Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка разрушения гематоэнцефалического барьера на мышиной модели легкой черепно-мозговой травмы

1.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66653

⸱

18 октября 2024 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Neurobiology, National Defense Medical College, 2Department of Pharmacology, National Defense Medical College, 3Department of Biochemistry, National Defense Medical College

В этой статье

Краткое содержание

Был разработан метод визуализации экстравазации красителя из-за разрушения гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) путем введения двух флуоресцентных красителей мышам в разные моменты времени. Использование глицерина в качестве криопротектора способствовало иммуногистохимии на том же образце.

Аннотация

Флуоресцентные красители используются для определения степени экстравазации красителя, которая происходит из-за разрушения гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). Мечение этими красителями является сложным процессом, на который влияют несколько факторов, таких как концентрация красителей в крови, проницаемость сосудов головного мозга, продолжительность экстравазации красителя и снижение концентрации красителя в ткани из-за деградации и диффузии. В модели легкой черепно-мозговой травмы воздействие ударных волн, вызванных взрывом (BSW), вызывает разрушение BBB в течение ограниченного временного окна. Для определения точной последовательности распада ГЭБ синий Эванса и флуоресцеин изотиоцианат-декстран вводили мышам внутрисосудисто и интракардиально в различные моменты времени относительно воздействия ББО. Затем было зарегистрировано распределение флуоресценции красителя в срезах мозга. Различия в распределении и интенсивности между двумя красителями выявили пространственно-временную последовательность распада ГЭБ. Иммуноокрашивание срезов мозга показало, что астроцитарные и микроглиальные реакции коррелируют с местами распада ГЭБ. Этот протокол имеет широкий потенциал для применения в исследованиях с использованием различных моделей пробоя ГЭБ.

Введение

Разрушение и дисфункция гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) вызваны системным воспалением, инфекциями, аутоиммунными заболеваниями, травмами и нейродегенеративными заболеваниями1. При легкой черепно-мозговой травме (ЧМТ), возникшей в результате воздействия ударных волн, вызванных взрывом (ЧМТ), наблюдалась значимая корреляция между интенсивностью ЧМТ и величиной утечки флуоресцентного красителя из-за пробоя ГЭБ 2,3,4. Одной из примечательных особенностей распада ГЭБ при ЧМТ является то, что он начинается сразу или в течение нескольких часов после воздействия ЧМТ и обычно является преходящим процессом, который длится около недели, прежде чем появятся отсроченные хронические неврологические расстройства. Хотя детали остаются неясными, распад ГЭБ является частью длительного патологического каскада и также может служить прогностическим фактором при ЧМТ6. Поэтому важно понимать пространственное и временное распределение распада ГЭБ в мозге.

Флуоресцентные красители используются для определения степени распада ГЭБ 3,8. Поскольку концентрация красителей в крови, а также величина и степень распада ГЭБ изменяются со временем, требуется осторожность при интерпретации изображений экстравазации красителя. Например, отсутствие экстравазации красителя не обязательно указывает на отсутствие распада ГЭБ. Распад ГЭБ не может быть обнаружен ни до, ни после повышения концентрации красителя в крови. Даже если краситель успешно накопился в месте распада BBB, он мог быть потерян со временем после того, как распад прекратился. В целом, водорастворимые и биологически инертные вещества быстро выводятся с мочой9. Поэтому для определения того, происходит ли распад ГЭБ в конкретное время, наиболее достоверные результаты получаются при введении флуоресцентного красителя в кровоток на короткий период непосредственно перед фиксацией животного. Таким образом следует использовать коммерчески доступный флуоресцеин изотиоцианат (ФИТК)-декстран с определенной молекулярной массой.

Evans blue — широко известный синий азокраситель с сильным сродством к сывороточному альбумину. Краситель проявляет красную флуоресценцию при возбуждении зеленым светом в биологических системах2. Из-за своей инертной природы синесывороточный альбуминный комплекс Эванса остается в крови до 2 ч, что делает его полезным индикатором 69 кДа для мечения областей с скомпрометированным ГЭБ в течение как минимум этого времени 10,11. Поэтому важно учитывать потенциальные неопределенности, связанные с фармакокинетикой и токсичностью синегоЭванса 9. Тем не менее, недавнее исследование показало, что синий цвет Эванса продолжает накапливаться в областях, где ГЭБ отсутствует или нарушен7. Эта функция позволила Эвансу Блю записать историю пробоя ГЭБ, в то время как ФИТК-декстран использовался для записи пробоя ГЭБ в определенный момент времени после воздействия ББВ. Хотя Evans blue можно вводить внутривенно или внутрибрюшинно10, внутривенное введение предпочтительно для экспериментов, чувствительных ко времени. Это исследование было направлено на демонстрацию использования синего Эванса и ФИТК-декстрана для обнаружения пространственно-временного распределения распада ГЭБ после воздействия БМВ.

Во-вторых, в исследовании была представлена техника замораживания срезов мозга после наблюдения за флуоресценцией распада ГЭБ и получения более тонких срезов, пригодных для иммуногистохимических процедур. Использование глицерина в качестве монтажной среды и криопротектора упрощает процесс иммуногистохимии. Сравнивая изображения распада ГЭБ с изображениями иммуногистохимии, пространственно-временное распределение распада ГЭБ может быть коррелировано с реакцией тканей того же образца.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с этическими принципами для экспериментов на животных, установленными Национальным медицинским колледжем обороны (Токорозава, Япония). Протокол исследования был одобрен Комитетом по исследованиям на животных Медицинского колледжа Национальной обороны (одобрение No 23011-1). В исследовании использовались самцы мышей C57BL/6J в возрасте 8 недель и массой 19-23 г. Как показано на рисунке 1, однократная инъекция синего цвета Эванса и перфузия FITC-декстрана выполнялись в различные моменты времени в связи с однократным воздействием BSW. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Анестезия

ПРИМЕЧАНИЕ: Это модифицированный протокол, который увеличивает количество медетомидина в 2,5 раза по сравнению с исходным12. Дозировки медетомидина гидрохлорида, мидазолама и буторфанола составляли 0,75 мг/кг, 4 мг/кг и 5 мг/кг соответственно.

  1. Приготовьте смесь медетомидина гидрохлорида (75 мкг/мл), мидазолама (400 мкг/мл) и буторфанола (500 мкг/мл) в физиологическом растворе.
  2. Вводите смесь внутрибрюшинно для обезболивания мыши (10 мкл/г)13.
  3. Примерно через 5-10 минут убедитесь в достаточной анестезии, наблюдая за отсутствием рефлексов защемления хвоста и отвода педалей.
  4. Держите мышь в тепле до тех пор, пока она не оправится от последствий анестезии.

2. Подверженность BSW

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовалась электрошоковая трубка собственного производства14.

  1. Обезболите мышь, как описано в шаге 1.
  2. Расположите мышь на расстоянии 5 см от выходного конца ударной трубки, убедившись, что ось ее корпуса параллельна, но не выровнена по оси трубки.
  3. Подайте в голову однократное воздействие BSW с пиковым избыточным давлением 25 кПа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите мышь в тепле, пока она не оправится от последствий анестезии. Регулярно контролируйте состояние обработанной мыши. Если наблюдаются признаки дистресса, такие как трудности с кормлением или питьем, сгорбливание или длительный аномальный внешний вид без признаков выздоровления, усыпьте мышь и прекратите эксперимент досрочно. Избегайте введения анальгетиков, так как они потенциально могут повлиять на глиальную реакцию.

3. Инъекция Evans blue в хвостовую вену

ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор Evans blue следует вводить внутривенно без анестезии. При наличии анестезии краситель часто недостаточно проникает в организм, вероятно, из-за снижения артериального давленияи температуры тела. Эванс синий вводили в дозе 100 мг/кг.

  1. Приготовьте раствор синего Эванса (4% по весу в физрастворе) в микропробирке, затем смешайте и храните в темноте перед использованием.
  2. Введите раствор в хвостовую вену (2,5 μл/г)13.

4. Транскардиальная перфузия раствором ФИТК-декстрана и фиксация

  1. Добавьте гепарин в фосфатно-солевой буфер (PBS) для получения концентрации 1 Ед/мл, затем добавьте FITC-декстран к гепаринизированному PBS для достижения концентрации 3 мг/мл.
  2. Перед применением полностью растворите порошок ФИТК-декстрана. Для этого нужно аккуратно встряхивать раствор в течение 30 мин или более. Перед использованием тщательно проверьте наличие нерастворенного порошка FITC-декстрана. Если что-то осталось, продолжайте встряхивать до полного его растворения.
  3. Обезболите мышь, как описано в шаге 1.
  4. Продолжайте работу по стандартному протоколу перфузионной фиксации с помощью перистальтического насоса15,16. Сначала проводят перфузию гепаринизированным PBS, содержащим FITC-декстран, в течение 2 мин со скоростью 4,0 мл/мин. Затем перфузируют 10% нейтральным буферным раствором формалина или 4% параформальдегидом-PBS в течение 2 мин со скоростью 4,0 мл/мин, а затем 8 мин со скоростью 3,5 мл/мин.
  5. Аккуратно удалите мозг с помощью хирургических ножниц и пинцета15,16. После вскрытия зафиксируйте мозг на ночь в том же фиксаторе (т.е. 10% нейтральном буферном растворе формалина или 4% параформальдегиде-PBS) при температуре 4 °C.
  6. На следующий день замените фиксатор на PBS.

5. Обработка тканей мозга

ПРИМЕЧАНИЕ: Даже если фиксация перфузии завершена, синий Эванса и ФИТК-декстран могут дисперсировать в буфере. Таким образом, процедуры, ведущие к шагу 6.8, должны быть завершены в течение недели после перфузионной фиксации. Кроме того, не подвергайте образец воздействию света.

  1. Приготовьте 24-луночный планшет с 500 мкл 20% глицерина в фосфатном буфере (PB; pH 7,4) в каждой лунке.
  2. С помощью слайсера для мозга разрежьте мозг коронально на 12 срезов, каждый толщиной 1 мм.
  3. Переложите каждый ломтик в соответствующую лунку 24-луночного планшета и храните его при температуре 4 °C не менее 2 часов.
  4. Замените раствор 50% глицерином-PB и храните его при температуре 4 °C не менее 2 часов.
  5. Наконец, замените раствор на 100% глицерин. Для немедленного микроскопического наблюдения дайте ломтикам постоять не менее 2 часов при комнатной температуре или храните их при температуре 4 °C. Теперь срезы будут полупрозрачными и готовыми к микроскопическому наблюдению.

6. Флуоресцентное измерение экстравазации красителя

ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность флуоресцентного мечения варьируется от мыши к мыши. Поэтому интенсивность флуоресценции необходимо нормализовать. Значения флуоресценции выражаются относительно значений в пределах гигантоцеллюлярного ретикулярного ядра (GRN), поскольку эта область минимально поражается при лечении BSW.

  1. Добавьте 500 μL глицерина на дно 35-миллиметровой посуды со стеклянным дном.
  2. Переложите срез в раствор глицерина и накройте его поверхность покровным стеклом.
  3. Удалите излишки глицерина с края покровного стекла.
  4. Измерьте интенсивность флуоресценции среза под флуоресцентным микроскопом.
  5. После микроскопических измерений верните срез в лунку.
  6. Повторите измерение для всех 12 ломтиков.
  7. Добавьте 500 μL PB в каждую лунку и храните 24-луночный планшет при температуре 4 °C в течение ночи; на следующий день ломтики будут насыщены 50% глицерином-PB.
  8. Замените раствор 30% глицерином-PB и храните при температуре 4 °C не менее 2 часов.
  9. Выполните процедуры, описанные на шаге 7, в течение нескольких недель.

7. Криосекция и иммуногистохимия

  1. Приготовьте 24-луночный планшет, добавив в лунку 1000 мкл смеси равных объемов тканевой замораживающей среды и 30% глицерина-PB. Затем добавьте 1000 μл тканевой среды для замораживания в лунку 2.
  2. Переложите ломтик в лунку 1 и встряхивайте тарелку при температуре 4 °C в течение 1 часа.
  3. Переложите ломтик в лунку 2 и встряхивайте тарелку при температуре 4 °C в течение 1 часа.
  4. Быстро заморозьте ломтик изопентаном с помощью сухого льда, стараясь не загнуть ломтик. Храните ломтики при температуре -80 °C до криосекции.
  5. Криосекция среза до толщины 6 мкм. После высыхания на предметном стекле микроскопа храните срезы при температуре -80 °C.
  6. Для извлечения антигена17 срезы погружают в 10 мМ цитрат натрия (pH 6,0), нагревают до 100 °C один раз, а затем поддерживают при 98 °C в течение 1 ч.
  7. Тщательно промойте срезы в дистиллированной воде. В настоящее время срезы готовы к иммуногистохимическому окрашиванию.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1А показан временной ход введения красителя в зависимости от начала BSW с пиковым избыточным давлением 25 кПа. В протоколе «Post» раствор синего Эванса вводили внутрисосудисто за 2 ч до перфузии FITC-декстрана, которая проводилась через 6 ч, 1 день, 3 дня и 7 дней после контакта с БМС. В протоколе «Pre» раствор синего Эванса вводили непосредственно перед воздействием BSW. В протоколе «Post» ожидается, что концентрация синего Эванса достигнет своего максимума примерно за 2 ч до фик...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Новая техника двойного мечения с использованием синего цвета Эванса и FITC-декстрана была использована для точной визуализации точного пространственно-временного распределения распада ГЭБ в одном мозге. В модели низкой интенсивности BSW в исследуемом мозге наблюдались заметные вариации в степени, локализации и степени экстравазации красителя (рис. 2 и рис. 3). Несоответствия между красителями показали, что распад ГЭБ начался при...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Маюми Ватанабэ за технику криосекции. Эта работа была поддержана грантом Advanced Research on Military Medicine от Министерства обороны Японии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10% нейтральный буферный раствор формалинаFUJIFILM Wako Chemicals062-01661
Anti GFAP, кроликDAKO-AgilentIR524
Anti Iba1, кроликFUJIFILM Wako Chemicals019-19741
Курица против мыши IgG (H+L) Перекрестно адсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-21200
Cryo MountMuto Pure Chemicals33351среда для замораживания тканей
DomitorOrion Corporationмедетомидин
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Высокоадсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA10040
Evans BlueSigma-Aldrich E2129
Falcon 24-луночный полистирол прозрачный плоскодонный необработанный планшет для культивирования клеток, с крышкой, индивидуально упакованный, стерильный, 50/КейсCORNING351147
флуоресцеина изотиоцианата– декстран средний моль весом 40 000Sigma-Aldrich FD40SFITC-dextran
Стеклянная тарелка 27 мм (No1 Стекло)AGC TECHNOGLASS 3910-03535 мм Стеклянная тарелка
IX83 Инвертированный микроскопOLYMPUS
MAS Гидрофильная адгезионная микроскоп Предметные стеклаМацунами СтеклоMAS-04
Мацунами  Защитное стекло (No1)  18 x 18 ммМацунами СтеклоC018181
Мидазолам для инъекций 10 мг [SANDOZ]Сандоз
Параформальдегид EMPROVE ESSENTIAL DACMerck Millipore1.04005.1000
Перистальтический насосATTOSJ-1211 II-H
МОЗГ ГРЫЗУНА MATRIX
Взрослая мышь, 30 г, Coronal		ASI INSTRUMENTSRBM-2000CМозговой слайсер
VetorphaleMeiji Animal HealthVETLI5буторфанол

Ссылки

  1. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-brain barrier: From physiology to disease and back. Physiol Rev. 99 (1), 21-78 (2019).
  2. Kabu, S., et al. Blast-associated shock waves result in increased brain vascular leakage and elevated ros levels in a rat model of traumatic brain injury. PLoS One. 10 (5), e0127971(2015).
  3. Kuriakose, M., Rama Rao, K. V., Younger, D., Chandra, N. Temporal and spatial effects of blast overpressure on blood-brain barrier permeability in traumatic brain injury. Sci Rep. 8 (1), 8681(2018).
  4. Yeoh, S., Bell, E. D., Monson, K. L. Distribution of blood-brain barrier disruption in primary blast injury. Ann Biomed Eng. 41 (10), 2206-2214 (2013).
  5. Readnower, R. D., et al. Increase in blood-brain barrier permeability, oxidative stress, and activated microglia in a rat model of blast-induced traumatic brain injury. J Neurosci Res. 88 (16), 3530-3539 (2010).
  6. Shetty, A. K., Mishra, V., Kodali, M., Hattiangady, B. Blood-brain barrier dysfunction and delayed neurological deficits in mild traumatic brain injury induced by blast shock waves. Front Cell Neurosci. 8, 232(2014).
  7. Nishii, K., et al. Evans blue and fluorescein isothiocyanate-dextran double labeling reveals the precise sequence of vascular leakage and glial responses after exposure to mild-level blast-associated shock waves. J Neurotrauma. 40 (11-12), 1228-1242 (2023).
  8. Hoffmann, A., et al. High and low molecular weight fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextrans to assess blood-brain barrier disruption: Technical considerations. Transl Stroke Res. 2 (1), 106-111 (2011).
  9. Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Møllgård, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: How appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Front Neurosci. 9, 385(2015).
  10. Manaenko, A., Chen, H., Kammer, J., Zhang, J. H., Tang, J. Comparison Evans blue injection routes: Intravenous versus intraperitoneal, for measurement of blood-brain barrier in a mice hemorrhage model. J Neurosci Methods. 195 (2), 206-210 (2011).
  11. Yen, L. F., Wei, V. C., Kuo, E. Y., Lai, T. W. Distinct patterns of cerebral extravasation by Evans blue and sodium fluorescein in rats. PLoS One. 8 (7), e68595(2013).
  12. Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Exp Anim. 60 (5), 481-487 (2011).
  13. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. 67, e2771(2012).
  14. Satoh, Y., et al. Molecular hydrogen prevents social deficits and depression-like behaviors induced by low-intensity blast in mice. J Neuropathol Exp Neurol. 77 (9), 827-836 (2018).
  15. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. 65, e3564(2012).
  16. Selever, J., Kong, J. Q., Arenkiel, B. R. A rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices. J Vis Exp. 53, e2807(2011).
  17. Jiao, Y., et al. A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections. J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).
  18. Nagaraja, T. N., Keenan, K. A., Fenstermacher, J. D., Knight, R. A. Acute leakage patterns of fluorescent plasma flow markers after transient focal cerebral ischemia suggest large openings in blood-brain barrier. Microcirculation. 15 (1), 1-14 (2010).
  19. Xu, Y., et al. Quantifying blood-brain-barrier leakage using a combination of Evans blue and high molecular weight fitc-dextran. J Neurosci Methods. 325, 108349(2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Модель бласт-волнымаркировка синим красителем Эвансаинъекция FITC-декстранафлуоресцентная микроскопияподготовка срезов мозгаиммуногистохимияреактивные астроцитыактивация микроглии
Оценка разрушения гематоэнцефалического барьера на мышиной модели легкой черепно-мозговой травмы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.