Методическая статья

Сборка нуклеосом in situ для одномолекулярной корреляционно-силовой и флуоресцентной микроскопии

2.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66579

⸱

6 сентября 2024 г.

 ,  ,  , 
1Laboratory of Nanoscale Biophysics and Biochemistry, The Rockefeller University, 2Tri-Institutional PhD Program in Chemical Biology

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данной статье представлена подробная экспериментальная процедура восстановления нуклеосомных ДНК-тросов для одномолекулярной корреляционной силовой и флуоресцентной микроскопии. Далее описывается несколько последующих экспериментов, которые могут быть проведены для визуализации связывания белков, взаимодействующих с хроматином, и анализа изменений физических свойств нуклеосом.

Аннотация

Нуклеосомы являются первичной единицей эукариотического хроматина и были предметом многочисленных информативных исследований одномолекулярных соединений относительно их биофизических свойств и взаимодействия с хроматин-связывающими белками. Восстановление нуклеосом на ДНК для этих исследований обычно включает процедуру солевого диализа, которая обеспечивает точный контроль над размещением и количеством нуклеосом, образующихся вдоль троса ДНК. Тем не менее, этот протокол занимает много времени и требует значительного количества ДНК и гистоновых октамеров в качестве входных данных. Чтобы предложить альтернативную стратегию, описан метод восстановления нуклеосом in situ для одномолекулярной силовой и флуоресцентной микроскопии, в котором используется гистоновый шаперон Nap1. Этот метод позволяет пользователям собирать нуклеосомы на любой матрице ДНК без необходимости в строгом позиционировании нуклеосомных последовательностей, регулировать плотность нуклеосом по требованию и использовать меньшее количество реагентов. Образование нуклеосом in situ происходит в течение нескольких секунд, что упрощает экспериментальный рабочий процесс и удобный переход к измерениям на одной молекуле. Далее описываются примеры двух последующих анализов для зондирования механики нуклеосом и визуализации поведения отдельных белков на хроматине.

Введение

Первичной упаковочной единицей эукариотического хроматина является нуклеосома, в которой ~147 пар оснований (..) ДНК обернуты вокруг октамера белков ядра гистонов 1,2. В дополнение к упаковке генома, нуклеосомная архитектура служит еще одним богатым слоем биофизической регуляции, который может быть использован хроматин-связывающими белками при выполнении ими различных функций 3,4. Экспериментальный доступ к физическим характеристикам нуклеосом и их измерение были технически сложными, поскольку эти единицы работают в мельчайших масштабах (например, нанометровые длины, силы пиконьютонов), и, таким образом, их зондирование требует достаточной чувствительности и точности для осмысленного информирования о функции. Более того, хроматин-связывающие белки часто взаимодействуют со своими субстратами временно, и большинству подходов к ансамблю не хватает соответствующего временного разрешения для информирования кинетики этих взаимодействий. К счастью, появление одномолекулярных методов сделало возможным визуализировать и манипулировать отдельными белками и их взаимодействиями в режиме реального времени, раскрывая механистическую информацию об этих молекулярных событиях, происходящих на наноуровне. В частности, одномолекулярная корреляционная силовая и флуоресцентная микроскопия (smCFFM) использует как инструменты обнаружения флуоресценции с высоким разрешением, так и инструменты манипулирования силой для одновременного определения механики, состава и координации хроматина и хроматин-белковых комплексов 7,8.

В smCFFM, где в качестве метода манипулирования силой используется «оптический пинцет», плотно сфокусированный лазер используется для захвата диэлектрического объекта, обычно пластикового шарика микронного размера, втрех измерениях. Биополимер, такой как фрагмент ДНК, может быть конъюгирован с шариком (например, с помощью, например, связи стрептавидин-биотин, дигоксигенин-анти-дигоксигенин антитела), и пользователь может как применить калиброванную силу, так и измерить силу/смещение, генерируемое системой10. Добавленный флуоресцентный модуль позволяет одновременно получать многоцветную флуоресцентную визуализацию для отслеживания состава и поведения белка.

Основной метод восстановления нуклеосомных матриц для smCFFM включает сборку нуклеосом на пользовательских матрицах ДНК с помощью солевого диализа 11,12,13. В этой процедуре очищенные октамеры гистонов инкубируют с матрицами ДНК в буфере с высоким содержанием соли (~1 М хлорида натрия), и по мере медленного диализа соли нуклеосомы спонтанно собираются на ДНК в зависимости от последовательности позиционным образом14,15. Таким образом, обычно сильные нуклеосомные позиционирующие последовательности (например, Widom 60116, X. laevis 5S рДНК17) встраиваются в матрицы ДНК для создания пользовательских нуклеосомных массивов. Несмотря на то, что этот хорошо зарекомендовавший себя метод обеспечивает точный контроль над размещением и количеством нуклеосом в ДНК, он имеет ряд недостатков: (1) включение последовательностей ДНК с сильным позиционированием нуклеосом может привести к образованию искусственно стабильных нуклеосом, которые искажают активность хроматин-связывающих белков, (2) процесс солевого диализа для образования нуклеосом требует большого количества ДНК и октамеров. и (3) процедура требует от одного до нескольких дней работы, а также значительных усилий для титрования правильного соотношения ДНК и октамера для оптимальной плотности нуклеосомной матрицы.

