Методическая статья

Анализ миграции in vitro в режиме реального времени на первичные мышиные CD8+ Т-клетки

2.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66580

⸱

24 мая 2024 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester, 2David H. Smith Center for Vaccine Biology and Immunology, University of Rochester

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол обеспечивает метод первичной изоляции Т-клеток мыши и покадровую микроскопию миграции Т-клеток в конкретных условиях окружающей среды с количественным анализом.

Аннотация

Адаптивный иммунный ответ зависит от способности Т-клеток мигрировать через кровь, лимфу и ткани в ответ на патогены и инородные тела. Миграция Т-клеток является сложным процессом, требующим координации многих сигналов, поступающих из окружающей среды и местных иммунных клеток, включая хемокины, хемокиновые рецепторы и молекулы адгезии. Кроме того, на подвижность Т-клеток влияют динамические сигналы окружающей среды, которые могут изменить состояние активации, транскрипционный ландшафт, экспрессию молекул адгезии и многое другое. В естественных условиях сложность этих, казалось бы, взаимосвязанных факторов затрудняет различение отдельных сигналов, способствующих миграции Т-клеток. Этот протокол предоставляет ряд методов от выделения Т-клеток до компьютерного анализа для оценки миграции Т-клеток в режиме реального времени в высокоспецифических условиях окружающей среды. Эти условия могут помочь пролить свет на механизмы, регулирующие миграцию, улучшить наше понимание кинетики Т-клеток и предоставить убедительные механистические доказательства, которые трудно получить с помощью экспериментов на животных. Более глубокое понимание молекулярных взаимодействий, влияющих на миграцию клеток, важно для разработки улучшенных методов лечения.

Введение

Т-клетки являются основными эффекторами адаптивного, антиген-специфического иммунного ответа. На популяционном уровне Т-клетки неоднородны, состоят из клеточных субпопуляций с различными специализированными функциями. Важно отметить, что CD8+ Т-клетки являются основными цитолитическими эффекторами иммунной системы, которые непосредственно устраняют инфицированные или дисфункциональные клетки1.

Зрелые CD8+ Т-клетки находятся в тканях и циркулируют через кровь и лимфатические системы в поисках антигенов. Во время инфекции Т-клетки получают антигены в крови или тканях и быстро дренируются к селезенке или ближайшему дренажному лимфатическому узлу, чтобы начать продуктивный иммунный ответ. В любом случае Т-клетки активируются, подвергаются клональной экспансии и покидают лимфатическую систему, чтобы попасть в кровь, если ее там еще нет. Во время этого процесса внутриклеточная сигнализация обеспечивает подавление лимфатических рецепторов самонаведения и активацию многочисленных рецепторов интегрина и хемокинов, необходимых для тканеспецифической миграции2. В конечном счете, направленная миграция Т-клеток к местам инфекции обусловлена сходящимися сигналами окружающей среды, которые включают передачу сигналов интегрина и хемокина.

Хемокины можно разделить на два основных класса: (1) гомеостатические сигналы, которые необходимы для дифференцировки, выживания и базальной функции, и (2) воспалительные сигналы, такие как CXCL9, CXCL10 и CCL3, которые необходимы для хемотаксиса. Как правило, хемокины создают градиент сигнала, который управляет направленной миграцией, известной как хемотаксис, в дополнение к активации экспрессии интегрина1. Хемотаксис тонко регулируется и обладает высокой чувствительностью, при этом Т-клетки способны реагировать на крошечные изменения градиента, которые могут привести их к определенному направлению или месту.

В дополнение к этим факторам, связанным с Т-клетками, на миграцию также влияют состав и плотность внеклеточного матрикса (ВКМ). ВКМ состоит из плотной сети белков, включая коллаген и протеогликаны, которые обеспечивают каркас для адгезивных рецепторов интегрина на Т-клетках. Интегрины представляют собой разнообразное семейство трансмембранных белков, каждый из которых обладает узкоспециализированными связывающими доменами и нисходящими сигнальными эффектами. Динамическая экспрессия интегриновых рецепторов на поверхности Т-клетки позволяет быстро адаптироваться к изменяющейся среде3. Важно отметить, что интегрины соединяют ВКМ и внутриклеточные цитоскелетные актиновые сети, которые работают вместе, чтобы генерировать движущую силу, необходимую для движения Т-клеток.

Таким образом, модели миграции варьируются в зависимости от фенотипа иммунных клеток или сигналов окружающей среды. Эти сложные биологические процессы жестко регулируются экспрессией цитокинов, хемокинов и интегринов на поверхности Т-клетки, окружающих клетках и местных, инфицированных тканях. In vivo эти миграционные механизмы могут быть сложными и могут быть результатом нескольких аддитивных сигналов4. Из-за этой сложности может оказаться невозможным установить причинно-следственную связь между, казалось бы, взаимосвязанными переменными. Чтобы преодолеть это, существует несколько подходов in vitro для изучения специфических аспектов миграции Т-клеток, таких как реакция на специфические хемокиновые сигналы и взаимодействие между интегринами Т-клеток и электронно-связывающими белками. Этот протокол рассматривает методы выделения и активации CD8+ Т-клеток мыши, с анализами миграции in vitro в двумерном пространстве и инструментами вычислительного анализа для анализа определенной миграции Т-клеток. Эти методы выгодны для пользователя, поскольку они не требуют сложных материалов или устройств, как в случае с некоторыми другими анализами миграции клеток, описанными в литературе. Данные о миграции клеток, полученные с помощью этих методов, могут предоставить доказательства иммунных реакций в упрощенной форме, что позволяет проводить дальнейшие обоснованные исследования in vivo.

Протокол

Протоколы содержания животных были одобрены Университетским комитетом по животным ресурсам Рочестерского университета. Мыши в этом исследовании содержались в свободном от патогенов помещении для животных Университета Рочестера. В настоящем исследовании использовались самцы/самки мышей C57BL/6 в возрасте 6-12 недель (15-30 г). Изоляция тканей мышей может быть выполнена на столе с перчатками, закрывающими руки, и лицевой маской, закрывающей нос и рот, или в шкафу биобезопасности. Вся клеточная культура и подготовка планшетов должны выполняться в шкафу биобезопасности. Реагенты и оборудование, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Очистка и активация CD8+ Т-клеток

  1. Подготовка материалов
    1. Для отрицательного отбора CD8+ Т-клеток: Готовят среду отрицательной селекции из надосадочной жидкости гибридомных клеточных линий антител GK1.5 и M5/114, которые продуцируют анти-CD4 и анти-MHCII соответственно. Смешайте надосадочную жидкость в соотношении 1:1, отфильтруйте ее и храните при температуре 4 °C для использования в будущем (>0,5 мкг каждого антитела на миллион клеток). В качестве альтернативы доступны коммерческие наборы для выделения CD8+ Т-клеток.
    2. Для активации Т-клеток: Добавьте 500 мкл антител CD3 (10 мкг/мл) и CD28 (16 мкг/мл) в 1x DPBS (без кальция и магния) в 24-луночный планшет без культуры тканей (ТК) и храните в течение ночи при 4 °C для обеспечения связывания с планшетом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела и белки покрывают культуральные планшеты/чашки, не обработанные ТС, лучше, чем обычные чашки, обработанные ТС, поэтому для получения Т-клеток используются культуральные планшеты, не обработанные ТС.
  2. Приготовьте чашку для культивирования размером 10 см (или эквивалентную), поместив в чашку клеточное сетчатое фильтр размером 70 мкм, и нанесите в фильтр 2 мл среды R9 (среда R9: RPMI 1640x с добавлением 10% FBS, 1% антибиотика-антимикотика, 20 мМ буфера HEPES, 1% заменимых аминокислот MEM, 50 мкМ β-меркаптоэтанола).
  3. Получить мышь с подходящим генетическим фоном, полом, возрастом и весом, как определено в соответствии с планом эксперимента.
  4. Усыпьте мышь с использованием CO2 с последующим вывихом шейки матки или соответствующими стратегиями эвтаназии, определенными местными протоколами по уходу и использованию животных и одобренными учреждением.
  5. Поместите мышь в положение лежа на спине, вытяните все четыре конечности перпендикулярно телу и прикрепите подушечки лап к доске для вскрытия с помощью Т-образных штифтов для препарирования мыши или их эквивалента. Сделайте поверхностный центральный разрез через кожный слой на вентральной нижней части живота ножницами для хирургического препарирования мыши и разрежьте прямо до подбородка (~8 см). Отделите кожу от брюшинной выстилки, чтобы обнажить лимфатические узлы. Натяните кожу перпендикулярно в сторону от туловища и приколите ее вниз5.
    1. Аккуратно иссеките шейные, аксиальные, плечевые и паховые лимфатические узлы двусторонне с помощью тупых щипцов (или предпочтительного типа из стандартного набора для хирургической диссекции мышей). Переложите в ячеечное ситечко, подготовленное на шаге 1.2.
    2. Откройте брюшину и удалите селезенку. Переложите в ячеечное ситечко, подготовленное на шаге 1.2.
    3. Утилизируйте тушку мыши в соответствующем контейнере для биологически опасных веществ.
  6. Получить одноклеточную суспензию вторичных лимфоидных тканей путем механического разрушения на клеточном фильтре размером 70 мкм с 2 мл среды R9 с шага 1.2 путем многократного поворота инструмента для разрушения тканей на пол-оборота по часовой стрелке и против часовой стрелки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конец поршня шприца с люэровским замком, объемом 3 мл или 10 мл, хорошо измельчает и гомогенизирует ткань. Альтернативные материалы могут быть использованы на усмотрение пользователя.
  7. Промойте клетки, конец шприца, ситечко и чашку для культивирования 7 мл среды, следя за тем, чтобы ситечко оставалось в вертикальном положении, чтобы предотвратить перенос более крупных кусочков ткани или клеточных агрегатов, которые могут присутствовать в одноклеточной суспензии.
  8. Перенесите клеточную суспензию в коническую трубку объемом 15 мл.
  9. Гранулировать клетки при температуре 270 х г при комнатной температуре (20 °C) в течение 5 минут и сцедить надосадочную жидкость.
  10. Добавьте 500 мкл лизирующего буфера на 1 мин для удаления эритроцитов. Разбавьте 9,5 мл среды R9 и отжимайте при 270 x g (20 °C) в течение 5 минут. Сцедите надосадочную жидкость.
  11. Ресуспендировать гранулу в 10 мл предварительно приготовленной отрицательной селекционной среды, содержащей анти-MHCII и анти-CD4 (шаг 1.1.1). Катать при комнатной температуре (20 °C) в течение 30 минут.
  12. Гранулируйте клетки при 270 х г в течение 5 минут и сцедите надосадочную жидкость. Умойтесь 3 раза 10 мл среды R9.
  13. Одновременно в конической пробирке объемом 15 мл промыть 200 мкл овечьих антикрысиных шариков IgG в 7 мл среды. Поместите тюбик на магнит, извлеките среду и дважды повторите этап промывки. Ресуспендируйте шарики в 7 мл среды R9.
  14. Гранулируйте клетки при 270 х г (20 °С) в течение 5 минут, сцеживайте надосадочную жидкость, а затем повторно суспендируйте гранулу в 7 мл гранулированной суспензии с шага 1.13. Катать при комнатной температуре (20 °C) в течение 45 минут.
  15. Обогащение CD8+ Т-клеток путем истощения магнитных гранул. Поместите коническую трубку непосредственно на магнит без крышки на 3 минуты, чтобы удалить антитела/клетки, связанные с шариками. CD8+ клетки должны быть сохранены. Пока трубка все еще находится в магните, соберите клеточную суспензию с помощью серологической пипетки или ее эквивалента и перенесите ее в новую пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте при 270 x g (20 °C) в течение 5 минут и промойте 3 раза в средней среде.
  16. Промойте предварительно покрытую активационную пластину (шаг 1.1.2) 1x DPBS дважды без непосредственного пипетирования на нижней поверхности пластины.
  17. Дополнительно: Выполните разделение живых/мертвых лимфоцитов для удаления мертвых клеток.
    1. Переложите клетки в коническую трубку объемом 15 мл. Аккуратно добавьте 2 мл разделительной среды лимфоцитов на дно клеточной суспензии. Центрифугируйте при давлении 900 x g в течение 10 мин (при комнатной температуре) при низком ускорении и замедлении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Живые клетки будут разделяться на границе среды и разделительной среды (средний белый слой). Мертвые клетки будут накапливаться на дне пробирки и могут быть выброшены в конце.
    2. Перенесите средний слой, содержащий живые лимфоциты, в новую пробирку и центрифугируйте при температуре 270 x g в течение 5 минут при комнатной температуре. Сцедите надосадочную жидкость.
  18. Ресуспендировать гранулу в 12 мл среды с 10 Ед/мл рекомбинантной мышиной IL-2. Планшет 1 мл на лунку в 24-луночном планшете, не обработанном ТЧ, и переложите до 37 °C на ночь.

2. Поднятие активированных CD8+ Т-клеток

  1. Визуализируйте клетки с помощью стандартного настольного светового микроскопа с объективом 4x или 10x.
    Примечание: Активированные Т-клетки будут казаться более крупными и круглыми или удлиненными по сравнению с инактивированными Т-клетками и должны иметь плотные кластеры клеток по всей лунке.
  2. Чтобы поднять активированные клетки, разрушьте их с помощью пипетки объемом 1 мл, тщательно перемешав края пластины. Переложите клетки в новую коническую трубку объемом 15 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Активированные клетки более липкие и требуют более энергичного пипетирования.
  3. Промойте лунки 1 мл среды R9, чтобы удалить оставшиеся клетки. При необходимости повторите еще раз. Центрифугируйте ячейки при 270 x g (20 °C) в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость.
  4. Выполните разделение живых и мертвых лимфоцитов для удаления мертвых клеток, как показано в шагах 1.17-1.18.
  5. Поддерживайте содержание Т-клеток путем удаления живых/мертвых клеток каждые 3-4 дня в среде R9 с IL-2 в 6-луночном планшете, отличном от TC.
    Примечание: Т-клетки лучше размножаются в лунках малого размера во время ранней активации, возможно, из-за контактов Т-клеток с Т-клетками или растворимых факторов Т-клеток, которые помогают их активации. Быстрая пролиферация Т-клеток приводит к тому, что культуральная среда становится желтой в течение 24-48 ч после культивирования. На этом этапе поднимите клетки и перенесите их в более крупную лунку (без покрытия, без ТС 6-луночный планшет) с достаточным количеством свежей питательной среды для питания клеток (обычно 5 мл на лунку). Заменяйте истощенную среду свежей всякий раз, когда на это указывает изменение цвета желтой среды, или каждые 3-4 дня.

3. Подготовка стеклянной посуды

  1. Подготовьте камеры или планшеты для миграции стеклянных клеток, покрыв их 300 мкл/см2 протеином А (0,1 мг/мл) на ночь при температуре 4 °C, дважды промойте 1x DPBS, вылив на чашку и сцедив, прежде чем переходить к следующему этапу.
  2. Покройте миграционную камеру или планшет 300 мкл/см2 рекомбинантной мышиной химерой ICAM-1 или VCAM-1 Fc (0,1-2,75 мг/мл) вместе с рекомбинантным мышиным хемокином (0,1-10 мкг/мл) в течение 2-3 ч при комнатной температуре. Другие интегриновые лиганды, такие как фибронектин, мышиный коллаген IV и мышиный E-кадгерин, непосредственно покрывают камеру при концентрации 2,5-10 мкг/мл в течение ночи при 4 °C.
    1. Дважды вымойте камеры с помощью 1x DPBS, выдав его на чашку и сцедив сразу после этого перед добавлением ячеек.
      Примечание: Т-клетки могут мигрировать по-разному в различных концентрациях интегриновых лигандов и хемокинов в зависимости от статуса активации, дифференцировки, сенсибилизации и прайминга. Настоятельно рекомендуется проводить анализ миграции клеток в нескольких различных концентрациях.
  3. Нанесите адгезивные клетки на пластины со стеклянным покрытием за 24 ч до начала визуализации при совместном культивировании Т-клеток с другими клетками, такими как раковые клетки, чтобы измерить гибель Т-клеток раковых клеток в режиме реального времени.

4. Подготовка клеток

  1. Опционально: Окрашивание Т-клеток и адгезивных клеток красителем по выбору из расчета 1 мкг/мл на 1 x 107 клеток в 1x DPBS в течение 15 мин при 37 °C или в соответствии с протоколом производителя.
  2. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра или его эквивалента.
  3. Планшет 1 x 105 CD8+ Т-клеток (или желаемого количества) в среде L-15 Лейбовица с добавлением глюкозы 1-5 г/л в камере при температуре 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Среда L-15 разработана для использования без системы бикарбоната CO2-натрия. Он буферизуется с использованием свободных основных аминокислот, фосфатных буферов и галактозы для поддержания уровня pH.
  4. Дополнительно: Выполните блокировку интегрина.
    1. Предварительно инкубируют Т-клетки с блокирующим антителом к интегрину (1-10 мкг/мл, антимышиному CD11a (M17/4), антимышиному CD18 (M18/2), антимышиному VLA-4 (9C10) в течение 10 мин и дают ползать в присутствии того же антитела.

5. Покадровая микроскопия

  1. Проведите видеомикроскопию.
  2. Для Т-клеток получайте светлопольные и флуоресцентные изображения каждые 10–60 с в течение 10–60 минут или с желаемыми настройками регистрации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Миграция Т-клеток чувствительна к температуре, а оптимальная температура для миграции Т-клеток мыши составляет 37 °C. Система контроля температуры, используемая в этом протоколе, состоит из закрытой и изолированной деки для микроскопа с прикрепленной системой нагрева. Камера визуализации расположена на деке визуализации. По периметру этой камеры есть колодец, заполненный дистиллированной водой, которая обеспечивает постоянное тепло и влажность во время визуализации. Микролунка расположена в центре камеры визуализации.

6. Программный анализ миграции Т-клеток

  1. Используйте программное обеспечение Volocity для оценки миграции Т-клеток.
    1. Откройте Volocity и создайте новую последовательность изображений.
    2. Выберите и переместите все фильмы с интервальной видеомикроскопией в синюю область в Volocity.
    3. Отрегулируйте яркость и контрастность с помощью инструмента повышения контрастности в соответствии с желаемыми параметрами исследователя.
    4. Проверьте размеры изображения: 0,325 мкм для 20х, 0,65 мкм для 10х.
    5. Последовательность: установите временные точки (например, 81 изображение при съемке каждые 15 секунд в течение 20 минут, 4 в минуту).
    6. Снимите флажки со всех временных точек на вкладке измерения.
    7. Находите объекты с помощью интенсивности - сдвиньте полосу так, чтобы она была прямо от пика.
    8. Исключение объектов по размеру: все клетки диаметром менее 10 мкм и более 100 мкм, чтобы исключить клеточный мусор или неклеточные частицы. Исключите Т-клетки, которые мигрируют менее чем на 20% времени записи (которое может варьироваться в зависимости от определения каждого исследователя).
    9. Игнорировать статические объекты (флажок).
    10. Автоматически соединять разбитые участки (флажок).
    11. Установите кратчайший путь не более 20 мкм.
    12. Траектория миграции клеток — это линия, соединяющая местоположение одной и той же клетки с течением времени. Убедитесь, что алгоритм отслеживания отслеживает, определяя, где отдельные объекты обнаруживаются путем сегментации в каждом кадре, и сопоставляя объекты между кадрами.
    13. Сохраните новый протокол, выбрав «Измерения» > «Сохранить протокол» > «Назвать новый протокол».
    14. Нажмите на «Измерить все временные точки » на вкладке измерения.
    15. Сортируйте треки по временному интервалу, от большого к меньшему.
    16. Запишите идентификационные номера дорожек для всех ячеек с хорошими дорожками, определенными исследователем. После автоматического отслеживания ячеек необходимо вручную оценить каждую дорожку ячейки, чтобы исключить ложно идентифицированные или сломанные дорожки. Исключите ячейки с плохими треками.
    17. Экспортируйте файл в виде текста, разделенного запятыми, и передайте данные в нужное программное обеспечение для анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Основные параметры: скорость (мкм/мин), смещение (перемещение нетто, мкм), длина гусеницы (общая длина пути, мкм) и индекс меандрирования (MI; чистое смещение/длина колеи. MI = 1 указывает на полностью прямую линейную траекторию).
  2. Выполните ручное отслеживание с помощью Image J.
    1. Откройте плагины и выберите отслеживание и ручное отслеживание. Задайте параметры - временные интервалы, x/y калибровку (размер пикселя) и z-калибровку (в ручном режиме слежения). Начните отслеживание отдельных ячеек, нажав на кнопку «Добавить трек», выбрав одну ячейку в первой временной точке и продолжив ее по всем временным точкам. Далее нажмите на End track. Повторите это для всех интересующих ячеек.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Trackmate, еще один инструмент для отслеживания клеток, представляет собой программное обеспечение для автоматического отслеживания, доступное через плагин ImageJ.

Результаты

Подтверждение активации Т-клеток может быть получено с помощью проточной цитометрии с целью выявления повышенной экспрессии CD69 и CD44, которые являются каноническими маркерами активации в мышиных Т-клетках6. Кроме того, чистота популяции Т-клеток может быть определена с помощью проточной цитометрии для CD3+ CD8+ Т-клеток. Этот метод дает >90 % популяции CD8+ Т-клеток.

Миграция Т-клеток может быть оценена с помощью программных программ отслеживания клеток, которые являются как воспроизводимыми, так и настраиваемыми в соответствии с потребностями исследователя. Некоторые основные параметры, используемые для определения экспериментальных эффектов, включают скорость клетки (длина миграции за определенный момент времени, чтобы определить, насколько быстро движется клетка), смещение (расстояние миграции, прямая линия от начальной точки до конечной точки, чтобы определить, как далеко мигрирует клетка), длина трека (расстояние миграции, общая длина пути миграции, чтобы определить, как далеко мигрирует клетка). и индекс меандрита (MI находится в диапазоне от 0 до 1 для определения прямолинейности миграции, 1 = прямолинейный). Эти параметры используются для оценки миграционных различий наивных и активированных CD8+ Т-клеток, ползающих по стеклу с покрытием ICAM-1 с CXCL12 (рис. 1). Увеличение средней скорости, смещения и индекса меандрита наблюдалось у активированных CD8+ Т-клеток по сравнению с наивными, что указывает на повышенную миграционную способность активированных Т-клеток. Аналогичным образом, влияние различных хемокинов на модели миграции клеток может быть выяснено с помощью этих методов. Например, активированные CD8+ Т-клетки демонстрируют повышенную миграцию в присутствии CXCL12, но не CCL2 или CCL22, и миграция увеличивается дозозависимым образом до насыщающей концентрации (рис. 2). Кроме того, программное отслеживание клеток позволяет охарактеризовать индивидуальную миграцию клеток, что позволяет понять влияние отдельных лигандов на поведение Т-клеток. Репрезентативные треки ячеек можно увидеть на рисунке 3.

В совокупности эти данные подтверждают эффективность современных методов, подтверждая, что мы можем (1) отслеживать миграцию клеток на индивидуальной клеточной основе и (2) различать различия в миграции CD8+ Т-клеток на основе статуса активации и в присутствии различных хемокинов и молекул адгезии. Этот анализ является важным шагом в анализе сложных сигнальных механизмов и информировании о целенаправленных экспериментах in vivo , которые могут в дальнейшем учитывать биологический вклад специфических сигналов в зависимости от типа клетки.

figure-results-1
Рисунок 1: Анализы in vitro на наивную и активированную миграцию CD8+ Т-клеток. Наивным или CD3/CD28-активированным CD8+ Т-клеткам мыши позволяли мигрировать на ICAM-1 плюс CXCL12 в течение 10 минут. Скорость, смещение и индекс меандрита миграции клеток анализировали с помощью покадровой микроскопии и Volocity. Каждая группа имеет 36 отдельных Т-клеток (среднее значение ± SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Анализы in vitro на хемокин-зависимую миграцию активированных CD8+ Т-клеток. CD3/CD28-активированным CD8+ Т-клеткам мышей позволяли мигрировать на ICAM-1 плюс указанный хемокин. В поле зрения определяли соотношения числа клеток, ползающих более чем на 50 мкм за 20 мин (процент от общего числа). В одном анализе анализировалось > 10 клеток (n = 3 анализа на группу среднее значение ± SEM). Непарный t-критерий, *p< 0,05 по сравнению с контролем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Миграционные пути активированных CD8+ Т-клеток на ICAM-1 плюс CXCL12 в течение 20 минут. Каждая цветная линия указывает миграционный путь каждой Т-клетки в направлении от точки клетки к противоположной. В этом конкретном анализе 24 из 38 клеток мигрировали на значительную длину (по крайней мере, на расстояние ширины их клеток по нашему определению). Т-клетки мигрировали на разные расстояния, что указывает на то, что каждая клетка находилась в разном состоянии активации или прайминга. Все мигрирующие клетки двигались в разных направлениях при условии, что поверхность была равномерно покрыта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Понимание биологического воздействия сходящихся сигналов in vivo является сложной и непростой задачей. Представленные здесь протоколы представляют собой разумный метод для понимания миграции Т-клеток в строго определенных и биологически значимых условиях. Эти условия могут быть определены по усмотрению исследователя, а протоколы могут быть изменены в соответствии с потребностями различных популяций Т-клеток, статусом активации и фенотипом клеток. Кроме того, многие лиганды и рецепторы могут быть исследованы с помощью этихопределенных процедур 8,9,10, блокирующих антитела 7,8 и покрытых лигандом стеклянных покрытий. Этот метод также является критически важной платформой для разработки инженерных иммунных клеток11,12.

Важные шаги в протоколе включают выделение вторичной лимфоидной ткани, активацию Т-клеток, покрытие стеклянных посудин для визуализации и анализ данных. Неопытному глазу может быть трудно идентифицировать и извлечь лимфатические узлы, встроенные в ткань. Это можно преодолеть с помощью практики. После того, как Т-клетки были выделены и очищены, этап активации приводит к образованию липких клеток, которые, если их не поднять должным образом, могут привести к низкому выходу. Этого можно избежать с помощью щедрой и тщательной промывки лунок. Стеклянная посуда должна быть должным образом покрыта интересующим лигандом и вымыта перед добавлением ячеек. Это обеспечит наличие прочного слоя белка для прилипания клеток, а также гарантирует, что избыток реагента не нарушит биологию. Поверхностное связывание белка А и связывание Fc-белка А в физиологическом pH и концентрации соли достаточно сильны, чтобы противостоять смыванию при бережной заливке и сцеживании буфера. Остаточные белки, если таковые имеются, в среде не вызывают никакой токсичности, хотя они могут нарушить взаимодействие клеток со связанными лигандами, если несвязанные лиганды находятся в высоких концентрациях. Мы исключаем такую возможность, промыв стекло с покрытием пару раз. Наконец, существует множество удобных для пользователя коммерческих и некоммерческих программ, которые позволяют исследователям обнаруживать даже незначительные различия в клеточном поведении и морфологии. Невозможно переоценить важность ручного заверения проанализированных результатов, чтобы исключить ошибки, которые может допустить программное обеспечение.

Методы очистки и активации Т-клеток могут быть модифицированы в соответствии с потребностями исследователя для получения надлежащего состояния и фенотипа клеток для повторения наблюдений in vivo. Различные типы и состояния клеток могут быть использованы для воздействия на различные механизмы инфекции и иммунного ответа 7,8,9,10,11,13, включая рассмотрение наивного поведения Т-клеток и поведения Т-клеток памяти, а также различных аспектов реакции памяти, таких как прайминг и рекрутинг, в тканеспецифичных условиях14. Этот метод может быть использован для совместного культивирования с различными типами клеток для дальнейшего понимания клеточных взаимодействий, включая время и продолжительность межклеточного контакта 7,9, презентацию антигена 9,13 и уничтожение клеток-мишеней6. Дополнительные репортеры и метки могут быть использованы для оценки субклеточных структур7, гранул15, апоптоза6 и других.

Протокол является отличным инструментом для проведения дополнительных экспериментов in vivo , основанных на наблюдениях в упрощенных и строго определенных условиях. В то время как оценка подвижности клеток in vitro может быть очень восстановительной, она является важным шагом в разрушении сложных биологических активностей. С помощью результатов этих экспериментов исследователи могут подойти к работе in vivo более физиологически релевантным и целенаправленным образом.

Простота этого метода также представляет собой его основное ограничение; Несмотря на то, что все результаты являются репрезентативными для деятельности in vivo, они могут быть дополнительно подтверждены, например, с помощью внутрижизненной многофотонной микроскопии. Описанный здесь способ является одним из самых простых, он полностью доступен исследовательским лабораториям со светлопольным микроскопом и/или эпифлуоресцентным микроскопом с цифровой камерой, интегрированной в микроскопическую систему или отдельно размещенной на объективе эндоскопа. С другой стороны, существует больше возможностей для расширенного анализа миграции иммунных клеток in vitro. Во-первых, иммунные клетки часто управляются хемокиновыми градиентами в биологической системе. Анализ поведения иммунных клеток под действием хемокиновых градиентов может быть выполнен несколькими способами. Одним из простых методов является использование специально разработанного предметного стекла (см. Таблицу материалов). Эта система канальных колодцев, дно которой покрыто интегриновыми лигандами, позволяет анализировать миграцию иммунных клеток при статическом градиенте хемокинов. Другие простые анализы хемотаксиса иммунных клеток включают покадровую микроскопию миграции клеток на наконечник микропипетки, который высвобождает хемокины16, в агарозном анализе17 и камеру Зигмонда18. Для более сложного анализа миграции с контролируемыми хемокиновыми градиентами требуются специализированные предметные стекла с микрофлюидными градиентными генераторами19,20. Во-вторых, иммунные клетки могут мигрировать в уникальных физических условиях, используя различные механизмы, иногда без использования интегрин-зависимой адгезии к лигандам. Анализ миграции in vitro в одномерном измерении может быть выполнен с покрытием интегрин-лигандом или без него и воспроизводит подвижность иммунных клеток в капиллярных сосудах21,22. Другим вариантом является анализ миграции клеток в трехмерном пространстве23,24 для изучения механизмов, лежащих в основе интерстициальной миграции клеток25,26. В целом, мы наметили простые, воспроизводимые и надежные методы изучения событий динамической миграции клеток.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что все исследования и подготовка рукописи проводились в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарим бывших и нынешних членов Лаборатории Кима, которые внесли свой вклад в разработку этих протоколов на протяжении долгого времени. Репрезентативные данные были получены с помощью P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/Соединенные Штаты и P01 HL018208/HLBI NIH HHS/Соединенные Штаты. Эта публикация стала возможной отчасти благодаря гранту No T32 GM135134 от Институциональной премии Рут Л. Киршштейн Национальной исследовательской службы.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Чашка 10 смCorning353003или эквивалент
15 мл коническая трубкаThermoFisher339650или эквивалент
1x DPBSGibco14190144без кальция и без магния
6 лунок пластина без обработки TCCorning3736или эквивалент
70 &микро; m сетчатый фильтрFisherScientific352350или аналог
лизирующего буфера ACKThermoFisherA1049201или эквивалент
центрифуги Allegra 6KRThermoScientificsorvall 16R с ротором и ведром tx400 3655или эквивалент
бета-меркаптоэтанолаSigmaM3148или эквивалент
CellTrace VioletThermoFisherC34571Или эквивалентная
центрифугаThermoScientificSorvall ST 16Rили эквивалентная
Коллаген (IV)Corning354233или эквивалентная
чашка для культуры DeltaT толщиной .17 мм прозрачнаяBioptechs04200417C
Dynabeads Sheep антикрысиный IgGInvitrogen11035
DynaMag 15 MagnetThermoFisher Scientific12301Dили эквивалент
Easy sep мышиный набор для выделения Т-клетокстволовые клетки19851
FBSSigmaAldrichF2442-500MLили эквивалент
фибронектинаSigmaAldrich10838039001или эквивалент
Fijihttp://fiji.sc/weblink
Filter cubesNikon или Olympus
GK1.5ATCCTIB-207
HEPESThermoFisher15630080или аналогичная
HQ CCD камераCoolSNAPили аналогичная
ImageJhttp://imagej.nih.gov/ij/hвеб-ссылка
ImageJ автоматический следящий плагин вhttp://imagej.net/TrackMateвеб-ссылка
ImageJ ручное отслеживание вставьте https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.htmlвеб-ссылку
L-15Различныематериалы СмМатериалы Средний Рецепт: Лейбовиц s L-15 среда без фенола красного (Gibco) с добавлением 1-5 г/л
глюкозы Среда L-15 Либовица, без фенола красногоThermoFisher21083027
Luer Lok одноразовый шприцFisher Scientific14-955-459или эквивалент
Среда для разделения лимфоцитовCorning25-072-CIили эквивалент
M5/114ATCCTIB-120
MEM Заменимые аминокислотыThermoFisher11140050или аналог
Микроскоп Система нагреваOkolabokolab.comДоступны индивидуальные дизайны
Millicell EZ слайдMilliporeC86024
Mojosort мышь CD8+ Naï ve Набор для выделения Т-клетокBiolegend480043
мыши E-cadherinR& D systems8875-EC-050или эквивалентный
набор для хирургического рассечения мышейFisher Scientific13-820-096или эквивалент
элементовNikon Software
non-TC 24wpCorning353047или эквивалент
пенициллин-стрептомицинаThermoFisher15140122или эквивалент
белка АThermoFisher Scientificили эквивалент
R9РазличныеСм МатериалыСредний Рецепт: RPMI 1640x с добавлением 10 % FBS, 1 % антибиотика-антимикотика (Gibco), 20 мМ буфера HEPES (Gibco), 1 % заменимых аминокислот MEM (Gibco), 50 мкм; M β-меркаптоэтанол (Sigma-Aldrich)
Рекомбинантная мышиная химера ICAM-1 Fc R& D системы796-IC-050или эквивалент
рекомбинантной мыши IL2Biolegend575410или эквивалент
RPMI 1640xThermoFisher11875093или эквивалент
Т-образных контактовFisher ScientificS99385или эквивалент
микроскопаNikon или эквивалент
Различные рекомбинантные хемокины мышиR& Dили эквивалентная
химера VCAM-1 Fc R& D systems643-VM-050или эквивалентное
программное обеспечениеVolocityPerkinElmer
NIS TE2000-U

Ссылки

  1. Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).
  2. Fowell, D. J., Kim, M. The spatio-temporal control of effector T cell migration. Nat Rev Immunol. 21 (9), 582-596 (2021).
  3. Tabdanov, E. D., et al. Engineering t cells to enhance 3d migration through structurally and mechanically complex tumor microenvironments. Nat Commun. 12 (1), 2815(2021).
  4. Kameritsch, P., Renkawitz, J. Principles of leukocyte migration strategies. Trends Cell Biol. 30 (10), 818-832 (2020).
  5. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse naive CD4+ T cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets. J Vis Exp. (98), e52739(2015).
  6. Sailer, C. J., et al. Pd-1(hi) CAR-T cells provide superior protection against solid tumors. Front Immunol. 14, 1187850(2023).
  7. Lim, K., Hyun, Y. M., Lambert-Emo, K., Topham, D. J., Kim, M. Visualization of integrin mac-1 in vivo. J Immunol Methods. 426, 120-127 (2015).
  8. Lim, K., et al. Neutrophil trails guide influenza-specific CD8+ T cells in the airways. Science. 349, 4352(2015).
  9. Lim, K., et al. In situ neutrophil efferocytosis shapes T cell immunity to influenza infection. Nat Immunol. 21 (9), 1046-1057 (2020).
  10. Reilly, E. C., et al. T(rm) integrins CD103 and CD49a differentially support adherence and motility after resolution of influenza virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (22), 12306-12314 (2020).
  11. Amitrano, A. M., et al. Optical control of CD8(+) T cell metabolism and effector functions. Front Immunol. 12, 666231(2021).
  12. Xu, Y., et al. Optogenetic control of chemokine receptor signal and t-cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), 6371-6376 (2014).
  13. Capece, T., et al. A novel intracellular pool of IFA-1 is critical for asymmetric CD8(+) T cell activation and differentiation. J Cell Biol. 216 (11), 3817-3829 (2017).
  14. Hirai, T., Whitley, S. K., Kaplan, D. H. Migration and function of memory CD8(+) T cells in skin. J Invest Dermatol. 140 (4), 748-755 (2020).
  15. Mouchacca, P., Schmitt-Verhulst, A. M., Boyer, C. Visualization of cytolytic T cell differentiation and granule exocytosis with T cells from mice expressing active fluorescent granzyme B. PLoS One. 8 (6), e67239(2013).
  16. Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol Biol. 370, 23-36 (2007).
  17. Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J Cell Biol. 159 (1), 91-102 (2002).
  18. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2), Pt 1 606-616 (1977).
  19. Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integr Biol (Camb). 2 (11-12), 648-658 (2010).
  20. Sai, J., Walker, G., Wikswo, J., Richmond, A. The IL sequence in the LLKIL motif in CXCR2 is required for full ligand-induced activation of Erk, Akt, and chemotaxis in HL60 cells. J Biol Chem. 281 (47), 35931-35941 (2006).
  21. Choi, Y., Sunkara, V., Lee, Y., Cho, Y. K. Exhausted mature dendritic cells exhibit a slower and less persistent random motility but retain chemotaxis against ccl19. Lab Chip. 22 (2), 377-386 (2022).
  22. Harding, M. G., Zhang, K., Conly, J., Kubes, P. Neutrophil crawling in capillaries: A novel immune response to staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 10 (10), e1004379(2014).
  23. Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zanker, K. S., Dittmar, T. Analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix. J Vis Exp. (92), e51963(2014).
  24. Wu, P. H., Giri, A., Sun, S. X., Wirtz, D. Three-dimensional cell migration does not follow a random walk. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (11), 3949-3954 (2014).
  25. Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
  26. Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin αv. Nat Immunol. 14 (9), 949-958 (2013).

Перепечатки и разрешения

Теги

CD8
Анализ миграции in vitro в режиме реального времени на первичные мышиные CD8+ Т-клетки
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.