Методическая статья

Подготовка и анализ гистологических стекол глазных яблок крыс и мышей для оценки сетчатки глаза

4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66663

⸱

23 августа 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Chair and Department of Experimental and Clinical Physiology, Laboratory of Centre for Preclinical Research, Medical University of Warsaw, 2Department of Pathology, Medical University of Warsaw

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данной рукописи представлен протокол гистологической подготовки предметных стекол из глазных яблок грызунов. С помощью предложенного метода внутреннюю часть сетчатки можно легко визуализировать и оценить под световым микроскопом. Процедура представлена для глазных яблок мышей и крыс.

Аннотация

Глазное яблоко грызунов является мощным инструментом для исследования патомеханизмов многих офтальмологических заболеваний, таких как глаукома, гипертоническая ретинопатия и многих других. Доклинические эксперименты позволяют исследователям изучить эффективность новых лекарств, разработать новые методы лечения или найти новые патомеханизмы, участвующие в возникновении или прогрессировании заболевания. Гистологическое исследование дает много информации, необходимой для оценки эффектов проведенных экспериментов, и может выявить дегенерацию, ремоделирование тканей, инфильтрацию и многие другие патологии. В клинических исследованиях редко есть шанс получить ткань глаза, пригодную для гистологического исследования, поэтому исследователям следует воспользоваться возможностью, предоставляемой исследованием глазных яблок грызунов. В данной рукописи представлен протокол гистологической подготовки срезов глазных яблок грызунов. Методика представлена для глазных яблок мышей и крыс и включает в себя следующие этапы: (i) забор глазного яблока, (ii) сохранение глазного яблока для дальнейшего анализа, (iii) обработка ткани парафином, (iv) подготовка предметных стекол, (v) окрашивание гематоксилином и эозином, (vi) оценка ткани под световым микроскопом. С помощью предложенного метода можно легко визуализировать сетчатку глаза и детально ее оценить.

Введение

Глазное яблоко представляет собой шарообразную структуру, составляющую орган зрения. Внутреннюю часть глазного яблока можно разделить на два сегмента: передний сегмент, который включает в себя роговицу, радужную оболочку, цилиарное тело, хрусталик, переднюю камеру и заднюю камеру, и задний сегмент, который включает в себя стекловидное тело, сетчатку, сосудистую оболочку, склеру, корешок зрительного нерва. Передняя камера расположена между роговицей и радужной оболочкой 1,2. Радужная оболочка представляет собой круглую структуру с отверстием в центре, называемым зрачком. На стыке роговицы и радужной оболочки находится дренажный угол, где специализированная система трабекул отводит водистую влагу от глазного яблока к венозной системе. Задняя камера ограничена радужной оболочкой, цилиарным телом и хрусталиком, а также подвешивающими связками, которые удерживают хрусталик на месте. За хрусталиком находится стекловидное тело, которое является самой большой структурой глазного яблока. Стекловидное тело прилегает к сетчатке и стабилизирует ее положение. Сетчатка окружена сосудистой оболочкой и склерой1. Анатомия глазного яблока представлена на рисунке 1.

Стенка глазного яблока состоит из трех слоев. Самым внешним слоем является склера, которая защищает глазное яблоко от травм и сохраняет его форму. На переднем полюсе глазного яблока склера превращается в прозрачную роговицу. Под склерой находится сосудистая структура, называемая увеакой, основной функцией которой является питание структур глаза. Язычковая оболочка образует сосудистую оболочку, а в пределах переднего полюса — цилиарное тело и радужную оболочку1. Самым внутренним слоем является сетчатка, которая представляет собой узкоспециализированную структуру глаза, состоящую из нейронов, глиальных клеток и клеток пигментного эпителия. Нейроны сетчатки включают фоторецепторные клетки (палочки и колбочки), горизонтальные клетки, биполярные клетки, амакриновые клетки и ганглиозные клетки сетчатки (РГК). Эти клетки организованы в сложные слои, и их роль заключается в получении и обработке световых стимулов 2,3. Глиальные клетки сетчатки состоят из клеток Мюллера, астроцитов и микроглии, которые присутствуют во всех слоях сетчатки. Многие функции глиальных клеток включают питание нейронов, поддержку гемато-сетчатчатого барьера, структурную поддержку нейронов для поддержания слоистой структуры сетчатки, регуляцию метаболизма нейронов, секрецию биологически активных белков, регулирующих функционирование, рост и выживание нейронов, а также регуляцию иммунологических процессов в сетчатке4. Клетки пигментного эпителия составляют самый внешний слой сетчатки и действуют как барьер между сосудистой оболочкой и фоторецепторами. Эти клетки регулируют двунаправленный транспорт продуктов жизнедеятельности и питательных веществ, а также защищают сетчатку от чрезмерного повреждения, вызванного светом, поглощая световую энергию и нейтрализуя генерируемые светом активные формы кислорода5.

Сетчатку можно разделить на десять слоев: (i) пигментный эпителий сетчатки, (ii) слой сегмента фоторецептора (палочки и колбочки), (iii) внешняя пограничная мембрана (ELM), (iv) внешний ядерный слой (ONL), (v) внешний плексиформный слой (OPL), (vi) внутренний ядерный слой (INL), (vii) внутренний плексиформный слой (IPL), (viii) слой ганглиозных клеток (GCL), (ix) слой нервных волокон сетчатки (RNFL), и (x) внутренняя пограничная мембрана (ILM)2. Ядрообразные слои сетчатки включают ONL, INL и GCL, в то время как слои с синаптическими связями между клетками включают OPL и IPL6. Ядра палочек и колбочек образуют ONL, а их аксоны простираются в OPL, где соединяются с дендритами биполярных и горизонтальных клеток. В пределах INL расположены ядра горизонтальной, биполярной и амакриновой клеток. В пределах IPL окончания аксонов биполярных и амакриновых клеток синапс с дендритами РГК. В пределах GCL RGC составляют большую часть клеточных тел, но также там могут быть обнаружены некоторые смещенные амакриновые клетки. Аксоны РГК образуют РНФЛ и, далее - зрительный нерв 7,8,9.

Многие офтальмологические заболевания, такие как нейродегенеративные заболевания сетчатки, приводят к необратимой и неизлечимойслепоте 10. Зрение считается одним из важнейших органов чувств, и постоянная слепота значительно снижает качество жизни пациента. Для углубления понимания патомеханизмов многих заболеваний широко проводятся доклинические исследования с использованием клеточных культур или животных моделей. Доклинические исследования на экспериментальных животных дают возможность оценить патомеханизмы глазных заболеваний и разработать новые терапевтические стратегии. Заболевания глаз можно моделировать как у крупных животных (обезьян, коров, собак и кошек), так и у мелких животных (кроликов, крыс, мышей и рыбок данио). Использование более крупных животных обеспечивает лучший доступ к глазу благодаря его размерам. Эксперименты, проведенные с грызунами, с другой стороны, благодаря их относительно быстрому размножению, позволяют выводить инбредные штаммы, характеризующиеся восприимчивостью к некоторым заболеваниям12,13.

На животных моделях возможна энуклеация, которая позволяет провести детальное гистопатологическое исследование глазного яблока, с оценкой незначительных патологий, которые появляются в тех или иных структурах глаза в процессе развития заболевания – обследование, которое может быть выполнено очень редко у человека. Гистопатологическая оценка является чрезвычайно ценным инструментом при исследовании патомеханизмов глазных заболеваний. В опубликованной литературе описания методики гистологического исследования глазных яблок весьма ограничены, а также отсутствуют пошаговые руководства, что затрудняет воссоздание для новичков. Данное исследование направлено на то, чтобы предложить простой и лаконичный метод подготовки гистологических препаратов и оценки сетчатки глаза крысы и мыши.

Протокол

Исследование проводилось в соответствии с институциональными рекомендациями. Глазные яблоки, использованные в этом исследовании, были получены от животных, включенных в эксперимент, проведенный на основании номера одобрения исследования WAW2/122/2020, выданного2-м местным комитетом по этике Варшавского университета естественных наук в Варшаве, Польша. Наш протокол был разработан путем обследования мышей в возрасте 11 и 44 недель и крыс в возрасте 6, 12 и 16 недель.

1. Подготовка глазных яблок мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: Данный протокол представляет собой метод подготовки срезов глазных яблок мышей и был разработан с использованием глазных яблок, полученных от: самок мышей C57Bl/6 в возрасте 11 недель (средний вес 21 г), самок мышей C57Bl/6 в возрасте 44 недель (средний вес 25 г), самок мышей DBA/2 в возрасте 11 недель (средний вес 21,5 г) и самок мышей DBA/2 в возрасте 44 недель с глаукомой (средний вес 25 г).

  1. Энуклеация
    1. Используйте небольшие щипцы, чтобы открыть веки. Надавите на веки, чтобы глазное яблоко выпало.
    2. Рассеките глазное яблоко от глазницы, отрезав ткань за глазным яблоком маленькими острыми ножницами. Как только глазное яблоко будет удалено из орбиты, отрежьте выступающую соединительную ткань и окологлазные мышцы.
      1. Отметьте глазные яблоки для лучшей ориентации, например, завязав небольшой шов на культе сухожилия латеральной прямой мышцы глазного яблока, чтобы отметить височную сторону глазного яблока.
  2. Фиксация тканей
    1. Поместите энуклеированное глазное яблоко в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и дайте ему отдохнуть в 4 % растворе параформальдегида (PFA), растворенном в фосфатном буферном растворе (PBS), в течение 24 ч.
    2. После этого обрабатывают глазное яблоко в течение 24 ч в 10% растворе сахарозы, затем удаляют и помещают его на 24 ч в 20% раствор сахарозы, и, наконец, извлекают и помещают на 24 ч в 30% раствор сахарозы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всего процесса держите глазное яблоко при низкой температуре 4 °C. Следует избегать проколов иглой для инфильтрации сахарозы, чтобы свести к минимуму риск повреждения глазного яблока.
  3. Замораживание и хранение тканей
    1. Извлеките глазное яблоко из раствора сахарозы и высушите его, слегка промокнув бумажным полотенцем.
    2. Поместите глазное яблоко в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и заморозьте при температуре -80 °C для дальнейшей обработки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При хранении при температуре -80 °C глазное яблоко может оставаться жизнеспособным до 12 месяцев до дальнейшей обработки.
  4. Подготовка предметного стекла
    1. Разморозьте глазное яблоко при комнатной температуре. Переместите его из микроцентрифужной пробирки в кассету и промойте под проточной водой в течение 20 минут, чтобы вымыть сахарозу.
    2. Обезвожьте глазное яблоко, поместив его в вытяжной шкаф, а затем извлеките из него следующие растворы: 70% раствор этилового спирта (EtOH) на 10 мин, 80% раствор EtOH на 10 мин, 96 % раствор EtOH на 10 мин, 99,9 % раствор EtOH на 10 мин и ацетон на 5 мин.
    3. Очистите глазное яблоко, поместив его в ксилол на 5 минут под вытяжной шкаф.
    4. Растопите парафин, поместив немного твердого парафина в стакан и поместив его в лабораторный инкубатор, установленный на температуру выше температуры плавления, указанной производителем парафина (температура плавления парафина составляет от 46 °C до 68 °C). После того как парафин полностью растает (время зависит от количества использованного парафина), переместите глазное яблоко в стакан с парафином и держите в тепле в инкубаторе 1 ч. В течение 1 часа инфильтрации парафина в ткани перемешивайте парафин каждые 10 - 15 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого этапа можно использовать тканевый процессор, который обеспечивает инфильтрацию парафина во время перемешивания раствора.
    5. Вставьте глазное яблоко в парафиновый блок, как описано ниже.
      1. Откройте кассету и снимите верхнюю крышку. Выберите металлическую форму и налейте небольшое количество парафина, чтобы покрыть дно формы. Извлеките глазное яблоко из кассеты с помощью щипцов и поместите его на парафин в форму. Положите глазное яблоко на бок, чтобы обеспечить разрез в сагиттальной плоскости.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Размещение глазного яблока на боку (с передним полюсом с одной стороны и задним полюсом с другой) позволит выполнить разрез в сагиттальной плоскости. Таким образом, будут получены срезы роговицы, радужной оболочки, цилиарного тела, зрачка, периферической и центральной сетчатки.
      2. Кратковременно охладите форму на охлаждающей пластине, установленной на -15 °C, чтобы парафин слегка застыл и закрепил ткань на месте. Тщательно накройте ткань парафином и кассетное дно, чтобы образовался блок. Положите блок на охлаждающую пластину для полного застывания. Затем извлеките блок из металлической формы и поместите парафиновые блоки обратно на охлаждающую пластину не менее чем на 15 минут, чтобы они остыли перед резкой.
    6. Закрепите парафиновый блок в микротоме. Устанавливаем микротом, чтобы обрезать излишки парафина с блока (ставим его на срез 15 мкм) и обрезаем до центра глазного яблока. Изменяем настройки микротома, чтобы вырезать более тонкие секции (мы устанавливаем его на 3,5 мкм) и помещаем секцию на слайд. Если вы используете микротом с прилегающей водяной баней, удалите лишнюю воду с горки влажной салфеткой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы получить не менее 3 поперечных сечений через зрачок. Чем менее опытен исследователь, тем больше разделов должно быть получено, чтобы обеспечить секционирование на уровне ученика. Поместите пару секций на один слайд. Также для менее опытных исследователей разрежьте ткань потолще, например, на участки толщиной 4 мкм или 5 мкм. Использование микротома с прилегающей водяной баней значительно облегчает процесс переноса срезов тканей на предметные стекла, если сравнивать с использованием микротомов без водяных бань. Еще один момент, на который стоит обратить внимание, заключается в том, что объектив может быть трудно прорезать. Чтобы свести к минимуму риск повреждения тканей хрупким хрусталиком, используйте только острые лезвия микротомов, предназначенные для разрезания твердых тканей. Рассмотрите возможность использования одного лезвия для обрезки, а другого — для резки секций, чтобы свести к минимуму затупление лезвия.
    7. Поместите предметное стекло в лабораторный инкубатор, установленный на 56 °C, на 30 минут.
    8. Извлеките предметное стекло из инкубатора и начните окрашивать его гематоксилином и эозином (H&E) вручную, последовательно помещая и снимая предметное стекло с помощью следующих растворов. Начните с 7 мин ксилола, 5 мин ксилола (еще один стакан с чистым раствором) и 5 мин ксилола (еще один стакан с чистым раствором). Затем 2 мин 96% EtOH, 1 мин 96% EtOH (еще один стакан с чистым раствором), 1 мин 96% EtOH (еще один стакан с чистым раствором).
    9. Промыть в 5 мин проточной водой, затем 2 мин гематоксилином Майера, 2 мин гематоксилином Майера (еще один стакан с чистым раствором), 5 мин проточной водой, 5 мин проточной водой (другой, чистый стакан).
    10. Добавьте 1% Эозин в течение 2 мин, затем 1 мин 96% EtOH, 30 с 96% EtOH (еще один стакан с чистым раствором), 30 с 96% EtOH (еще один стакан с чистым раствором), 2 мин ксилола, 1 мин ксилола (еще один стакан с чистым раствором), 2 мин ксилола (еще один стакан с чистым раствором).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы используйте автоматическую морилку для слайдов.
    11. Запечатайте предметное стекло с помощью автоматического запечатывателя слайдов. Подготовленное предметное стекло готово к хранению и оценке под световым микроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно выполнить герметизацию слайдов вручную, поместив тонкий слой полистирольного монтажника на окрашенную ткань и накрыв его стеклянным покровным стеклом.
      ВНИМАНИЕ: Действия, включающие PFA, EtOH, ацетон и ксилол, следует выполнять под лабораторным вытяжным шкафом.

2. Подготовка секции глазных яблок крысы и монтаж предметного стекла

ПРИМЕЧАНИЕ: Данный протокол представляет собой метод подготовки срезов глазных яблок крыс и был разработан с использованием глазных яблок, собранных от: самцов крыс SHR в возрасте 6 недель (средний вес 115,5 г), самцов крыс SHR в возрасте 12 недель с артериальной гипертензией (средний вес 262,5 г), самцов крыс WKY в возрасте 6 недель (средний вес 143,5 г), самцов крыс WKY в возрасте 12 недель (средний вес 265 г), самцы крыс Льюиса в возрасте 12 недель (средний вес 310 г) и самцы крыс Льюиса в возрасте 16 недель с индуцированным сахарным диабетом (средний вес 259 г).

  1. Энуклеация
    1. Используйте небольшие щипцы, чтобы открыть веки. Надавите на веки, чтобы выпасть глазное яблоко.
    2. Рассеките глазное яблоко от глазницы, отрезав ткань за глазным яблоком маленькими острыми ножницами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отметьте глазные яблоки для лучшей ориентации, например, наложив небольшой шов на культю сухожилия латеральной прямой мышцы глазного яблока, чтобы отметить височную сторону глазного яблока.
  2. Фиксация тканей
    1. Поместите энуклеированное глазное яблоко в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и дайте ему отдохнуть в 4% растворе параформальдегида (PFA), растворенном в фосфатном буферном растворе (PBS) в течение 24 ч.
    2. После этого обработайте глазное яблоко в течение 24 ч в 10% растворе сахарозы, затем снимите и поместите его на 24 ч в 20% раствор сахарозы, и, наконец, удалите и поместите его на 24 ч в 30% раствор сахарозы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всего процесса держите глазное яблоко при низкой температуре 4 °C. Следует избегать проколов иглой для инфильтрации сахарозы, чтобы свести к минимуму риск повреждения глазного яблока.
  3. Замораживание и хранение тканей
    1. Извлеките глазное яблоко из раствора сахарозы и высушите его, слегка промокнув бумажным полотенцем.
    2. Поместите глазное яблоко в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и заморозьте его при температуре -80 °C для дальнейшей обработки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При хранении при температуре -80 °C глазное яблоко может оставаться жизнеспособным до 12 месяцев до будущей обработки.
  4. Подготовка предметного стекла
    1. Извлеките глазное яблоко из морозильной камеры и из микроцентрифужной пробирки. Разрежьте глазное яблоко пополам по сагиттальной плоскости острым скальпелем. Снимите и выбросьте объектив.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап проще всего выполнять на замороженном глазном яблоке, только что добытом из морозилки. Во время разреза глазного яблока хрусталик может повредить окружающие ткани. Чтобы свести к минимуму риск повреждения, используйте очень острый скальпель и будьте осторожны.
    2. Разморозьте глазное яблоко при комнатной температуре. Переместите две половинки в кассету и промойте под проточной водой в течение 20 минут, чтобы смыть сахарозу.
    3. Обезвоживайте глазное яблоко, помещая его в вытяжной шкаф, а затем извлекая из него следующие растворы: 70% раствор этилового спирта (EtOH) в течение 15 минут, 80% раствор EtOH в течение 15 минут, 96% раствор EtOH в течение 15 минут, 99,9% раствор EtOH в течение 15 минут и ацетон в течение 7 минут.
    4. Очистите глазное яблоко, поместив его в ксилол на 7 минут под вытяжной шкаф.
    5. Растопите парафин, поместив немного твердого парафина в стакан и поместив его в лабораторный инкубатор, установленный на температуру выше температуры плавления, указанной производителем парафина (температура плавления парафина составляет от 46 °C до 68 °C). После того как парафин полностью растает (время зависит от количества используемого парафина), переместите глазное яблоко в стакан с парафином и держите в тепле в течение 1 ч. В течение 1 часа инфильтрации парафина в ткани перемешивайте парафин каждые 10 - 15 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого этапа можно использовать тканевый процессор, который обеспечивает инфильтрацию парафина во время перемешивания раствора.
    6. Вставьте глазное яблоко в парафиновый блок, как описано ниже.
      1. Откройте кассету и снимите верхнюю крышку. Выберите металлическую форму и налейте небольшое количество парафина, чтобы покрыть дно формы. Извлеките глазное яблоко из кассеты с помощью щипцов и поместите его на парафин в форму. Поместите одну половинку глазного яблока дном чашки вверх, а другую – вниз.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Размещение половинок глазного яблока одной половиной дном чашки вверх, а другой - вниз, позволит разрезать ткани в сагиттальной плоскости. Таким образом, будут получены срезы роговицы, радужной оболочки, цилиарного тела, зрачка, периферической и центральной сетчатки.
      2. Кратковременно охладите форму на охлаждающей пластине, установленной на -15 °C, чтобы парафин слегка застыл и закрепил глазное яблоко на месте. Тщательно накройте глазное яблоко парафином и дно кассеты до образования блока. Положите блок на охлаждающую пластину для полного застывания. Затем извлеките блок из металлической формы и поместите парафиновые блоки обратно на охлаждающую пластину не менее чем на 15 минут, чтобы они остыли перед резкой.
    7. Закрепите парафиновый блок в микротоме. Установите микротом, чтобы обрезать излишки парафина с блока (мы ставим его на срез 15 мкм) и обрезайте до тех пор, пока не дойдете до центра глазного яблока. Изменяем настройки микротома, чтобы вырезать более тонкие секции (мы устанавливаем его на 3,5 мкм) и помещаем секцию на слайд. Если вы используете микротом с прилегающей водяной баней, удалите лишнюю воду с горки влажной салфеткой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы получить не менее 3 поперечных сечений через зрачок. Чем менее опытен исследователь, тем больше разделов должно быть получено, чтобы обеспечить секционирование на уровне ученика. Поместите пару секций на один слайд. Также для менее опытных исследователей разрежьте ткань потолще, например, на участки толщиной 4 мкм или 5 мкм. Использование микротома с прилегающей водяной баней значительно облегчает процесс переноса срезов тканей на предметные стекла, если сравнивать с использованием микротомов без водяных бань.
    8. Снимите предметное стекло и начните окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) вручную, последовательно помещая и удаляя предметное стекло к следующим растворам и обратно. Начните с 7 мин ксилола, 5 мин ксилола (еще один стакан с чистым раствором) и 5 мин ксилола (еще один стакан с чистым раствором). Затем 2 мин 96% EtOH, 1 мин 96% EtOH (еще один стакан с чистым раствором), 1 мин 96% EtOH (еще один стакан с чистым раствором).
    9. Промыть в 5 мин проточной водой, затем 2 мин гематоксилином Майера, 2 мин гематоксилином Майера (еще один стакан с чистым раствором), 5 мин проточной водой, 5 мин проточной водой (другой, чистый стакан).
    10. Добавьте 1% Эозин в течение 2 мин, затем 1 мин 96% EtOH, 30 с 96% EtOH (еще один стакан с чистым раствором), 30 с 96% EtOH (еще один стакан с чистым раствором), 2 мин ксилола, 1 мин ксилола (еще один стакан с чистым раствором), 2 мин ксилола (еще один стакан с чистым раствором).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы используйте автоматическую морилку для слайдов.
    11. Запечатайте предметное стекло с помощью автоматического запечатывателя слайдов. Подготовленные предметные стекла готовы к хранению и оценке под световым микроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы выполните герметизацию слайдов вручную, поместив тонкий слой полистирольного монтажника на окрашенную ткань и накрыв стеклянным покровным стеклом.
      ВНИМАНИЕ: Действия, включающие PFA, EtOH, ацетон и ксилол, следует выполнять под лабораторным вытяжным шкафом.

3. Оценка срезов глазного яблока

  1. Сканирование слайдов
    1. Поместите предметное стекло в гистопатологический сканер предметного стекла и отсканируйте срезы в режиме сканирования: 40x. Сохраняйте изображения в виде цифровых файлов с высоким разрешением.
  2. Анализ слайдов
    1. Откройте отсканированный файл с помощью программного обеспечения для просмотра изображений. Найдите поперечные сечения зрачков и проанализируйте три последовательных сечения.
    2. Найдите самую толстую часть сетчатки и увеличьте изображение до 20x, нажав на поле увеличения в верхнем правом углу и выбрав 20x. Переместите мышь на уровень ELM в самой толстой части сетчатки и нажмите правую кнопку мыши, выберите «Аннотация» и «Линейка».
    3. Переместите мышь в сторону ILM и нажмите левую кнопку. Озаглавьте значение измерения RT и установите флажки для отображения заголовка и отображения длины. Таким образом, толщина сетчатки (RT) будет измерена, и измерение будет показано в μm. Репрезентативные результаты показаны на рисунках 2 и 3.
    4. С помощью линейки измерьте толщину каждого слоя сетчатки, включая ONL, OPL, INL и IPL, и пометьте их. Репрезентативные результаты показаны на рисунках 4 и 5.
    5. Чтобы подсчитать количество клеток в GCL, установите заранее заданную длину сетчатки. Например, для сетчатки мыши используйте один срез 500 мкм, а для сетчатки крысы — пять срезов по 100 мкм.
    6. С помощью линейки измерьте выбранное расстояние вдоль GCL. Нажмите правую кнопку мыши и выберите Аннотация > Сохранено > 1x RBC. Нажмите на каждую клетку, идентифицированную как круглое, окрашенное гематоксилином тело вдоль GCL по заданной длине сетчатки. Посчитайте количество обведенных клеток. Репрезентативные результаты показаны на рисунках 6 и 7.
    7. Проанализировав три последовательных участка, нарисуйте среднее значение по всем измерениям.

Результаты

С помощью представленного протокола можно детально оценить анатомию и морфологию конкретных структур глазного яблока. Наша команда сосредоточена на исследовании патомеханизмов нейродегенерации при заболеваниях сетчатки, таких как глаукома, диабетическая ретинопатия и гипертоническая ретинопатия. Чтобы оценить особенности нейродегенерации сетчатки, мы оценили ЛТ (глазное яблоко мыши - Рисунок 2, глазное яблоко крысы - Рисунок 3), ONL, OPL, INL и IPL (глазное яблоко мыши - Рисунок 4, глазное яблоко крысы - Рисунок 5), а также количество клеток GCL (глазное яблоко мыши - Рисунок 6, глазное яблоко крысы - Рисунок 7). Ожидается, что ЛТ и клетки ГКЛ будут самыми высокими в центральной части сетчатки и самыми низкими на периферии. Путем разреза глазного яблока на уровне зрачка на одном предметном стекле достигаются поперечные сечения центральной (на заднем полюсе глазного яблока) и периферической (близкой к цилиарному телу) сетчатки.

В то время как подсчет клеток GCL можно считать вполне объективным, систематическая ошибка, вызванная асимметричным срезом, может повлиять на результаты измерения конкретных слоев сетчатки. Чтобы избежать систематической ошибки, измерения можно представить в виде отношения толщины данного слоя к значению RT: ONL/RT, OPL/RT, INL/RT и IPL/RT.

Диаграмма анатомии глаза с обозначенными частями: сетчатка, склера, хрусталик, роговица, зрительный нерв, макула.
Рисунок 1: Анатомия глазного яблока. Сагиттальное сечение глазного яблока с маркировкой его наиболее крупных структур. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Микроскопическое изображение поперечного сечения сетчатки, показывающее слои тканей, толщина 125 мкм.
Рисунок 2: Толщина сетчатки у мыши. Измерение толщины сетчатки (ОТ) от внешней пограничной мембраны до внутренней пограничной мембраны в самой широкой точке, отмеченной зеленой полосой. Глазное яблоко мыши (штамм: C57Bl/6, возраст: 44 недели). Масштабная линейка в левом углу показывает длину 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Гистологический срез со слоями сетчатки толщиной 53,4 мкм; Микроскопическое изображение, исследование тканей.
Рисунок 3: Толщина сетчатки у крысы. Измерение толщины сетчатки (ОТ) от внешней пограничной мембраны до внутренней пограничной мембраны в самой широкой точке, отмеченной зеленой полосой. Глазное яблоко крысы (штамм: Льюиса, возраст: 16 недель). Масштабная линейка в левом углу показывает длину 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Диаграмма поперечного сечения ткани сетчатки; измеряемые слои: IPL, INL, OPL, ONL; Микроскопический анализ.
Рисунок 4: Слои сетчатки у мыши. Измерение толщины отдельных слоев сетчатки: наружного ядерного слоя (ONL), наружного плексиформного слоя (OPL), внутреннего ядерного слоя (INL) и внутреннего плексиформного слоя (IPL), отмеченных зелеными полосами. Глазное яблоко мыши (штамм: C57Bl/6, возраст: 44 недели). Масштабная линейка в левом углу показывает длину 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Микроскопическое изображение поперечного сечения сетчатки с мечеными слоями: OPL, ONL, IPL, INL; масштабная линейка 100 мкм.
Рисунок 5: Слои сетчатки у крысы. Измерение толщины отдельных слоев сетчатки: наружного ядерного слоя (ONL), наружного плексиформного слоя (OPL), внутреннего ядерного слоя (INL) и внутреннего плексиформного слоя (IPL), отмеченных зелеными полосами. Глазное яблоко крысы (штамм: Льюиса, возраст: 16 недель). Масштабная линейка в левом углу показывает длину 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Гистологический разрез, показывающий слоистую клеточную структуру, изображение с микроскопа, анализ тканей, масштаб 500 мкм.
Рисунок 6: Подсчет клеток слоя ганглиозных клеток у мыши. Метод подсчета клеток ганглиозного клеточного слоя (ГКЛ) вдоль сетчатки на длине 500 мкм. Одиночные клеточные тела были идентифицированы как круглые, окрашенные гематоксилином тельца, расположенные в слое ганглиозных клеток. Клетки отмечены черными кругами. Глазное яблоко мыши (штамм: DBA/2, возраст: 44 недели). Масштабная линейка в левом углу показывает длину 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Гистологическое стекло, срез сетчатки; видимые слои тканей; Микроскопическое исследование, масштаб 100 мкм.
Рисунок 7: Подсчет клеток слоя ганглиозных клеток у крысы. Метод подсчета клеток слоя ганглиозных клеток (ГКЛ) вдоль сетчатки на длине 100 мкм. Одноклеточные тельца были идентифицированы как круглые, окрашенные гематоксилином тела, расположенные в слое ганглиозных клеток. Клетки отмечены черными кругами. Глазное яблоко крысы (штамм: Льюиса, возраст: 16 недель). Масштабная линейка в левом углу показывает длину 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Гистологическое исследование глазного яблока мыши и крысы является мощным инструментом в области экспериментальной офтальмологии. Он может предоставить новую информацию, связанную с изменениями в глазных структурах в ходе офтальмологических заболеваний, которые в противном случае не наблюдались бы в клинических условиях. Описанные протоколы представляют собой простой метод проведения гистологического анализа сетчатки. Тонкости процедуры, необходимой для обработки передних тканей, таких как роговица, здесь не описываются.

В представленном исследовании энуклеация проводилась после усыпления животных, поскольку, помимо глазных яблок, для исследовательских целей были собраны и другие ткани (кровь, почки). Тем не менее, энуклеация также может быть выполнена на живых животных под анестезией. Уайлдинг и др. описали процедуру14, и мы хотели бы отослать читателей к этой работе, чтобы ознакомиться с фотографиями процедуры энуклеации.

Несмотря на то, что протоколы подготовки глазных яблок мыши и крысы схожи, принципиальное различие между глазными яблоками мыши и крысы, которое следует учитывать при подготовке предметных стекол, заключается в их размере. Глазные яблоки крыс имеют в 8 - 10 раз больший объем по сравнению с мышами, в то время как средняя осевая длина глазного яблока мыши составляет около 3,2 мм, а осевая длина глазного яблока крысы обычно колеблется около 6,91 мм15,16. Это облегчает необходимость разрезать глазные яблоки крыс пополам для лучшего проникновения реагента в ткани во время обработки. Кроме того, время, необходимое для проникновения реагента в ткани крысы, больше, чем для глазных яблок мыши. Разрезая глазные яблоки крысы пополам, важно использовать острое лезвие, так как твердая, замерзшая хрусталик может оказаться препятствием.

Еще один момент, который стоит обсудить, – фиксация тканей после сбора у животных. В представленном протоколе глазные яблоки, после энуклеации, фиксировали с помощью ПФА и погружали в растворы сахарозы. Сахароза действует как криопротектор, так как защищает клетки крупных тканей от повреждения кристаллами льда, которые образуются при замораживании17. Замораживание ткани позволяет исследователям хранить ткань дольше, а также использовать ее для различных исследований в будущем, включая гистопатологический анализ с микротомом (как представлено), гистопатологический анализ с помощью криотомного и иммуномечение для оценки с помощью конфокальной микроскопии. Например, при разрезании глазного яблока крысы пополам (шаг 2.4.1), если разрез выполнен качественно и быстро (в течение 5 - 10 с), а глаз не успел оттаять, то одна половина глазного яблока может быть использована для гистопатологии, а другая может быть помещена обратно в морозильную камеру для будущей иммуномаркировки. Мы не рекомендуем проводить иммуномечение тканей, ранее инфильтрированных парафином, в связи с возможными изменениями конформации белковых эпитопов после фиксации парафина. Однако, если группа исследователей только планирует выполнить гистопатологический анализ с помощью микротома, можно использовать более простой, стандартный метод фиксации тканей для заделки парафина – например, вместо выполнения шагов 1.2.1 – 1.4.1 для мышей или шагов 2.2.1 – 2.4.2 для крыс поместить ткани в 10% раствор ПФА на 24 ч, а затем хранить их в PBS при температуре 4 °C до обработки. Сахароза тогда не понадобится в качестве криопротектора, так как ткани не будут заморожены. Используя этот предложенный метод, можно избежать процесса замораживания, который может оказаться полезным и привести к получению слайдов более высокого качества. Замораживание глазных яблок, хотя и предоставляет исследователям больше свободы в выборе времени для проведения гистопатологического исследования, является шагом, который потенциально может снизить качество образца и привести к отслоению сетчатки. Однако следует помнить, что при хранении тканей при температуре 4 °C их биологическая стабильность будет короче, и ткани должны быть проанализированы в течение 4 недель. Также, при работе с крысиными глазными яблоками, шаг 2.4.1 (разрезание глазных яблок пополам) будет гораздо сложнее выполнить на незамороженном глазном яблоке.

Представленная методология разработана на основе методологии, описанной Chai et al.18, Igarashi et al.19, Zhang et al.20 и Dorfman et al.21, на основе личного опыта, а также метода проб и ошибок. Метод измерения толщины сетчатки и отдельных слоев описан на основе методики, представленной Chai et al.16 и Barber et al.18,22. Метод подсчета РГК сетчатки был разработан на основе обзора работ Chai et al.16, Zhang et al.18, Steinle et al.19 и Dorfman et al.18,20,21,23. В целом, приготовление гистопатологических стекол глазных яблок отличается от стандартного препарата предметного стекла с фиксированным формалином парафином, поскольку глазное яблоко имеет сферическую форму и, следовательно, его сложнее обрабатывать, резать и резать. Кроме того, склера является барьером для инфильтрации реагента в ткани. При подготовке гистологических препаратов глазных яблок необходимо работать более деликатно и аккуратно, стараясь при этом не повредить нежные структуры внутренней части глазного яблока. Модификации этого протокола могут включать использование метода встраивания метакрилата вместо встраивания парафина, что, как сообщается, может обеспечить лучшие морфологические результаты. Тем не менее, очень немногие исследователи использовали этот метод для оценки сетчатки24,25.

Этот протокол не свободен от предвзятости. Самой большой проблемой, с которой боролась наша команда, был разрыв сетчатки и отслоение сетчатки. Особенно склонной к разрывам была сетчатка глазных яблок крыс, так как перед подготовкой предметного стекла их приходилось разрезать пополам, и поэтому сетчатка была более подвержена повреждениям. Из-за отслойки сетчатки этот протокол не может быть использован для оценки сосудистой оболочки глаза, пигментного эпителия сетчатки или слоя сегмента фоторецептора. Тем не менее, наша команда считает, что этот протокол может быть использован для оценки внутренней сетчатки (от ILM до ELM). Чтобы свести к минимуму разрыв и отслоение сетчатки, каждый шаг протокола должен выполняться аккуратно, медленно и точными движениями.

Гистопатологический анализ сетчатки не является частью стандартной диагностики человека, но является широко используемым методом в доклинических исследованиях. Результаты гистопатологической оценки сетчатки в доклинических исследованиях могут быть соотнесены и обсуждены с результатами оптической когерентной томографии (ОКТ)26, которая представляет собой исследование, показывающее поперечное сечение сетчатки во время исследования in vivo , которое может быть выполнено в клинических условиях, среди людей в клинических испытаниях. ОКТ, однако, является менее подробным обследованием. Поэтому информация, которую мы можем почерпнуть из гистологических исследований, проведенных в рамках доклинических исследований, незаменима и необходима для развития медицинских знаний.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Работа, в том числе на крысах, финансировалась в рамках проекта TIME 2 MUW - повышение квалификации преподавания как возможность для развития Варшавского медицинского университета, софинансируемого Европейским социальным фондом в рамках Операционной программы Развитие образования знаний на 2014-2020 годы, номер соглашения о софинансировании: POWR.03.05.00-00-Z040/18-00. Работа, в том числе на мышах, проводилась в рамках проекта, реализованного в период с 2020 по 2022 год и финансируемого за счет субсидии на науку, полученной Варшавским медицинским университетом.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ацетон Chempur 
Пинцет Dumont #5, 11см, 0.05 x 0.01мм НаконечникиWorld Precision Instruments14095маленькие, микрохирургические щипцы
EosinMar-Four4P.05.2001/LВодный раствор
Этиловый спирт 96 %Chempur CH.ET. АЛ.96%ЧЕХИЯ.
CH Этиловый спирт 99,9 %Chempur ЧЛ. ЭТИЛ. ALK.99,9%BWИспользовать для приготовления 70% и 80% растворов EtOH
Glacier - 86° C Морозильная камера со сверхнизкой температурой NU-9483ENuAire13027D0034Температура заморозки - 80 градусов; C
Стеклянные слайдыMar-FourMI.15.01673Матовые стеклянные слайды с двусторонним матовым полем для описания
Leica CV5030 Полностью автоматизированная стеклянная туфелькаLeica Biosystems 14,04,78,80,101Автоматический запечатыватель слайдов 
ГематоксилинМайера Chempur 
Металлические основания форм 15 мм   x 15 ммLeica Biosystems 
Microme HM 340 EThermo Scientific90-519-0Microtome
бритвенные лезвия MicrotomeMar-FourHI. N.35Угол реза 35&d;
Микро-двойная кассета для биопсииMar-FourLN.13874550
Микроволновый гибридный тканевый процессорMilestone
Multistainer Leica ST5020Leica Biosystems Автоматизированная морилка для предметных стекол 
Сканер слайдов NanoZoomer 2.0-HTHamamatsuC9600Гистопатологический сканер слайдов
NDP.view2 Программное обеспечение для просмотра изображенийHamamatsuU12388-01Программное обеспечение для просмотра изображений
Paraffin Pathowax PlusMar-Four4P. PWP.010Температура плавления 56 °° С - 58 °°; C
ПараформальдегидSigma - Aldrich441244-1KGПриготовьте 4% раствор в
таблетках PBS PBSMerck Millipore524650-1EAИспользуйте для приготовления раствора фосфатного буферного раствора, в соответствии с инструкциями производителя
Проколите микроцентрифужные трубки, 1,5 млхолодильника-морозильника Thermo Scientific69715
EN14000AWElectrolux925032562-00Холодильные 4° C
Лезвие скальпеляSwann-MortonT.OST. SKAL00.024
СахарозаChempur 
SuperCut Пружинные ножницы, 12,5 см, изогнутыемировые прецизионные инструменты501925изогнутые, маленькие микрохирургические ножницы
Лента для автоматических запайщиковMar-FourKP-3020/SMRH001
XyleneChempur ЧЛ. KSYL.5L.METAL.OP 
1110248001246874023803081427720906

Ссылки

  1. Kels, B. D., Grzybowski, A., Grant-Kels, J. M. Human ocular anatomy. Clin Dermatol. 33 (2), 140-146 (2015).
  2. Gupta, M. P., Herzlich, A. A., Sauer, T., Chan, C. C. Retinal anatomy and pathology. Dev Ophthalmol. 55, 7-17 (2016).
  3. Masland, R. H. Neuronal diversity in the retina. Curr Opin Neurobiol. 11 (4), 431-436 (2001).
  4. Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C. Glia-neuron interactions in the mammalian retina. Prog Retin Eye Res. 51, 1-40 (2016).
  5. Boulton, M., Dayhaw-Barker, P. The role of the retinal pigment epithelium: Topographical variation and ageing changes. Eye (Lond). 15 (Pt 3), 384-389 (2001).
  6. Baden, T., Euler, T., Berens, P. Understanding the retinal basis of vision across species. Nat Rev Neurosci. 21 (1), 5-20 (2020).
  7. Nguyen-Ba-Charvet, K. T., Chédotal, A. Development of retinal layers. C R Biol. 337 (3), 153-159 (2014).
  8. Adams, T., Chernoff, E., Wilson, J., Dharmarajan, S. Reactive muller glia as potential retinal progenitors. InTech. , (2013).
  9. Salman, A., Mcclements, M. E., Maclaren, R. E. Insights on the regeneration potential of müller glia in the mammalian retina. Cells. 10 (8), 1957(2021).
  10. Marchesi, N., Fahmideh, F., Boschi, F., Pascale, A., Barbieri, A. Ocular neurodegenerative diseases: Interconnection between retina and cortical areas. Cells. 10 (9), 2394(2021).
  11. Enoch, J., Mcdonald, L., Jones, L., Jones, P. R., Crabb, D. P. Evaluating whether sight is the most valued sense. JAMA Ophthalmol. 137 (11), 1317-1320 (2019).
  12. Struebing, F. L., Geisert, E. E. What animal models can tell us about glaucoma. Prog Mol Biol Transl Sci. 134, 365-380 (2015).
  13. Bouhenni, R. A., Dunmire, J., Sewell, A., Edward, D. P. Animal models of glaucoma. J Biomed Biotechnol. 2012, 692609(2012).
  14. Wilding, L. A., Uchihashi, M., Bergin, I. L., Nowland, M. H. Enucleation for treating rodent ocular disease. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (3), 328-332 (2015).
  15. Lin, C. H., et al. A protocol to inject ocular drug implants into mouse eyes. STAR Protoc. 3 (1), 101143(2022).
  16. Lozano, D. C., Twa, M. D. Development of a rat schematic eye from in vivo biometry and the correction of lateral magnification in sd-oct imaging. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (9), 6446-6455 (2013).
  17. Castro, G., Navajas, E., Farah, M. E., Maia, M., Rodrigues, E. B. Migration, integration, survival, and differentiation of stem cell-derived neural progenitors in the retina in a pharmacological model of retinal degeneration. ISRN Ophthalmol. 2013, 752161(2013).
  18. Chai, G. R., Liu, S., Yang, H. W., Chen, X. L. Quercetin protects against diabetic retinopathy in rats by inducing heme oxygenase-1 expression. Neural Regen Res. 16 (7), 1344-1350 (2021).
  19. Igarashi, T., et al. Tyrosine triple mutated aav2-bdnf gene therapy in a rat model of transient iop elevation. Mol Vis. 22, 816-826 (2016).
  20. Zhang, W., et al. Therapeutic efficacy of neural stem cells originating from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in diabetic retinopathy. Sci Rep. 7 (1), 408(2017).
  21. Dorfman, D., Aranda, M. L., Rosenstein, R. E. Enriched environment protects the optic nerve from early diabetes-induced damage in adult rats. PLoS One. 10 (8), e0136637(2015).
  22. Barber, A. J., et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. J Clin Invest. 102 (4), 783-791 (1998).
  23. Steinle, J. J., Kern, T. S., Thomas, S. A., Mcfadyen-Ketchum, L. S., Smith, C. P. Increased basement membrane thickness, pericyte ghosts, and loss of retinal thickness and cells in dopamine beta hydroxylase knockout mice. Exp Eye Res. 88 (6), 1014-1019 (2009).
  24. Polley, E. H., Walsh, C. A technique for flat embedding and en face sectioning of the mammalian retina for autoradiography. J Neurosci Method. 12 (1), 57-64 (1984).
  25. Turner, K. W. Hematoxylin toluidine blue-phloxinate staining of glycol methacrylate sections of retina and other tissues. Stain Technol. 55 (4), 229-233 (1980).
  26. Cheng, J., et al. Correlation of optical coherence tomography and retinal histology in normal and pro23his retinal degeneration pig. Transl Vis Sci Technol. 7 (6), 18(2018).

Перепечатки и разрешения

Теги

Подготовка и анализ гистологических стекол глазных яблок крыс и мышей для оценки сетчатки глаза
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.