В этой рукописи мы описываем альтернативный метод формирования нуклеосом вдоль ДНК in situ в одномолекулярном коррелятивном и флуоресцентном микроскопе с использованием рекомбинантного гистонового шаперона Nap1, который напоминает физиологический путь образования нуклеосом in vivo 18,19,20,21,22. Этот метод позволяет пользователям собирать нуклеосомы на неспецифических последовательностях ДНК, легко регулировать плотность нуклеосом и использовать значительно меньшее количество реагентов, и все это в течение нескольких минут. Кроме того, формирование связок нуклеосомной ДНК in situ упрощает экспериментальный рабочий процесс и делает его более удобным для визуализации и манипулирования одной молекулой. Таким образом, когда равномерное и специфическое позиционирование нуклеосом не является необходимостью, этот протокол предлагает полезный вариант для исследования механики нуклеосом или поведения белка на хроматине, для которого мы также описываем примеры анализов.

Протокол

Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованном в исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Получение биотинилированной ДНК

  1. Приготовьте объемную реакцию объемом 120 мкл, содержащую 20 мкг λ ДНК, 33 мкМ биотина-dCTP, 33 мкМ биотина-dUTP, 33 мкМ биотина-dATP, 33 мкМ dGTP, 10 единиц фермента Кленоу и 1x NEB Buffer 2.
    Примечание: В данной процедуре специально используется линейная двухцепочечная (ds) геномная ДНК бактериофага λ без метилирования (48 502.с.), которая содержит 12-нуклеотидную (nt) 5'-одноцепочечную (ss) ДНК23. Тем не менее, протокол может быть адаптирован для использования любой длины или последовательности линейной дцДНК при условии, что она содержит, по меньшей мере, несколько nt 5'-выступов, причем длина и последовательность nt определяют количество биотинилированных nts, установленных на каждом конце для последующего связывания между оптическими ловушками. Кроме того, реакцию можно уменьшить. Например, 5 г ДНК можно использовать в реакции объемом 30 мкл. Кроме того, полученные таким образом субстраты ДНК не ограничены на кручение. Для получения информации о протоколах создания ДНК, ограниченной на кручение, обратитесь к ранее опубликованным отчетам 24,25.
  2. Инкубируйте реакцию при комнатной температуре в течение 15 минут.
  3. Добавьте 10 мМ ЭДТА и инкубируйте при 75 °C в течение 20 минут.
  4. Выполнение осаждения этанола для получения биотинилированного продукта ДНК.
    1. Добавьте 0,1x объем 3 М ацетата натрия и 3x объем ледяного 100% этанола. Хранить при температуре -20 °C не менее 1 часа до ночи. Центрифуга при 13 500 x g в течение 30 мин при 4 °C.
    2. Осторожно удалите надосадочную жидкость, не потревожив гранулы, и добавьте 1 мл 75% этанола. Центрифугируйте при 13 500 x g в течение 1 минуты при 4 °C.
    3. Повторите этапы удаления надосадочной жидкости, добавления этанола и центрифугирования.
    4. Осторожно удалите всю надосадочную жидкость и дайте гранулам высохнуть на воздухе в течение 10 минут. Растворите гранулу в 100-200 μл буфера TE или ddH2O (может инкубироваться при 37 °C для облегчения растворения). Измерьте концентрацию с помощью спектрофотометра Nanodrop.

2. Подготовка каналов в проточной камере

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура основана на коммерчески доступном микрофлюидном чипе (см. Таблицу материалов), но может быть адаптирована к любому прибору smCFFM с многоканальной проточной ячейкой.

  1. Пассивируйте каналы (гл) 4 и 5 (или любые гл. , которые будут содержать белки) (см. схему каналов на рисунке 1А). Добавьте 500 μL 0,1% BSA в каждый канал и пейте со скоростью 0,8 бар (~0,45 μЛ/с для трубок с внутренним диаметром 0,010 дюйма) в течение 8 мин. Удалите раствор.
  2. Добавьте 500 мкл 0,05% Pluronic-F127 в каждый канал и пейте со скоростью 0,8 бар в течение 8 минут. Удалите раствор и промойте шприцы 1x PBS. Добавьте 2 мл 1x PBS в каждый канал и пейте со скоростью 0,8 бар в течение 27 минут.
  3. Вортексируйте исходный раствор шариков, покрытых стрептавидином (для этой процедуры используются шарики размером 3,13 мкм) и добавьте 2,15 мл раствора гранул к 1 мл 1x PBS. Добавить в гл. 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер и концентрация шариков, покрытых стрептавидином, могут быть отрегулированы в соответствии с предпочтениями пользователя.
  4. Добавьте 30-80 нг биотинилированной λ ДНК в 1 мл 1x PBS. Добавить в гл. 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация биотинилированной ДНК может быть отрегулирована в соответствии с предпочтениями пользователя. Большее количество ДНК увеличит частоту формирования ДНК-тросов, но также повысит частоту связывания нескольких молекул ДНК одновременно, что может усложнить эксперимент.

3. Nap1-опосредованное образование нуклеосом in situ

  1. Добавьте 500 мкл безбелкового буфера для изображения в гл. 3.
    Примечание: Буферная композиция в главе 3 является гибкой и должна быть подходящей как для нуклеосом, так и для конкретного белка (белков), представляющего интерес. По желанию пользователи могут выбрать добавление систем очистки кислорода для уменьшения фотообесцвечивания флуорофоров и/или конкурирующей ДНК для удаления октамеров гистонов, которые не упакованы должным образом в нуклеосомы.
  2. Добавьте 2 нМ S. cerevisiae Nap1 и 2-5 нМ меченого LD655 гистонового октамера (HO) H4 к 500 мкл 1x HR буфера18. Добавить в гл. 4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гистон-октамеры и Nap1 могут быть коммерчески приобретены или приготовлены на месте (см. Таблицу материалов). Количество нуклеосом, которые должны быть сформированы вдоль каждой привязанной ДНК, зависит от концентрации октамера, а также от времени, проведенного в этом канале. Желаемая и приближенная плотность нуклеосом пользователя вдоль каждой молекулы ДНК может быть модулирована путем регулировки одного или обоих этих параметров. Кроме того, пользователь может выбрать маркировку гистоновых октамеров предпочитаемым флуорофором.
  3. Необязательно: Добавьте хроматин-связывающий белок или другой белок, представляющий интерес, в главу 5 в соответствующий буфер.
  4. Протекайте все каналы со скоростью 1,0 бар (~0,55 мкл/с в текущей экспериментальной установке) в течение 30 с, чтобы промыть каналы проточной ячейки образцами.
  5. Установите расход на 0,2 бар (~0,16 μл/с в текущей экспериментальной установке). Переместите оптические ловушки (ОТ) в гл. 1 и поймайте подходящую пару шариков, покрытых стрептавидином.
  6. Переместите ОТ в главу 3, проведите силовую калибровку для пары шариков, включите красный конфокальный лазер (или другую линию лазера по выбору) и откалибруйте область визуализации.
  7. Установите расход на 0,2 бар и переместите ОТ на главу 2. Улавливайте биотинилированную ДНК.
  8. Переместите ОТ на гл. 3 и остановите поток. Увеличьте расстояние между ОТ, чтобы растянуть ДНК, и отслеживайте соответствующую кривую сила-расстояние (FD), чтобы подтвердить наличие одного троса ДНК (в отличие от нескольких тросов). Кривая должна следовать модели червеобразной цепи для дцДНК при заданной длине контура26.
  9. Отрегулируйте расстояние между ОТ так, чтобы напряжение ДНК составляло примерно 1 пН.
    Примечание: Напряжение в 1 пН достаточно низкое, чтобы нуклеосомы оставались обернутыми в ДНК27 , но достаточно высокое, чтобы поместить всю молекулу ДНК в ось визуализации линии.
  10. Включите линейное сканирование, чтобы начать сбор кимографа с включенным красным лазером.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кимографы или 2D-сканирования привязанной ДНК могут быть получены, в соответствии с предпочтениями пользователя.
  11. Переместите ОТ на главу 4 с выключенным потоком. С помощью Nap1 HO загружаются в ДНК и оборачиваются для формирования нуклеосом в режиме реального времени. Загрузка нуклеосом визуализируется в виде флуоресцентных траекторий, появляющихся на ДНК внутри кимографов. В то же время, образование нуклеосом на ДНК можно контролировать по увеличению силы по мере того, как все больше НО нагружаются, когда положения ОТ остаются постоянными.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лазер возбуждения флуоресценции может быть отключен на этапах формирования нуклеосом, чтобы избежать фотообесцвечивания флуорофоров. Кроме того, неспецифическое связывание гистоновых октамеров с ДНК, при котором октамеры не обернуты в нуклеосомы, может происходить с использованием этого протокола. Эти события связывания не приводят к «разрыву» при растяжении ДНК, как описано в приведенном ниже протоколе «Разворачивание нуклеосом» (шаг 4), и иногда могут быть смыты мягким потоком буфера, особенно если буфер содержит свободную конкурирующую ДНК.
  12. Когда будет сформировано примерное нужное количество нуклеосом, приступайте к сбору данных.

4. Раскрытие нуклеосом

  1. Выполните шаги 2 и 3.
  2. После формирования троса ДНК, содержащего нуклеосомы, переместите ОТ в главу 3.
  3. Подготовьтесь к экспериментам по раскрытию нуклеосом, сократив расстояние между ОТ до тех пор, пока сила не станет примерно равной нулю. Обнулите силу.
  4. Начните перемещение OT 1 от OT 2 с постоянной скоростью 0,1 мкм/с. На кимографе бусина в ОТ 1 будет визуально удаляться от бусины в ОТ 2. На кривой FD сила будет увеличиваться по мере увеличения расстояния. По мере раскрытия нуклеосом будут возникать «разрывы» или переходы в силе (~8-37 пН), которые означают распутывание внутренней оболочки отдельных нуклеосом 27,28,29.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сила, с которой происходит разворачивание, зависит от скорости вытягивания, которая ожидается при неравновесных процессах. Иногда несколько нуклеосом разворачиваются одновременно, вызывая большее изменение расстояния при переходе по кривой FD. Кроме того, распущение внешней оболочки нуклеосомы не так хорошо видно в этих экспериментальных условиях (см. раздел «Обсуждение»).

5. Визуализация связывания белка с хроматином

  1. Выполните шаги 2 и 3.
  2. Добавьте 10 нМ меченого Cy3 линкера гистона H1.4 к 500 мкл буфера изображения в главе 5.
    Любой представляющий интерес белок может быть добавлен в гл. 5 в концентрации по выбору (обычно ниже 100 нМ для визуализации одной молекулы).
  3. После формирования троса ДНК, содержащего нуклеосомы, включите зеленый лазер в дополнение к красному лазеру и переместите OTs на главу 5 для визуализации связывания H1 с хроматином в режиме реального времени.
  4. Продолжайте собирать кимографы или сканы до тех пор, пока не будет достигнута достаточная статистика (не менее ~10-20 кимографов в зависимости от частоты событий и сложности эксперимента).

Результаты

С помощью схемы, описанной на шаге 3 (рис. 1A), формирование нуклеосом вдоль троса ДНК визуализировалось как появление красных флуоресцентных очагов на 2D-сканировании (рис. 1B, слева) или траекторий с течением времени на кимографе (рис. 1B, справа). Правильно упакованные нуклеосомы давали траектории флуоресценции, которые были неподвижными во времени в пределах дифракционного предела конфокального детектирования (~300 нм). Примечательно, что множественные нуклеосомы, образовавшиеся рядом друг с другом ниже дифракционного предела, не могут быть пространственно разрешены и выглядят как более яркие очаги или траектории. Тем не менее, этапы фотообесцвечивания отдельных нуклеосомных траекторий были проанализированы и часто показывали 1-ступенчатые (рис. 1C) или 2-ступенчатые (рис. 1D) события фотообесцвечивания, что указывает на то, что очаги в основном содержали мононуклеосомы, учитывая примерно 70% скорость мечения белка H4 в этом образце. Более того, на основе среднего количества фотонов для одного флуорофора LD655 в этом экспериментальном условиях было оценено количество меченых копий H4 в каждой траектории нуклеосомы, что показало, что нуклеосомные локусы преимущественно (>75%) содержали 1 или 2 меченые копии H2A (рис. 1E), что опять же согласуется с представлением о том, что они были первоначально загружены как пространственно разделенные мононуклеосомы. Другие, более яркие фокусы содержали более 3 копий меченого H4, вероятно, представляющих несколько нуклеосом в пределах дифракционного предела.

Образование нуклеосом также контролировалось по увеличению натяжения вдоль троса, когда положение ОТ оставалось неизменным по мере того, как больше ДНК оборачивалось вокруг гистоновых октамеров (рис. 1B, внизу). В отсутствие Nap1 октамеры гистонов все еще могут связываться с ДНК, но остаются в основном неразвернутыми, поскольку связанное с этим напряжение при удержании позиций OT остается постоянным (рис. 1F). Не исключено, что неспецифическое связывание октамеров гистонов с ДНК происходит даже в присутствии Nap1. В другом эксперименте был проведен тот же протокол формирования нуклеосом, содержащих H2A, меченный Cy3, который дал результаты, аналогичные тем, которые были выполнены с LD655-меченым H4 (рис. 1G), что указывает на сборку интактных октамеров в нуклеосомы.

Используя установку, описанную на шаге 4 (рисунок 2A), раскрытие нуклеосом визуализировалось с течением времени на кимографе по мере увеличения расстояния между тросами (рисунок 2B). Ранее сообщалось, что октамеры гистонов часто остаются связанными с ДНК после развертки30,31, и поэтому флуоресцентные траектории часто сохраняются даже при высоких напряжениях. Раскрытие нуклеосом также контролировалось на соответствующей кривой FD (рис. 2C). Поддающиеся количественной оценке характеристики кривой FD включают в себя силу, с которой нуклеосома (нуклеосомы) разворачиваются (см. «Переход F» на врезке на рисунке 2C), а также длину ДНК, которая была высвобождена из октамера гистонов (см. «ΔL» на врезке на рисунке 2C), которая существует с кратностью ~24 нм, что согласуется с независимым раскрытием внутренних витков ДНК отдельных нуклеосом27. 30. Эти параметры могут быть использованы для оценки количества нуклеосом, образующихся на каждом тросе, или для дополнительного последующего анализа механики нуклеосом. Таким образом, количество разрывов с внутренним поворотом, полученных в экспериментах по механическому вытягиванию, сравнивалось с оценочным числом меченых копий H4 на каждой траектории нуклеосом на основе интенсивности мономера, что показало, что эти числа в значительной степени согласуются (примеры показаны на рисунках 2D-G). Тем не менее, было отмечено, что они не полностью совпадают из-за ~70% меченой эффективности белка H4 в образце и любого остаточного Nap1-независимого связывания гистонов с ДНК, как показано на рисунке 1F. Наконец, как и ожидалось, растягивание Nap1-связанных оголенных нитей ДНК (без гистонов) не приводит к форсированным переходам (рисунок 2H), что указывает на то, что Nap1 сам по себе существенно не искажает ДНК.

Используя установку, описанную на шаге 5 (рис. 3A), связывание линкерного гистона H1 с хроматином визуализировали как появление зеленых флуоресцентных очагов вдоль хроматинового троса (рис. 3B). Примечательно, что H1-связанные нуклеосомы генерировали двухцветные траектории (см. белые стрелки на рисунке 3B), которые казались неподвижными с течением времени. Кроме того, наблюдались диффундирующие траектории H1 через участки ДНК, свободные от нуклеосом (см. зеленые звезды на рисунке 3B).

figure-results-1
Рисунок 1: Nap1-опосредованное образование нуклеосом in situ . (A) Схема экспериментальной установки, описанной в Nap1-опосредованном протоколе формирования нуклеосом in situ (шаг 3). Пара бусин была оптически захвачена в гл. 1, а одна молекула λ ДНК была связана между бусинами через биотин-стрептавидиновую связь в гл. 2. Затем трос был перемещен в гл. 4, содержащий меченые LD655 октамеры гистонов (красный) и Nap1 для формирования нуклеосом в реальном времени по всей ДНК. (B) Репрезентативное 2D-сканирование (слева) и кимография (справа) меченого LD655-H4 нуклеосомного ДНК-троса. Соответствующее показание силы (внизу) показывает увеличение силы сразу же при перемещении троса в главу 4, когда положения ОТ остаются постоянными, что указывает на обертывание нуклеосом. Более яркие траектории обозначают множественные соседние нуклеосомы, расположенные в пределах дифракционного предела ~300 нм. (C) Пример кимографа, показывающего 1-ступенчатое фотообесцвечивание (белая стрелка) нуклеосомы, содержащей LD655-H4. (D) Пример кимографа, показывающего двухступенчатое фотообесцвечивание (белые стрелки) нуклеосомы, содержащей LD655-H4. (E) Относительная частота числа меченых LD655 H4 на траекторию, оцененная по интенсивности их флуоресценции. (F) Репрезентативная кимография троса, связанного с гистоновыми октамерами в отсутствие Nap1. Связанное с этим силовое показание (внизу) остается неизменным, даже когда октамеры гистонов связываются с ДНК. (G) Репрезентативный кимограф меченного Cy3-H2A нуклеосомного ДНК-троса. Соответствующее показание силы (внизу) показывает увеличение силы сразу же при перемещении троса в главу 4 (содержащую октамеры и Nap1), поскольку нуклеосомы образуются, когда позиции OT остаются постоянными. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Анализ раскрытия нуклеосом. (А) Схема экспериментальной установки, описанной в протоколе раскрытия нуклеосом (шаг 4). Трос ДНК, содержащий нуклеосомы, перемещали в гл. 3, содержащую безбелковый буфер изображения, где расстояние между бусинами увеличивалось, а нуклеосомы разворачивались. (B) Репрезентативный кимограф нуклеосомного троса ДНК, натянутого с высокой силой за счет постепенного увеличения межбусинного расстояния. Снижение интенсивности флуоресценции по направлению к нижней бусине, вероятно, было связано с небольшим наклоном ДНК от фокуса сканирования линии. (C) Соответствующая кривая FD, показывающая вызванные силой переходы разворачивания внутреннего поворота, происходящие в диапазоне от 8 до 37 пН. На врезке показан увеличенный вид примера перехода, для которого можно записать и дополнительно проанализировать расстояние разворачивания (ΔL = ~24 нм для внутреннего витка ДНК отдельных нуклеосом) и силу перехода (переход F). Для этого троса было развернуто 26 нуклеосом, и трос разорвался при температуре ~65 пН, что обозначено белой пунктирной линией на кимографе. (Д,Э) Пример нуклеосомного троса, содержащего LD655-H4, натянутого под действием высоких сил, где количество H4 на траекторию оценивается с помощью интенсивности флуоресценции (указано на кимографе, D), а количество обернутых нуклеосом оценивается по размеру изменения расстояния, вызванного силой (указано на соответствующей кривой сила-расстояние, E). (Ф,Г) Другой пример, как в (D,E). (H) Тросы ДНК (n = 5) растягиваются с высокой силой после инкубации в канале, содержащем только Nap1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Визуализация белок-хроматинового взаимодействия. (A) Схема экспериментальной установки, описанной в протоколе визуализации связывания белка с хроматином (шаг 5). Трос ДНК, содержащий нуклеосомы, перемещали в гл. 5, содержащую 10 нМ меченого Cy3 линкера гистона H1 (зеленого цвета). (B) Репрезентативный двухцветный кимограф связывания H1 с нуклеосомным ДНК-тросом. События колокализации H1-нуклеосом обозначены белыми стрелками. Траектория несвязанных нуклеосом обозначается пурпурной стрелкой. Молекулы H1, диффундирующие на голой ДНК, обозначаются зелеными звездами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Описанный протокол обеспечивает ряд преимуществ для восстановления нуклеосом, включая минимизацию реагентов и времени, а также возможность шаперон-зависимого формирования нуклеосом вдоль любой (потенциально нативной) последовательности ДНК. Кроме того, метод in situ позволяет упростить экспериментальный рабочий процесс и удобно перейти к одномолекулярным анализам механики нуклеосом и взаимодействия белка с хроматином. С другой стороны, ограничения этого подхода включают невозможность прямого позиционирования нуклеосом вдоль ДНК (даже при включении сильных последовательностей позиционирования нуклеосом) и точного контроля количества нуклеосом, образующихся на один трос ДНК (хотя это может быть эмпирически настроено путем стандартизации экспериментального рабочего процесса). По сути, те, кто выбирает этот метод, жертвуют точным контролем позиционирования и плотности нуклеосом для большей простоты рабочего процесса и низкой потребности в реагентах, выбор которых зависит от каждого конкретного эксперимента. Также отмечается, что внешний поворот ДНК не разрешен в текущем протоколе из-за большой длины троса (~48,5 кбит/с) и условий буфера32. Для получения информации о внешнем повороте ДНК, а также о межнуклеосомном укладывании, пользователь может выбрать сокращение длины ДНК и нагрузку нуклеосом более высокой плотности на ДНК и/или использовать метод солевого диализа для размещения нуклеосом на сильных позиционирующих последовательностях, разделенных регулярными длинами линкеров. Наконец, вероятно, произойдет неспецифическое связывание октамеров гистонов с ДНК; Поэтому при интерпретации результатов важно учитывать как флуоресцентные, так и силовые сигналы.

Одним из важнейших аспектов текущего протокола является обеспечение того, чтобы пользователь достиг высокой скорости флуоресцентного мечения для гистоновых октамеров (если требуется визуализация), чтобы большинство, если не все, нуклеосомы могли быть визуально обнаружены. Еще одним важным аспектом является подтверждение того, что пользователь выбрал подходящий буфер для канала визуализации, совместимый с нуклеосомами и любыми другими белками, представляющими интерес. Специфические для пользователя модификации протокола могут включать конъюгацию флуорофора с другим гистоном (см. отчеты 33,34 для примеров использования этого метода для формирования нуклеосом с мечеными H3 или H2B), выбор альтернативного флуорофора, включение ДНК-тросов различных последовательностей и длины, добавление системы поглощения кислорода для продления срока жизни флуорофоров, выбор другого размера гранул; и использование альтернативной системы конъюгации ДНК-гранул (например, связывание антител дигоксигенин-анти-дигоксигенин).

Таким образом, описанный метод предоставляет smCFFM удобный и универсальный подход к созданию нуклеосомных тросов, которые могут быть легко использованы для изучения широкого спектра вопросов в биологии, связанных с хроматином. Применимые области исследований включают механику хроматина, регулируемую вариантами гистонов и посттрансляционными модификациями, биофизическое взаимодействие и кинетику хроматин-связывающих белков, а также процессы сборки более высокого порядка, управляемые нуклеосомами, такие как биомолекулярная конденсация 35,36,37,38.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

G.N.L.C. выражает признательность за поддержку со стороны Национального института психического здоровья Национальных институтов здравоохранения (NIH) в рамках гранта под номером F31MH132306. С. Л. поддерживается Фондом Робертсона, Международным фондом синдрома Ретта и NIH (награда No R01GM149862).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1x буфер HRн/д н/д30 мМ  Трис  ацетат pH 7,5, 20 мМ ацетат магния, 50 мМ хлорид калия, 0,1 мг/мл BSA 
1x PBS (фосфатно-солевой буфер)Н/ДН/Д137 мМ натрия хлорида, 2,7 мМ хлорида калия, 10 мМ натрия фосфата двухосновного, 1,8 мМ калия фофата одноосновного 
Уксусная кислота, ледянаяМиллипоры SigmaAX0074-6Используйте для получения трис ацетата
Биотин-11-dUTPJena BioscienceNU-803-BIOX-S
Jena BioscienceNU-835-BIO14-S
Biotin-14-dCTPJena BioscienceNU-956-BIO14-S
Бычья сыворотка АльбуминМиллипоры SigmaA9418-50GРастворение в H2O и пропустить через фильтр 0,22 мкм
Cy3 Малеимид Монореактивный красительCytivaPA23031Малеимид функционализированный Cy3 флуорофор
dGTPNew England BiolabsN0442S
Eppendorf Centrifuge 5425 R FisherScientific05-414-051Настольная центрифуга с охлаждением
Этиловый спирт, ЧистаяМиллипора Sigma459844
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)Миллипоры сигмаE9884растворяют в H2O до 0,5 М
октамера гистонов человека (H4, L50C; H2A, K119C) Н/Д Н/ДРекомбинантные белки гистонов и белки, содержащие меченые мутации, очищали на месте, как описано ранее (см. ссылки 33, 34, 35, 36). Вкратце, рекомбинантные гистоны экспрессировались в клетках BL21 (De3) pLySS (Promega). Тельца включения выделяли после ультразвуковой обработки, а гистоны экстрагировали в условиях денатурации. Гистоны диализовали в буфер А (7 М мочевины, 10 мМ трис гидрохлорида pH 8,0, 100 мМ натрия хлорида, 1 мМ ЭДТА и 5 мМ 2-меркаптоэтанола) и раствор добавляли в гравитационную колонну, загруженную Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). Затем сквозной поток добавляли в гравитационную колонку, загруженную SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), и гистоны элюировали из колонки путем добавления буфера А с добавлением 600 мМ хлорида натрия. Гистоны, несущие мутации маркировки (H4, L50C; H2A, K119C) очищали, а затем конъюгировали с нужным флуорофором с помощью малеимид-функционализированных красителей (Cytiva, Lumidyne) с использованием молярного соотношения красителя и белка 20:1 (см. ссылки 33, 34). Октамеры гистонов собирали путем добавления равного молярного соотношения каждого гистона дикого типа или меченного флуорофором в условиях денатурации, диализовали в буфер с высоким содержанием солей, содержащий 2 М хлорида натрия, а затем очищали с помощью эксклюзионной хроматографии, как описано ранее (см. ссылки 36, 37). В качестве альтернативы можно приобрести отдельные гистоновые белки и готовые октамеры гистонов (например, Epicypher).
Буфер изображенияН/ДН/Д20 мМ трис гидрохлорид pH 8,0, 100 мМ хлорид натрия
Кленоу Фрагмент (от 3' до 5' экзо-)New England BiolabsM0212S
Лямбда ДНК (dam-, dcm-)Thermo Fisher ScientificSD0021Без метилирования &лямбда; ДНК
LD655-MALLumidyne Technologies9Малеимид функционализированный LD655 флуорофор
Линкер гистон H1.4 (A4C)N/AN/AОчищенный рекомбинантный белок собственного производства (см. ссылку 38)
LUMICKS C-Trap DymoLUMICKSN/AКонфигурация с двумя ловушками; стандартные материалы для прибора предоставлены производителем
Раствор ацетата магнияMillipore Sigma63052-100MLИспользуйте для приготовления буфера HR
NEBuffer 2New England BiolabsB7002SВ комплекте с набором фрагментов
Pluronic F-127Millipore SigmaP2443-250GРастворите в H2O и пропустите через фильтр 0,22 мкм
Хлорид калияMillipore SigmaP3911Используйте для приготовления PBS и буфера HR
Одноосновательный фосфат калияMillipore SigmaP0662Используйте для изготовления PBS
S. cerevisiae Nap1N/A/ANap1 был очищен на месте, как описано ранее (см. ссылки 33, 34). В качестве альтернативы можно приобрести Nap1 на коммерческой основе (например, Active Motif).
Ацетат натрияMillipore Sigma241245растворить в H2O до 3 M
Хлорид натрияMillipore SigmaS9888Использовать для создания PBS и буфера изображения
Двухосновной фосфат натрияMilliporeSigma S9763Использовать для изготовления PBS
SPHERO Частицы, покрытые биотином (3,0-3,4 & микро; m)SpherotechTP-30-5
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c СпектрофотометрFisher ScientificND2000NanoDrop Спектрофотометр
Tris BaseFisher ScientificBP152-500Растворить в H2O и отрегулировать до соответствующего pH; использовать для создания буфера изображения и трис ацетата
Биотин-14-dATP N

Ссылки

  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: A repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
  3. Zhou, K., Gaullier, G., Luger, K. Nucleosome structure and dynamics are coming of age. Nat Struct Mol Biol. 26, 3-13 (2019).
  4. McGinty, R. K., Tan, S. Principles of nucleosome recognition by chromatin factors and enzymes. Curr Opin Struct Biol. 71, 16-26 (2021).
  5. Fierz, B., Poirier, M. G. Biophysics of chromatin dynamics. Annu Rev Biophys. 48, 321-345 (2019).
  6. Single-molecule techniques: A laboratory manual. Selvin, P. R., Ha, T. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
  7. Chua, G. N. L., Liu, S. When force met fluorescence: Single-molecule manipulation and visualization of protein-DNA interactions. Annu Rev Biophys. , (2024).
  8. Hashemi Shabestari, M., Meijering, A. E. C., Roos, W. H., Wuite, G. J. L., Peterman, E. J. G. Recent Advances in biological single-molecule applications of optical tweezers and fluorescence microscopy. Methods Enzymol. 582, 85-119 (2017).
  9. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Opt Lett. 11, 288(1986).
  10. Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
  11. Hansen, J. C., van Holde, K. E., Lohr, D. The mechanism of nucleosome assembly onto oligomers of the sea urchin 5 S DNA positioning sequence. J Biol Chem. 266, 4276-4282 (1991).
  12. Salt Peterson, C. L. gradient dialysis reconstitution of nucleosomes. CSH Protoc. 2008, 5113(2008).
  13. Leicher, R., Liu, S. Probing the interaction between chromatin and chromatin-associated complexes with optical tweezers. Methods Mol Biol. 2478, 313-327 (2022).
  14. Segal, E., et al. A genomic code for nucleosome positioning. Nature. 442, 772-778 (2006).
  15. Ioshikhes, I. P., Albert, I., Zanton, S. J., Pugh, B. F. Nucleosome positions predicted through comparative genomics. Nat Genet. 38, 1210-1215 (2006).
  16. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J Mol Biol. 276, 19-42 (1998).
  17. Chipev, C. C., Wolffe, A. P. Chromosomal organization of Xenopus laevis oocyte and somatic 5S rRNA genes in vivo. Mol Cell Biol. 12, 45-55 (1992).
  18. Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination. Cell. 181, 1380-1394 (2020).
  19. Vlijm, R., et al. Comparing the assembly and handedness dynamics of (H3.3-H4)2 tetrasomes to canonical tetrasomes. PLoS One. 10, e0141267(2015).
  20. Mazurkiewicz, J., Kepert, J. F., Rippe, K. On the mechanism of nucleosome assembly by histone chaperone NAP1. J Biol Chem. 281, 16462-16472 (2006).
  21. Nakagawa, T., Bulger, M., Muramatsu, M., Ito, T. Multistep chromatin assembly on supercoiled plasmid DNA by nucleosome assembly protein-1 and ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor. J Biol Chem. 276, 27384-27391 (2001).
  22. Andrews, A. J., Chen, X., Zevin, A., Stargell, L. A., Luger, K. The histone chaperone Nap1 promotes nucleosome assembly by eliminating nonnucleosomal histone DNA interactions. Mol Cell. 37, 834-842 (2010).
  23. Wu, R., Taylor, E. Nucleotide sequence analysis of DNA. II. Complete nucleotide sequence of the cohesive ends of bacteriophage lambda DNA. J Mol Biol. 57, 491-511 (1971).
  24. King, G. A., Peterman, E. J., Wuite, G. J. Unravelling the structural plasticity of stretched DNA under torsional constraint. Nat Commun. 7, 11810(2016).
  25. Paik, D. H., Roskens, V. A., Perkins, T. T. Torsionally constrained DNA for single-molecule assays: An efficient, ligation-free method. Nucleic Acids Res. 41, e179(2013).
  26. Bustamante, C. J., Chemla, Y. R., Liu, S., Wang, M. D. Optical tweezers in single-molecule biophysics. Nat Rev Methods Primers. 1, 25(2021).
  27. Diaz-Celis, C., et al. Assignment of structural transitions during mechanical unwrapping of nucleosomes and their disassembly products. Proc Natl Acad Sci USA. 119, e2206513119(2022).
  28. Leicher, R., et al. Single-molecule and in silico dissection of the interaction between Polycomb repressive complex 2 and chromatin. Proc Natl Acad Sci USA. 117, 30465-30475 (2020).
  29. Chua, G. N. L., et al. Differential dynamics specify MeCP2 function at methylated DNA and nucleosomes. bioRxiv. , (2023).
  30. Brower-Toland, B. D., et al. Mechanical disruption of individual nucleosomes reveals a reversible multistage release of DNA. Proc Natl Acad Sci USA. 99, 1960-1965 (2002).
  31. McCauley, M. J., et al. Human FACT subunits coordinate to catalyze both disassembly and reassembly of nucleosomes. Cell Rep. 41, 111858(2022).
  32. Mihardja, S., Spakowitz, A. J., Zhang, Y., Bustamante, C. Effect of force on mononucleosomal dynamics. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15871-15876 (2006).
  33. Li, S., et al. Nucleosome-directed replication origin licensing independent of a consensus DNA sequence. Nat Commun. 13, 4947(2022).
  34. Li, S., et al. Origin recognition complex harbors an intrinsic nucleosome remodeling activity. Proc Natl Acad Sci USA. 119, e2211568119(2022).
  35. Harada, B. T., et al. Stepwise nucleosome translocation by RSC remodeling complexes. Elife. 5, e10051(2016).
  36. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Expression and purification of recombinant histones and nucleosome reconstitution. Methods Mol Biol. 119, 1-16 (1999).
  37. Rogge, R. A., et al. Assembly of nucleosomal arrays from recombinant core histones and nucleosome positioning DNA. J Vis Exp. (79), e50354(2013).
  38. Leicher, R., et al. Single-stranded nucleic acid binding and coacervation by linker histone H1. Nat Struct Mol Biol. 29, 463-471 (2022).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in situNap1

Похожие статьи