Зависимое от опыта ремоделирование синаптической связи обонятельных сенсорных нейронов ювенильного мозга в раннем критическом периоде жизни

Краткое содержание

Мы описываем методы индуцирования и анализа зависимого от обоняния ремоделирования синаптических клубочков антенной доли в ювенильном мозге дрозофилы .

Аннотация

Обонятельный сенсорный опыт в раннем возрасте вызывает драматическое ремоделирование синаптических клубочков в ювенильном мозге дрозофилы , которое эмпирически дозозависимо, ограничено во времени и временно обратимо только в короткий, четко определенный критический период. Направленность ремоделирования синаптических связей мозговой цепи определяется специфическим запахом, действующим на класс рецепторов-респондентов обонятельных сенсорных нейронов. В целом, каждый класс нейронов экспрессирует только один рецептор запаха и иннервирует один обонятельный синаптический клубок. В генетической модели дрозофилы полный массив обонятельных клубочков был точно отображен по реакции на запах и поведенческому выходу. Одорант этилбутирата (EB) активирует нейроны рецептора Or42a, иннервирующие клубочек VM7. В ранний критический период жизни опыт БЭ приводит к дозозависимой элиминации синапсов в обонятельных сенсорных нейронах Or42a. Временные периоды воздействия дозированного одоранта БЭ позволяют исследовать зависимое от опыта отсечение цепных связей в ювенильном мозге. Конфокальная микроскопия синаптических клубочков антенной доли проводится с помощью трансгенных маркеров, управляемых рецепторами Or42a, которые обеспечивают количественную оценку количества синапсов и объема иннервации. Сложный генетический инструментарий дрозофилы позволяет проводить систематическое препарирование клеточных и молекулярных механизмов, опосредующих ремоделирование мозговых цепей.

Введение

Ремоделирование ювенильных мозговых цепей в раннем возрасте представляет собой последний шанс для крупномасштабных изменений синаптических связей, чтобы соответствовать очень изменчивой, непредсказуемой среде, в которой рождается животное. Будучи наиболее многочисленной группой животных, насекомые разделяют этот эволюционно консервативный, основополагающий механизм ремоделирования критического периода¹. Критические периоды открываются с началом сенсорного ввода, демонстрируют обратимые изменения контуров для оптимизации связности, а затем закрываются, когда силы стабилизации сопротивляются дальнейшему^{ремоделированию}. Насекомые особенно зависимы от обонятельной сенсорной информации и демонстрируют четко определенный обонятельный критический период. Дрозофила представляет собой прекрасную генетическую модель для исследования этого зависимого от опыта критического периода в ювенильном мозге. Воздействие запаха в течение первых нескольких дней после эклозии приводит к изменению цепных связей в индивидуально идентифицированных синаптических клубочках ^3,4. Направление ремоделирования зависит от конкретного входного одоранта. Некоторые одоранты вызывают увеличение объема синаптического клубочка в течение нескольких дней после эклозии (dpe)3,5,6,7, в то время как другие одоранты вызывают быструю элиминацию синапсов в течение критического периода 0-2 dpe, что приводит к снижению объема иннервации ^8,9,10. В частности, опыт запаха этилбутирата (БЭ) приводит к дозозависимому синаптическому обрезанию нейронов обонятельных рецепторов Or42a только в этот критический^{период раннего} возраста8. Элиминация синапсов полностью обратима за счет модуляции поступления одоранта EB в течение критического периода, но становится постоянной после закрытия критического периода. Эта зависимая от обонятельного опыта синаптическая обрезка обеспечивает ценную экспериментальную систему для выяснения ограниченных во времени механизмов, лежащих в основе ремоделирования ювенильных цепей мозга.

Здесь мы представляем подробный протокол, используемый для индуцирования и анализа зависимого от опыта БЭ синаптического обрезания обонятельных сенсорных нейронов рецептора Or42a в течение критического периода раннего возраста. Мы показываем, что синаптические окончания Or42a в клубочке VM7 антенной доли могут быть специфически помечены путем трансгенного управления мембранно-привязанным маркером mCD8::GFP, либо непосредственно слитым с промотором Or42a (Or42a-mCD8::GFP)¹¹, либо с использованием бинарной системы экспрессии Gal4/UAS (Or42a-Gal4 driving UAS-mCD8::GFP)¹². Отдельные синапсы нейронов Or42a могут быть аналогичным образом помечены с использованием целевой трансгенной экспрессии маркеров пресинаптической активной зоны, объединенных в массив флуоресцентных меток (например, Bruchpilot::RFP)⁸, или электронно-плотного сигнала для ультраструктурного анализа синапсов (например, miniSOG-mCherry)⁸. Синаптические терминали Or42a могут быть визуализированы с помощью комбинации лазерно-сканирующей конфокальной микроскопии и просвечивающей электронной микроскопии. Мы показываем, что обрезка синаптических клубочков Or42a зависит от дозы БЭ, масштабируясь до концентрации временного воздействия одоранта. Процентное содержание одоранта EB, растворенного в минеральном масле, используемом в качестве транспортного средства, может варьироваться, как и продолжительность воздействия одоранта на животных на стадии развития. Наконец, мы показываем методы, используемые для анализа степени обрезки синаптических клубочков путем измерения интенсивности и объема иннервации VM7. Число синапсов также может быть количественно определено путем подсчета меченых синаптических точек и измерения параметров ультраструктуры синапсов с помощью просвечивающей электронной микроскопии⁸. В целом, показанный здесь протокол представляет собой мощный подход, который позволяет систематически препарировать как клеточные, так и молекулярные механизмы, опосредующие обрезку синаптической связи обонятельной цепи дрозофилы в ювенильный критический период. Описанная в этом исследовании общая установка воздействия запаха была использована в предыдущих исследованиях с использованием других запахов и анализом других клубочков ^3,7.

Протокол

1. Воздействие одоранта

1. С помощью тонкой кисти отсортируйте 40-50 животных на стадии развития в виде фаратных темных куколок (через 90+ ч после окукливания при 25 °C) в полистирольные флаконы дрозофилы размером 25 мм x 95 мм, содержащие стандартный корм из кукурузной патоки (рис. 1A).
2. Поместите тонкую проволочную сетку из нержавеющей стали на концы флаконов дрозофилы , чтобы сдерживать мух и при этом обеспечивать хороший поток воздуха. Закрепите крышки из проволочной сетки с помощью прозрачной пленки на боковой стороне флаконов дрозофилы .
3. В микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл поместите 1 мл 100% минерального масла (управление транспортным средством) или растворите одорант этилбутирата (EB) в минеральном масле в другой пробирке для получения желаемой концентрации (например, 15% (150 μл) или 25% (250 μл)).
4. Поместите пробирки для управления транспортным средством или микроцентрифуги с одорантом в вертикальном положении в герметичный контейнер Glasslock объемом 3700 мл. С помощью ленты надежно закрепите пробирки в центре камер с запахом вместе с флаконами дрозофилы (рис. 1B).
5. Поместите герметичные камеры управления транспортным средством и одоранта EB, содержащие поэтапные флаконы с куколками фарата дрозофилы , во увлажненный (70%) инкубатор с регулируемой температурой (25 °C) в цикле свет/темнота 12 ч.
6. Удалите только что закрытых мух через 4 часа после воздействия одоранта в камере и быстро пересадите 20-25 мух в свежие флаконы дрозофилы в камеры со свежеприготовленным одорантом (рис. 1A, B). Выбросьте незакрытые куколки.
7. Держите мух в герметичных камерах с запахом в инкубаторах в общей сложности 24 часа. Для более длительного дозирования одоранта быстро пересаживайте мух в новые флаконы с дрозофилами в свежеизготовленных камерах одоранта каждые 24 часа.
8. Обезболите мух на стадии развития, погрузив их в чашку с 70% этанолом на 1 минуту для подготовки к немедленной диссекции мозга и иммуноцитохимической обработке.

2. Диссекция головного мозга

1. Маркируйте флаконы как контрольные (только 100% минеральное масло) или подверженные воздействию БЭ (% БЭ) с помощью маркировки и сохраняйте эти обозначения в течение всего времени вскрытия мозга и последующей обработки. Обработайте 10-20 животных для каждого генотипа/состояния запаха.
2. С помощью щипцов перенесите одну муху под наркозом в маленькую миску со свежеприготовленным фосфатно-солевым буфером (PBS)¹³. Погрузите муху в PBS и продолжайте полное вскрытие мозга, полностью погрузив муху в воду.
3. Тонкими (#1) заточенными щипцами обеими руками положите брюшную сторону мухи вверх и захватите верхнюю часть грудной клетки одним щипцом и головку под хоботком другими щипцами. Следите за тем, чтобы не проникнуть в мозг.
4. Отделите голову от остальной части тела, осторожно потянув обеими руками в противоположных направлениях. Голова должна легко отделяться от грудной клетки; оставьте изолированную головку для вскрытия (рисунок 1C).
5. Проденьте щипцы, ранее использовавшиеся для захвата грудной клетки, под противоположную сторону хоботка. Начните аккуратно оттягивать кутикулу экзоскелета в противоположные стороны, чтобы она разорвалась между глазами, чтобы раскрыть мозг.
6. При вытягивании зрительные доли мозга могут отделяться вместе с экзоскелетом. Чтобы предотвратить это, используйте медленное, устойчивое потягивание двумя щипцами во время удаления кутикулы экзоскелета (Рисунок 1C, посередине).
7. Продолжайте удалять кутикулу экзоскелета с головы. Убедитесь, что все части экзоскелета удалены. Удалите все ткани, прикрепленные к мозгу, включая жировое тело и выступающую трахею.
8. Чтобы предотвратить прилипание, промойте наконечник пипетки P20 PBS + 0,2% Triton-X 100 (PBST). Сразу после вскрытия перенесите мозги в фиксирующий раствор (4% параформальдегид (PFA) + 4% сахароза) в закрытой пробирке (рис. 1C,D).

3. Иммуноцитохимия мозга

1. Зафиксируйте мозг на 30 минут при комнатной температуре (RT) с вращением из конца в конец. Сохраняя мозг в трубке, отсоедините пипетку и правильно утилизируйте опасный фиксатор. Быстро промойте неподвижные мозги 3 раза с помощью PBS (Рисунок 1D).
2. Мозги часто можно обнаружить застрявшими в колпачке трубок после вращения. Чтобы предотвратить случайную потерю мозга, которая является постоянной опасностью при всех переносах, используйте диссекционный микроскоп во время пипетирования жидкостей.
3. При подготовке к мечению антителами блокируйте фиксированный мозг на 1 ч при ЛТ в PBST + 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) + 0,5% нормальной козьей сыворотки (NGS) с постоянным вращением конца за концом (рис. 1D).
4. Удалите блок и инкубируйте мозг с выбранным первичным антителом, соответствующим образом разведенным в PBST + 0,2% BSA + 0,1% NGS. Инкубируйте мозг в течение ночи (14-16 ч) при температуре 4 °C при постоянном вращении.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Примеры использованных антител: крысиный анти-CadN (разведение 1:50)¹⁴ для мечения синаптических клубочков и куриный анти-GFP (1:1000)⁸ для мечения Or42a-mCD8::GFP (рис. 1D).
5. Отведите пипетку от первичного антитела. Промойте мозги 3 раза по 20 минут каждый с PBST. Мозг инкубируют вторичными антителами, разведенными в PBST с 0,2% БСА + 0,1% NGS в течение 2 ч при ЛТ с постоянным вращением.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно инкубировать мозг в течение ночи (14-16 часов) при температуре 4 °C. Разведите антитела в PBST с 0,2% BSA + 0,1% NGS; Здесь использованы вторичные антитела: 488 козьих анти-куриц (1:250) и 546 козьих анти-крыс (1:250).
6. Отведите пипеткой вторичные антитела. Промойте мозги 3 раза по 20 минут каждый с PBST. В конце промойте мозги в течение 20 минут PBS (Рисунок 1D).
7. Подготовьте предметные стекла для микроскопа (75 мм х 25 мм), добавив две тонкие полоски двустороннего скотча на предметное стекло на расстоянии ~25 мм друг от друга. Это обеспечивает спейсер, чтобы избежать раздавливания мозга.
8. Пипетка ~10-15 мкл монтажной среды между двумя полосками ленты для крепления мозга. С помощью наконечника для пипетки P20, предварительно промытого PBST, перенесите помеченные мозги на предметное стекло микроскопа (рис. 1E).
9. После того, как мозги будут перенесены, используйте тонкую кисть, чтобы выровнять их, убедившись, что доли антенн обращены вверх. Ищите сторону, которая имеет изогнутый горб, в котором будут находиться доли усиков.
10. После того, как мозг будет правильно сориентирован, накройте его стеклянным покровным стеклом (No 1.5H), убедившись, что покровное стекло надежно закреплено на ленте. Затем заполните боковые стороны покровного стекла дополнительным монтажным материалом (Рисунок 1E).
11. Заклейте края покровного стекла прозрачным лаком для ногтей. Дайте предметному стеклу полностью высохнуть, а затем храните его в холодильнике для последующей визуализации.

4. Конфокальная визуализация

1. Ослепите все слайды мозга в отношении генотипа и состояний опыта до получения изображений, пометив слайд закодированной меткой для последующей расшифровки.
2. Используйте лазерный сканирующий конфокальный микроскоп с 63-кратным масляным иммерсионным объективом. На всех изображениях, показанных здесь, мы используем микроскоп Zeiss 510 META (рис. 1F).
3. Используйте соответствующие лазерные линии для используемых флуорофоров. Здесь используется лазер Argon 488 и HeNe 543 для визуализации синаптических клубочков антенной доли и обонятельных сенсорных нейронов Or42a (Рисунок 2).
4. Определите оптимальное усиление и смещение для обоих каналов, в идеале сохраняя усиление для обоих каналов <750 и смещение ≈0. Это сделано для того, чтобы обеспечить оптимальное соотношение сигнал/шум при ограничении фона.
5. Расположите визуализацию к центру мозга. При визуализации клубочки VM7 располагаются проксимально к отверстию, оставшемуся в середине мозга после удаления пищевода во время диссекции (рис. 2A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клубочки VM7 всегда будут находиться близко к отверстию пищевода. Тем не менее, точное местоположение и размер немного варьируются в зависимости от различий в рассечении мозга и креплении, поэтому учитывайте это при визуализации.
6. Выберите разрешение изображения и толщину оптического среза. Здесь используется разрешение 1024 x 1024 с толщиной среза Z-стека 0,37 мкм.
7. Проведите всю конфокальную проекцию Z-стека через антенную долю, обеспечив захват полной иннервации нейронов Or42a клубочков VM7.

5. Синаптические измерения

1. Загрузите слепое изображение генотипа/состояния в Fiji (1.54f). Разделите каналы лазерной линии, нажав «Изображение» > «Цвет» > «Разделить каналы».
2. В обонятельном сенсорном канале Or42a определите, какие срезы содержат иннервацию Or42a, прокручивая весь Z-стек и определяя, где начинается и заканчивается флуоресценция.
3. Создайте проекцию суммарных срезов, включающую только срезы, содержащие иннервацию нейронов Or42a, щелкнув Image > Stacks > Z Project > Sum Slices и введя нужный диапазон.
4. На Фиджи нажмите на инструмент «Лассо » на верхней панели, чтобы проследить контур иннервации нейрона Or42a в клубочке VM7, обрабатывая каждую сторону мозгового клубочка независимо (рис. 3).
5. Умножьте длину окружности на количество срезов Z-стека и толщину каждого среза, чтобы получить объем иннервации синаптического клубочка VM7. Для количественной оценки числа синапсов можно использовать инструмент find maxima вместе с макросом find maxima stacks для подсчета точек синапса в очерченной области ^8,15.

Результаты

На рисунке 1 показан рабочий процесс для обонятельного опыта, критического периода, воздействия запаха и методов визуализации мозга. Протокол начинается с сопоставления возраста фаратных темных куколок непосредственно перед экслозией (рис. 1A). Куколки помещают в камеры с одорантами на 4 часа, а затем вновь закрытых взрослых особей переворачивают в свежие флаконы либо в камерах управления транспортным средством, либо в камерах дозированного одоранта EB (рис. 1B). Обычно мы подвергаем воздействию одоранта в течение 24 часов, хотя возможна любая продолжительность. После воздействия одоранта вскрытие мозга начинается с удаления головки из грудной клетки, а затем удаления экзоскелета кутикулы с помощью тонких щипцов (Рисунок 1C). Изолированный мозг очищается от любых связанных с ним тканей, которые могут мешать визуализации, а затем немедленно фиксируется в 4% параформальдегида и 4% сахарозы в PBS. Короткого перерыва в 30 минут достаточно для хорошей целостности мозговой ткани. Иммуноцитохимический протокол начинается с 1-часового блока (например, BSA, NGS), ночной инкубации первичных антител (например, анти-GFP, -CadN), а затем кратковременной 2-часовой инкубации вторичных антител (рис. 1D). Меченые мозги установлены на стеклянных предметных стеклах под герметичными покровными стеклами спинной поверхностью мозга вверх для лучшей визуализации долей антенн (рис. 1E). Обратите внимание, что все образцы слепы как к генотипу, так и к условиям опыта, помечая предметное стекло закодированным обозначением для последующей расшифровки. Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп с 63-кратным масляным иммерсионным объективом используется для визуализации центральных долей антенн мозга (рис. 1F). Выбраны оптимальные для используемых флуорофоров лазерные линии (например, Argon 488 и HeNe 543) для визуализации иннервации обонятельных сенсорных нейронов Or42a VM7 в контексте окружающих клубочков.

Важно выбрать оптимальное усиление, смещение, разрешение изображения и толщину оптического среза для захвата всей проекции Z-стека иннервации нейронов Or42a в клубочках VM7. Все сравниваемые генотипы и условия опыта визуализируются с идентичными настройками микроскопа. Z-стеки обрабатываются с помощью программного обеспечения ImageJ с изменениями, зависящими от опыта, которые оцениваются в первую очередь по объему иннервации ^7,14. Существует два способа вычисления объемных измерений. С помощью функции лассо ImageJ вычисляется площадь иннервации срез за срезом, а затем каждое значение умножается на толщину каждого среза (мкм)^8,9. Другой использует Z-проекции суммарных срезов и умножает количество Z-стековых срезов на толщину среза для определения среднего объема. Оба метода дают стабильные результаты. В дополнение к объемным измерениям, интенсивность флуоресценции также можно оценить с помощью проекции максимальной интенсивности клубочков VM7¹⁶. Взвешенная сумма всех пикселей оценивается с помощью проекции ImageJ sum slice max, при этом количество пикселей на каждом уровне интенсивности суммируется для вычисления общей интенсивности ^8,9. Фон может быть вычтен путем количественного определения внеклубочковой области идентичного размера. Этот метод вычитания является более трудоемким, но более точным, поскольку он учитывает различные уровни фоновой маркировки антител в каждом образце мозга для получения более репрезентативной количественной оценки значений интенсивности иннервационной флуоресценции. Измерения интенсивности проводятся в типичном диапазоне 18-30 оптических срезов (0,37 мкм/срез) в Z-стеке, усредненных для каждого мозга¹⁶. Почти во всех случаях измерения интенсивности и объема иннервационной флуоресценции дают стабильные результаты.

Во всех методах измерения репрезентативные результаты остаются неизменными; ранний опыт приема одоранта EB приводит к значительной потере иннервации нейронов Or42a. Клубочковый клубок VM7 может быть надежно идентифицирован по размеру, форме и расположению среди других точно картированных обонятельных клубочков антенной доли (рис. 2A) и по целенаправленной экспрессии мембранной метки Or42a-mCD8::GFP в сочетании с мечением клубочков антинейронным кадгерином (CadN; Рисунок 2В). Временное воздействие одоранта на транспортное средство (минеральное масло) приводит к иннервации нейронов Or42a, неотличимой от необработанного, нормального животного. Тем не менее, воздействие одоранта БЭ в первые несколько дней после эклозии (ДПЭ) вызывает обрезку синаптических клубочков (Рисунок 2В). Этот механизм обрезки полностью ограничен коротким критическим периодом на ранней стадии жизни ^8,10. В настоящее время мы обычно используем 24-часовое воздействие одоранта для оценки синаптической обрезки клубочков VM7 и связанного с этим снижения объема иннервации в мозге молодых дрозофил. Воздействие в течение 24 часов (0-1 dpe) на одорант (минеральное масло) поддерживает нормальную, плотную иннервацию Or42a-mCD8::GFP (зеленая) в синаптических клубочках VM7 (белые пунктирные кружки) в обоих полушариях мозга (рис. 2D, слева). В противоположность этому, 24-часовое воздействие (0-1 dpe) 25% одоранта EB, растворенного в минеральном масле, приводит к сильному снижению иннервации Or42a-mCD8::GFP (зеленый) и потере синаптического гломерулярного объема (Рисунок 2D, справа). Эти результаты визуально очевидны и неизменно ясны. Одним из самых важных атрибутов этого протокола восприятия запаха является четкость результатов визуализации мозга, которые также чрезвычайно поддаются прямому количественному определению интенсивности и объема флуоресценции иннервации.

Основным преимуществом этого протокола восприятия одоранта является возможность использовать его для изучения временных ограничений и дозозависимых механизмов одоранта во время критического периода синаптической обрезки. Для элиминации синапсов нейрона Or42a, вызванной БЭ в клубочке VM7, механизм ремоделирования в первую очередь ограничен ранним ювенильным возрастом (0-2 dpe), без обнаруживаемой зависимой от опыта синаптической обрезки в зрелом возрасте (7-9 dpe), за исключением незначительной модуляции при самых высоких уровнях воздействия EB⁸. Такое временное ограничение определяет критический период, и понимание этого временного механизма является важной задачей. Еще одним признаком этого протокола является то, что зависимая от опыта синаптическая обрезка является дозозависимой для БЭ (рис. 3). Временное воздействие одоранта (минеральное масло) с 0% одоранта EB приводит к нормальной иннервации нейронов Or42a синаптического клубочка VM7, что неотличимо от необработанного животного. Расчет трехмерного объема иннервации нейрона Or42a показывает размер, типичный для нормального ювенильного мозга (2260^мкм3; Рисунок 3А, слева). Репрезентативные результаты показывают, что увеличение концентрации одоранта EB приводит к все более сильному обрезанию синаптических клубочков. Например, воздействие 15% одоранта EB в течение 24 часов (0-1 dpe) приводит к явной и постоянной потере иннервации (Рисунок 3A, посередине). Количественная оценка объема 3D-иннервации показывает поразительное снижение по сравнению с контролем транспортного средства (760^мкм3 против 2260^мкм3). Воздействие 25% одоранта EB в течение 24 часов (0-1 dpe) приводит к еще большей потере иннервации (281^мкм3; Рисунок 3А, справа). Репрезентативные количественные оценки для этого диапазона концентраций одоранта EB показывают стабильные результаты по интенсивности флуоресценции (Рисунок 3B) и объему иннервации (Рисунок 3C). Эта зависимость от дозы позволяет изучить средства для предотвращения синаптической обрезки, а также для улучшения обрезки при более низком воздействии одоранта, чтобы продемонстрировать повышенное ремоделирование синаптических клубочков. Некоторые предыдущие исследования показали противоположный эффект увеличения объема клубочков при использовании других одорантов с этим протоколом¹⁰. Воздействие одоранта EB в критический период всегда приводит к поразительной и легко обнаруживаемой обрезке синаптических клубочков.

Рисунок 1: Блок-схема исследований воздействия одорантов на мозг молодых особей дрозофилы . (A) Фаратные темные куколки (через 90+ ч после окукливания при 25 °C) собирают и помещают в камеры с запахом. В одорантных условиях для эксклозии отводится 4 ч, а затем молодь мух перекладывается в свежий флакон. (B) Мухи соответствующего возраста подразделяются либо на условия управления транспортным средством (100% минерального масла), либо на этилбутират (EB; % v/v в минеральном масле). Тонкая проволочная сетка (вставка) обеспечивает доступ одоранта. Мухи обычно подвергаются воздействию в течение дополнительных 20 часов, в общей сложности 24 часа воздействия, через 0-1 день после эксклозии (dpe). (C) Мух препарируют, сначала удаляя голову, а затем тонкими щипцами аккуратно удаляют экзоскелет кутикулы и изолируют ювенильный мозг. Изолированный мозг очищается от всех окружающих тканей и выступающей трахеи. (D) Изолированный мозг фиксируется, блокируется, а затем последовательно инкубируется в первичные и вторичные антитела. Диапазон используемых антител обычно включает общий мембранный зонд для выявления синаптических клубочков антенной доли и специфический мембранный зонд для обонятельных сенсорных нейронов Or42a. (E) Меченые мозги помещаются в монтажную среду на стеклянном предметном стекле микроскопа с прокладками для ленты под герметичным покровным стеклом. Правильная ориентация мозга (тыльной поверхностью вверх) имеет решающее значение для оптимальной визуализации долей антенн. (F) Изображение мозга осуществляется с помощью лазерного сканирующего конфокального флуоресцентного микроскопа. Все образцы ослеплены в отношении генотипа и условий опыта перед визуализацией и последующим количественным анализом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Обрезка синаптических клубочков в зависимости от ощущения одоранта. (A) Обонятельные клубочки антенной доли (AL) точно картированы. Показано несколько репрезентативных синаптических клубочков. Класс обонятельных сенсорных нейронов (OSN) рецептора Or42a специфически иннервирует клубочки VM7. (B) Меченые нейроны Or42a-mCD8::GFP (зелеными) плотно иннервируют парные клубочки VM7 на левой (L) и правой (R) сторонах мозга, с мечением антителами N-кадгерина (CadN) всех синаптических клубочков AL (пурпурного). Нахлыстовая леска w¹¹¹⁸; Or42a-mCD8::GFP/+. (C) Схематическое графическое изображение иннервации синаптических клубочков VM7 с помощью Or42a OSN в условиях управления транспортным средством (100% минерального масла; слева) и воздействия этилбутирата (% EB v/v в минеральном масле; справа) в течение ювенильного критического периода. Зависимая от опыта иннервация происходит только при воздействии БЭ в раннем возрасте, при этом синапсы удаляются, а аксоны теряются, что приводит к уменьшению объема иннервации. (D) Репрезентативные конфокальные изображения иннервации Or42a OSN парных синаптических клубочков VM7 (пунктирные белые контурные круги; Or42a-mCD8::GFP, зеленый) после контроля автомобиля с маслом (слева) и воздействия 25% EB (справа) в течение 24 часов (0-1 dpe). Опыт одоранта EB приводит к синаптической обрезке и потере объема иннервации. Этот механизм, зависящий от опыта, ограничен во времени и временно обратим только в пределах четко определенного обонятельного критического периода в первые несколько дней после эклозы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Количественная оценка интенсивности флуоресценции и объема иннервации синаптических клубочков БЭ. (A) Меченая иннервация БЭ Or42a-mCD8::GFP в синаптическом клубочке VM7 (зеленый), подвергшийся воздействию от 0-1 дпВ на одорант транспортного средства контроля минерального масла (0% ЭБ, слева), 15% ЭБ (в центре) или 25% ЭБ (справа). Ниже: Те же изображения с контуром клубочковой иннервации (белые круги) и рассчитанным 3-мерным объемом иннервации. Система управления транспортным средством имеет иннервацию синаптического клубочка VM7 нейронами Or42a, что неотличимо от необработанных животных. Опыт критического периода с 15% воздействием одоранта EB приводит к явной обрезке синаптического клубочка, при этом на 66% уменьшается трехмерный объем иннервации в этом случае. Воздействие более высокого уровня 25% EB приводит к большей обрезке, в этом случае почти на 90% теряется объем синаптического клубочка. Таким образом, можно представить дозозависимую обрезку по мере увеличения ощущения одоранта. (B) Репрезентативные результаты исследования Or42a-mCD8::GFP по интенсивности флуоресценции в синаптических клубочках VM7 при воздействии от 0 до 1 dpe на одорант (масло, зеленый), 15% EB (средний, оранжевый) или 25% EB (справа, черный). (C) Репрезентативные результаты трехмерных объемов иннервации клубочков VM7 в условиях воздействия одоранта в тот же критический период. Диаграммы рассеяния показывают все отдельные точки данных со средним значением ± SEM. Значимость обозначается как p≤0,05 (*), p ≤ 0,01 (**), p ≤ 0,001 (***) и p ≤ 0,0001 (****). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Представленный здесь протокол воздействия одорантов и визуализации мозга может быть использован для надежного индуцирования и количественной оценки зависимой от опыта обрезки синаптических клубочков обонятельных сенсорных нейронов в ранний критический период жизни. В более ранних исследованиях, использующих эту парадигму лечения для изучения ремоделирования обонятельной цепи, воздействие одоранта начиналось на^2-й день после эклозии ^3,4,5. В противоположность этому, мы начинаем воздействие запаха на фаратных куколок до эклозии взрослой особи и обнаруживаем, что подавляющее большинство ремоделирования происходит в течение первых 24 ч после эклозии ^8,9. Таким образом, важным шагом в этом протоколе воздействия одоранта является помещение стадированных темных куколок в камеры с запахом до их выведения (Рисунок 1). Это не относится к воздействию одоранта куколки как такового, а скорее для обеспечения воздействия одоранта сразу после заражения взрослого особи. Мы отобрали закрытых молодых особей через 4 часа после стадирования, чтобы синхронизировать возраст в пределах узкого временного окна и избежать различий во времени воздействия одоранта. Этот более ранний интервал переживаний согласуется с недавними исследованиями, показывающими, что привыкание к обонянию БЭ заканчивается уже через 2 дня после эклозии^{через 10} дней. Тем не менее, последствия различий во времени воздействия одоранта в течение критического периода (например, 0-1 против 1-2 дней) не были хорошо охарактеризованы. Обонятельные сенсорные нейроны Or42a избирательно иннервируют клубок VM7 в антеннальной доле, который легко идентифицируется на основе точных клубочковых карт и целенаправленной иннервационной маркировки (например, Or42a-mCD8::GFP; Рисунок 2). Воздействие одоранта EB в течение критического периода не изменяет экспрессию промотора Or42a или уровни репортера⁸. Своевременное воздействие одоранта вызывает последовательную элиминацию синапсов и потерю иннервации аксонов из нейронов рецептора Or42a. Эта обрезка полностью обратима в течение раннего критического периода жизни (0-2 dpe), но не во взрослой зрелости (7-9 dpe), когда изменения в среде одоранта больше не влияют на иннервацию. Жесткое временное ограничение этого сенсорно-зависимого механизма является одним из главных нерешенных вопросов в этой области. Предпринимается много попыток вновь открыть пластичность критического периода в зрелом возрасте. Приведенный здесь протокол является мощным средством для расследования.

Простота воздействия одорантов и описанного здесь протокола визуализации мозга обеспечивает широкую доступность и широкие возможности адаптации. Опыт, начало, окончание и продолжительность воздействия одоранта полностью зависят от усмотрения исследователя, что позволяет проводить целенаправленные исследования свойств критического периода, обратимости ремоделирования и повторного раскрытия критической пластичности, подобной периодической. Аналогичным образом, силой одоранта можно легко манипулировать для изучения дозозависимой обрезки синаптических клубочков (рис. 3). Важно отметить, что исследования, в которых используются более низкие концентрации БЭ (например, 15% БЭ), могут быть использованы для тестирования манипуляций, которые могут увеличить скорость или степень ремоделирования синаптических клубочков. Например, результаты могут показать, что синаптическая обрезка при более низких уровнях EB (например, 15%) неотличима от более высоких уровней EB (например, 25%). При различных манипуляциях результаты можно сравнить с последовательной иннервацией органов управления носителем запаха и надежной обрезкой синаптических клубочков, происходящей при 25% БЭ (Рисунок 3). Одним из ограничений этого метода является то, что воздействие одоранта полностью зависит от летучести растворенного одоранта. Переменные факторы, такие как температура и относительная влажность, влияют на эффективность воздействия одоранта⁸. Плотность мух в камерах одоранта также может потенциально влиять на воздействие одоранта, например, из-за производства одорантов, полученных от мух. Рекомендуется плотность не более 20-25 мух на флакон. Концентрация запаха, необходимая для того, чтобы вызвать очень сильную обрезку синаптических клубочков, вероятно, выше, чем обычно наблюдается в природе^10,17. Для определения элиминации синапсов при более низких концентрациях одоранта потребовались бы методы визуализации с гораздо более высоким разрешением. Тем не менее, текущий протокол позволяет проводить последовательные и надежные исследования для целого ряда манипуляций.

Этот протокол воздействия одоранта и визуализации мозга имеет огромные преимущества. Дрозофила является чрезвычайно выгодной животной моделью, основанной на обширном и сложном генетическом инструментарии, который может быть систематически использован для широкого изучения взаимодействий генов и окружающей среды в критическом периоде ремоделирования обонятельных цепей. Примеры, показанные здесь, включают трансгенную линию драйвера Or42a-Gal4, мембранный маркер UAS-mCD8::GFP и прямое слияние Or42a-mCD8::GFP. Не существует заметных различий между обрезкой синаптических клубочков с помощью прямого слияния Or42a и подходами к непрямой маркировке Gal4/UAS ^8,9. Драйвер Or42a-Gal4 обеспечивает возможность как манипулировать нейронами целевых обонятельных рецепторов, так и визуализировать зависящие от опыта изменения иннервации VM7, в то время как линия прямого слияния освобождает бинарную трансгенную систему UAS-Gal4 для других манипуляций, направленных на клетки. Многие другие мутантные и трансгенные линии из обширного инструментария дрозофилы могут быть использованы для тестирования временных ограничений и механизмов, зависящих от опыта, включая идентификацию клеток, опосредующих синаптическую обрезку, межклеточные сигнальные пути, передающие обонятельную информацию, и внутриклеточные механизмы, необходимые для целенаправленного элиминирования синапсов. В целом, этот протокол позволяет систематически исследовать многие механизмы, управляющие ремоделированием контуров мозга, зависящим от обонятельного опыта. Этот протокол воздействия запаха и визуализации мозга также может быть использован для исследования поведенческих модификаций обонятельного опыта, специфичных для критического периода, генетических и фармацевтических манипуляций, которые могут обеспечить повторное открытие критической пластичности, подобной периодической, в зрелом возрасте, и других аспектов пластичности обонятельных контуров, выходящих за рамки обрезки синаптических клубочков.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
<сильный>Для воздействия запаха
<ем>Дрозофила флаконы	Genesee Scientific	32-110
Этилбутират	Sigma Aldrich	E15701
Микроцентрифужные пробирки	Fisher Scientific	05-408-129
Минеральное масло	Sigma Aldrich	M3516
Обонятельные камеры	Glasslock
Кисти для рисования	Winsor & Newton	Series 233
Parafilm	Thermofisher	S37440
Проволочная сетка	Научное оборудование	378460000
Brain Dissection
Ethanol, 190 proof	Decon Labs	2801	Разбавленный до 70%
щипцы	Fine Science Tools	11251-30	Dumont #5
Параформальдегид	Электронный микроскоп Sciences	157-8	Разбавленный до 4%
чашки Петри	Fisher Scientific	08-757-100B
Фосфатно-солевой буфер	Thermo Fisher Scientific	70011-044	Разбавленный до 1x
сахарозы	Fisher Scientific	BP220-1
Sylgard	Электронный микроскоп Sciences	24236-10
Triton-X 100	Fisher Scientific	BP151-100
Иммуноцитохимия головного мозга
488 козий антикуриный	Invitrogen	A11039
546 козий противокрысиный	Invitrogen	A11081
бычья сыворотка альбумин	Sigma Aldrich	A9647
Курица анти-GFP	Abcam	13970
Coverslips	Avantor	48366-067	25 x 25 мм
Двусторонняя лента	Скотч	34-8724-5228-8
Fluoromount-G	Электронный микроскоп Sciences	17984-25
Предметные стекла для микроскопа	Fisher Scientific	12-544-2	75 x 25 мм
Лак для ногтей	Sally Hansen	109	Xtreme Wear, Invisible
Normal козья сыворотка	Sigma Aldrich	G9023
Rat anti-CadN	Developmental Studies Hybridoma Bank	AB_528121
Confocal/Analysis
Любой компьютер/ноутбук
Конфокальный микроскоп	Carl Zeiss		Zeiss 510 META
Программное обеспечение для Фиджи			Версия 2.14.0/1.54f