примечание: Селезенка была собрана у тех же мышей на шаге 2.1.
  2. Полученную на шаге 4.1 суспензию переложить в пробирки объемом 15 мл и лизировать с использованием 5 мл буфера для лизиса эритроцитов на льду в течение 10 мин. Промойте RPMI-1640, содержащим 2% FBS, центрифугируйте при 350 x g в течение 5 минут, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки RPMI-1640, содержащим 2% FBS.
  3. Подсчитайте ячейки с помощью автоматического счетчика клеток (Таблица материалов) и отрегулируйте концентрацию до 1 x 106 клеток/мл.
  4. Пипетку ввели 100 мкл клеточной суспензии в пробирки объемом 1,5 мл и инкубировали с 1 мкл антитела14 к мышиному CD16/32 (0,5 мг/мл) в течение 30 мин для блокирования неспецифического окрашивания. Промыть с помощью RPMI-1640 и центрифугировать при 350 х г в течение 5 минут, сбросить надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в 100 мкл RPMI-1640, содержащего 2% FBS.
  5. Окрашивание антителами, специфичными к CD45 (Alexa Fluor 700), CD3 (FITC), CD4 (APC) и CD69 (BV674) к клеткам Teff15 в течение 30 мин, по 2 мкл для каждого антитела. Окрашивание антителами, специфичными к CD45 (Alexa Fluor 700), CD3 (FITC), CD4 (APC), CD44 (BV421) и CD62L (PE) для Tem-клеток16 в течение 30 мин, по 2 мкл для каждого антитела. Промыть с помощью RPMI-1640 и центрифугировать при 350 x g в течение 5 минут, удалить надосадочную жидкость и повторно суспендировать клетки в 350 μл PBS. Анализируйте пропорции клеток с помощью проточного цитометра и соответствующего программного обеспечения (Таблица материалов).

5. Анализ цитокинов с помощью цитометрической матрицы шариков

  1. Используйте цитометрическую матрицу шариков (Таблица материалов) для измерения IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, фактора некроза опухоли (TNF)-α и IFN-γ в мозге мышей, методы, описанные ниже.
  2. Соберите мозг мыши, как описано в шаге 2.1.
  3. Экстракция общего белка: Разрежьте и взвесьте 50 мг мозговой ткани (три мозга в контрольной группе, группа EAE в пиковой стадии и стадия RR). Поместите мозг в пробирки объемом 1,5 мл и добавьте 500 мкл буфера для лизиса, содержащего PMSF, ингибитор протеазы и ингибиторы фосфатазы.
  4. Мозги нарезать небольшими кусочками размером около 1мм3, извлечь с помощью ультразвукового гомогенизатора при 400 Вт, 5 с ВКЛ и 5 с ВЫКЛ; Повторите 5 раз. Поместите пробирку на лед на 10 минут, центрифугируйте при 12000 x g в течение 5 минут и соберите надосадочную жидкость (Таблица материалов).
  5. Приготовьте для мыши стандарты цитокинов Th1/Th2/Th17, как описано ниже.
    1. Откройте флакон с лиофилизированными мышами стандартов Th1/Th2/Th17. Переложите эталоны в коническую полипропиленовую трубку объемом 15 мл. Промаркируйте верхнюю часть трубки как стандартную.
    2. Восстановите стандарты в 2,0 мл разбавителя анализа. Дайте восстановленному стандарту сбалансироваться в течение 15 минут при комнатной температуре. Аккуратно перемешайте восстановленный белок с помощью пипетирования.
    3. Наклейте этикетки на тубы размером 12 мм x 75 мм и расположите их в следующем порядке разведения: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 и 1:256. Пипетка 300 мкл разбавителя анализа в каждую меченую пробирку.
    4. Выполнение серийных разведений: Переведите 300 μL высшего стандарта в пробирку для разведения 1:2 и тщательно перемешайте с помощью пипетирования. Продолжайте серийное разведение, переливая 300 мкл из пробирки 1:2 в пробирку 1:4 и так далее до пробирки 1:256. Приготовьте пробирку размером 12 мм x 75 мм, содержащую только разбавитель анализа, который будет использоваться в качестве отрицательного контроля 0 пг/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно перемешайте с помощью пипетирования. Не делайте вихревые соединения, чтобы предотвратить отпадение связи антител на микрогранулах.
    5. Чтобы смешать бусины захвата цитокинов Th1/Th2/Th17 мыши, подготовьте для эксперимента 19 пробирок, включая стандарты, по 3 образца в каждой группе (контрольная группа, группа EAE в пиковой стадии и стадия RR). Перед смешиванием энергично взбейте суспензию захватывающего валика в течение 5 секунд. Добавьте 190 μL каждой бусины в одну пробирку и пометьте ее как смешанные бусины. Тщательно перебейте смесь бусин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конъюгированные с антителами гранулы со временем выводятся из состояния суспензии. Необходимо провести вортекс флакона перед тем, как брать шарик-суспензию аликоты.
    6. Для выполнения пробного анализа с помощью вихревых шариков захвата смеси. Добавьте 50 мкл шариков во все пробирки. Добавьте 50 мкл стандартных разведений цитокинов мыши Th1/Th2/Th17 в контрольные пробирки, как показано в таблице 1.
    7. Добавьте 50 мкл реагента для детектирования мышиного Th1/Th2/Th17 PE во все пробирки для анализа. Пробирки для анализа инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре и беречь от света. Добавьте 1 мл промывочного буфера в каждую пробирку для анализа и центрифугируйте при температуре 200 x g в течение 5 минут. Тщательно отсадите и выбросьте надосадочную жидкость из каждой пробирки.
    8. Добавьте 300 мкл промывочного буфера в каждую пробирку для повторного взвешивания гранул. Анализируйте данные о цитокинах Th1/Th2/Th17 мыши с помощью программного обеспечения FCAP Array (Table of Materials).

  

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оценка клинических баллов
Как показано на рисунке 1, у мышей контрольной группы не проявлялось никаких клинических симптомов. У мышей в группе EAE, которые были иммунизированы MOG35-55, паралич хвоста наблюдался примерно через 12 дней после иммунизации. К 16-му дню симптомы достигли полного паралича задних конечностей (определяется как пиковая стадия, Peak). После этого симптомы постепенно исчезли. Клинические симптомы у мышей усугубились примерно на 25-й день и достигли полного паралича задних конечностей примерно на 30-й день (определяется как рецидивирующая стадия, ОР). Примечательно, что симптомы длились дольше, чем в предыдущий раз, что привело к развитию классического рецидивирующе-ремиттирующего признака. Основное проявление рецидивирующе-ремиттирующего мышей ЭАЭ у мышей с различными стадиями вспышки, ремиссии и рецидива в течение течения заболевания, которые имеют определенную периодичность и флуктуацию.

Гистологический анализ
У мышей контрольной группы наблюдалась неповрежденная структура ткани мозга с равномерно распределенными и четко очерченными кровеносными сосудами, без инфильтрации воспалительных клеток. (Рисунок 2А). На пиковой стадии у мышей группы EAE наблюдалась значительная инфильтрация воспалительных клеток в мозге (рис. 2B), образующая манжетообразные изменения вокруг кровеносных сосудов (обозначены красной стрелкой). Аналогичным образом, у мышей группы EAE на стадии RR наблюдалась очевидная инфильтрация воспалительных клеток (рисунок 2C) с преобладающей агрегацией вокруг кровеносных сосудов (обозначена красной стрелкой).

Анализ окрашивания LFB
В контрольной группе миелиновая оболочка спинномозгового белого вещества выглядела синей, что указывало на то, что ее структура была неповрежденной и плотно упакованной (рис. 3А). На пиковой стадии группы ЭАЭ белое вещество позвоночника имело светло-голубой или белый цвет; структура оказалась рыхлой и прерывистой, со значительным присутствием вакуолярных дегенераций, обозначенных красной стрелкой (рис. 3B). На стадии RR модельной группы EAE наблюдалась обширная потеря миелина белого вещества в спинном мозге. Структура казалась рыхлой, и можно было наблюдать значительное количество вакуолярных дегенераций (обозначено красными стрелками; Рисунок 3В).

Проточная цитометрия
Результаты, представленные на рисунках 4A, B, продемонстрировали значительное увеличение доли клеток CD4+CD69+ Teff у мышей EAE на пиковой стадии по сравнению с контрольной группой (P < 0,0001). Кроме того, доля этих клеток также увеличилась на стадии RR, хотя разница не была статистически значимой (P > 0,05). На рисунках 4C,D показано заметное увеличение доли CD4+CD44+CD62L-Tem клеток у мышей EAE как на пиковой, так и на RR стадиях по сравнению с контрольной группой (P < 0,0001).

Цитокин измеряется с помощью цитометрической матрицы шариков
Результаты, представленные на рисунке 5 , показывают, что по сравнению с контрольной группой, уровни ИЛ-4 (P < 0,0001), IL-6 (P < 0,001), ИФН-γ (P < 0,0001) и TNF-α (P < 0,0001) были значительно повышены в группе EAE на пиковой стадии. Хотя экспрессия IL-17A также увеличивалась, разница не была статистически значимой (P > 0,05). Кроме того, уровень IL-2 не претерпел изменений в период пиковой стадии у мышей EAE (P > 0,05); однако он значительно увеличился на стадии RR (P < 0,01). Кроме того, экспрессия как TNF-α (P < 0,001), так и IL-17A (P < 0,01) на стадии RR была значительно выше, чем в контрольной группе. И наоборот, экспрессия IL-10 в группе EAE была значительно ниже, чем в контрольной группе, как на пиковой стадии, так и на стадии RR (P < 0,0001).

figure-results-1
Рисунок 1: Оценка клинической шкалы. Клиническая шкала оценивалась ежедневно и показывает, что у мышей развилась классическая рецидивирующе-ремиттирующая ЭАЭ, иммунизированная MOG35-55. (А) Диаграмма развития симптомов у мышей EAE. (B) Оценка мышей EAE по средним клиническим баллам. Данные выражаются в виде среднего ± SEM, n = 6. Данные были проанализированы с использованием одностороннего ANOVA с апостериорными сравнениями для оценки статистически значимых различий. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Микроскопическая карта окрашивания мозга H&E. (A) Мозг мышей в контрольной группе. (B) Мозг мышей EAE в пиковой стадии. Воспалительные клетки были инфильтрированы в мозг на пиковой стадии у мышей группы EAE и распределены вокруг кровеносных сосудов, образуя изменения, похожие на манжету (красная стрелка). (C) Мозг мышей EAE в стадии RR. Воспалительные клетки у мышей группы ЭАЭ стадии RR агрегировались вокруг кровеносных сосудов (красная стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Микроскопическая карта окрашивания миелиновой оболочки LFB. (A) Мыши, с миелиновой оболочкой в контрольной группе. (B) Миелиновая оболочка мышей EAE в пиковой стадии. Белое вещество спинного мозга было светло-голубым или белым, структура рыхлая и прерывистая, появилось большое количество вакуолярных дегенераций (красная стрелка). (C) Миелиновая оболочка мышей EAE в стадии RR. Белое вещество миелин спинного мозга было широко утрачено, структура была рыхлой, и появилось большое количество вакуолярных дегенераций (красная стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Иммунизация MOG35-55 индуцировала повышение соотношения CD4 Teff и Tem клеток как на пиковой, так и на RR стадии у мышей EAE. (A) Иллюстративный график потока, показывающий иммуноокрашивание CD4+CD69+ клеток. (B) Процентное содержание CD4+CD69+ клеток Teff. (C) Иллюстративный график потока, показывающий иммуноокрашивание CD44+CD62L+ клеток (гейт на CD4 Т-клетках). (D) Процентное содержание CD44+CD62L+ Tm-клеток. Данные выражаются в виде среднего ± SEM, n = 5. Данные были проанализированы с использованием одностороннего ANOVA с апостериорными сравнениями для оценки статистически значимых различий. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Уровень цитокинов в мозге мышей, проанализированный с помощью цитометрической матрицы шариков. Данные выражаются как среднее ± SEM, n = 3. Данные были проанализированы с использованием одностороннего ANOVA с апостериорными сравнениями для оценки статистически значимых различий. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Этикетка для тубыКонцентрация (пг/мл)Стандартное разведение цитокинов
10 (отрицательный контроль)без стандартного разведения (только разбавитель для анализа)
2201:256
3401:128
4801:64
51561:32
6312.61:16
76251:8
812501:4
925001:2
105000Высочайший стандарт

Таблица 1: Перечень стандартных разведений цитокинов в контрольные пробирки.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

РС является наиболее распространенным аутоиммунным демиелинизирующим заболеванием ЦНС, которым страдают миллионы людей во всем мире17. EAE является типичной животной моделью для моделирования клинических патологических особенностей MS18. Исследования показали, что люди с рассеянным склерозом испытывают когнитивные нарушения и другие нарушения из-за дегенерации аксонов и нейронов в ЦНС 19,20,21. На пиковой и RR-стадии модели EAE у мышей наблюдался паралич хвоста и задних конечностей. Кроме того, наблюдалось проникновение воспалительных клеток в ЦНС, что приводило к различной степени потери миелиновой оболочки. Эти результаты свидетельствовали об успешном создании модели EAE в данном эксперименте.

Процесс эмульгирования MOG35-55 и CFA необходимо проводить на льду, чтобы предотвратить деградацию MOG35-55, вызванную выделением тепла в процессе гомогенизации. ПТХ вводится внутрибрюшинно для повышения проницаемости сосудов, что позволяет Т-клеткам легко пересекать гематоэнцефалический барьер и достигать миелиновой оболочки, окружающей нейроны22. Особого внимания заслуживает тот факт, что в тех случаях, когда мыши парализованы и не могут самостоятельно есть или пить, важно обеспечить их лотками для еды и воды в клетке или кормить их вручную, чтобы предотвратить чрезмерную жажду и голод.

С помощью проточной цитометрии анализировали долю клеток CD4+CD69+ Teff и клеток CD4+CD44+CD62L-Tem. Доля клеток CD4+CD69+ Teff в селезенке мышей EAE значительно регулировалась на пиковой стадии. Кроме того, она была выше, чем у контрольной группы в стадии рецидива, хотя эта разница не достигала статистической значимости. С другой стороны, доля CD4+CD44+CD62L-Tem клеток была значительно выше у мышей EAE по сравнению с контрольной группой как на пиковой, так и на RR стадии. Это позволяет предположить, что в инициации EAE могут участвовать как CD4+CD69+ Teff, так и CD4+CD44+CD62L-Tem-клетки на пиковой стадии, в то время как на стадии RR, возможно, в первую очередь доминируют CD4+CD44+CD62L-Tem-клетки. CD69 является самой ранней молекулой мембранной поверхности, экспрессируемой во время активации лимфоцитов. Он играет решающую роль в модуляции адгезии и миграции Т-клеток, тем самым помогая иммунным клеткам выявлять и локализовать очаги инфекции или воспаленияв организме. Покоящиеся Т-клетки не экспрессируют CD69, но когда они стимулируются и активируются анти-CD3/TCR активаторами, они могут быть индуктивно экспрессированы24. После эффекторной стадии значительная часть Т-клеток подвергается апоптозу, поскольку они не способны к дальнейшей дифференцировке. Это снижение численности в первую очередь вызвано отсутствием цитокинов, способствующих выживанию, в том числе IL-2, которые вырабатываются во время стимуляции антигена. Кроме того, подавление рецепторов к этим цитокинам еще больше способствует этому феномену клональногосокращения25. Кроме того, клиренс инфекционного агента посредством адаптивного иммунного ответа приводит к клональному сокращению Т-клеток, в конечном итоге оставляя меньше долгоживущих клеток памяти для обеспечения иммунного ответа хозяину в случае повторного зараженияпатогеном. В настоящем исследовании доля CD4+CD69+ Т-клеток была значительно повышена на пиковой стадии, однако снизилась на стадии RR, что указывает на то, что CD4 Teff-клетки не могут выживать в течение длительного периода и в конечном итоге подвергаются апоптозу, только небольшая часть антиген-специфических Т-клеток развивается в долгоживущие Т-клетки памяти. Темные клетки имеют низкую экспрессию CD62L. Тем не менее, они способны экспрессировать некоторые хемокиновые рецепторы и молекулы адгезии, которые облегчают их миграцию в воспаленные ткани. После реактивации антигена скорость пролиферации относительно медленная, но цитокины быстро высвобождаются, инициируя эффекторную функцию27. В настоящем исследовании антигены у мышей высвобождаются из эмульсии и снова атакуют иммунную систему, ТЭМ-клетки могут реактивироваться и высвобождать большое количество цитокинов, таких как IL-6 и ИФН-γ, что может привести к рецидиву у мышей EAE.

Первичными провоспалительными популяциями CD4 Т-клеток, ассоциированными с аутоиммунными заболеваниями (включая РС), являются клетки Th1, которые секретируют клетки IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α и Th17, которые секретируют IL-17. Было продемонстрировано, что Th1-ассоциированный ИФН-γ может оказывать прямое вредное воздействие на олигодендроциты, приводя к повреждению нейронов ЦНС пациента28. Клетки Th17 также играют значительную роль в развитии нескольких аутоиммунных заболеваний, включая рассеянный склероз. Исследования показали повышенные уровни клеток Th17 и мРНК IL-17 в поражениях головного мозга пациентов с рассеянным склерозом по сравнению с лицамибез этого заболевания. Трег-клетки, для которых характерна продукция IL-10 и TGF-β30, обладают иммуносупрессивным действием и играют решающую роль в поддержании толерантности иммунной системы к собственным компонентам, тем самым давая возможность организму поддерживать иммунный гомеостаз. Здесь мы наблюдали значительное повышение экспрессии IL-4, IL-6, IFN-γ и TNF-α в группе EAE на пиковой стадии. Кроме того, экспрессия Ил-17А также была увеличена, хотя это не имело значения. Напротив, уровни экспрессии TNF-α и IL-17A в стадии RR были значительно выше по сравнению с контрольной группой. Это говорит о том, что пиковая стадия EAE в первую очередь управляется клетками Th1, а не Th17, в то время как стадия RR EAE была инициирована клетками Th1 и Th17. Стоит отметить, что экспрессия IL-10 в группе ЭАЭ как в пиковом, так и в RR-периоде была заметно ниже, чем в контрольной группе, что позволяет предположить, что иммуносупрессивная функция Treg-клеток была нарушена во время патологической процессии ЭАЭ.

В заключение следует отметить, что проведенные нами исследования свидетельствуют об успешном создании модели рецидивирующе-ремиттирующего ЭАЭ у мышей путем иммунизации пептидом MOG35-55. С точки зрения активной фазы, пиковая стадия EAE, вероятно, была инициирована CD4+CD69+ Teff и CD4+CD44+CD62L-Tem-клетками, в то время как рецидив стадии EAE RR может преобладать в основном CD4+CD44+CD62L-Tem-клетками. С точки зрения функции иммунного эффекта, пиковая стадия ЭАЭ в основном была инициирована не клетками Th17, а клетками Th1. Однако стадия RR ЭАЭ инициируется клетками Th1 и Th17. Иммуносупрессивная функция Treg-клеток была угнетена в ходе патологического процесса ЭАЭ. Тем не менее, молекулярные механизмы, лежащие в основе активации клеток Th1/Th17 и подавления клеток Treg, требуют дальнейшего изучения.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Фондом естественных наук Нинся (2022AAC03601 и 2023AAC02087) и Исследовательским фондом Медицинского университета Нинся (XM2019052). Спасибо за поддержку Исследовательского центра медицинской науки и технологий Медицинского университета Нинся.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Аппарат для анестезии испарительNorvap20-17368
  ИзофлуранСигма-Олдрич (Шанхай) Трейдинг Co.Ltd.
70 μ Сетчатый фильтр XIYANCo., Ltd.15-1070
Alexa Fluor 700 антимышиный CD45 АнтителоBiolegend103128
APC антимышиный CD4 АнтителоBiolegend100616
Автоматический счетчик клетокJiangsu JIMBIO technology Co., LTDJIMBIO iCyta S2
BD* Цитометрическая бисерная матрица (CBA) мышь Th1/Th2/Th17 CBA KitBD Biosciences560485
биотин антимышиный CD16/32 АнтителоBiolegend101303
Brilliant Violet 510 антимышиный CD69 АнтителоBiolegend104532
BV786 Крысиный антимышиный CD62L(MEL-14)BD Pharmingen563109
Column Tissue& Набор для экстракции клеточного белкаShanghai Epizyme Biomedical Technology Co., LtdPC201Plus
Complete Freund's AdjuvantSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd. 
ДегидраторDIAPATHDonatello
Одноразовый стерилизованный шприц (1 мл)Yikang Group210820
Одноразовый стерилизованный шприц (2,5 мл)Yikang Group210820
Одноразовый стерилизованный шприц (5 мл)Yikang Group210820
Красильная машинаDIAPATHGiotto
Машина для встраиванияWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-P5
ЭтанолSCRC100092683
сыворотка плода крупного рогатого скотаProcell Life Science& Технологическая компания Лтд.FSP500
FITC Хомяк Антимышь CD3e(145-2C11)BD Pharmingen553062
Проточный цитометрBecton,Dickinson and CompanyFACSКелеста
Проточный цитометрBecton,Dickinson and CompanyAccuri C6
Flow Jo программное обеспечениеBD Biosciences10.8.1
Замороженная платформаWuhan Junjie Electronics Co., ОООJB-L5
Предметное стеклоServicebioG6004
HE набор раствора красителяServicebioG1003
Раствор гематоксилин-эозинаServicebioG1002
Высокоскоростная охлаждаемая центрифугаThermo Fisher ScientificMogafugo8R
Система визуализацииNikonNIKON DS-U3
Набор для быстрого окрашивания в синий цветLuxol ServicebioG1030
Ms CD44 BV421 IM7BD Pharmingen564970
Mycobacterium tuberculosis H37RABD Pharmingen231141
Гликопротеин миелина олигодендроцитов (MOG35-55)AnaSpecAS-60130-1
Нейтральная камедьSCRC10004160
ОрганайзерKEDEEKD-P
ПечьЛаботерияGFL-230
Патологоанатомический слайсерLeicaRM2016
Коклюшный токсин от Bordetella pertussisSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.P7208
Фосфатный буферный растворServicebioG4202
Пипетка 0,5-10 шт; LDLAB Scientific7010101004
Пипетка 100-1000 μ LDLAB Scientific7010101014
Пипетка 20-200 μ LDLAB Scientific7010101009
RPMI-1640Procell Life Science & Технологическая компания Лтд.
Тройник клапанGuangdong Kanghua Medical Co., LTDA06
Разбрасыватель тканейZhejiang Kehua Instrument Co., LtdKD-P
Вертикальный оптический микроскопNikonNIKON ECLIPSE E100
XyleneSCRC10023418
792632SLCH4887PM150110

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Swanberg, K., et al. Multiple sclerosis diagnosis and phenotype identification by multivariate classification of in vivo frontal cortex metabolite profiles. Sci Rep. 12 (1), 13888(2022).
  2. Zahoor, I., et al. An emerging potential of metabolomics in multiple sclerosis: a comprehensive overview. Cell Mol Life Sci. 78 (7), 3181-3203 (2021).
  3. Vitturi, B., et al. Spatial and temporal distribution of the prevalence of unemployment and early retirement in people with multiple sclerosis: A systematic review with meta-analysis. PloS one. 17 (7), 0272156(2022).
  4. Brambilla, R. The contribution of astrocytes to the neuroinflammatory response in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Acta neuropathologica. 137 (5), 757-783 (2019).
  5. Niedźwiedzka-Rystwej, P., Tokarz-Deptuła, B., Deptuła, W. Characteristics of T lymphocyte subpopulations. Postepy Hig Med Dosw. 67, 371-379 (2013).
  6. Loos, J., et al. Functional characteristics of Th1, Th17, and ex-Th17 cells in EAE revealed by intravital two-photon microscopy. J neuroinflammation. 17 (1), 357(2020).
  7. Prajeeth, C., et al. Effectors of Th1 and Th17 cells act on astrocytes and augment their neuroinflammatory properties. J neuroinflammation. 14 (1), 204(2017).
  8. Nielsen Birgitte, R., et al. Characterization of naïve, memory and effector T cells in progressive multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 310, 17-25 (2017).
  9. Xie, L., et al. The role of CD4+ T cells in tumor and chronic viral immune responses. Med Comm. 4 (5), e390(2023).
  10. Sun, L., et al. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).
  11. Kawabe, T., et al. Memory-phenotype CD4+ T cells spontaneously generated under steady-state conditions exert innate TH1-like effector function. Sci Immunol. 2 (12), (2017).
  12. Moon, J., et al. A study of experimental autoimmune encephalomyelitis in dogs as a disease model for canine necrotizing encephalitis. J Vet Sci. 16 (2), 203-211 (2015).
  13. Pérez-Nievas, B., et al. Chronic immobilisation stress ameliorates clinical score and neuroinflammation in a MOG-induced EAE in Dark Agouti rats: mechanisms implicated. J neuroinflammation. 7, 60(2010).
  14. Zheng, J., et al. Prostaglandin D2 signaling in dendritic cells is critical for the development of EAE. J Autoimmun. 114, 102508(2020).
  15. Adamczyk, M., et al. The expression of activation markers CD25 and CD69 increases during biologic treatment of Psoriasis. J Clin Med. 12 (20), 6573(2023).
  16. Meng, R., et al. Echinococcus multilocularisIndoleamine 2,3-dioxygenase 1 signaling orchestrates immune tolerance in -infected mice. Front Immunol. 13, 1032280(2022).
  17. Sheinin, M., et al. Suppression of experimental autoimmune Encephalomyelitis in mice by β-Hydroxy β-Methylbutyrate, a body-building supplement in humans. J Immunol. 211 (2), 187-198 (2023).
  18. Ghareghani, M., et al. Hormones in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) animal models. Transl Neurosci. 12 (1), 164-189 (2021).
  19. Pérez-Miralles, F., et al. Clinical impact of early brain atrophy in clinically isolated syndromes. Mult Scler. 19 (14), 1878-1886 (2013).
  20. Nygaard, G., et al. Cortical thickness and surface area relate to specific symptoms in early relapsing-remitting multiple sclerosis. Mult Scler. 21 (4), 402-414 (2015).
  21. Biberacher, V., et al. Atrophy and structural variability of the upper cervical cord in early multiple sclerosis. Mult Scler. 21 (7), 875-884 (2015).
  22. Ma, Y., et al. Epsilon toxin-producing Clostridium perfringens colonize the multiple sclerosis gut microbiome overcoming CNS immune privilege. J Clin Invest. 133 (9), e163239(2023).
  23. Cibrián, D., Sánchez, M. CD69: from activation marker to metabolic gatekeeper. Eur J Immunol. 47 (6), 946-953 (2017).
  24. Clarkson Benjamin, D., et al. Preservation of antigen-specific responses in cryopreserved CD4 and CD8 T cells expanded with IL-2 and IL-7. J Transl Autoimmun. 5, 100173(2022).
  25. Raeber Miro, E., et al. The role of cytokines in T-cell memory in health and disease. Immunol Rev. 283 (1), 176-193 (2018).
  26. Ville, S., et al. Co-stimulatory blockade of the CD28/CD80-86/CTLA-4 balance in transplantation: Impact on memory T cells. Front Immunol. 6, 411(2015).
  27. Natalini, A., et al. OMIP-079: Cell cycle of CD4+ and CD8+ naïve/memory T cell subsets, and of Treg cells from mouse spleen. Cytometry A. 99 (12), 1171-1175 (2021).
  28. Joffre, O., et al. Cross-presentation by dendritic cells. Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).
  29. Montes, M., et al. Oligoclonal myelin-reactive T-cell infiltrates derived from multiple sclerosis lesions are enriched in Th17 cells. Clin Immunol. 130 (2), 133-144 (2009).
  30. Feruglio, S., Kvale, D., Dyrhol, R. T. Cell responses and regulation and the impact of in vitro IL-10 and TGF-β modulation during treatment of active tuberculosis. Scand J Immunol. 85 (2), 138-146 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

T CD4Th1 Th17
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи