Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Экзосомный miR-15a, полученный из слёз, как новый диагностический инструмент диабетической ретинопатии

1.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66687

⸱

30 декабря 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UM Eye Research Centre (UMERC), Department of Ophthalmology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya, 2Department of Ophthalmology, Universiti Malaya Medical Centre, 3Department of Anaesthesiology and Department of Pathology, Johns Hopkins School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье описывается протокол для сбора и обнаружения miR-15a из слёз как нового диагностического инструмента диабетической ретинопатии.

Аннотация

Диабетическая ретинопатия (ДР) — это серьёзное осложнение сахарного диабета, затрагивающее значительную долю населения с диабетом. Ранняя диагностика и вмешательство критически важны для предотвращения необратимой потери зрения. Современные методы диагностики, хотя и эффективны, имеют ограничения. miRNA — небольшая некодирующая РНК, которая ингибирует стабильность и/или трансляцию мРНК путём связывания с 3'-нетранслированными областями (3'-UTR) целевых мРНК, всё чаще признаётся значимой связью с диабетом и может быть получена через слёзы. В этом исследовании изучался потенциал экзосомного miR-15a, полученного из слезной жидкости, как нового диагностического маркера для ДР. Образцы слёз были получены у 135 пациентов с диабетом (36 с диабетической ретинопатией [DR] и 50 без DR) и 49 здоровых контрольных групп. Экзосомы были изолированы, а уровни экспрессии экзосомного miR-15a измерялись с помощью капельной цифровой ПЦР (ddPCR). Результаты показали, что экспрессия экзосомного miR-15a была изменена у пациентов с диабетом и ДР по сравнению со здоровыми пациентами. Эти данные указывают на то, что экзосомный miR-15a, полученный из слезной жидкости, может играть роль в молекулярных механизмах, лежащих в основе диабета и его осложнениях. Кроме того, он обладает потенциалом как неинвазивный и надёжный диагностический биомаркер диабетической ретинопатии, обеспечивая высокую чувствительность и специфичность.

Введение

Диабетическая ретинопатия (ДР) — одно из самых известных микроваскулярных осложнений диабета, угрожающее зрению миллионов людей по всему миру. Глобальная распространённость ДР по демографическим данным по Атласу ВПЛ 2019 оценивается в 22,7% от всего населения диабетиков в мире, при этом число новых случаев постоянно растёт, особенно в развитых и развивающихсястранах 1. Клинически ДР характеризуется ранней стадии ДР или непролиферативной диабетической ретинопатией (NPDR), поздней стадией ДР или пролиферативной диабетической ретинопатией (PDR), а также наличием макулярного отёка. Повышенная сосудистая проницаемость и закупорка капилляров — два распространённых патологических изменения, наблюдаемые при NPDR, а при PDR 2,3 наблюдается аномальная неоваскуляризация радужки, макулы, зрительного диска или сетчатки. Прогрессирование в PDR, которое может привести к кровоизлиянию стекловидного тела и отслоению сетчатки, может привести к значительному ухудшениюзрения 3. Во всех случаях патологические изменения можно выявить с помощью фундоскопии или фотообследования фундуса обученными офтальмологами4. С помощью стандартного метода фотосъёмки дна диабетическая ретинопатия может быть выявлена с чувствительностью 78%-96% и специфичностью 86%-97% 5. Однако этот метод обнаруживает только после повреждения сетчатки. Существует неудовлетворённая потребность в раннем выявлении ДР до появления клинически видимых признаков сетчатки, таких как кровоизлияния сетчатки, микроаневризмы, экссудаты и пролиферация новых сосудов.

Развитие молекулярных инструментов привело к открытию экзосом как потенциального диагностического инструмента для различных заболеваний, включая рак и сердечно-сосудистыезаболевания 6,7. Экзосомы — это частицы наноразмера, связанные липидной двухслойной мембраной, которую большинство клеток выделяют в пространство внеклеточного везикула (EV). Эти экзосомы могут транспортироваться с помощью биожидкостей, таких как кровь, слёзы, слюна и моча, что делает их легко доступными для неинвазивных или малоинвазивных диагностическихпроцедур 8. Они несут различные маркеры происхождения клеток, включая белки, липиды и нуклеиновые кислоты. Особый интерес представляют небольшие некодирующие РНК, содержащиеся внутри электромобилей. Хотя эти РНК не кодируются для белков, они играют ключевую роль в регуляции генов и участвуют во многих физиологических и патологических процессах, включая β-клетки поджелудочной железы, которые имеют большое значение в развитиидиабета 9,10.

В частности, было показано, что miR-15a тесно связан с развитием диабета, главным образом через регуляцию выработки инсулина и функции бета-клетокподжелудочной железы 11. Наша группа недавно продемонстрировала, что miR-15a изменён в плазме диабетической ретинопатии. Кроме того, было показано, что miR-15a выделяется бета-клетками поджелудочной железы и распространяется по кровотоку ксетчатке-12. Слёзная жидкость считается легко доступной жидкостью, которую можно получить из глаза неинвазивным и экономически эффективнымспособом 13. Он содержит смесь различных белков, липид, электролитов и других молекул, что отражает физиологическое состояние поверхности глаза и окружающих тканей, включаясетчатку-14. В слезной жидкости обнаружено большее количество миРНК, чем в сыворотке и водном растворевлаги 15,16. Состав слёз меняется в ответ на различные системные заболевания, включая диабет17. Фактически, анализ слёзной жидкости показал многообещающий потенциал для мониторинга и диагностики других заболеваний, не связанных с глазами, таких как рассеянный склероз и рак молочнойжелезы 18,19. С учётом прямой связи диабетической ретинопатии с глазом, было бы актуальнее искать возможные диагностические свойства слёзной жидкости при этом заболевании. Уровни IL-1RA, IL-8, IL-6 и TNF-α в слезной жидкости пациентов с диабетической ретинопатией наблюдаются изменениями, которые также варьируются в зависимости от тяжести заболевания20,21. По сравнению с традиционным обследованием фундускопии, анализ слёзной жидкости при диабетической ретинопатии обладает потенциальными преимуществами с точки зрения доступности, неинвазивности и специфичности, а также позволяет выявлять их на раннем этапе до начала заболевания22.

Поэтому основная цель этого исследования — изучить потенциал экзосомного miR-15a, полученного из слезной жидкости, как нового диагностического маркера диабетической ретинопатии посредством выделения и количественной оценки миРНК из слёзных жидкостей популяции диабетической ретинопатии. Благодаря этому появился бы новый метод обнаружения диабетической ретинопатии с помощью скрининга слезной жидкости, который можно обнаружить даже до появления осложнений сетчатки, что позволяет проводить ранние профилактические или терапевтические меры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Исследование было проведено с одобрения Медицинского исследовательского комитета Медицинского центра Университета Малайи (номер отсылки: 20165-2446). Письменное согласие было получено от всех участников перед набором. Всего было включено 135 участников из числа пациентов, посещающих офтальмологическую клинику Медицинского центра Университета Малайи (UMMC), Куала-Лумпур. Критерии включения включали пациентов, получавших услуги по UMMC и имевших возраст от 20 до 80 лет. Пациенты, проходившие активное лечение инсулином, имели анамнез лазерное или анти-VEGF лечение за последние 3 месяца, либо принимали обычные антитромбоциты или антитроцитные препараты, были исключены из исследования. Затем участников разделили на три группы: (1) здоровый контроль (контрольный), (2) диабетик без ретинопатии (ДМ без ДР) и (3) диабетик с ретинопатией (ДР). Краткое описание протокола приведено на рисунке 1. Подробности о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведены в Таблице материалов.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Обзор протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

1. Подготовка материалов    

  1. Разложите стерильный базовый набор для перевязки с двумя щипцами, шестью ватными шариками, четырьмя марлями, пносом и мешком для биологической опасности.
  2. Залить 5 мл раствора орошения хлорида натрия с 0,9% в лоток.
  3. Откройте упаковку салфеток для промывания век и положите на стерильное поле.
  4. Приготовьте пробирку с 250 мкл консервантного раствора.
  5. Сложите полоску Schirmer на уровне клина, пока она ещё в упаковке, перед тем как положить стерильную полоску на стерильное поле.
  6. Наденьте хирургические перчатки асептическим образом.
  7. Используя пару стерильных щипцов, увлажните ватные шарики раствором орошения с 0,9% w/v стерильного хлорида натрия.

2. Подготовка человеческих объектов    

  1. Позвольте испытуемому сесть удобнее и попросите закрыть глаза.
  2. Протрите периглазничную кожу четыре раза ватными шариками, замочёнными в растворе для проливания.
  3. Протрите кожу вокруг глазницы влажной салфеткой для очищения век.

3. Сбор человеческой слёзной жидкости

  1. Собирайте слёзные жидкости с помощью полоски Ширмерса, расположенной в нижней височной форниксе.
  2. При размещении частично сложенной полоски на правый глаз попросите испытуемого смотреть влево. Опустите нижнюю крышку, чтобы обнажить нижний форникс.
  3. Используя пару стерильных щипцов, наместите полоску Ширмера на внешние две трети нижней конъюнктивальной форникса. Избегайте контакта полоски с кожей, чтобы предотвратить загрязнение образца потом или другими материалами.
  4. Положите марлевую прокладку под полоску, чтобы предотвратить контакт с кожей.
  5. Дайте разрывам впитаться в полоску до отметки 20 мм или максимум 5 минут, в зависимости от того, что наступит раньше.
  6. Если отметка уровня 20 мм не достигнута, задокументируйте уровень разрывов на основе отметок для стандартизации объёма слезной жидкости.
  7. Используя пару стерильных щипцов, аккуратно удалите полоску Ширмера и поместите её в трубку с 1x раствором солевого раствора с фосфатным буфером (PBS).
  8. Положите трубку в холодильник для транспортировки в лабораторию.
  9. Очистите периглазничную поверхность, вытирая остатки раствора с кожи.

4. Предварительная обработка образцов слёз    

  1. Вихрь — трубку с полосой Ширмера, замоченной в PBS на 5 минут при комнатной температуре.
  2. Перемешивать трубку на коровале 5 минут при комнатной температуре.
  3. Центрифугуйте трубку при 2000 x g на 15 минут при 4 °C.
  4. Переливайте раствор в новую трубку, маркуйте и держите при -80 °C до следующей обработки.
  5. Отбросьте оставшуюся полоску.

5. Изоляция экзосомов

ПРИМЕЧАНИЕ: Изоляция РНК проводится с использованием коммерчески доступного комплекта в соответствии с производственным протоколом (см. таблицу материалов).

  1. Разморозьте раствор для слёз на льду на 10 минут.
  2. Уравновесьте спин-колонку на 15 минут при комнатной температуре перед использованием.
  3. Удалите нижний выход колонны и поставьте его на предоставленную пластину для сбора отходов.
  4. Снимите верхний герметный коврик и дайте буферу проходить через колонну под действием гравитации.
  5. Добавьте 250 мкл PBS и дайте ему пройти через колонку.
  6. Повторите шаг 5.5.
  7. Примените образец объёмом 110 мкл к верхней части каждого столбца и позвольте образцу войти в столбца.
  8. Перенесите колонку на предоставленную пластину для сбора образцов.
  9. Добавьте 100 мкл PBS и дайте ему пройти через колонку в пластину для сбора образцов.
  10. Перенесите колонку на пластину для сбора отходов.
  11. Добавьте 4x 200 мкл PBS в столбец и позвольте ему войти в столбец для удаления свободной белковой фракции с первой загрузки.
  12. Добавьте 110 мкл образца в колонку. Позвольте войти в колонку.
  13. Поставьте колонку на пластину для сбора образцов. Добавьте 100 мкл PBS и дайте ему пройти через колонку.
  14. Кратко центрифугуйте пластину для сбора образцов при 100 х г в течение 30 секунд. Изолированные экзосомы теперь готовы к выделению РНК.

6. Изоляция РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Изоляция РНК проводится с использованием коммерчески доступного комплекта в соответствии с производственным протоколом (см. таблицу материалов).

  1. Субъект 200 мкл изолированных экзосом, подвержен изоляции РНК.
  2. Добавьте 60 мкл буфера лизиса к изолированным экзосомам. Vortex на 5 секунд.
  3. Инкубировать при комнатной температуре в течение 3 минут.
  4. Добавьте 20 мкл буфера для осадки ингибиторов, вихрь на 20 секунд и инкубировать при комнатной температуре в течение 3 минут.
  5. Центрифугу при температуре 12 000 г в течение 3 минут при комнатной температуре.
  6. Перенесите прозрачный, бесцветный супернатант в новую трубку.
  7. Добавьте 1 том изопропанола.
  8. Vortex на 5 секунд и перенесите решение в мини-спин-колонку, предусмотренную в наборе.
  9. Центрифугу при комнатной температуре на 15 секунд при 8000 x g. Отбросьте поток сквозь.
  10. Промой колонку 700 мкл буфера для промывки RWT.
  11. Центрифуга на 15 секунд при 8000 x g. Отбросьте поток.
  12. Промой колонку 500 мкл буфера для промывания RPE.
  13. Центрифуга на 15 секунд при 8000 x g. Отбросьте поток.
  14. Добавьте 500 мкл этанола 80% в мини-спин-колонку образца.
  15. Центрифуга на 2 минуты при 8000 x g. Отбросьте проток и сборную трубку.
  16. Поставьте мини-спин-колонку в новую трубку для сбора объемом 2 мл.
  17. Центрифугуйте колонку и трубку при 18 000 x g в течение 5 минут. Отбросьте поток и сборную трубку.
  18. Поместите мини-спин-колонку в новую трубку объёмом 1,5 мл и добавьте 15 мкл воды без РНазы в центр мембраны спиновой колонны.
  19. Инкубировать 3 минуты при комнатной температуре.
  20. Центрифугу на 18 000 x g в течение 1 минуты для элюции РНК. РНК готова к дальнейшей обработке.
  21. Провести анализ отслеживания наночастиц для контроля качества и проверки выхода РНК.

7. Синтез кДНК

  1. Проводите синтез cDNA с использованием коммерчески доступных наборов в соответствии с производственными протоколами (см. Таблицу материалов).
  2. Мастер-смесь приготовьте согласно таблице 1 в микроцентрифуге объёмом 1,5 мл.
  3. Смешивайте раствор, прокручивая пипетом.
  4. Pipette 5,1 мкл мастер-микса в ПЦР-лампы объёмом 0,1 мкл.
  5. Добавьте 9,9 мкл образца в выделенную лампу с мастер-миксом.
  6. Поместите ПЦР-трубки в термоциклер и запустите по Таблице 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: cDNA готова к дальнейшему анализу.
КомпонентОбъём/реакция
10x RT-буфер1,5 мкл
100M смесь dNTP0,15 мкл
Ингибитор РНК (200U/мкл)0,19 мкл
Multiscribe RT Enzyme (50U/μl)1 мкл
Капсуль RT 20x0,75 мкл
Свободная вода с РНК1,51 мкл
Образец9,9 мкл
Общий объём15 мкл

Таблица 1: Подготовка мастер-смеси ПЦР, используемой для синтеза кДНК из изолированной РНК.

ШагТемператураПродолжительность
Обратная транскрипция16 °C30 мин
42 °C30 мин
Стой85 °C5 мин
Стой4 °C

Таблица 2: Условия термоциклирования для синтеза кДНК.

8. Цифровая капельная ПЦР

ПРИМЕЧАНИЕ: Цифровая капельная ПЦР (ddPCR) проводится с использованием коммерчески доступных наборов в соответствии с производственными протоколами (см. таблицу материалов).

  1. Подготовьте мастер-смесь для ddPCR в микроцентрифуге объёмом 1,5 мл согласно таблице 3.
  2. Pipette 19,8 мкл мастер-микса в ПЦР-лампы объёмом 0,1 мкл. Добавьте 2,2 мкл образцов и хорошо перемешайте, пипетируя смесь вверх и вниз 10 раз.
  3. Перенесите 20 мкл смеси образца в полосу выборки картриджа ddPCR.
  4. Добавьте 50 мкл масла в масляный коридор картриджа.
  5. Прикрепите прокладку к картриджу с помощью крючка на пластине.
  6. Поместите картридж в машину для генерации капель. Щелчок указывает на правильное вставление картриджа в машину для генерации капель.
  7. Аккуратно перенесите все образующиеся капли в колодцы пластины с 96 лунками. Добавьте хотя бы одну скважину без контроля шаблона и отрицательный контроль.
  8. Запечатайте пластину с помощью прокалываемой фольги в машине для герметизации пластин (см. Таблицу материалов).
  9. Поставьте пластину в термоциклер и запускайте по таблице 4.
  10. Перенесите пластину в считыватель капель, чтобы считать положительные и отрицательные капли.
  11. Количественно определите количество копирования/мл с помощью значения копирования/20 мкл, сгенерированного в ходе запуска.
КомпонентОбъём/реакция
2x ddPCR Supermix для зондов (без dUTP)10 мкл
20x капсуль/зонд1 мкл
Образец7 мкл
Свободная вода с РНК2 мкл
Общий объём20 мкл

Таблица 3: Подготовка мастер-смеси ПЦР, используемой для ddPCR.

ШагТемператураПродолжительностьПандусЦикл
Активация ферментов95 °C10 мин~2 °C/ s на каждый шаг1
Денатурация94 °C30-е годы40
Отжиг60 °C1 минута40
Деактивация ферментов98 °C10 мин1
Стой4 °CН/ДН/Д

Таблица 4: Условия термоцикла для ddPCR.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Стандартная кривая
Была создана стандартная кривая для определения точного объёма слёз, собранных у каждого пациента. В основном, разные объёмы консервантов варьируются от 3 мкл до 25 мкл под воздействием полосок Ширмера. Также наблюдалось расстояние влажной зоны на Ширмере. Процедура повторялась три раза для каждой процедуры, и среднее значение было рассчитано. Была сформирована стандартная кривая объёма собранных разрывов по сравнению с расстоянием влажных участков ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Обследование фундускопией, оптической когерентной томографией и флуоресцеиновой ангиография — это современные методы обнаружения диабетической ретинопатии. Эти три метода часто используются вместе для всесторонней оценки различных заболеваний сетчатки и хориоиды. Фундоскопия — это клиническое обследование, которое регулярно проводится во время оценки диабетической ретинопатии. Этот метод проводится обученными офтальмологами и является золотым стандартом для диагностики диабетической рети...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано исследовательским институтом Alcon Research Institute (IF011-2020) и грантом FOM UMSC Care Postdoctoral Research Grant 2021.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,9% с хлоридом натрияAin Medicare Sdn BhdGB16165967618
1x фосфатный буферный физиологический растворТермо Фишер Сайентифик10010-023
Прикладные биосистемы  Комплект обратной транскрипции TaqMan MicroRNAПрикладные биосистемы4366596
ddPCR Supermix для зондов (без dUTP)Лаборатории BioRad1863024
ddPCR 96-Well пластиныЛаборатории BioRad12001925
Картриджи DG8Лаборатории BioRad1864008
Прокладки DG8Лаборатории BioRad1863009
Масло для генерации капель для зондовЛаборатории BioRad1863005
Экзоспин-96 Экзосомный изоляционный наборСистемы наведения ячейкиEX07-96
miRNeasy Сыворотка/Плазменный продвинутый наборЦягэн  217204
PX1 PCR Plate SealerЛаборатории BioRad1814000
Цифровая система ПЦР с каплями QX100Лаборатории BioRadQX100
Генератор капель QXDx Лаборатории BioRad12001049
Стрип ШирмерOptitechSCH-100
Термоциклер T100Лаборатории BioRad1861096
Анализ Taqman MicroRNA MTOMED 20 (ID анализа: 000389)Прикладные биосистемы4440887Последовательность цели: UAGCAGCAUAAUGGUUGUGUG

Ссылки

  1. Teo, Z. L., et al. Global prevalence of diabetic retinopathy and projection of burden through 2045: Systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 128 (11), 1580-1591 (2021).
  2. Sayin, N., Kara, N., Pekel, G. Ocular complications of diabetes mellitus. World J Diabetes. 6 (1), 92-108 (2015).
  3. Wang, W., Lo, A. C. Y. Diabetic retinopathy: Pathophysiology and treatments. Int J Mol Sci. 19 (6), 1816(2018).
  4. Yang, Z., Tan, T. E., Shao, Y., Wong, T. Y., Li, X. Classification of diabetic retinopathy: Past, present and future. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1079217(2022).
  5. Goh, J. K. H., et al. Retinal imaging techniques for diabetic retinopathy screening. J Diabetes Sci Technol. 10 (2), 282-294 (2016).
  6. Parizadeh, S. M., et al. Circulating exosomes as potential biomarkers in cardiovascular disease. Curr Pharm Des. 24 (37), 4436-4444 (2018).
  7. Nair, S., Tang, K. D., Kenny, L., Punyadeera, C. Salivary exosomes as potential biomarkers in cancer. Oral Oncol. 84, 31-40 (2018).
  8. Dellar, E. R., Hill, C., Melling, G. E., Carter, D. R. F., Baena-Lopez, L. A. Unpacking extracellular vesicles: RNA cargo loading and function. J Extracell Biol. 1 (5), e40(2022).
  9. Fluitt, M. B., Kumari, N., Nunlee-Bland, G., Nekhai, S., Gambhir, K. K. miRNA-15a, miRNA-15b, and miRNA-499 are reduced in erythrocytes of pre-diabetic African-American adults. Jacobs J Diabetes Endocrinol. 2 (1), 014(2016).
  10. Belgardt, B. F., et al. The microRNA-200 family regulates pancreatic beta cell survival in type 2 diabetes. Nat Med. 21 (6), 619-627 (2015).
  11. Sun, L. L., et al. MicroRNA-15a positively regulates insulin synthesis by inhibiting uncoupling protein-2 expression. Diabetes Res Clin Pract. 91 (1), 94-100 (2011).
  12. Kamalden, T. A., et al. Exosomal microRNA-15a transfer from the pancreas augments diabetic complications by inducing oxidative stress. Antioxid Redox Signal. 27 (13), 913-930 (2017).
  13. Posa, A., et al. Schirmer strip vs. capillary tube method: Non-invasive methods of obtaining proteins from tear fluid. Ann Anat. 195 (2), 137-142 (2013).
  14. Ohashi, Y., Dogru, M., Tsubota, K. Laboratory findings in tear fluid analysis. Clin Chim Acta. 369 (1), 17-28 (2006).
  15. Nakagawa, A., Nakajima, T., Azuma, M. Tear miRNA expression analysis reveals miR-203 as a potential regulator of corneal epithelial cells. BMC Ophthalmol. 21 (1), 377(2021).
  16. Chan, H. W., et al. A pilot study on microRNA profile in tear fluid to predict response to anti-VEGF treatments for diabetic macular edema. J Clin Med. 9 (9), 2920(2020).
  17. Barmada, A., Shippy, S. A. Tear analysis as the next routine body fluid test. Eye (Lond). 34 (10), 1731-1733 (2020).
  18. Tomečková, V., et al. Experimental analysis of tear fluid and its processing for the diagnosis of multiple sclerosis. Sensors (Basel). 23 (11), 5251(2023).
  19. Daily, A., et al. Development and validation of a short-term breast health measure as a supplement to screening mammography. Biomark Res. 10 (1), 76(2022).
  20. Quevedo-Martínez, J. U., et al. Pro-inflammatory cytokine profile is present in the serum of Mexican patients with different stages of diabetic retinopathy secondary to type 2 diabetes. BMJ Open Ophthalmol. 6 (1), e000717(2021).
  21. Sorkhabi, R., Ahoor, M. H., Ghorbani Haghjo, A., Tabei, E., Taheri, N. Assessment of tear inflammatory cytokines concentration in patients with diabetes with varying severity of involvement. Exp Eye Res. 224, 109233(2022).
  22. Adigal, S. S., et al. Human tear fluid analysis for clinical applications: Progress and prospects. Expert Rev Mol Diagn. 21 (8), 767-787 (2021).
  23. Mackay, D. D., Garza, P. S., Bruce, B. B., Newman, N. J., Biousse, V. The demise of direct ophthalmoscopy: A modern clinical challenge. Neurol Clin Pract. 5 (2), 150-157 (2015).
  24. Saeedi, P., et al. Global and regional diabetes prevalence estimates for 2019 and projections for 2030 and 2045: Results from the International Diabetes Federation Diabetes Atlas, 9th edition. Diabetes Res Clin Pract. 157, 107843(2019).
  25. Kong, L., et al. Significance of serum microRNAs in pre-diabetes and newly diagnosed type 2 diabetes: A clinical study. Acta Diabetol. 48, 61-69 (2011).
  26. Baldeón, R. L., et al. Decreased serum level of miR-146a as sign of chronic inflammation in type 2 diabetic patients. PLoS One. 9 (12), e115209(2014).
  27. Liang, Y. Z., et al. Identification of neuroendocrine stress response-related circulating microRNAs as biomarkers for type 2 diabetes mellitus and insulin resistance. Front Endocrinol (Lausanne). 9, 132(2018).
  28. Wan, S., et al. Increased serum miR-7 is a promising biomarker for type 2 diabetes mellitus and its microvascular complications. Diabetes Res Clin Pract. 130, 171-179 (2017).
  29. Santovito, D., et al. Plasma microRNA signature associated with retinopathy in patients with type 2 diabetes. Sci Rep. 11 (1), 4136(2021).
  30. Smit-McBride, Z., et al. Unique molecular signatures of microRNAs in ocular fluids and plasma in diabetic retinopathy. PLoS One. 15 (7), e0235541(2020).
  31. Sun, Y., Liu, W., Zuo, C. Regulatory role of miRNA-23a in diabetic retinopathy. Exp Ther Med. 22 (6), 1-9 (2021).
  32. Wong, W. K. M., et al. MicroRNA profiling from tears as a potential non-invasive method for early detection of diabetic retinopathy. Methods Mol Biol. 2678, 117-134 (2023).
  33. Amorim, M., et al. Putative biomarkers in tears for diabetic retinopathy diagnosis. Front Med (Lausanne). 9, 873483(2022).
  34. Arroyo, C. A. -D., et al. Diurnal variation on tear stability and correlation with tear cytokine concentration. Cont Lens Anterior Eye. 45 (6), 101705(2022).
  35. Patel, S., Mittal, R., Kumar, N., Galor, A. The environment and dry eye: Manifestations, mechanisms, and more. Front Toxicol. 5, 1173683(2023).
  36. Benito, M. J., et al. Intra- and inter-day variation of cytokines and chemokines in tears of healthy subjects. Exp Eye Res. 120, 43-49 (2014).
  37. Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. Diagnostic biomarkers in tear fluid: From sampling to preanalytical processing. Sci Rep. 11 (1), 10064(2021).
  38. Shoji, J., Aso, H., Inada, N. Clinical usefulness of simultaneous measurement of the tear levels of CCL17, CCL24, and IL-16 for the biomarkers of allergic conjunctival disorders. Curr Eye Res. 42 (5), 677-684 (2017).
  39. Gijs, M., et al. Pre-analytical sample handling effects on tear fluid protein levels. Sci Rep. 13 (1), 1317(2023).
  40. Vandermeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex. Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).
  41. Benlloch-Navarro, S., et al. Lipid peroxidation is increased in tears from the elderly. Exp Eye Res. 115, 199-205 (2013).
  42. Li, K., Chen, Z., Duan, F., Liang, J., Wu, K. Quantification of tear proteins by SDS-PAGE with an internal standard protein: A new method with special reference to small volume tears. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248 (6), 853-862 (2010).
  43. Grigor'eva, A. E., et al. Exosomes in tears of healthy individuals: Isolation, identification, and characterization. Biochem (Moscow) Suppl B Biomed Chem. 10 (2), 165-172 (2016).
  44. Hu, L., et al. Discovering the secret of diseases by incorporated tear exosomes analysis via rapid-isolation system: iTEARS. ACS Nano. 16 (8), 11720-11732 (2022).
  45. Ter-Ovanesyan, D., et al. Framework for rapid comparison of extracellular vesicle isolation methods. eLife. 10, e70725(2021).
  46. Guo, J., et al. Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications. J Extracell Vesicles. 10 (11), e12145(2021).
  47. Aqrawi, L. A., et al. Proteomic and histopathological characterisation of sicca subjects and primary Sjögren's syndrome patients reveals promising tear, saliva and extracellular vesicle disease biomarkers. Arthritis Res Ther. 21 (1), 181(2019).
  48. Aqrawi, L. A., et al. Identification of potential saliva and tear biomarkers in primary Sjögren's syndrome, utilizing the extraction of extracellular vesicles and proteomics analysis. Arthritis Res Ther. 19 (1), 14(2017).
  49. McKay, T. B., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D., Ciolino, J. B. Extracellular vesicles secreted by corneal epithelial cells promote myofibroblast differentiation. Cells. 9 (5), 1080(2020).
  50. Atienzar-Aroca, S., et al. Oxidative stress in retinal pigment epithelium cells increases exosome secretion and promotes angiogenesis in endothelial cells. J Cell Mol Med. 20 (8), 1457-1466 (2016).
  51. Liu, J., et al. Roles of exosomes in ocular diseases. Int J Nanomedicine. 15, 10519-10538 (2020).
  52. Kenny, A., et al. Proteins and microRNAs are differentially expressed in tear fluid from patients with Alzheimer's disease. Sci Rep. 9 (1), 15437(2019).
  53. Wijesinghe, P., et al. MicroRNAs in tear fluids predict underlying molecular changes associated with Alzheimer's disease. Life Sci Alliance. 6 (6), e202201757(2023).
  54. Urbizu, A., Arnaldo, L., Beyer, K. Obtaining miRNA from saliva-Comparison of sampling and purification methods. Int J Mol Sci. 24 (3), 2386(2023).
  55. Cirillo, P. D. R., Margiotti, K., Mesoraca, A., Giorlandino, C. Quantification of circulating microRNAs by droplet digital PCR for cancer detection. BMC Res Notes. 13 (1), 351(2020).
  56. Sangalli, E., et al. Circulating microRNA-15a associates with retinal damage in patients with early stage type 2 diabetes. Front Endocrinol (Lausanne). 11, 254(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Экзосомы слезыбиомаркеры слезной жидкостикапельная цифровая ПЦРвыделение экзосомпрофилирование микроРНКтрекинг наночастицнеинвазивная диагностикапредотвращение потери зрения
Экзосомный miR-15a, полученный из слёз, как новый диагностический инструмент диабетической ретинопатии
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.