Методическая статья

Выделение, экспансия и дифференцировка фиброадипогенных предшественников из модели колючей мыши

DOI:

10.3791/66717

⸱

15 ноября 2024 г.

 ,  ,  , 
1School of Biomedical Engineering and Department of Medical Genetics, University of British Columbia, 2Aspect Biosystems

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает выделение фиброадипогенных предшественников (FAP) скелета и сердечной мышцы от колючей мыши (Acomys) с помощью ферментативной диссоциации и сортировки клеток, активируемых флуоресценцией. FAP, полученные по этому протоколу, могут быть эффективно расширены и дифференцированы до миофибробластов и адипоцитов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Благодаря своей исключительной программе восстановления, колючая мышь является новой исследовательской моделью для регенеративной медицины. Фиброадипогенные предшественники представляют собой тканевые резидентные клетки, способные дифференцироваться в адипоциты, фибробласты и хондроциты. Фиброадипогенные предшественники имеют основополагающее значение для организации регенерации тканей, поскольку они отвечают за ремоделирование внеклеточного матрикса после травмы. Это исследование сосредоточено на изучении специфической роли фиброадипогенных предшественников в восстановлении сердца у колючих мышей и регенерации скелетных мышц. С этой целью был оптимизирован протокол для очистки фиброадипогенных предшественников колючих мышей методом проточной цитометрии из ферментативно диссоциированных скелетных и сердечных мышц. Популяция, полученная по этому протоколу, способна расширяться in vitro, и может быть дифференцирована до миофибробластов и адипоцитов. Этот протокол предлагает исследователям ценный инструмент для изучения отличительных свойств колючей мыши и сравнения их с мускулатурой. Это позволит получить понимание, которое может продвинуть понимание регенеративных механизмов в этой интригующей модели.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Первоначально признанная своей исключительно хрупкой кожей и замечательной способностью восстанавливать повреждения кожи, колючая мышь продемонстрировала превосходную регенеративную способность в различных системах органов, таких как опорно-двигательный аппарат, почки, центральная нервная система и сердечно-сосудистая система, по сравнению с Mus musculus 1,2.

Фиброадипогенные предшественники (ФАП) представляют собой подмножество стромальных клеток, которые являются резидентами в различных тканях, включая скелетные и сердечные мышцы. Эти клетки обладают уникальной способностью связываться с фиброгенными и адипогенными линиями in vivo и in vitro 3,4. FAP играют решающую роль в регенерации тканей, модулируя внеклеточный матрикс и поддерживая функции других типов клеток, участвующих в процессе восстановления. В скелетных мышцах FAP активируются в ответ на травму и способствуют дифференцировке мышечных стволовых клеток и миогенезу 5,6. При ишемическом повреждении сердца ФАП закладывают рубцовую ткань для поддержания целостности миокарда. В отличие от мышечной, сердечные FAP становятся хронически активными и способствуют патологическому ремоделированию 7,8.

Предыдущие исследования показали, что внеклеточный матрикс колючей мыши имеет другой состав, структуру и свойства, которые поддерживают регенерацию по сравнению с Mus musculus 9,10. Было отмечено, что при мышечных и сердечных травмах FAP способствуют превосходному заживлению у колючих мышей 11,12,13. Понимание поведения и регуляторного контроля FAP и стромы колючих мышей может пролить свет на механизм, лежащий в основе их регенеративных способностей. В то время как FAP широко изучаются на других животных моделях, таких как mus musculus14,15, в настоящее время нет опубликованных протоколов для выделения FAP у колючих мышей. Разработка такого протокола заполнила бы значительный пробел в этой области и позволила бы исследователям изучить клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе регенеративного потенциала колючей мыши.

Этот протокол описывает надежный и воспроизводимый протокол для выделения, расширения и дифференциации FAP скелетных и сердечных мышц от колючей мыши. Описанный здесь протокол позволяет получить высококачественные суспензии одиночных клеток, пригодные для сортировки клеток, активируемых флуоресценцией (FACS). Используя rh-TGFβ1 или совместимую коммерчески доступную среду, два метода, широко используемых для дифференциации mus musculus FAP16, отсортированные колючие FAP сохраняют свою способность к дифференцировке по фиброгенной линии и адипогенной линии соответственно (рис. 1).

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры содержания животных и эксперименты проводились в соответствии с одобрением Комитета по уходу за животными Университета Британской Колумбии и правилами Университета Британской Колумбии. Животные содержались в закрытом помещении, свободном от патогенов, в стандартных условиях (цикл свет-темнота 12:12, 21-23 °C и уровень влажности 40%-60%) и получали богатую белком мышиную диету и воду в неограниченном количестве. Для исследования были использованы взрослые (от 4 до 6 месяцев, 50-60 г) самки и самцы мышей Acomys dimidiatus . Подробная информация обо всех используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Приготовление раствора и буфера

  1. Приготовьте 1x Фосфатный буферный раствор (PBS).
  2. Приготовьте PBS-EDTA, смешав 4 мл 0,5 М ЭДТА (2 мМ) и 996 мл 1x PBS, pH = 7,4.
  3. Приготовьте 250 мМ CaCl2 , добавив 2,7745 г CaCl2 к 100 мл воды, не содержащей нуклеаз.
  4. Приготовьте буфер для пищеварения: смешайте 50 мкг/мл либеразы, 2,5 мМ CaCl2 и 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS) в DMEM/F12.
  5. Приготовьте буфер FACS, смешав 488 мл 1x PBS, 2 мл 0,5M EDTA и 10 мл FBS.
  6. Приготовьте буфер жизнеспособности, смешав буфер FACS с йодидом пропидия (PI; 1 мкг/мл).
  7. Приготовьте базовую среду, смешав DMEM/F12 с 5% FBS и 1% (v/v) пера/стрептококка.
  8. Приготовьте пролиферативную среду, смешав DMEM/F12 с 10% FBS, 1% (v/v) pen/strepping и 2,5 нг/мл bFGF.
  9. Приготовьте фиброгенную среду, смешав основные среды и 10 нг/мл rh-TGFβ1,
  10. Приготовьте адипогенную среду (1x), смешав DMEM/F12 с 1% пер/стрептококком и коммерчески доступной добавкой для 10-кратной адипогенной дифференцировки мышей.
  11. Приготовьте 4% PFA, добавив 4% параформальдегида (w/v) в 1x PBS.
  12. Приготовьте 0,3% PBS-Triton, смешав 498,5 мл 1x PBS и 1,5 мл TritonX-100.
  13. Приготовьте буфер для блокировки Donkey, смешав 5% (v/v) сыворотки Donkey, 1% BSA (w/v) и 0,3% PBS-Triton.
  14. Приготовьте блокирующий буфер Donkey + MOM, смешав 2,5 мл блокирующего буфера Donkey и 2 капли блока MOM.
  15. Приготовьте раствор для окрашивания DAPI, смешав 600 нМ 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в 1x PBS.

2. Забор тканей

  1. Усыпьте животное в соответствии с рекомендациями Комитета по уходу и использованию животных в учреждениях. Для колючих мышей рекомендуется изофлуран с последующим последующим выбросомCO2 (20% объема клетки/мин) и вывихом позвоночника для обеспечения смерти.
  2. Поместите мышь на ступень вскрытия в лежачем положении и тщательно распылите 70% этанол для предотвращения загрязнения шерсти мыши.
  3. Сделайте вертикальный разрез на 2-3 см по вентральной средней линии и обнажите грудную клетку и мышцу живота. Разрежьте мышцу в области мечевидного отростка тканевыми ножницами и обнажите диафрагму. Разрежьте диафрагму и грудную клетку с обеих сторон. С помощью кровоостанавливателя зажмите и очистите срезанные ребра.
  4. Проткните правое предсердие тканевыми ножницами, поместите иглу 23 G, прикрепленную к шприцу объемом 20 мл в верхушку сердца, и перфузируйте ее, медленно вводя 20 мл 2 мл 2 мМ PBS-EDTA.
  5. Сердцевину исчерпать, прополоскать в холоде 1х ПБС в чашке Петри 60 мм на льду, удалить предсердия, и максимально очистить кровь.
  6. Снимите кожу над коленным суставом. Используйте тонкие щипцы для удаления фасции и изолируйте четырехглавую мышцу ножницами, используя бедренную кость в качестве ориентира. Поместите в отдельную чашку Петри с холодным 1x PBS.
  7. Повторите шаг 2.6 для другой ноги.

3. Пищеварение тканей

  1. Добавьте 2 мл буфера для пищеварения в транспортный флакон объемом 5 мл для сердца и 4 мл буфера для пищеварения в центрифугу объемом 15 мл для двух четырехглавых мышц.
  2. Измельчите ткань тканевыми ножницами на крышке чашки Петри на менее 1 мм3 штуки.
  3. Добавьте измельченную салфетку в соответствующие пищеварительные трубки. Вихрь в течение 2 с на небольшой скорости для перемешивания.
  4. Инкубировать при температуре 37 °C при осторожном вращении и встряхивании.
  5. Через 20 минут снимите трубки с вращателя и дайте кусочкам ткани осесть. Извлеките надосадочную жидкость с помощью пипетки P1000 в 20 мл ледяного буфера FACS в центрифужных пробирках объемом 50 мл.
  6. Наполните пищеварительные трубки 2 мл и 4 мл буфера для пищеварения сердца и мышц соответственно и установите их обратно при температуре 37 °C с легким вращением и встряхиванием.
  7. Повторите шаг с 3.5 по шаг 3.6 еще раз через 20 минут. Поместите надосадочную жидкость в соответствующую центрифужную пробирку объемом 50 мл, начиная с шага 3.5.
  8. Остановите разложение через 60 минут, охладив буфер для разложения ледяным буфером FACS.
  9. Фильтруйте взвесь и надосадочную жидкость через клеточное сетчатое фильтр 40 мкм на вершине центрифужных пробирок объемом 50 мл. Долейте до 40 мл с помощью буфера FACS.
  10. Центрифугируйте клеточную суспензию при 500 x g в течение 8 мин при 4 °C. Сцедите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 3 мл буфера для лизиса ACK. Инкубировать на льду в течение 5 минут и долить до 40 мл с буфером FACS.
  11. Центрифугируйте при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C. Сцедите надосадочную жидкость.
  12. Ресуспендируйте в 0,5 мл буфера FACS, пипетируя вверх и вниз, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток.
  13. Отфильтровать суспензию через фильтр 40 мкм на полистирольных трубках с круглым дном объемом 5 мл с крышкой из ячейки-фильтра.

4. Окрашивание для сортировки флуоресцентно-активируемых клеток (FACS)

  1. Для одноцветного и флуоресцентного контроля (FMO) приготовьте 30 мкл окрашивающего буфера (антитела, разведенные в буфере FACS) в 2-кратной рабочей концентрации в предварительно помеченных центрифужных пробирках объемом 1,5 мл. В таблице 1 приведена информация о настройке буфера для окрашивания антителами.
  2. Подготовьте отдельные цвета и регуляторы FMO для мышц и сердца отдельно.
  3. Перенесите 30 μL одноцветного и контрольного буфера для окрашивания FMO на 96-луночный планшет. Долейте 20 μL буфера FACS.
  4. Для окрашивания образца методом FACS приготовьте 0,5 мл окрашивающего буфера (антитело, разведенное в буфере FACS) в 2-кратной рабочей концентрации в центрифужных пробирках объемом 1,5 мл.
  5. Добавьте 10 мкл суспензии ячеек в одноцветные и контрольные лунки FMO. Добавьте буфер для окрашивания к остальной суспензии клеток и повторите.
  6. Инкубировать при температуре 4 °C в защищенном от света месте в течение 30 минут.
  7. Долейте в лунки 100 мкл буфера FACS, а пробирку с образцом — 2 мл буфера FACS.
  8. Центрифугируйте при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C и удалите надосадочную жидкость.
  9. Повторите шаги 4.7 и 4.8.
  10. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в буфере жизнеспособности. 100 мкл для одноцветных и FMO-регуляторов, 1 мл для сортировки образцов FACS.
  11. Подготовьте пробирки для сбора, добавив 300 мкл пролиферационной среды в центрифужные пробирки объемом 1,7 мл.

5. Сортировка клеток, активируемых флуоресценцией

  1. Стратегия стробирования: используйте FSC против SSC (бревно) для удаления мусора. Используйте FSC-H в сравнении. FSC-A для синглетов ворот. Используйте CD31 по сравнению с ПИ для гейта на жизнеспособных и линейно-отрицательных клетках. Используйте PDGFRα для гейта для FAP (рис. 2).
  2. Отсортируйте по заранее подготовленным пробиркам для сбора.

6. Культура тканей

  1. Центрифугируйте собранные клетки при давлении 800 x g в течение 10 мин при 4 °C.
  2. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки P1000. Будьте осторожны, чтобы не потревожить клеточную гранулу.
  3. Ресуспендируйте гранулу в питательных средах (250 μл/лунку) и затравите при 25 тыс. клеток/лунку в 48-луночном планшете для культивирования тканей.
  4. Культура в инкубаторе (37 °C, 5%СО2). Меняйте среду каждые 3 дня до тех пор, пока клетки не достигнут 80% конфлюенции.

7. Фиброгенная дифференцировка

  1. Как только клетки будут готовы к обработке, поместите основные среды и 1x DPBS в теплую ванну или при комнатной температуре перед их использованием.
  2. Отсасывайте питательные среды.
  3. Промойте 200 мкл 1x DPBS дважды.
  4. Промойте 200 мкл основного средства один раз.
  5. Добавьте 250 μL фиброгенной или основной среды в соответствующие лунки.
  6. Верните клетки в инкубатор (37 °C, 5%CO2).
  7. Прекратите дифференцировку через 48 ч.

8. Адипогенная дифференцировка

  1. Как только клетки будут готовы к обработке, поместите основные среды, адипогенные среды и 1x DPBS в теплую ванну или при комнатной температуре перед их использованием.
  2. Отсасывайте питательные среды.
  3. Промойте 200 мкл 1x DPBS дважды.
  4. Промойте 200 мкл основного средства один раз.
  5. Добавьте в соответствующие лунки 400 μл адипогенных или основных сред.
  6. Возврат в инкубатор (37°C, 5%CO2).
  7. Каждые 2 дня удаляйте пипеткой 200 мкл среды из лунок и добавляйте 200 мкл свежей адипогенной или основной среды.
  8. Прекратите дифференцировку на6-й день для ФАП скелетных мышц и на14-й день для сердечных ФАПов.

9. Иммуноокрашивание

  1. Остановите дифференцировочный анализ, аспирационировав среду и промыв 250 мкл 1x PBS дважды. Выполняйте все промывки с помощью иглы 18 G, прикрепленной к шприцу объемом 3 мл, чтобы избежать отслоения клеток.
  2. Добавьте 250 μл 4% PFA на лунку и инкубируйте при комнатной температуре в течение 7 минут.
  3. Удалите PFA и промойте 3 раза в течение 5 минут каждый раз 250 мкл 1x PBS.
  4. На последней промывке аспирируйте 1x PBS и добавьте 250 μL буфера для блокировки Donkey + MOM.
  5. Выдерживать при комнатной температуре в течение 60 минут.
  6. Приготовьте первичный раствор для окрашивания антител в блокирующем буфере Donkey (анти-SMA и анти-перилипин) для конечного объема 100 мкл на лунку.
  7. Отсасывайте из окрашивающих лунок. Оставьте буфер блокировки Donkey + MOM под контролем, если это возможно.
  8. Добавьте раствор первичного окрашивания антител в соответствующие лунки.
  9. Инкубировать при температуре 4 °C в течение ночи.
  10. На следующий день умыться 3 раза по 5 минут каждый раз с 1x PBS.
  11. Приготовьте раствор для вторичного окрашивания антител в блокирующем буфере Donkey с конечным объемом 100 мкл на лунку.
  12. Отсадите последнюю промывку и добавьте во все лунки вторичный раствор для окрашивания антител.
  13. Инкубировать при комнатной температуре в течение 45 минут (с этого момента образцы должны быть защищены от света).
  14. Стирайте 3 раза по 5 минут каждый раз с 1x PBS.
  15. Отсадите последнюю стирку и добавьте 250 мкл раствора для окрашивания DAPI.
  16. Выдерживать при комнатной температуре в течение 5 минут.
  17. Удалите раствор для окрашивания DAPI и постирайте один раз в течение 5 минут 1x PBS.
  18. Добавьте по 100 мкл Fluoromount-G в каждую лунку.
  19. Закройте тарелку крышкой и парафиновой пленкой, чтобы свести к минимуму испарение. Хранить при температуре 4 °C в защищенном от света месте до момента визуализации.
  20. Изображение с помощью микроскопа (рисунок 3 и рисунок 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сыворотка Donkey используется в блокирующем буфере в качестве видоспецифичного блока против вторичных антител, поднятых Donkey Raised, которые используются в этом протоколе. Реагент, блокирующий мышь-мышь, используется против первичного антитела против СМА, которое вырабатывается у мыши.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Схема этого протокола для выделения и культивирования FAP скелетных мышц и сердца представлена на рисунке 1. При заборе тканей изменение цвета печени с темно-красного на бледно-желтый обычно свидетельствует об успешной перфузии. В указанных возрастных диапазонах колючих мышей вес сердца обычно составляет около 200 мг, в то время как четырехглавой мышцы составляет около 350 мг.

Во время каждой смены буфера для сбраживания на этапах 3.5-3.7 буфер для сбраживания в пищеварительных трубках кажется непрозрачным по мере высвобождения клеток из ткани. В конце разложения раствор должен представлять собой относительно однородную кашицу с оставшимися кусочками ткани. Обязательно заканчивайте переваривание до того, как все ткани будут полностью переварены, чтобы избежать переваривания, которое негативно повлияет на жизнеспособность клеток и результаты культивирования.

Графики ожидаемого потока для FACS показаны на рисунке 2. Ожидается, что FAP будут составлять около 2% живых и LIN-сот. Процент событий PI+ является показателем качества пробоподготовки и должен составлять менее 10%. В этом исследовании обычно получают 150 тыс. FAP на сердце (только желудочки) и 100k FAP на две четырехглавые мышцы.

Попав в планшет, клетки обычно прикрепляются в течение 72 ч, достигают 80% конфлюенции в течение 5 дней и демонстрируют типичную морфологию фибробластов с проекциями (рис. 5).

figure-results-1
Рисунок 1: Схематическое изображение протокола и приблизительное время, необходимое для каждого этапа. Сбор салфетки: 10 мин на мышь. Переваривание тканей: 1,5-2 ч. Окрашивание клеток: 45-75 мин. Флуоресцентно-активируемая сортировка клеток: 2 ч. Экспансия фиброадипогенных предшественников (ФАП): 4 дня. Дифференцировка FAP: 48 ч для фиброгенной дифференцировки, 6 дней для адипогенной дифференцировки для FAP скелетных мышц и 14 дней для сердечных FAP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Репрезентативные графики FACS для выделения скелетных мышц (вверху) и сердца (внизу) FAP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Дифференцировка FAP скелетных мышц колючей мыши. (A) Контроль фиброгенной дифференцировки. (Б) Фиброгенная дифференцировка. (В) Контроль адипогенной дифференцировки. (D) Адипогенная дифференцировка. Перилипин (зеленый), SMA (пурпурный), DAPI (синий), масштабная линейка = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4: Дифференцировка сердечного FAP у колючих мышей. (A) Контроль фиброгенной дифференцировки. (Б) Фиброгенная дифференцировка. (В) Контроль адипогенной дифференцировки. (D) Адипогенная дифференцировка. Перилипин (зеленый), SMA (пурпурный), DAPI (синий), масштабная линейка = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-5
Рисунок 5: Светлопольные изображения скелетных мышц (А) и сердца мышей (В) FAP после 5 дней культивирования, до дифференцировки. Масштабная линейка = 360 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рычаги управленияCD31 SCPDGFRα SCCD31 FMOPDGFRα FMOОбразец
Антитела к CD31+--++
Антитела PDGFRα-++-+

Таблица 1: Схематическое руководство по настройке коктейлей для окрашивания антител для контроля и образца. SC = одноцветный контроль, FMO = флуоресценция минус один контроль, + = с соответствующим антителом, - = без соответствующего антитела.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Колючие ткани мышей более чувствительны к стрессам при диссоциации тканей, и существует несколько аспектов этого протокола, направленных на минимизацию стресса для улучшения жизнеспособности клеток. Метод серийной ферментативной диссоциации используется для подготовки образцов с целью снижения концентрации необходимого фермента. По мере протекания ферментативного пищеварения ферментативная активность снижается. Заменив его свежими ферментами, можно лучше достичь стабильной ферментативной активности на протяжении всего пищеварения, а также избежать высоких концентраций фермента. Кроме того, исключается замена буфера для переваривания уже высвобожденных клеток в растворе. Во-вторых, буфер для лизиса ACK используется для удаления эритроцитов. Несмотря на то, что сердце обескровлено и перфузировано, оно все еще содержит красные кровяные тельца, поскольку это орган с высокой васкуляризацией. Удаляя загрязняющие эритроциты, время, необходимое для проведения FACS, сводится к минимуму, чтобы избежать деградации клеток. Наконец, важно работать быстро и усердно с шага 2.1 по шаг 6.4 и следовать передовым методам работы с клетками, таким как щадящее пипетирование и удержание льда как можно дольше. Некоторые детали сложно показать даже в аудиовизуальном формате и могут потребовать определенного уровня опыта.

В клеточной культуре начальная плотность посева имеет решающее значение для оптимального расширения клеток. FAP в чашке общаются паракринным образом и стимулируют рост с помощью секретируемых факторов роста. В условиях низкой плотности посева клетки не получают достаточных сигналов для роста и либо не могут расширяться, либо требуют дополнительного времени на культивирование для достижения соответствующих уровней слияния для последующего применения. Это также является обоснованием для изменения только половины среды при каждой смене среды в адипогенной дифференцировке. Важно оставить некоторые кондиционированные среды, содержащие факторы роста из преадипоцитов, которые имеют решающее значение для их дифференцировки.

Во время иммуноокрашивания важно быть осторожным при добавлении или удалении буферов, чтобы свести к минимуму отслоение клеток. В частности, на шаге 9.1 клетки наиболее склонны к отслоению до фиксации. Рекомендуется ручная аспирация, например, с помощью пипетки или иглы и шприца, но не рекомендуется использовать мощные вакуумные аспираторы.

Ограничением данного протокола является то, что PDGFRα является общим маркером FAP, и для различения уникальных подтипов FAP17 требуется больше маркеров. Подтипы, такие как предшественники DPP4+, такие как FAP и CD10+ адипогенные FAP, были вовлечены как в болезнь, так и в гомеостатический контекст 18,19,20. Подмножества FAP, вероятно, также существуют у колючих мышей. Они могут существовать в разных пропорциях, проявлять различное клеточное поведение или иметь разные физиологические функции по сравнению с соответствующими подгруппами FAP musculus. Дальнейшая оптимизация подвидовых маркеров FAP у колючих мышей потребуется для изучения деталей FAP у колючих мышей.

Таким образом, в этом протоколе подробно описан надежный и воспроизводимый метод выделения, культивирования и дифференциации скелетных мышц и сердечных FAP от колючих мышей. Колючая мышь набирает обороты в качестве новой гиперрегенеративной модели животного. FAP и строма активно участвуют в поддержании гомеостаза мышц и сердца и способствуют дисфункции органов при множественных моделях хронических заболеваний 5,7. Характеристика ФАП у колючих мышей может пролить свет на механизм их замечательной регенеративной способности и проложить путь к новым стратегиям в регенеративной медицине.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы выразить признательность Энди Джонсону и Джастину Вонгу (Justin Wong), основному центру UBC flow, за их опыт и помощь в оптимизации протокола FACS, а также персоналу ветеринарного центра UBC Biomedical Research Center за уход за колючими мышами. Рисунок 1 выполнен с использованием Biorender. Рисунок 2 был сделан с использованием программного обеспечения FlowJo.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,5М ЭДТАИнвитроген15575– 038
Микроцентрифужные пробирки 1,7 млVWR87003-294
15  mL центрифужная пробиркаFalcon352096
1x Dulbecco' s Фосфатно-солевой буфер (DPBS)Gibco14190-144
20 мл шприцBD309661
4′,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI)InvitrogenD3571
40  μ m клеточное ситечкоFalcon352340
48 луночный плоскодонный планшет для культуры тканейFalcon53078
5 мл полипропиленFalcon352063
5 мл полистирольная круглодонная трубка с крышкой клеточного фильтраFalcon352235
5 мл шприцBD309646
50  Центрифужная трубкаmL Falcon352070
60 мм чашка ПетриFalcon353002
96 лунок V-образная тарелка для культуры тканейCorning3894
Acomys dimidiatus мышей (колючие мыши)любезно подаренные доктором Эшли В. Сейферт (Университет Кентукки).
Аммоний-хлорид-калий-калийный лизирующий буферGibcoA10492-01
Анти-перилипин (1:100)SigmaP1873
Анти-СМА (1:100)Инвитроген14-9760-82
APC PDGFRa (1:800)Abcamab270085
BD PrecisionGlide Needle 18 GBD BD305195
BD PrecisionGlide Needle 23 GBD305145
Бычий сывороточный альбуминSigmaA7906-100g
BV605 CD31 (1:500)BD biosciences744359
CaCl2Sigma-AldrichC4901
ЦентрифугаEppendorf5810R
DMEM/F12Gibco11320033
Donkey anti-mouse Alexa 555 (1:1000)InvitrogenA31570
Ослик против кролика Alexa 647 (1:1000)InvitrogenA31573
Ослиная сывороткаSigmaS30-100ML
FACS сортировщик - MoFlo Astrios 5 лазеровBeckman coulterB52102
Фетальная бычья сывороткаGemini100-500
Тонкие ножницыFST14058-11
Фторомунт-GSouthernBiotech0100-01
ЩипцыFST11051-10
ГемостатFST91308-12
человеческий FGF-основной рекомбинантный белок (bFGF)Gibco13256029
человека TGF бета-1 рекомбинантный белок (TGFb1)eBiosciences14-8348-62
Инкубатор - Heracell 160i CO2ThermoFisher51033557
Инвертированный микроскоп - RevolveECHOn/a
LiberaseRoche5401127001
мышь MesenCult Adipogenic Differentiation 10x ДополнениеSTEMCELL technologies5507
Мышь на мыши (MOM) блокирующий реагентVector LaboratoriesMKB-2213
ПараформальдегидSigmaP1648-500g
Пенициллин-стрептомицинGibco15140– 122
PicoLab Mouse Diet 20LabDiet3005750-220
Пропидиум йодид (PI)InvitrogenP3566
Транспортный флакон 5 мл тюбикCaplugs Evergreen222-3005-080
Triton X-100Sigma9036-19-5

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gaire, J., et al. Spiny mouse (Acomys): An emerging research organism for regenerative medicine with applications beyond the skin. NPJ Regen Med. 6, 1(2021).
  2. Sandoval, A. G. W., Maden, M. Regeneration in the spiny mouse, Acomys, a new mammalian model. Curr. Opin. Genet. Dev. 64, 31-36 (2020).
  3. Judson, R. N., Zhang, R. H., Rossi, F. M. A. Tissue-resident mesenchymal stem/progenitor cells in skeletal muscle: Collaborators or saboteurs. FEBS J. 280 (17), 4100-4108 (2013).
  4. Uezumi, A., et al. Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle. J Cell Sci. 124, 3654-3664 (2011).
  5. Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nat Cell Biol. 12, 153-163 (2010).
  6. Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nat Cell Biol. 122 (12), 143-152 (2010).
  7. Soliman, H., et al. Pathogenic Potential of Hic1-Expressing Cardiac Stromal Progenitors. Cell Stem Cell. 26 (2), 205-220 (2020).
  8. Hall, C., Gehmlich, K., Denning, C., Pavlovic, D. Complex relationship between cardiac fibroblasts and cardiomyocytes in health and disease. J Am Heart Assoc. 10, 1-15 (2021).
  9. Gawriluk, T. R., et al. Comparative analysis of ear-hole closure identifies epimorphic regeneration as a discrete trait in mammals. Nat Commun. 71 (7), 1-16 (2016).
  10. Seifert, A. W. Skin shedding and tissue regeneration in African spiny mice (Acomys). Nature. 489, 561(2012).
  11. Koopmans, T., et al. Ischemic tolerance and cardiac repair in the spiny mouse (Acomys). NPJ Regen Med. 6, 78(2021).
  12. Peng, H., et al. Adult spiny mice (Acomys) exhibit endogenous cardiac recovery in response to myocardial infarction. NPJ Regen Med. 6, 74(2021).
  13. Maden, M., et al. Perfect chronic skeletal muscle regeneration in adult spiny mice, Acomys cahirinus. Sci Rep. 8, 8920(2018).
  14. Riparini, G., Simone, J. M., Sartorelli, V. FACS-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle. J Vis Exp. (184), e63983(2022).
  15. Low, M., Eisner, C., Rossi, F. Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture. Methods Mol Biol. 1556, 179-189 (2017).
  16. Molina, T., Fabre, P., Dumont, N. A. Fibro-adipogenic progenitors in skeletal muscle homeostasis, regeneration and diseases. Open Biol. 11 (12), 210110(2021).
  17. Contreras, O., Rossi, F. M. V., Theret, M. Origins, potency, and heterogeneity of skeletal muscle fibro-adipogenic progenitors-time for new definitions. Skelet Muscle. 111 (11), 1-25 (2021).
  18. Fitzgerald, G., et al. MME+ fibro-adipogenic progenitors are the dominant adipogenic population during fatty infiltration in human skeletal muscle. Commun Biol. 61 (6), 1-21 (2023).
  19. Babaeijandaghi, F., et al. DPPIV+ fibro-adipogenic progenitors form the niche of adult skeletal muscle self-renewing resident macrophages. Nat Commun. 141 (14), 1-10 (2023).
  20. Schutz, P. W., Cheung, S., Yi, L., Rossi, F. M. V. Cellular activation patterns of CD10+ fibro-adipogenic progenitors across acquired disease states in human skeletal muscle biopsies. Free Neuropathol. 5, 3-3 (2024).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи