Методическая статья

Покадровая визуализация мигрирующих нейронов и глиальных предшественников в эмбриональных срезах мозга мышей

1.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66631

⸱

8 марта 2024 г.

 ,  , 
1Department of Anatomy, Keio University School of Medicine, 2Department of Molecular Neurobiology, Institute for Developmental Research, Aichi Developmental Disability Center

В этой статье

Краткое содержание

Во время развития коры головного мозга нейроны и глиальные клетки берут начало в желудочковой зоне, выстилающей желудочек, и мигрируют к поверхности мозга. В этом процессе участвует множество генов. Этот протокол представляет собой технику покадровой визуализации мигрирующих нейронов и глиальных предшественников.

Аннотация

Во время развития коры головного мозга нейроны и глиальные клетки берут начало в желудочковой зоне, выстилающей желудочек, и мигрируют к поверхности мозга. Этот процесс имеет решающее значение для правильной работы мозга, и его нарушение может привести к нервно-психическим расстройствам и психическим расстройствам после рождения. На самом деле, было обнаружено, что многие гены, ответственные за эти заболевания, участвуют в этом процессе, и поэтому раскрытие того, как эти мутации влияют на клеточную динамику, важно для понимания патогенеза этих заболеваний. Этот протокол представляет собой метод покадровой визуализации мигрирующих нейронов и глиальных предшественников в срезах мозга, полученных из эмбрионов мышей. Клетки помечаются флуоресцентными белками с помощью внутриутробной электропорации, которая визуализирует отдельные клетки, мигрирующие из желудочковой зоны с высоким соотношением сигнал/шум. Более того, эта система переноса генов in vivo позволяет нам легко проводить эксперименты по усилению или потере функции на данных генах путем совместной электропорации их экспрессии или нокдаунов/нокаутных векторов. Используя этот протокол, можно анализировать миграционное поведение и скорость миграции отдельных клеток, информацию, которая никогда не получается от неподвижного мозга.

Введение

Во время развития коры головного мозга (апикальная) радиальная глия в паллиальной желудочковой зоне (ВЗ), выстилающей латеральный желудочек, продуцирует сначала нейроны, а затем глиальные предшественники с некоторым перекрывающимся периодом1. Нейроны также генерируются промежуточными предшественниками или базальной радиальной глией в субвентрикулярной зоне (SVZ), прилегающей к VZ, оба из которых происходят из (апикальной) радиальной глии 2,3. У мышей радиальные глиальные клетки продуцируют только нейроны на эмбриональный день (E) 12-14, оба нейрона и глиальные предшественники на E15-16, а глиальные предшественники с E17 идалее 4. Основная популяция глиальных предшественников, образованных на этих эмбриональных стадиях, преимущественно дифференцируется в астроциты, хотя некоторые клетки также дифференцируются в олигодендроциты5. Нейроны и предшественники астроцитов, образующиеся на этих стадиях, мигрируют к поверхности мозга и попадают в корковую пластину (будущее корковое серое вещество). Миграция нейронов из VZ в корковую пластинку происходит в несколько фаз. Нейроны сначала принимают многополярную морфологию непосредственно над многополярной зоной накопления клеток (МАЗ), перекрывая SVZ или промежуточную зону, где они энергично расширяются и втягивают множественные тонкие отростки и медленно мигрируют (мультиполярная миграция)6,7. Примерно через 24 ч нейроны трансформируются в биполярную морфологию, расширяя толстый ведущий отросток к поверхности мозга и тонкий отстающий отросток назад, и линейно мигрируют к поверхности мозга, используя радиальный отросток, простирающийся от радиальной глии к поверхности пиала в качестве каркаса, который называется режимом локомоции 2,8. Поскольку нейроны в режиме локомоции всегда достигают самой внешней поверхности корковой пластинки, проходя через своих предшественников прямо под маргинальной зоной, нейроны выстраиваются в корковой пластинке 9,10,11 в зависимости от даты рождения наизнанку.

Напротив, предшественники астроцитов быстро мигрируют в промежуточную зону и кортикальную пластинку, с частыми изменениями направления. Это миграционное поведение полностью отличается от миграции нейронов и называется эрратической миграцией. Предшественники астроцитов также мигрируют по кровеносным сосудам в процессе, называемом миграцией, управляемой кровеносными сосудами. Предшественники астроцитов переключаются между этими режимами миграции и достигают корковой пластинки 5,12. Несмотря на то, что расположение астроцитов строго не определяется датой их образования, наблюдалась умеренная тенденция раннерожденных астроцитов оседать в поверхностной части корковой пластинки. Интересно, что астроциты, которые оседают в корковой пластинке, генерируются на эмбриональных стадиях и в конечном итоге дифференцируются в протоплазматические астроциты, в то время как постнатально генерируемые астроциты не мигрируют активно, остаются в белом веществе и дифференцируются в волокнистые астроциты. Как происходит эта стадийно-зависимая спецификация астроцитарных подтипов, остается неясным.

Выявлено растущее число генов, участвующих в миграции нейронов, в том числе тех, которые участвуют в развитии нервной системы и психических расстройствах13,14. Поэтому крайне важно выяснить влияние мутаций в этих генах на поведение мигрирующих нейронов. Как упоминалось ранее, миграция нейронов происходит в несколько фаз. Покадровые наблюдения могут непосредственно определить фазу, которая в основном затронута (выход из клеточного цикла, мультиполярно-биполярный переход, скорость миграции локомоции и т. д.). Тем не менее, молекулярные механизмы, лежащие в основе спецификации, миграции и позиционирования астроцитов, остаются в значительной степени неизвестными. Учитывая, что астроциты играют решающую роль в синаптогенезе15 и формировании гематоэнцефалического барьера во время развития мозга16, дефекты развития астроцитов могут приводить к нарушениям развития нервной системы. Покадровые исследования предшественников астроцитов могут прояснить эти молекулярные механизмы и их связь с психическими заболеваниями.

Этот протокол предоставляет метод покадрового наблюдения за корковыми клетками, полученными из VZ. Подобный видеопротокол для наблюдения за миграцией нейронов уже опубликован17. В этой статье мы опишем метод как для мигрирующих нейронов, так и для предшественников астроцитов. Для мечения этих клеток флуоресцентными белками, такими как зеленые и красные флуоресцентные белки (GFP и RFP), плазмидные смеси, содержащие соответствующие компоненты, вводят в кортикальную VZ путем внутриутробной электропорации на соответствующих стадиях 18,19,20,21. Манипулируемые эмбрионы удаляются на желаемых стадиях, а мозг разрезается и используется для покадровых наблюдений с помощью лазерного сканирующего микроскопа. Скорость, направление миграции и другие факторы поведения, которые никогда не рассматриваются с помощью фиксированных образцов мозга, могут быть изучены с помощью этого метода. Использование внутриутробной электропорации, экспрессии и нокдауна/нокаута векторов может быть легко перенесено одновременно с флуоресцентными белковыми векторами, что позволяет нам проводить исследования усиления и потери функции конкретных генов.

Протокол

Настоящее исследование было проведено с одобрения и в соответствии с рекомендациями Комитета по уходу за животными и их использованию Института исследований развития, Центра инвалидности развития Айти (#2019-013) и Университета Кэйо (A2021-030). Мышей с временной беременностью ICR (дикого типа) были получены коммерчески (см. таблицу материалов). Для наблюдения за взаимосвязью между мигрирующими клетками и кровеносными сосудами использовали мышей Flt1-DsRed, у которых эндотелиальные клетки экспрессируют DsRed22. Самцов мышей Flt1-DsRed скрещивали с самками мышей ICR (обе мыши были в возрасте 8-24 недель). Все животные содержались и обрабатывались в специфических условиях, свободных от патогенов (SPF) до отбора проб. Реагенты и оборудование, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Внутриутробная электропорация

  1. Приготовьте буферизованный физиологический раствор HEPES, добавив равный объем автоклавной воды к коммерчески доступным 2x HBS.
  2. Существует два варианта анестетиков; изофлуран (ингаляции) и MMB (инъекции). В случае использования MMB, готовьте его следующим образом. Добавьте 0,75 мл медетомидина (1 мг/мл), 2 мл мидазолама (5 мг/мл) и 2,5 мл буторфанола (5 мг/мл) в 19,75 мл автоклавированной воды23.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот обезболивающий раствор становится менее активным в течение 2 месяцев. Хранить при температуре 4 °C с помощью светозащитного экрана.
  3. Приготовьте раствор атипамезола. Разведите 0,75 мл атипамезола (5 мг/мл) с 24,25 мл автоклавной воды.
  4. Приготовьте 0,2% (масс./об.) раствор Fast Green в автоклавной воде. Простерилизовать с помощью фильтра (размер пор 0,22 мкм).
  5. Готовят плазмиду с помощью обычного набора для очистки плазмид на основе щелочного лизиса и очистки колонки23 в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). Растворите очищенную плазмиду из 100 мл культуры бактерий в 30-50 мкл HBS для получения плазмидного сырья (3-5 мкг/мкл) (Дополнительный файл 1).
    1. Смешайте и разбавьте плазмидные массы с HBS и добавьте 1/10 объема 0,2% Fast Green для окрашивания инжектора. Компоненты и конечные концентрации плазмид определены в соответствии с их назначением (табл. 1).
  6. Делайте микропипетки, вытягивая стеклянные капилляры с помощью съемника для пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кончик пипетки разрезается наискось с помощью тонких щипцов. Внешний диаметр наконечника составляет примерно 70 мкм. Отметьте микропипетки с интервалом 2 μл, всасывая 2 μл воды.
  7. Введите анестетик MMB в дозе 10 мкл/г массы тела внутрибрюшинно беременной мыши на соответствующем этапе (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами).
    Примечание: Эмбриональные стадии, с которыми необходимо манипулировать, должны быть определены в соответствии с целью. Для обозначения будущих пирамидальных нейронов II/III подходит E14.5. Для маркировки глиальных предшественников необходимо провести электропорацию на Е15-16. В качестве альтернативы, мышей можно обезболить путем ингаляции изофлурана (1%-2%).
  8. После того, как мышь будет глубоко обезболиваена, поместите ее на теплую пластину при температуре 38 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы мышь не реагировала на щипки за хвост.
  9. После удаления шерсти вокруг места операции с помощью крема для депиляции продезинфицируйте операционную область несколько раз круговыми движениями как скрабом на основе йода, так и 70% спиртом. Сделайте разрез кожи длиной 2 см по средней линии от уровня2-й самой задней пары сосков спереди, а затем разрез по средней линии 2 см в брюшной стенке по белой линии (рисунок 1А).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В процессе разреза брюшной стенки слегка приподнимайте его тонкими щипцами, чтобы не разрезать внутренние органы.
  10. Положите на кожу стерильный пластиковый лист и на него лист стерильной папиросной бумаги (рисунок 1А). Создайте отверстие в центре, чтобы обнажить операционную область.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильный пластиковый лист и стерильная папиросная бумага помещаются после разреза, потому что для расположения разреза относительно положения сосков требуется широкое поле обзора.
  11. Намочите бумагу стерильным ПБС, внимательно осмотрите рога матки от разреза, а рог матки вытяните через отверстия пластикового листа и бумаги.
  12. С помощью микропипетки, прикрепленной к аспираторной трубке, введите 1 мкл плазмидной смеси в левый или правый боковой желудочек через стенку матки под давлением выдоха (рис. 1A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы плазмида может быть введена с помощью микроинъектора.
  13. Защемите головку эмбриона электродом пинцетального типа и подайте электронные импульсы с помощью электропоратора (35 В для Е14-16, 50 В для Е17, квадратные импульсы 50 мс с интервалом 450 мс, 5 раз) (рисунок 1А).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не зажимайте сильно голову эмбрионов, так как это может повредить эмбрионы. Фактический ток должен составлять 40-70 мА.
  14. Поместите маточный рог обратно в брюшную полость.
  15. Сшить брюшную стенку с помощью шелковой нити 5-0.
  16. Применяют раствор атипамезола в дозе 10 мкл/г массы тела внутрибрюшинно.
  17. Сшить кожу с помощью шелковой нити 5-0.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скин можно закрыть с помощью автоклипа.
  18. Держите обработанных мышей на теплой тарелке не менее 30 минут. Мыши начнут двигаться в клетке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура внутриутробной электропорации (с шагов 1.7 по 1.16) должна быть выполнена в течение 30 минут. Типичное время работы составляет 20 минут.

2. Подготовка ломтиков

ПРИМЕЧАНИЕ: Свежесть ломтиков является ключом к успеху этого эксперимента. Ломтики должны быть подготовлены (из шагов 2.5-2.12) в течение 2 часов.

  1. Приготовьте сбалансированный солевой раствор Хэнкса с Ca2+ и Mg2+; HBSS(+). Добавьте 5 мл CaCl2 (14 г/л, автоклавирование) и 5 мл MgSO4.7H 2O(20 г/л, автоклавирование) к 500 мл HBSS(-). Хранить при температуре 4 °C. Перед использованием раствор с 95% O2 + 5% CO2 в течение 5 минут опустошите на лед.
  2. Подготовьте питательную среду. Необходимо не менее 2,5 мл на чашку. Добавьте 2 мл фетальной бычьей сыворотки, 25 мкл L-глутамина (200 мМ), 200 мкл B27 (50x), 50 мкл пенициллина + стрептомицина (10 тыс. ед./мл и 10 мг/мл) к 8 мл нейробазальной среды.
  3. Приготовьте 3% агарозный гель с низкой температурой плавления. Порите 50 мл HBSS (+), затем добавьте 1,5 мг агарозы с низкой температурой плавления и автоклавируйте ее. Перед использованием растопите агарозу в микроволновой печи и выдержите ее при температуре 50 °C в инкубаторе на водяной бане.
  4. Добавьте 1,9 мл питательной среды в стеклянную форму для основания. Осторожно наденьте на него вставку для клеточных культур, чтобы не застрять воздушные колбы под фильтром, затем добавьте 500 мкл питательной среды на фильтр (рис. 1B). Положите его на лед.
  5. После обезболивания манипулируемых мышей путем ингаляции 5% изофлурана принесите их в жертву путем вывиха шейки матки (в соответствии с институционально утвержденными протоколами) на соответствующих стадиях наблюдения.
    Примечание: Через два дня (48 ч) и 3 дня после электропорации в точке E14.5 можно наблюдать мультиполярно-биполярный переход и режим локомоции соответственно.
  6. Достаньте эмбрионы и поместите их в чашку Петри с холодной PBS.
  7. Отбирают эмбрионы по экспрессии GFP или других флуоресцентных белков под микроскопом.
  8. После обезглавливания эмбрионов рассеките мозг6 под препарирующим микроскопом и держите его в холоде HBSS(+).
  9. Расплавленный 3% агарозный гель низкой температуры плавления вылейте в криомолд (см. Таблицу материалов), а затем поместите в него мозги и прокатайте их несколько раз. Поместите его при комнатной температуре до полного застывания агарозы, а затем поместите на лед.
  10. Коронально разрежьте мозг на толщину 350 мкм с помощью вибрирующего микротома (см. Таблицу материалов).
  11. Расположите ломтики на фильтре (максимум 6 ломтиков на фильтр).
  12. Извлеките питательную среду изнутри и снаружи фильтрующего стакана (всего 600 мкл). На этом этапе ломтики прижимаются и фиксируются на фильтре. Через 5 минут добавьте 100 мкл питательной среды внутрь вкладыша для клеточной культуры.

3. Покадровая съемка

  1. Камеру для культивирования, установленную на предметном столике инвертированного лазерного сканирующего микроскопа, следует держать при температуре 37 °C с помощью нагревателя камеры или колпака, закрывающего микроскоп, не менее чем за 30 минут до получения изображения, чтобы предотвратить дрейф Z. Подайте увлажненный газ 5%CO2 + 40%O2 в камеру для культивирования.
  2. Установите чашку для культуры с подготовленными выше ломтиками в камеру для культуры.
  3. Используя 20-кратный объектив с большим рабочим расстоянием (NA = 0,45), получите около 10 изображений Z-стека с шагом 5 мкм каждые 15-30 минут в течение 24 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется использовать моторизованный двухкоординатный стол. Это позволяет нам получать изображения из нескольких объективных полей. Как правило, в одном эксперименте с интервальной съемкой мы получаем 10-20 изображений с разных объективных полей.

4. Визуализирующий анализ

  1. Преобразуйте изображения XYZT в XYT по максимальной проекции оси Z с помощью ImageJ или другого программного обеспечения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если срезы скользили во время наблюдения, отрегулируйте положение ячеек внутри изображений с помощью StackRed, плагина ImageJ, с функцией трансформации твердого тела (см. Таблицу материалов).
  2. Отслеживайте траекторию GFP- или других флуоресцентных белков-положительных клеток вручную или автоматически. Ручная и автоматическая трассировка может быть выполнена с помощью MTrackJ24 и TrackMate 25,26 (плагины ImageJ) соответственно. Автоматическая трассировка с помощью TrackMate эффективна для непредвзятого анализа большого количества ячеек. Тем не менее, ручная трассировка с помощью MTrackJ остается полезной для точного отслеживания отдельных ячеек.

Результаты

Радиальные глиальные клетки в паллиальном VZ продуцируют только нейроны до Е14, а также нейроны и глиальные клетки до Е15 и Е16. Чтобы наблюдать за миграционным поведением нейронов и глиальных клеток одновременно, мы пометили их усиленными GFP (EGFP) и RFP соответственно, используя нейрон-специфичный промотор Tα1 промотор27 и промотор28 глиального фибриллярного кислого белка человека (hGFAP), который преимущественно активируется в астроцитах. Предшественники астроцитов повторяют деление клеток во время миграции, что приводит к разведению плазмиды в клетках. Чтобы избежать этого, использовали транспозонную векторную систему, состоящую из донорской плазмиды (pPB) и вектора экспрессии транспозазы (pCAG-hyPBase)29,30. Используемая здесь донорская плазмида (pPB-CAG-LNL-RFP) имеет кассету loxP-neo-loxP (LNL) и экспрессирует RFP в зависимости от рекомбиназы Cre. Мыши ICR (дикий тип; WT) электропорировали с помощью указанных плазмид, показанных на рисунке 2А в Е15, и срезы получали через 3 дня. В течение этого периода времени первая когорта нейронов EGFP+ достигла поверхности кортикальной пластинки (рис. 2B), но многие нейроны EGFP+ все еще мигрировали. Покадровое наблюдение проводилось в течение 24 часов. Во время этого наблюдения нейроны с толстым ведущим отростком линейно мигрировали к поверхности мозга с относительно постоянной скоростью в кортикальной пластинке (19,54 ± 6,21 мкм/ч, среднее ± стандартное отклонение, 70 клеток). Траектории миграции были автоматически отслежены с помощью программного обеспечения TrackMate (пурпурные линии на рисунке 2B). В той же объективной области предшественники астроцитов визуализировались с помощью RFP (рис. 2C). Поскольку промотор hGFAP также активен в радиальных глиальных клетках на поздних эмбриональных стадиях, некоторые нейроны, полученные из этой радиальной глии, также экспрессируют RFP (синие стрелки на рисунке 2B, C). Эти нейроны почти всегда трансфицируются вектором экспрессии EGFP. Таким образом, предшественники астроцитов были идентифицированы как RFP-одиночные положительные клетки.

В отличие от нейронов, предшественники астроцитов мигрируют быстро и хаотично с частыми изменениями направления в пределах промежуточной зоны и корковой пластинки (эрратическая миграция)5. Миграцию предшественников астроцитов отслеживали вручную с помощью программного обеспечения MTrackJ (пурпурные линии на рисунке 2C), что выявило их высокую подвижность (88,37 ± 33,61 мкм/ч, 5 клеток). Для наблюдения за взаимосвязью между предшественниками астроцитов и кровеносными сосудами использовали мышей Flt1-DsRed, которые экспрессируют DsRed, RFP, в эндотелиальных клетках. В этом эксперименте предшественники астроцитов должны были быть идентифицированы только с помощью EGFP. С этой целью была разработана системаrDIO 5 , в которой экспрессия EGFP в зависимости от hGFAP-Cre может быть элиминирована в нейронах с помощью промотора Dcx (раннего нейрон-специфического промотора)31-зависимой активации другого набора рекомбиназы ДНК и его узнавающей последовательности (Dre-rox) (Рисунок 2D, последовательность pPB-CAG-rDIO-EGFP представлена в Дополнительном файле 1)32, 33. Система rDIO была введена в мышь Flt1-DsRed на E15 с помощью внутриутробной электропорации, а срезы были приготовлены через 24 часа. В результате было замечено, что EGFP-положительные предшественники астроцитов активно мигрируют по кровеносным сосудам (миграция, управляемая кровеносными сосудами)5 (рис. 2E).

figure-results-1
Рисунок 1: Поток покадровых наблюдений за клетками, помеченными внутриутробной электропорацией. (А) Беременная мышь на соответствующей стадии подвергается анестезии, а брюшная полость разрезается. Операционная зона покрывается стерильным пластиком и стерильными бумажными листами. Рога матки обнажаются, эмбрионам вводят 1 л плазмидной смеси и вводят электронные импульсы. Брюшную стенку и кожу зашивают, а манипулируемых мышей помещают обратно в домашнюю клетку. (В) Срезы, приготовленные из электропорированного мозга, помещают на фильтр клеточной культуры (максимум 6 срезов) в стеклянную чашку. Стеклянные поддонные посуды, содержащие ломтики, монтируются в камеру для культивирования. Эта система замедленной съемки оснащена акриловым колпаком, закрывающим весь микроскоп для поддержания температуры на уровне 37 °C. Камера для культивирования, в которую подается увлажненный газ из смешанной смеси, оснащена предметным столиком для микроскопа внутри колпака. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Покадровые наблюдения за нейронами и предшественниками астроцитов. (A) Метод дифференциальной маркировки нейронов (EGFP, зеленый) и предшественников астроцитов (RFP, красный), а также репрезентативное изображение среза, полученного через 2 дня после электропорации, через 2 ч с начала покадровой визуализации (справа). (В,В) Покадровые изображения ячеек EGFP+ (B) и RFP+ (C) на одном и том же объективном поле, показанном на рисунке (A)-справа от 2 ч до 21 ч наблюдения. (B) Траектории мигрирующих ячеек EGFP+ , автоматически обнаруженных программным обеспечением TrackMate, были показаны пурпурным цветом. (C) Траектории RFP+ ячеек отслеживались вручную с помощью программного обеспечения MTrackJ. Двойные положительные клетки EGFP/RFP, которые считаются нейронами, обозначены синими стрелками. (D) Стратегия мечения предшественников астроцитов с использованием системы rDIO в эмбрионах мышей Flt1-DsRed. (E) Репрезентативный результат миграции, управляемой кровеносными сосудами. Клетка (стрелка) выступала в ведущем отростке (стрелка) и мигрировала вдоль кровеносного сосуда, экспрессирующего DsRed (пурпурного), к поверхности пиала. ДЦП; кортикальная пластинка. ИЗ; промежуточная зона. ВЗ; желудочковая зона. Масштабные линейки: 200 μм (A–C), 50 μм (E). Этот рисунок адаптирован из Tabata H. et al.5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Нейроны (слои II/III)Предшественники астроцитовСистема rDIO
(астроцитарно-специфическая маркировка)
pCAG-EGFP0,5 мкг/мклpPB-CAG-LNL-EGFP0,5 мкг/мклpPB-CAG-rDIO-EGFP0,5 мкг/мкл
или Ta1-EGFP (более специфичный для нейронов)0,5 мкг/мклhGFAP-Cre0,75 мкг/мклhGFAP-Cre0,75 мкг/мкл
pCAG-hyPBase0,5 мкг/мклpDcx-Dre0,5 мкг/мкл
pCAG-hyPBase0,5 мкг/мкл

Таблица 1: Репрезентативные компоненты плазмидной смеси для каждой мишени. Векторы EGFP могут быть заменены эквивалентными RFP или другими векторами экспрессии флуоресцентных белков. Для мечения предшественников астроцитов используется транспозонная векторная система. Векторы pPB — это транспозонные векторы PiggyBac для интеграции генома. pCAG-hyPBase — вектор экспрессии транспозазы PiggyBac. LNL — кассета loxP-neo-loxP для Cre-зависимой экспрессии. rDIO-EGFP — это Cre-loxP и Dre-roxP, зависящие от кассеты экспрессии EGFP. Чтобы наблюдать за фенотипом усиления или потери функции желаемых генов, можно добавить векторы экспрессии или нокдауны в концентрации 1 г/мкл. Концентрация этих векторов должна быть скорректирована в каждом конкретном случае.

Дополнительный файл 1: Плазмидные последовательности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Этот протокол представил метод покадрового наблюдения за клетками, полученными из паллиального (коркового) VZ. Для мечения мигрирующих клеток из VZ мы использовали внутриутробную электропорацию, при которой отдельные клетки были четко помечены с более высоким соотношением сигнал/шум, чем при вирусно-векторном мечении. Используя внутриутробную электропорацию, любой тип вектора в любой комбинации может быть легко введен в радиальные глиальные клетки (нейральные стволовые клетки) у живых эмбрионов. Нейроны и глиальные предшественники могут быть выборочно помечены с помощью различных промоторов. Поскольку число копий плазмид, вводимых при внутриутробной электропорации, велико, исследования усиления и потери функции могут быть легко проведены путем совместной электропорации векторов экспрессии GFP и различных векторов, связанных с представляющими интерес генами, таких как векторы экспрессии и векторы нокдауна/нокаута. Кроме того, внутриутробная электропорация может быть использована для введения плазмидных векторов в VZ различных областей мозга, отличных от коркового VZ, что позволяет нам наблюдать за миграцией других типов клеток, таких как тормозные нейроны, предшественники олигодендроцитов из ганглионарных возвышенностей 34,35,36 и пирамидальные нейроны гиппокампа 37.

В покадровых исследованиях влияние экспериментов с усилением и потерей функции на поведение клеток можно оценить с помощью программного обеспечения TrackMate и MTrackJ. Многие гены, в том числе ответственные за нарушения развития нервной системы и интеллектуальные нарушения, участвуют в миграции нейронов. Покадровые исследования могут напрямую показать, как эти гены регулируют поведение клеток. По сравнению с миграцией нейронов, молекулярные механизмы миграции глиальных клеток не очень хорошо изучены. Этот метод может выявить не только нормальное развитие глиальных клеток, но и генетические факторы и факторы окружающей среды, которые могут влиять на развитие глии и его связь с психическими заболеваниями.

Ограничением этого метода является то, что он неизбежно зависит от метода культивирования среза in vitro . Интересно, что мигрирующие нейроны не теряют направленных сигналов для миграции к поверхности мозга, даже в срезах, выращенных in vitro. Тем не менее, следователи должны быть осторожны с артефактами. Ячейки у поверхности крепятся к фильтру, а края срезов легко деформируются. Эти клетки должны быть исключены из анализа. По возможности следует рассмотреть возможность проведения контрольных экспериментов. Важно отметить, что срезы мозга повторяют нормальное развитие в течение примерно 24 часов. Поэтому сроки подготовки среза методом электропорации должны быть определены таким образом, чтобы анализируемые события происходили в это временное окно. Для наблюдения за мультиполярно-биполярным переходом срезы следует готовить через 2 дня после электропорации. Для анализа миграции в режиме локомоции целесообразно через 3 дня. Наблюдение за миграцией, управляемой кровеносными сосудами, является более сложной задачей, чем в других экспериментах. Эндотелиальные клетки легко разрушаются срезами без кровотока. Чтобы свести к минимуму деградацию кровеносных сосудов, срезы должны быть приготовлены как можно быстрее и выдержаны в среде, содержащей 20% сыворотки и 40% газаО2 . Другие дополнительные эксперименты, такие как гистологические анализы неподвижного мозга или визуализация in vivo в реальном времени с использованием двухфотонной микроскопии, могут усилить наблюдения, обнаруженные в срезовом покадровом анализе.

Подводя итог, можно сказать, что этот метод является единственным вариантом наблюдения за поведением клетки в течение 24 ч. С развитием новых плазмидных векторов спектр применения этого метода в будущем будет еще больше расширяться.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов.

Благодарности

ПромоутерT α1 — подарок от. Баркера и Ф. Д. Миллера. Промоутер Dcx — подарок от Q. Lu. hGFAP-Cre был подарком от Олби Мессинга. Векторная система транспозонов PiggyBac была предоставлена Институтом Сэнгера. Мыши Flt1-DsRed были предоставлены M. Ema (Университет Сига). Эта работа была поддержана JSPS KAKENHI (грант No JP21K07309 для Х. Табата, JP20H05688 и JP22K19365 для К. Накадзимы) и Научным фондом Такеда, Мемориальным фондом Кэйо Гиджуку Фукудзава для продвижения образования и исследований, Фондами академического развития Кэйо Гиджуку для К. Накадзимы.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Аспираторная трубка в сбореDrummond2-040-000
Атипамезол (5 мг/мл)MeijiMepatia
AutoclipBecton Dickinson4276309 мм
B27 добавкаGibco17504-044
Буторфанол (5 мг/мл)MeijiVetorphale
Клеточная культурная вставкаMilliporePICM ORG 50
Конфокальный микроскопNikonA1RHD25Оснащен объективом с большим рабочим расстоянием (S Plan Fluor ELWD 20XC)
CryomoldTissue-Tek4566
Культуральная камераTokkenTK-NBCMPИзготовленный на заказ
электропораторNEPA GeneNEPA21
Fast GreenSigma-AldrichF7258
ГазосмесительTokkenTK-MIGM01-02
Стеклянное основание тарелкиIwaki3910-035Диаметр стеклянного основания 27 мм
Стеклянные капиллярыNarishigeGD-1
HBS (2x)Sigma-Aldrich51558
HBSS(-)Wako084-08345
Нагревательный блокTokkenTK-0003HU20Изготовлен на заказ, включая вытяжку и обогреватель
hGFAP-CreAddgene#40591Подарок от Albee Messing
ImageJhttps://imagej.net/ij/
L-глютамин (200 мМ)Gibco25030
Низкая температура плавления агарозыLonza50100
Медетомидин (1 мг/мл)MeijiMedetomin
МикроинъекторNarishigeIM-300
Мидазолам (5 мг/мл)SandozMidazolam
MTrackJhttps://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
Нейробазальная средаGibco21103-049
pCAG-hyPBaseКДНК hyPBазы из pCMV-hyPBase (подарок от Института Сэнгера) была вставлена в нисходящий поток CAG-промотора pCAGGS (подарок от J. Miyazaki).
pDcx-DreПромоутер Dcx от Dcx4kbEGFP70 (подарок от Q. Lu) был обменян на CAG-промоутера pCAG-NLS-HA-Dre34 (подарок от Pawel Pelczar, Addgene #51272).
Пенициллин + стрептомицинGibco15140122
набор для очистки плазмидInvitrogenPureLink HiPure plasmid midiprep kit (K210005)
pPB-CAG-LNL-RFPCAG-LNL кассета от pCALNL-DsRed (подарок от Connie Cepko, Addgene #13769) и кДНК TurboRFP (Evrogen, FP232) были вставлены в сайт клонирования pPB-CAG.EBNXN (подарок от Института Сэнгера).
pPB-CAG-rDIO-EGFPПоследовательность, содержащая синтетические сайты rox, синтетическую кассету DIO и кДНК EGFP из pEGFP-N1 (Clontech, U55762) в обратном направлении  была вставлена в сайт клонирования pPB-CAG.EBNXN (подарок от Института Сэнгера). Последовательность указана в дополнительном файле.
PullerNarishigePN-31
StackRedплагин для ImageJhttp://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/
Шовная иглаNazmeC-24-521-R No.1круг, длина 14 мм
Шовная нитьNazmeC-23-B2Silk, размер 5-0
Timed pregnant ICR (wild-type) мышиJapan SLCICR
TrackMatehttps://imagej.net/plugins/trackmate/index
электрод типа TweezerBEX или NEPA GeneCUY650P5 
Т&альфа; 1-EGFPкДНК EGFP из pEGFP-N1 (Clontech, U55762) была вставлена в нисходящий поток Tα 1 промотор в плазмиде 253 (подарок от. Баркера и Ф. Д. Миллера)
Виброскопический микротомLeica или микротом ZeissVibrating blade VT1000S или Hyrax V50.

Ссылки

  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32 (1), 149-184 (2009).
  2. Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
  3. Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: A major site of neurogenesis. P Natl Acad Sci USA. 101 (9), 3196-3201 (2004).
  4. Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
  5. Tabata, H., et al. Erratic and blood vessel-guided migration of astrocyte progenitors in the cerebral cortex. Nat Commun. 13 (1), 6571(2022).
  6. Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar Migration: The third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 23 (31), 9996-10001 (2003).
  7. Tabata, H., Kanatani, S., Nakajima, K. Differences of migratory behavior between direct progeny of apical progenitors and basal progenitors in the developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 (9), 2092-2105 (2009).
  8. Rakic, P. Mode of cell migration to the superficial layers of fetal monkey neocortex. J Comp Neurol. 145 (1), 61-83 (1972).
  9. Sekine, K., Honda, T., Kawauchi, T., Kubo, K., Nakajima, K. The outermost region of the developing cortical plate is crucial for both the switch of the radial migration mode and the Dab1-dependent "inside-out" lamination in the neocortex. J Neurosci. 31 (25), 9426-9439 (2011).
  10. Shin, M., et al. Both excitatory and inhibitory neurons transiently form clusters at the outermost region of the developing mammalian cerebral neocortex. J Comp Neurol. 527 (10), 1577-1597 (2019).
  11. Sekine, K., et al. Reelin controls neuronal positioning by promoting cell-matrix adhesion via inside-out activation of integrin α5β1. Neuron. 76 (2), 353-369 (2012).
  12. Morimoto, K., Tabata, H., Takahashi, R., Nakajima, K. Interactions between neural cells and blood vessels in central nervous system development. BioEssays. 230091, (2023).
  13. Tabata, H., Nagata, K. Decoding the molecular mechanisms of neuronal migration using in utero electroporation. Med Mol Morphol. 49 (2), 63-75 (2016).
  14. Ishii, K., Kubo, K., Nakajima, K. Reelin and neuropsychiatric disorders. Front Cell Neurosci. 10, 229(2016).
  15. Bosworth, A. P., Allen, N. J. The diverse actions of astrocytes during synaptic development. Curr Opin Neurobiol. 47, 38-43 (2017).
  16. Tabata, H. Crosstalk between blood vessels and glia during the central nervous system development. Life. 12 (11), 1761(2022).
  17. Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse confocal imaging of migrating neurons in organotypic slice culture of embryonic mouse brain using in utero electroporation. J Vis Exp. (125), e55886(2017).
  18. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient Gene Transfer into the Embryonic Mouse Brain Using in Vivo Electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  19. Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev Growth Differ. 50 (6), 507-511 (2008).
  20. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  21. Fukuchi-Shimogori, T. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
  22. Matsumoto, K., et al. Study of normal and pathological blood vessel morphogenesis in Flt1-tdsRed BAC Tg mice. Genesis. 50 (7), 561-571 (2012).
  23. Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Exp Anim. 60 (5), 481-487 (2011).
  24. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
  25. Ershov, D., et al. TrackMate 7: Integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nat Methods. 19 (7), 829-832 (2022).
  26. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  27. Gloster, A., et al. The T alpha 1 alpha-tubulin promoter specifies gene expression as a function of neuronal growth and regeneration in transgenic mice. J Neurosci. 14 (12), 7319-7330 (1994).
  28. Zhuo, L., et al. hGFAP-cre transgenic mice for manipulation of glial and neuronal function in vivo. Genesis. 31 (2), 85-94 (2001).
  29. Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. P Natl Acad Sci USA. 108 (4), 1531-1536 (2011).
  30. Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. J Neurosci Meth. 207 (2), 172-180 (2012).
  31. Wang, X., Qiu, R., Tsark, W., Lu, Q. Rapid promoter analysis in developing mouse brain and genetic labeling of young neurons by doublecortin-DsRed-express. J Neurosci Res. 85 (16), 3567-3573 (2007).
  32. Sauer, B. DNA recombination with a heterospecific Cre homolog identified from comparison of the pac-c1 regions of P1-related phages. Nucleic Acids Res. 32 (20), 6086-6095 (2004).
  33. Hermann, M., et al. Binary recombinase systems for high-resolution conditional mutagenesis. Nucleic Acids Res. 42 (6), 3894-3907 (2014).
  34. Kanatani, S., et al. The COUP-TFII/Neuropilin-2 is a molecular switch steering diencephalon-derived GABAergic neurons in the developing mouse brain. P Natl Acad Sci USA. 112 (36), E4985-E4994 (2015).
  35. Yozu, M., Tabata, H., Nakajima, K. The caudal migratory stream: A novel migratory stream of interneurons derived from the caudal ganglionic eminence in the developing mouse forebrain. J Neurosci. 25 (31), 7268-7277 (2005).
  36. Kanatani, S., Yozu, M., Tabata, H., Nakajima, K. COUP-TFII is preferentially expressed in the caudal ganglionic eminence and is involved in the caudal migratory stream. J Neurosci. 28 (50), 13582-13591 (2008).
  37. Kitazawa, A., et al. Hippocampal pyramidal neurons switch from a multipolar migration mode to a novel "climbing" migration mode during development. J Neurosci. 34 (4), 1115-1126 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in utero

Похожие статьи