Методическая статья

Метод культивирования in vitro для изучения клеточной динамики чешуи рыбок данио

DOI:

10.3791/66619

⸱

10 января 2025 г.

 , 
1Department of Biology, Mount Saint Vincent University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол предлагает метод изучения клеточной динамики с использованием простой техники культивирования in vitro . Это дает возможность исследователям и преподавателям рыбок данио изучать клеточные процессы, такие как те, которые связаны с гомеостазом костей и основами клеточной биологии, визуализируя флуоресцентные ядра и апоптотические клетки в чешуйках.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чешуя рыбок данио обладает целым рядом преимуществ для использования в стандартных лабораториях в учебных и исследовательских целях. Чешуйки легко собираются без необходимости эвтаназии, регенерируются в течение пары недель, а также полупрозрачные и небольшие, что позволяет рассматривать их с помощью стандартного микроскопа. Чешуя рыбок данио особенно полезна в образовательной среде, поскольку она предоставляет учащимся уникальную возможность участвовать в практическом обучении, особенно в понимании клеточной динамики и методов культивирования in vitro . Основной целью данного протокола является описание метода сбора и поддержания чешуи рыбок данио в культуре для использования в различных биологических исследованиях с использованием базового лабораторного оборудования. Кроме того, в протоколе подробно описывается их использование для понимания костного гомеостаза путем изучения активности костных клеток, участвующих в резорбции и отложении костей. Он также включает в себя дополнительные протоколы для общих методов, таких как визуализация ядер и апоптотических клеток. Протокол культивирования in vitro дает надежные результаты с минимальным количеством реагентов и оборудования. В этой статье обсуждаются преимущества использования in vitro культур чешуи данио рерио для стимулирования научных исследований и описываются ресурсы, необходимые для поддержки их интеграции в образовательные учреждения.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В последние годы рыбки данио (Danio rerio) стали ценным модельным организмом в различных научных областях, включая генетику, биологию развития и токсикологию 1,2,3. Данио-рерио – это небольшие тропические пресноводные рыбы, обитающие в реках Юго-Восточной Азии4. Они стали популярным модельным организмом в биологии благодаря своей простоте в уходе, небольшому размеру, быстрому репродуктивномуциклу и полупрозрачным эмбрионам. Это позволяет легко наблюдать за их внутренним развитием, что делает их идеальными для изучения различных биологических процессов в биологии развития. Рыбки данио имеют генетическое сходство с людьми; Примерно 70% человеческих генов имеют по крайней мере один аналог данио-рерио, что делает их отличной моделью для изучения генетических нарушений и заболеваний у человека 5,6. Манипулируя конкретными генами рыбок данио, исследователи могут получить ценную информацию о функциях и поведении генов, которая затем может быть примененак исследованиям в области здоровья человека, редактированию генов и созданию трансгенных линий 7,8.

Чешуя данио-рерио регенерируется после удаления 9,10 и может культивироваться в течение одного-трех дней в базовом (не содержащем CO2) инкубаторе, пока она используется для экспериментов11. Использование чешуи рыбок данио рерио выгодно в базовых лабораториях, так как ее можно извлечь из обезболенных рыб без необходимости эвтаназии. Чешуя данио-рерио является составной частью кожного скелета, состоящего в основном из двух слоев: внутреннего слоя, который является толстым и состоит из частично минерализованной ткани, образованной слоями коллагеновых фибрилл, и внешнего слоя, который сильно минерализован и содержит сеть переплетенных коллагеновых фибрилл12,13 (рисунок 1A-C). Эти морфологические и клеточные особенности чешуи легко наблюдаются под стандартным составным микроскопом. Эти характеристики делают чешую данио рерио хорошей моделью для изучения клеточных и молекулярных клеток. Например, чешуя рыбок данио использовалась для изучения гомеостаза костей, включая активность костных клеток 11,12. Они также использовались для понимания регенерации тканей 9,14,15, генных путей и передачи сигналов14,16, метаболизма17, исследований микробиоты18 и т. д. Данио-рерио, как и другие костистые, также очень чувствительны к факторам окружающей среды, таким как загрязняющие вещества и токсины 19,20,21,22. Таким образом, рыбья чешуя используется для изучения воздействия токсинов на популяции рыб. Эти характеристики делают весы отличной моделью для обучения студентов воздействию факторов окружающей среды на живые организмы. Кроме того, чешуйки трансгенных линий данио-рерио, такие как Tg(osterix:mCherry) и Tg(runx2a:GFP), могут добавить еще один уровень сложности в студенческие эксперименты.

Таким образом, используя чешую рыбок данио, исследователи могут разрабатывать и проводить эксперименты для изучения различных аспектов биологии, от клеточных механизмов до изменений окружающей среды. Рыбки данио также являются ценным ресурсом в высшем образовании, поскольку они могут предоставить практический опыт в планировании экспериментов, сборе и анализе данных. Рыбки данио также могут быть использованы на продвинутых курсах и в исследовательских программах для изучения конкретных областей интересов. В этой статье описывается протокол использования чешуи рыбок данио в исследовательской и учебной среде.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все описанные здесь протоколы соответствуют рекомендациям Канадского совета по уходу за животными и ежегодно утверждаются комитетом по уходу за животными Университета Святой Марии/Университета Маунт-Сент-Винсент под номерами протоколов 20-14 и 21-12. Прежде чем выполнять этот протокол, пользователи должны убедиться в том, что федеральные и провинциальные рекомендации по использованию животных в научных исследованиях или обучении соблюдаются. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Приготовление реагентов для культивирования накипи

  1. Приготовьте среду DMEM с HEPES (10 г порошка DMEM, 5,95 г HEPES, в 1 л дистиллированной воды или dH2O, pH: 6,91), аликвоту, и храните при температуре 4 °C.
  2. Готовят питательную среду - рабочий раствор (88% среду DMEM с HEPES, 10% фетальную бычью сыворотку и 2% пенициллин-стрептомицин [5000 единиц пенициллина и 5 мг стрептомицина на мл], доведенный до объема, необходимого на день проведения эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий раствор должен быть приготовлен свежим ежедневно и не может храниться. Питательную среду необходимо хранить в холоде (при 4 °C или на льду) до использования.
  3. Залейте питательную среду рабочим раствором в емкости, в которых будет проводиться эксперимент. В этом случае использовали пробирки объемом 0,2 мл или 96-луночный планшет. Держите эти аликвоты на льду до тех пор, пока они не потребуются.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор должен быть приготовлен свежим и не может храниться более 1 суток. Обратитесь к таблице 1 для всех реагентов.

2. Удаление чешуи с живой рыбы

  1. Подготовьте емкость или емкость для данио-рерио объемом воды примерно 2 л для 4-5 взрослых рыб.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Типичными параметрами воды, подходящими для рыбок данио-рерио, являются pH 7,5, температура 28,5 °C, проводимость 640-781 μS и 12-12-часовой цикл темноты-света. Следите за тем, чтобы в баке постоянно поддерживалась температура.
  2. Используйте рыболовную сеть, чтобы поймать 4-5 взрослых рыбок данио-рерио и поместите их в подготовленный выше аквариум для хранения рыбок данио.
  3. Подготовьте емкость с не менее чем 60 мл воды, где рыбы будут обезболиваться.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рыба должна иметь возможность перемещаться в контейнере и находиться достаточно глубоко, чтобы она не могла выпрыгнуть. Этот контейнер должен содержать буферизованный 0,01% трикаин метан-сульфонат (MS222), который должен состоять из воды данио рерио (разбавить 0,1% MS222, который готовится с 0,3 г MS222, 615 мкл 1 М NaOH в 300 мл системы воды данио-рерио, десять раз).
    ВНИМАНИЕ: Лица, проводящие эти эксперименты, должны иметь одобрение Совета по этике животных учреждения для отлова, обезболивания и обращения с рыбками данио. Аналогичным образом, используемый анестетик представляет собой низкую концентрацию трикаина метансульфоната (MS222), который является химическим веществом, обычно используемым в биологии рыб, но требующим надлежащего обращения, такого как соответствующие средства индивидуальной защиты, включая одноразовые нитриловые перчатки, защитные очки/брызговики и лабораторный халат (см. паспорт безопасности MS222 для получения дополнительной информации).
  4. Подготовьте контейнер для восстановления с теми же характеристиками, что и на шаге 1 (не менее 2 л воды), куда будет помещена рыба после удаления чешуи. В этой емкости должно быть достаточно места и правильные параметры воды, как уже отмечалось выше.
  5. С помощью сачка осторожно пересадите одну взрослую рыбку данио в контейнер с 0,01% MS222. Подождите, пока рыба полностью неподвижна и начнет минимально двигаться оперкулярно (обычно это занимает менее 10 минут).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Весь этот этап выполняется по одной рыбе за раз. Не обезболивайте следующую рыбу до тех пор, пока чешуя не будет успешно удалена с рыбы, с которой ведется работа, и пока эта рыба не будет перемещена в контейнер для восстановления.
  6. По отдельности поместите взрослых рыбок данио на перевернутую чашку Петри, застеленную влажным бумажным полотенцем.
  7. Под препарирующим стереомикроскопом и с помощью тонких щипцов снимают максимум 10-12 чешуек с отдельной рыбы. Чешуя удаляется из боковой области рыбы, где чешуя больше и имеет более постоянный размер по сравнению с другими частями тела (Рисунок 2). Можно использовать обе стороны рыбы.
    1. Удаляйте чешуйки по одной, осторожно потягивая в естественном направлении чешуи (т. е. в направлении от переднего к заднему). Сделать это нужно как можно быстрее.
  8. Поместите каждую отдельную чешую в отдельную пробирку объемом 0,2 мл, содержащую раствор для культуры накипи в рабочей среде (приготовленный на шаге 1.1), чтобы предотвратить их разложение. В качестве альтернативы можно использовать планшет на 96 лунок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изоляция отдельных чешуек в отдельных пробирках или лунках предотвращает слипание чешуек и позволяет отслеживать отдельные чешуйки, которые могут потребоваться для нескольких экспериментов.
  9. Если конкретный эксперимент требует обработки накипью, примените ее на этом этапе. Примеры некоторых протоколов см. в шагах 4 и 5.
  10. Поместите пробирки с весами внутрь инкубатора при температуре 28 °C. Питательную среду следует менять каждые 24 ч (с помощью питательной среды - рабочего раствора). Для описанных здесь экспериментов использовался инкубатор, не содержащийCO2 .
  11. После удаления чешуи осторожно верните рыбок данио в резервуар для восстановления и следите за тем, пока движение не возобновится. Пипетка или аэрационный камень используются для подачи воздуха в резервуар для ускорения восстановления.
  12. Как только движение восстановится, верните рыбок данио в обычный аквариум для выращивания. Не забывайте держать рыб, которые были использованы, отдельно от любых других рыб, чтобы они могли восстановиться отдельно и отслеживать, какие рыбы активно восстанавливают свою чешую.
  13. Подождите ~2 недели, прежде чем повторять удаление чешуи с этих же рыб. Это дает им время для естественной регенерации чешуи.

3. Фиксация весов

  1. Трижды промойте чешуйки 200 мкл 1x фосфатно-солевого буфера (PBS), приготовленного из 10x PBS (на 1 л добавьте 80 г NaCl, 2 г KCl и 11,2 г Na2HPO4, добавьте dH2O до 1 л).
  2. Удалите 1x PBS и добавьте 200 мкл 4% параформальдегида (PFA) на ночь при температуре 4 °C. На 100 мл PFA добавьте 4 г параформальдегида и 0,1 г NaOH, затем добавьте 1x PBS до 100 мл. Перемешайте на горячей плите, установленной на слабый огонь, и перемешайте, пока раствор не станет прозрачным, затем дайте раствору остыть и стабилизируйте pH до 7,4. Хранить при температуре -20 °C. Более подробную информацию см. в Дополнительном файле 1 (Таблица 1).
  3. После фиксации трижды промойте чешуйки 200 мкл 1x PBS. Хранить весы при температуре 4 °C.
    ВНИМАНИЕ: ПФА вреден. Дополнительную информацию см. в паспорте безопасности. Все эти процессы требуют надлежащего обращения, например, соответствующих средств индивидуальной защиты, включая одноразовые нитриловые перчатки, защитные очки/брызговики, а также лабораторный халат.

4. Гомеостаз костей

ПРИМЕЧАНИЕ: Ниже описаны две процедуры костного гомеостаза. Окрашивание тартрат-резистентной кислой фосфатазой (TRAP) и щелочным фосфатом (AP) обычно используется для идентификации активных остеокластов и остеобластов соответственно. Остеокласты резорбируют костный матрикс, в то время как остеобласты откладывают костный матрикс. AP является основным ферментом, выделяемым остеобластами во время формирования кости, в то время как TRAP выделяется остеокластами в кислотное пространство между остеокластом и костным матриксом, способствуя разрушению и резорбции кости 24,25,26. Этот протокол также доступен в информационной сети данио-рерио27и был ранее опубликован28. Щелочная фосфатаза — это фермент, вырабатываемый несколькими типами клеток в рамках метаболического процесса. Этот процесс не является полностью специфичным для остеобластов, но в костной ткани он используется в качестве маркера функции остеобластов.

  1. Окрашивание тартрат-резистентной кислой фосфатазой (TRAP)
    1. Поместите каждую фиксированную шкалу в пробирку объемом 0,2 мл или 96-луночный планшет с 200 μл dH2O. Промойте чешуйки, добавив и удалив около 150 μл dH2O в течение 15 минут три раза. Более подробную информацию см. в Дополнительном файле 1 (Таблица 2).
    2. Извлеките чешуйки из пробирки или лунки объемом 0,2 мл и поместите их в новую пробирку, содержащую 200 мкл буфера из 50 мМ тартрата. Выдерживать в течение 1 ч при комнатной температуре.
      1. На 100 мМ буфера тартрата приготовьте стеклянную емкость, добавьте 2,3 г винной кислоты и смешайте ее с 0,2 М ацетатным буфером (pH 5,5) до 100 мл раствора. Хорошо перемешайте и храните при температуре 4 °C. Чтобы приготовить 50 мМ буфера тартрата, добавьте равные объемы dH2O и 100 мМ буфера тартрата. Подробнее см. Дополнительный файл 1 (Таблица 3 и Таблица 4).
    3. Извлеките буфер для тартрата из пробирки и добавьте 200 мкл раствора субстрата TRAP. Инкубируйте образцы в течение 1 ч при комнатной температуре. Убедитесь, что образцы остаются в темноте.
      1. Приготовьте емкость из темного стекла и добавьте 30 мл 100 мл буфера из тартрата, 1 мл гексазотизированного PRS (раствор параросанилина гидрохлорида) и 2 мл раствора ферментного субстрата. Хорошо перемешайте.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор не может быть сохранен; Во время использования держите его в темноте при комнатной температуре. Для получения решений, необходимых для приготовления раствора подложки TRAP, см. Дополнительный файл 1 (Таблицы 5-9).
    4. Удалите раствор подложки TRAP и промойте чешую, добавив и удалив около 150 мкл dH2O в течение 15 минут три раза.
    5. Извлеките чешуйки из пробирки и поместите их в новую пробирку или лунку с 200 мкл 80% глицерина (на 100 мл смешайте 80 мл глицерина с 20 мл dH2O), завернутую в алюминиевую фольгу, чтобы избежать выцветания, и храните при температуре 4 °C.
    6. Чтобы визуализировать чешуйки под микроскопом, используйте углубительное или вогнутое предметное стекло.
  2. Окрашивание щелочными фосфатами (АФ)
    1. Поместите каждую фиксированную шкалу в пробирку объемом 0,2 мл или 96-луночный планшет с 200 μл dH2O и промойте их, добавив и удалив около 150 μL dH2O в течение 15 минут три раза. Более подробную информацию см. в Дополнительном файле 1 (Таблица 2).
    2. Извлеките чешуйки из пробирок или лунок объемом 0,2 мл и поместите их в новую пробирку, содержащую 200 мкл трис-малеатного буфера, и инкубируйте ее в течение 1 часа при комнатной температуре.
      1. Для этого буфера подготовьте стеклянную емкость и добавьте 0,605 г трис-буфера и 0,55 г малеиновой кислоты. Добавьте dH2O до 25 мл и хорошо перемешайте. Стабилизируйте до pH 8,3. Хранить при температуре 4 °C. Более подробную информацию см. в Дополнительном файле 1 (Таблица 10).
    3. Извлеките трис-малеатный буфер из пробирки и добавьте 200 мкл раствора подложки AP. Выдержите его в течение 1 ч при комнатной температуре. Убедитесь, что образцы остаются в темноте.
      1. Для этого раствора готовят емкость из темного стекла, добавляют 8 мг соли диазония, и смешивают ее с 0,1 мл наптол-AS-TR-фосфата в N,N-диметилформамиде и 10 мл трис-малеатного буфера (pH 8,3), хорошо размешивают. Приготовьте этот раствор в свежем виде. Более подробную информацию см. в Дополнительном файле 1 (Таблица 11).
    4. Удалите раствор подложки AP и промойте чешую, добавив и удалив 200 мкл dH2O в течение 15 мин, три раза.
    5. Извлеките чешуйки из пробирки и поместите их в новую пробирку или лунку с 200 мкл 80% глицерина, завернутую в алюминиевую фольгу, чтобы избежать выцветания. Хранить при температуре 4 °C.
    6. Чтобы визуализировать чешуйки с помощью микроскопа, поместите чешуйки на вогнутое или углубительное предметное стекло.
      ВНИМАНИЕ: Большинство реагентов, используемых при окрашивании TRAP и AP, могут быть вредными. Обратитесь к паспорту безопасности для каждого химического вещества. Все эти процедуры требуют надлежащего обращения, например, соответствующих средств индивидуальной защиты, включая одноразовые нитриловые перчатки, защитные очки/брызговики и лабораторный халат.

5. Визуализация динамики клеток чешуи данио-рерио

ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации различий между масштабами и для маркировки ячеек внутри шкалы можно использовать ряд методов окрашивания (Рисунок 3B). Например, ниже описаны методы окрашивания ядер и лизосом в клетках чешуи.

  1. Окрашивание DAPI для визуализации ядра клеток
    DAPI используется для маркировки ядер всех клеток путем маркировки ДНК. DAPI — это флуоресцентный маркер, который прочно связывается с областями, обогащенными аденином и тимином в последовательностях ДНК.
    1. Перед использованием DAPI убедитесь, что весы закреплены в 4% параформальдегиде (шаг 3). Промойте чешуйки 200 μL 1x PBS в течение 5 минут после фиксации.
    2. Приготовьте рабочий раствор DAPI в соотношении 1:10 следующим образом. Смешайте 1 мкл DAPI с 9 мкл 1x PBS, чтобы общий объем составил 10 мкл.
    3. После приготовления раствора DAPI с помощью щипцов или пластиковой пипетки поместите весы на вогнутое предметное стекло, удалите излишки PBS и добавьте около 10 μL приготовленного раствора DAPI.
      DAPI немедленно окрашивает шкалу, поэтому ее можно визуализировать с помощью флуоресцентного микроскопа с длиной волны возбуждения 352-402 нм и длиной волны излучения 417-477 нм. DAPI окрашивает все ядра клеток в ярко-синий цвет. Для того, чтобы увидеть весь масштаб в поле зрения, использовался объектив 4x. Одиночные окрашенные ядра видны с помощью объектива 20x.
    4. Подсчитайте количество окрашенных DAPI ядер, чтобы определить количество клеток в шкале.
  2. Апоптотическое окрашивание для визуализации гибели клеток в живых образцах
    ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентные красители можно использовать для маркировки апоптотических клеток. Например, используемый здесь протокол флуоресцентного маркера предназначен для кислых сред и может быть использован для маркировки и отслеживания кислотных органелл, таких как лизосомы. Увеличение количества этих органелл коррелирует с увеличением гибели клеток. Это окрашивание следует наносить на незафиксированные чешуйки, которые либо только что вытащены, либо культивировались в течение 2 дней.
    1. Приготовьте раствор флуоресцентного красителя для отслеживания апоптоза в соответствии с инструкциями производителя, используя питательную среду в качестве разбавителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация флуоресцентного красителя может резко меняться в зависимости от используемого метода апоптоза. Обратитесь к коммерческому протоколу для выбора красителя для получения подробной информации о рекомендуемых концентрациях.
    2. Осторожно удалите питательную среду из каждой пробирки объемом 0,2 мл или лунки из 96-луночного планшета, если чешуйки были ранее культивированы.
    3. Добавьте достаточное количество раствора флуоресцентного окрашивания, чтобы покрыть всю чешую (около 50 мкл).
    4. Накройте все трубки алюминиевой фольгой, чтобы избежать выцветания, и оставьте на 30 минут.
    5. Удалите раствор флуоресцентного окрашивания из пробирок или лунок.
    6. Промойте образцы, добавив 200 мкл 1x PBS в пробирки или лунки на 5 минут.
    7. Снимите PBS и добавьте 200 мкл 4% PFA в пробирки или лунки для фиксации образцов на 1 ч при комнатной температуре.
    8. Промойте образцы, добавив 200 μL 1x PBS в пробирки или лунки на 5 минут.
    9. Переложите весы в новую пробирку или лунку объемом 0,2 мл и добавьте 200 мкл свежего 1x PBS. Закройте эти трубки/колодцы алюминиевой фольгой, чтобы избежать выцветания. Хранить при температуре 4 °C.
    10. Чтобы визуализировать чешуйки с помощью флуоресцентного микроскопа, используйте вогнутое или депрессионное стекло и правильный фильтр. Используемый здесь флуоресцентный сигнал имеет максимум возбуждения и излучения 577-590 нм. Флуоресцентное окрашивание показывает апоптотические клетки, содержащие лизосомы, красным цветом.
    11. Подсчитайте количество окрашенных клеток для того, чтобы определить количество клеток, подвергающихся апоптозу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Алюминиевая фольга используется во время окрашивания и хранения, чтобы избежать выцветания. Образцы могут храниться в темноте пару часов или даже дней, в зависимости от того, какой флуоресцентный краситель используется. Чтобы хранить флуоресцентные образцы в течение более длительного времени, используйте протокол фиксации и монтажа, совместимый с флуоресцентным красителем. Все флуоресцентное окрашивание визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа с не менее чем 20-кратным увеличением. Фильтр использовался следующим образом: для DAPI 417-477 нм; для отслеживания апоптоза 577-590 нм.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Недавно этот протокол культивирования шкалы был использован для изучения костного гомеостаза11. Чешуйки могут сохраняться в питательной среде не менее 2 суток. Количество апоптотических клеток анализировалось в каждый день культивирования, максимум в течение трех дней, путем подсчета помеченных клеток. Эти результаты показали, что количество апоптотических клеток значительно увеличилось на третий день культивирования, что указывает на то, что время культивирования должно быть ограничено двумя дням...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чешуя рыбок данио является легкодоступной моделью in vitro для изучения множества различных биологических процессов, которые могут поддерживаться до 2 дней с использованием метода культивирования и инкубатора для моделирования их естественной средыобитания. Чешуйки имеют регулярное и пропорциональное распределение присутствующих клеток, что позволяет исследователям просматривать, подсчитывать и помечать клетки, а также проводить простые эксперименты по кл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят персонал водного объекта Университета Маунт-Сент-Винсент и всех членов лаборатории развития костей Франца-Одендаля за обеспечение необходимого ухода за рыбами. Выражаем особую благодарность Алише Макнил (Alisha McNeil), Кили А. Маклеллан (Keely A. MacLellan) и Ширин Джеради (Shirine Jeradi) за помощь в оптимизации некоторых протоколов. Это исследование было поддержано Канадским космическим агентством (CSA) [19HLSRM01] и Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,2 мл пробирокн/дн/д
37% HCl EMDHX0603-4Для стабилизации pH и препрепирования PRS
Вогнутое стеклон/д/д
DAPIVectashieldH-1200Для визуализации ядра клеток
Соль диазония (Fast Blue B)SigmaD9805Для субстрата AP
раствор Модифицированная орлиная среда (DMEM) Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) порошок Сигма D5523Для накипи питательных сред 
Этил3-аминобензоат метансульфонат (MS222) Сигма E10521Для приготовления 0,1% MS222
Фетальная бычья сыворотка Сигма F4135Для накипи питательных сред 
Флуоресцентный микроскопн/дн/д
ледяной уксусной кислоты Рыбак A38 212Для ацетатного буфера
ГлицеринVWRBDH1172-4LPДля 80% глицерина - накопительные весы
HEPES ТермоФишер 15630106Для масштаба культура медиа 
Конфоркан/дн/д
KCl SigmaP217-10Для приготовления PBS
LysotrackerThermoFisherL7528Для визуализации лизосом 
Малеиновая кислотаSigmaM0375Для трис-Малеатного буфера 
Микропипеткан/дн/д
N,N-диметилформамидSigma319937для раствора субстрата AP
N,N-диметилформамид Sigma319937для раствора ферментного субстрата
Na2HPO4 EMDSX0720-1Для приготовления PBS
NaCl Сигма S9888Для получения PBS
NaNO2SigmaS-2252для 4% NaNO2
NaOH SigmaS5881Для приготовления 4% PFA
NaOH Сигма S5881Для фиксации накипи и стабилизации pH
Napthol-AS-TR-фосфатSigmaN6125Для раствора субстрата
AP Napthol-AS-TR-phosphate SigmaN6125для ферментного субстрата раствора
параросанилина гидрохлорида SigmaP3750Для PRS
Пенициллин-стрептомицин 5000 единиц пенициллина и 5 мг стрептомиоцина/млThermoFisher 15140122Для масштаба культура медиа 
Средства индивидуальной защиты (СИЗ): одноразовые нитриловые перчатки, защитные очки/брызговики и лабораторный халат.н/дн/д
PFA Сигма P6148Для фиксации накипи
Ацетат натрия Сигма S2889Для ацетатного буфера
Стандартный составной микроскопн/д/д
Пластина для перемешиваниян/дн/д
Винная кислотаSigmaT6521Для тартратного буфера
Трис основаниеRoche03 118 142 001Для трис-малеатного буфера 
н н

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. New York. (2002).
  2. Linney, E., Upchurch, L., Donerly, S. Zebrafish as a neurotoxicological model. Neurotoxicol Teratol. 26 (6), 709-718 (2004).
  3. Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model. Drug Safety Eval: Met Prot. , 271-279 (2011).
  4. Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2020).
  5. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  6. Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods Cell Biol. 105, 309-337 (2011).
  7. Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab Anim Res. 37, 1-29 (2021).
  8. Brito, R. S., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends. Sci Total Environ. 848, 157665(2022).
  9. Bergen, D. J. M., et al. Regenerating zebrafish scales express a subset of evolutionary conserved genes involved in human skeletal disease. BMC Biol. 20 (1), 1-25 (2022).
  10. Sire, J., Girondot, M., Babiar, O. Marking zebrafish, Danio rerio (Cyprinidae), using scale regeneration. J Exp Zool. 286 (3), 297-304 (2000).
  11. Carvajal-Agudelo, J. D., McNeil, A., Franz-Odendaal, T. A. Effects of simulated microgravity and vibration on osteoblast and osteoclast activity in cultured zebrafish scales. Life Sci Space Res. 38, 39-45 (2023).
  12. Pasqualetti, S., Banfi, G., Mariotti, M. Osteoblast and osteoclast behavior in zebrafish cultured scales. Cell Tissue Res. 350, 69-75 (2012).
  13. Pasqualetti, S., Banfi, G., Mariotti, M. The zebrafish scale as model to study the bone mineralization process. J Mol Histol. 43, 589-595 (2012).
  14. De Vrieze, E., et al. Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales. Osteoporos Int. 25, 567-578 (2014).
  15. Iwasaki, M., Kuroda, J., Kawakami, K., Wada, H. Epidermal regulation of bone morphogenesis through the development and regeneration of osteoblasts in the zebrafish scale. Dev Biol. 437 (2), 105-119 (2018).
  16. Aman, A. J., Fulbright, A. N., Parichy, D. M. Wnt/β-catenin regulates an ancient signaling network during zebrafish scale development. Elife. 7, e37001(2018).
  17. Carnovali, M., Luzi, L., Banfi, G., Mariotti, M. Chronic hyperglycemia affects bone metabolism in adult zebrafish scale model. Endocr. 54, 808-817 (2016).
  18. Burns, A. R., Guillemin, K. The scales of the zebrafish: Host-microbiota interactions from proteins to populations. COMICR. 38, 137-141 (2017).
  19. Vieira, E. F. S., et al. The use of freshwater fish scale of the species Leporinus elongatus as adsorbent for anionic dyes: An isothermal calorimetric study. J Therm Anal Calorim. 109 (3), 1407-1412 (2012).
  20. Ighalo, J. O., Eletta, O. A. A. Recent advances in the biosorption of pollutants by fish scales: A mini-review. Chem Eng Commun. 208 (9), 1301-1312 (2021).
  21. Eletta, O. A. A., Ighalo, J. O. A review of fish scales as a source of biosorbent for the removal of pollutants from industrial effluents. J Res Inf Civ Eng. 16 (1), 2479-2510 (2019).
  22. Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicol. Sci. 86 (1), 6-19 (2005).
  23. CCAC Canadian Council of Animal Care (CCAC). , https://ccac.ca/ (2024).
  24. Suzuki, N., Hattori, A. Melatonin suppresses osteoclastic and osteoblastic activities in the scales of goldfish. J. Pineal Res. 33 (4), 253-258 (2002).
  25. Suzuki, N., et al. Effect of vibration on osteoblastic and osteoclastic activities: Analysis of bone metabolism using goldfish scale as a model for bone. ASR. 40 (11), 1711-1721 (2007).
  26. Kawakami, K., et al. z Trap: zebrafish gene trap and enhancer trap database. BMC Dev Biol. 10, 1-10 (2010).
  27. ZFIN The Zebrafish Model Organism Database.. , https://zfin.org/ (2024).
  28. Edsall, S. C., Franz-Odendaal, T. A. A quick whole-mount staining protocol for bone deposition and resorption. Zebrafish. 7 (3), 275-280 (2010).
  29. Howe, D. G., et al. the Zebrafish Model Organism Database: Increased support for mutants and transgenics. Nucleic Acids Res. 41 (D1), D854-D860 (2012).
  30. Singleman, C., Holtzman, N. G. Growth and maturation in the zebrafish, Danio rerio: A staging tool for teaching and research. Zebrafish. 11 (4), 396-406 (2014).
  31. Barresi, M. J., et al. Zebrafish in the Classroom. Zebrafish. 5 (3), 205-208 (2008).
  32. Ghods, S., et al. On the regeneration of fish scales: Structure and mechanical behavior. J Exp Biol. 223 (10), jeb211144(2020).
  33. Krishnan, S., Sekar, S., Katheem, M. F., Krishnakumar, S., Sastry, T. P. Fish scale collagen-A novel material for corneal tissue engineering. Artif Organs. 36 (9), 829-835 (2012).
  34. Zhao, S., et al. A novel porous nanocomposite of sulfur/carbon obtained from fish scales for lithium-sulfur batteries. J Mater Chem. 1 (10), 3334-3339 (2013).
  35. Kumar, R., et al. A noninvasive technique for rapid extraction of DNA from fish scales. IJEB. 45 (11), 992-999 (2007).
  36. Hutchinson, J. J., Trueman, C. N. Stable isotope analyses of collagen in fish scales: Limitations set by scale architecture. J Fish Biol. 69 (6), 1874-1880 (2006).
  37. Kumari, S., Rath, P. K. Extraction and characterization of chitin and chitosan from (Labeo rohit) fish scales. Procedia Mater Sci. 6, 482-489 (2014).
  38. Stepnowski, P., Ólafsson, G., Helgason, H., Jastorff, B. Preliminary study on chemical and physical principles of astaxanthin sorption to fish scales towards applicability in fisheries waste management. Aquac. 232 (1-4), 293-303 (2004).
  39. Ghods, S., Murcia, S., Ossa, E. A., Arola, D. Designed for resistance to puncture: The dynamic response of fish scales. J Mech Behav Biomed Mater. 90, 451-459 (2019).
  40. Yang, W., et al. Protective role of Arapaima gigas fish scales: Structure and mechanical behavior. Acta Biomater. 10 (8), 3599-3614 (2014).
  41. Zhu, D., Zhang, C., Liu, P., Jawad, L. A. Comparison of the morphology, structures and mechanical properties of teleost fish scales collected from New Zealand. J. Bionic Eng. 16, 328-336 (2019).
  42. Witzmann, F. Morphological and histological changes of dermal scales during the fish-to-tetrapod transition. Acta Zool. 92 (3), 281-302 (2011).
  43. Ibañez, A. L., Cowx, I. G., O'Higgins, P. Geometric morphometric analysis of fish scales for identifying genera, species, and local populations within the Mugilidae. Can J Fish Aquat Sci. 64 (8), 1091-1100 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи