Методическая статья

Моделирование восходящей вагинальной инфекции, преждевременных родов и неонатальной заболеваемости у мышей

1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66723

⸱

10 октября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1EGA Institute for Women's Health, University College London, 2Department of Women and Children's Health, St Thomas' Hospital, King's College London

В этой статье

Краткое содержание

Преждевременные роды (роды < сроке 37 недель) являются неотложной глобальной проблемой здравоохранения с неоптимальными вариантами профилактики и лечения. Мы представляем мышиную модель восходящей вагинальной бактериальной инфекции преждевременных родов и описываем, как анализировать полученную в результате неонатальную заболеваемость и смертность.

Аннотация

Преждевременные роды по-прежнему являются одной из основных причин неонатальной смертности и заболеваемости во всем мире, при этом профилактическая терапия ограничена. Существует настоятельная необходимость в клинической
Актуальные и воспроизводимые животные модели для трансляции инновационных вмешательств
стать реальностью. Существуют различные модели преждевременных родов у мышей. Тем не менее, они не повторяют неонатальную заболеваемость человека, включая невропатологические изменения и
повреждение легких, которые являются характерными последствиями восходящей инфекции и преждевременных родов. Мы охарактеризовали модель, которая, насколько нам известно, является единственной, которая имитирует человеческий сценарий, в соответствии с которым эти неонатальные заболевания присутствуют после индукции преждевременных родов живой бактерией, которая поднимается из влагалища. В данной работе демонстрируется интравагинальное введение биолюминесцентного штамма Escherichia coli и подробно описывается оценка невропатологических исходов и повреждения легких с использованием иммуногистохимических и гистологических методов.

Введение

Преждевременные роды (ПТБ; роды < 37 недель) являются основным фактором неонатальной смертностиво всем мире1,2. На долю которого приходится 11% всех рождений, это серьезная глобальная проблема здравоохранения со сложной этиологией, которая плохо изучена, что затрудняет прогнозирование и профилактику 3,4,5. У неонатальных пациентов, перенесших ПТБ, могут наблюдаться неблагоприятные исходы развития нервной системы, включая церебральный паралич, респираторные расстройства, такие как бронхолегочная дисплазия (БЛД), и желудочно-кишечные расстройства, такие как некротизирующий энтероколит (НЭК)6,7,8. Таким образом, существует острая потребность в клинически значимых, воспроизводимых животных моделях для устранения биологических путей, способствующих ПТБ, и разработки инновационных вмешательств.

Существует ряд возможных механизмов, лежащих в основе спонтанного ПТБ, таких как децидуальное старение, нарушение толерантности матери и плода, стресс, короткая длина шейки матки или повреждение шейки матки9. Тем не менее, по меньшей мере 40% спонтанных ПТБ связаны с микробной инфекцией10,11. Микробы, восходящие из вагинального канала через шейку матки в матку, являются гипотезой и широко признаны в качестве общего пути инфекции из-за корреляции между микробами, выделенными из амниотической жидкости, и микробами, присутствующими в микробиоте влагалища 12,13,14. Микроорганизмы, часто ассоциированные с преждевременными родами, включают виды Mycoplasma, Ureaplasma, Fusobacterium и Streptococcus, и в большинстве случаев являются полимикробными15,16.

Мышей часто используют для моделирования ПТБ, при этом наиболее распространенным подходом является введение бактериального токсина липополисахарида (ЛПС), который может быть доставлен внутриматочным, внутрибрюшинным или внутриамниотическим путем, чтобы вызвать уровни воспаления, необходимые для началародов. Тем не менее, ЛПС не моделирует живую микробную инфекцию, и, что важно, неонатальные исходы не могут быть измерены в этих моделях, поскольку ЛПСвызывает гибель плода. В последние годы были разработаны животные модели восходящей вагинальной бактериальной инфекции, но повторение как преждевременных родов, так и связанных с ними неонатальных исходов было сложной задачей 19,20,21,22,23,24.

Наша группа создала новую модель восходящей вагинальной бактериальной инфекции, преждевременных родов и неонатальной заболеваемости, которая повторяет патофизиологию ПТБ человека25. В этой статье мы демонстрируем, как оценить неонатальную невропатологию и повреждение легких у щенков, подвергшихся воздействию инфекции восходящего влагалища матери патогенным штаммом Escherichia coli (E. coli), который был связан с неонатальным менингитом человека. Эта модель предоставляет уникальную возможность изучить патофизиологию восходящей инфекции, а также предоставляет средства для оценки эффективности вмешательств при преждевременных родах в улучшении неонатальных исходов.

Протокол

Процедуры проводились в соответствии с лицензией МВД Великобритании (PAD4E6357) в соответствии с Законом о научных процедурах на животных (1986 г.) и руководящими принципами ARRIVE. Температура (19-23 °C), влажность (~55%) и 12-часовые циклы света/темноты строго контролировались. Девственные самки мышей C57BL/6 Tyrc-2J (в возрасте 6-12 недель) спаривались в течение ночи в течение 16-18 часов. Признаком копулятивной пробки был назначен эмбриональный день (Е) 0,5.

Патогенная E. coli O18:K1 (A192PP)26, крысиный пассажный штамм A192 (DSM. No 10719)27, был модифицирован для содержания люкс-оперона (luxCDABE), происходящего из симбионта нематоды Photorhabdus Luminescens ATCC29999 (штамм Hb), и включающего кассету с канамицинорезистентностью (Km2)28. Этот штамм классифицируется как группа опасности 2 Консультативным комитетом правительства Великобритании по опасным патогенам (ACDP). Носите соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ) и следуйте местным рекомендациям при обращении с биологическими агентами и их утилизации.

1. Мышиная модель восходящей вагинальной бактериальной инфекции

  1. Подготовка культур кишечной палочки
    1. Приготовьте бульон Лурия-Бертани (LB), растворив порошок в дистиллированной воде (dH2O) до получения 20% раствора и автоклава. Как только LB остынет до комнатной температуры, добавьте 50 мкг/мл канамицина. Хранить при температуре 4 °C до 1 недели.
    2. Приготовьте 20% раствор плуронового геля F127, растворив твердое вещество в стерильном фосфатно-солевом буфере (PBS). Вихрь перемешать и взболтать при температуре 4 °C в течение ночи.
    3. Добавьте 10 мл обработанного антибиотиками бульона LB в стерильный универсальный контейнер объемом 30 мл. Извлеките замороженный глицериновый запас кишечной палочки из хранилища при температуре -80 °C. С помощью стерильного наконечника для пипетки соскребите замороженный глицериновый запас кишечной палочки, чтобы слегка покрыть конец наконечника, и выбросьте наконечник прямо в бульон LB. Закрепите универсальный контейнер парапленкой, пометьте его как биологически опасный и поместите его в орбитальный шейкер на ночь (200 об/мин) при температуре 37 °C.
    4. На следующее утро разбавьте бактериальную культуру в соотношении 1:100 (0,1 мл культуры + 9,9 мл свежего бульона LB) и верните ее в орбитальный шейкер на 1,5-3 ч (200 об/мин при 37 °C), регулярно проверяя рост культуры, измеряя абсорбцию при 600 нм. Пипетируйте 100 мкл культуры в двух экземплярах в прозрачный 96-луночный планшет с плоским дном. Измерьте поглощение на спектрофотометре с активированной коррекцией длины пути. OD600 в диапазоне от 0,5 до 0,7 означает среднелогарифмическую фазу роста.
    5. При достижении OD600 0,5-0,7 (~108-9 колониеобразующих единиц [КОЕ]) удалите 100 мкл из бактериальной культуры и разведите 900 мкл стерильного PBS. Центрифугируйте при 14 000 × г в течение 1 минуты, чтобы промыть бактериальную гранулу и удалить бульон LB. Удалите надосадочную жидкость, повторно суспендируйте бактериальную гранулу в стерильном PBS и разведите 1:10 000 в стерильном PBS (до 102-3 КОЕ).
    6. Перед утилизацией продезинфицируйте все наконечники и контейнеры, контактирующие с бактериями.
  2. Анестезия
    1. На Е16.5 обезболить беременных мышей путем ингаляции изофлурана (5% для индукции, 1,5% для поддержания кислорода). Перенесите поток анестезии, а затем животное к носовому конусу, расположив самку в положении лежа. Подтвердите анестезию отсутствием рефлекса на пальцы ноги и поддерживайте изофлуран в минимальном процентном соотношении, необходимом для процедуры.
      ВНИМАНИЕ: Изофлуран является раздражителем глаз и кожи, а также токсикантом центральной нервной системы. Носите соответствующие СИЗ. Всегда используйте систему очистки.
    2. Введите во влагалище 20 мкл кишечной палочки в среднелогарифмической фазе (1 × 102-3 КОЕ ресуспендировано в стерильном PBS) или стерильном PBS (контроль носителя) с помощью стерильного наконечника для пипетки объемом 200 мкл (рис. 1). С помощью свежего стерильного наконечника для пипетки объемом 200 мкл введите во влагалище 20 мкл геля F127 20% Pluronic Gel F127, чтобы предотвратить утечку бактерий. Используя стерильную марлю, нанесите порошок хинина на интроитус, чтобы отпугнуть мышей от очистки бактериальной суспензии. Запишите дату и время лечения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использованные КОЕ были основаны на экспериментах по титрованию для достижения желаемого фенотипа (преждевременные роды с живыми щенками). КОЕ можно определить путем последовательного разведения и нанесения покрытия на агаровые пластиныLB 29.
    3. Поодиночке содержать животных в клетках с индивидуальной вентиляцией (НПВ) и дать им восстановиться после анестезии перед возвращением клетки в помещение для содержания; Четко обозначьте клетку как биологически опасную. Наблюдайте за животными до тех пор, пока их нормальное поведение не возобновится.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура должна занимать не более 5 минут, при этом животные должны быстро восстановиться (в течение 2-5 минут).
  3. Оценка гестационных исходов
    1. Настройте систему видеонаблюдения, прикрепив по одной камере к внешней стороне каждой клетки, чтобы следить за мышами на предмет признаков родов и родов щенков. Запишите время, прошедшее до родов, как количество часов с момента интравагинального введения E. coli или PBS (шаг 1.2.2) до рождения первого щенка.
    2. Запишите количество живых/мертвых щенков при рождении и рассчитайте процент выживаемости на помет. Наблюдайте за матерью и детенышами ежедневно, регистрируя выживаемость детенышей до 7 дней после рождения и обеспечивая восстановление матерей. В этот период измерьте и другие измерения, такие как вес и длина щенка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Признаки родов включают усиленный груминг, вращение по кругу, а также вытягивание и выталкивание задних лап. Поскольку это живая бактериальная инфекция, у матерей со временем (обычно через 24 часа после лечения) развиваются симптомы. Самка должна выздороветь от инфекции, но если у нее все еще проявляются симптомы инфекции после родов, она не построила гнездо или не выкормила своих детенышей в течение первого дня, то гуманно принесите животных в жертву с использованием методов Списка 1 (таких как воздействиеСО2 в возрастающей концентрации и подтверждение смерти от вывиха шейки матки).
  4. Биолюминесцентная визуализация
    1. После бактериальной инокуляции сделайте снимки самок через 24 ч и 48 ч, чтобы отследить распространение инфекции, как описано ниже. Визуализируйте детенышей в послеродовой день (P)0 до P14 без необходимости анестезии.
    2. После открытия программного обеспечения для обработки изображений нажмите «Инициализировать » и подождите, пока камера достигнет рабочей температуры (полоса температуры станет зеленой и «заблокируется»). Установите флажок « Люминесцентная визуализация» и убедитесь, что для фильтра возбуждения установлено значение «Блокировать », а для фильтра излучения установлено значение «Открыто».
    3. Обезболивание взрослых самок путем ингаляции изофлурана (5% для индукции, 1,5% для поддержания в кислороде). Поместите животных в лежачее положение в аппарат биолюминесцентной визуализации (с нагреваемой сценой) с сохранением анестезии для мышей. Выберите Авто время экспозиции или вручную установите время экспозиции (диапазон экспозиции: 1 мин - 5 мин). После визуализации верните животных в клетки, чтобы они оправились от анестезии, прежде чем возвращать их в помещение для хранения.
    4. Чтобы количественно измерить излучение фотонов, выберите интересующие области (ROI) на изображениях мыши и запишите количество фотонов в секунду на квадрат сантиметра на стерадиан (фотоны ∙(second-cm2)-1∙sr-1).

2. Анализы тканей плода и новорожденного

  1. Забор перинатальной ткани
    1. На E18.5 пожертвовать плотиной, поддавшись воздействию повышающейся концентрацииCO2 и подтвердив смерть от вывиха шейки матки, и выполнить мини-лапаротомию для удаления матки; Затем сделайте разрез в матке с помощью ножниц.
    2. При сборе околоплодных вод сделайте небольшой разрез на околоплодных ободках и соберите жидкость с помощью пастеровской пипетки или безыгольного шприца.
    3. Используя щипцы, одной рукой удерживайте внешнюю часть матки в месте прикрепления плаценты, а изогнутыми щипцами другой рукой аккуратно отделите плаценту от внутренней стенки матки, раздвигая ткани, осторожно выводя плод с прикрепленными оболочками и плацентой из матки. Опять же, держа щипцы в каждой руке, осторожно удерживайте плаценту и захватите и выщипывайте оболочки в точке, где они встречаются с плацентой (убедитесь, что они отделяются чисто).
    4. Теперь, когда ткани разделены, соберите необходимые гестационные ткани (например, матку, плаценту, оболочки плода, шейку матки и влагалище) и препарируйте ткани плода (например, мозг, легкие и кишечник).
    5. Немедленно заморозьте ткани на сухом льду или в жидком азоте и/или зафиксируйте ткани в параформальдегиде (PFA; 4% в PBS).
    6. Хранить замороженную салфетку при температуре -80 °C и зафиксировать салфетки в течение 24-48 часов; затем хранить в 30% сахарозе при 4 °C.
      ВНИМАНИЕ: PFA легко воспламеняется и может вызвать раздражение глаз, кожи и дыхательных путей. Приготовьте 4% раствор в шкафу биобезопасности и надевайте соответствующие СИЗ при обращении.
  2. Забор тканей после родов
    1. На Р7 обезболить щенков с помощью изофлурана (5% для индукции, 1,5% для поддержания в кислороде).
    2. Проведите обескровливание и перфузию тканей путем разреза правого предсердия и введите 10 мл PBS в левый желудочек. Обезглавьте тушу и удалите мозг и легкие с помощью стерильных ножниц и щипцов. Обрабатывайте и храните ткань так, как описано выше.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Замороженные ткани матери и плода могут быть проанализированы на наличие воспалительных и других медиаторов с помощью количественной ПЦР, ИФА и вестерн-блоттинга. Протоколы для этих методов легко доступны у производителей реагентов или в других публикациях 25,30,31.
  3. Криосекция головного мозга плода и новорожденного
    1. С помощью лезвия удалите мозжечок, чтобы создать ровную поверхность и заморозьте ткань на сухом льду. Закрепите замороженную ткань на держателе образца с использованием состава с оптимальной температурой резки (ОКТ) и покройте ткань тонким слоем ОКТ. Дайте застыть (1-2 минуты).
    2. С помощью криостата, установленного на -20 °C, убедитесь, что рычаг заблокирован, и загрузите держатель образца. Точно отрегулируйте положение ткани и зафиксируйте на месте. Обрежьте ткань и начните сбор срезов ткани на микропредметных стеклах из места слияния мозолистого тела, немедленно заморозив срезы на сухом льду. Разрежьте по 50 последовательных участков по 40 мкм каждой ткани.
      ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны с острым лезвием.
    3. Хранить замороженные срезы на микрослайдах при температуре -80 °C.
  4. Иммуногистохимия
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенный ниже протокол может быть использован для идентификации астроцитов (глиальный фибриллярный кислый белок; GFAP), микроглия (фактор воспаления аллотрансплантата 1; IBA-1) и нейтрофилы (член семейства лимфоцитарных антигенов 6 G; Ly6G). Информацию об антителах можно найти в Таблица 1.
    1. Выберите пять участков мозга на расстоянии 400 мкм друг от друга, что позволит оценить различные области мозга на разной глубине мозга. Увлажните замороженные участки каплей dH2O и распределите и разверните ткань с помощью двух тонких щеток. Просушите ткань под вентилятором в течение 20-30 минут. С помощью гидрофобной (ПАП) ручки аккуратно обведите вокруг ткани, не касаясь ее.
    2. В день 1 приготовьте 4% формальдегид (ЖК), добавив 5,4 мл формальдегида в 50 мл 0,1 М фосфатного буфера (ПБ) на одну кювету объемом 50 мл (емкость 15 слайдов). Погрузите предметные стекла в FA на 5 минут, чтобы зафиксировать криоучастки, обеспечивая адгезию к предметным стеклам, и обездвижить антигены.
      ВНИМАНИЕ: ЖК легко воспламеняется и может вызывать раздражение глаз, кожи и дыхательных путей. Приготовьте 4% раствор в шкафу биобезопасности и надевайте соответствующие СИЗ при обращении.
    3. Приготовьте 0,1% сыворотку бычьего альбумина (БСА), добавив 0,4 г БСА к 400 мл 0,1 М ПБ. Промойте секции 2 раза, погрузив их в 0,1 M PB, а затем одну стирку в BSA (~3 с за промывку). Храните слайды в
      кюветы, содержащие БСА, до тех пор, пока они не понадобятся.
    4. Подготовьте камеры влажности, смочив папиросную бумагу с dH2O и поместите их в камеру, сливая лишнюю воду.
    5. Приготовьте 5% козью сыворотку (50 мкл козьей сыворотки в 1 мл 0,1 М ПБ). Тщательно высушите предметное стекло вокруг участка ткани папиросной бумагой, убедившись, что граница ручки PAP не повреждена, затем нанесите 50 мкл раствора на каждый участок ткани. Выдерживать в камере влажности в течение 30 минут.
    6. Удалите сыворотку, постучав по предметному стеклу по чистой папиросной бумаге, и добавьте первичное антитело, разведенное в БСА (антитела и разведения представлены в таблице 1). Инкубировать в течение ночи при температуре 4 °C.
    7. На 2-й день инкубируйте вторичное антитело в сыворотке мышей (см. Таблицу 1) в течение 30 мин при 37 °С и добавьте к БСА (разведение 1:100) (например, 5 мл БСА + 100 мкл мышиной сыворотки + 50 мкл вторичного антитела).
    8. Промойте слайды 2 раза, погрузив их (~3 с) в BSA, а затем один раз в 0,1 М PB. Держите предметные стекла в кюветах, содержащих BSA, и промокните насухо вокруг каждого участка ткани. Нанесите 50 мкл раствора вторичного антитела на каждый срез ткани и инкубируйте в течение 1 ч во влажной камере.
    9. Готовят авидин биотиновый комплекс (АВК) (0,1% разведение) путем добавления 10 мкл А и 10 мкл В в 1 мл 0,1 М ПБ. Погрузите (~3 с) предметные стекла 2 раза в BSA и один раз в 0,1 М ПБ, затем поместите предметные стекла в кювету, содержащую 0,1 М ПБ. Промокните предметные стекла насухо, нанесите 50 μл раствора ABC на предметное стекло и инкубируйте в течение 1 часа в камере влажности.
    10. Приготовьте раствор диаминобензидина (DAB). Свесьте 25 мг DAB на кювету, растворите в 50 мл 10 мл PB и отфильтруйте фильтровальной бумагой No 4.
      ВНИМАНИЕ: DAB представляет опасность для здоровья с возможной мутагенностью и канцерогенностью половых клеток. Наденьте соответствующие СИЗ и утилизируйте их безопасно.
    11. Промойте предметные стекла 3 x 3 с 10 мМ ПБ и поместите их в кюветы, содержащие 10 мМ ПБ. Добавьте перекись водорода (H2,O2) в раствор DAB перед тем, как сразу разлить раствор в свежие кюветы (16,7 мклH2,O2 на кювету). Переместите предметные стекла в кюветы DAB и оставьте на ~3 мин (максимум 5 мин), при этом постоянно проверяя интенсивность окрашивания под микроскопом.
      ВНИМАНИЕ: H2O2 может раздражать глаза, кожу и горло. Носите соответствующие СИЗ.
    12. Промойте предметные стекла (3 с) один раз в 10 мМ PB и 2x в dH2O и дайте предметным стеклам высохнуть. Погрузите сухие предметные стекла 3 раза в ксилол. Нанесите каплю монтажного материала DPX на покровный стекло и поместите его на участок ткани, стараясь не допустить попадания пузырьков воздуха.
      ВНИМАНИЕ: Ксилол и DPX легко воспламеняются и могут вызывать раздражение глаз, кожи и дыхательных путей. Держите в руках в шкафу биобезопасности и всегда надевайте перчатки при обращении.
  5. Окрашивание по Нисслю
    1. В день 1 регидратируйте и распределите ткань в dH2O. Приготовьте 4% FA, добавив 5,4 мл FA в 50 мл 0,1 M PB, и используйте немедленно. Инкубируйте предметные стекла при 4% FA в течение ночи.
    2. На 2-й день переместите предметные стекла с 4% FA до 70% этанола (EtOH) и инкубируйте в течение ночи.
    3. Приготовьте краситель Ниссля, растворив 4 г Cresyl Violet в 40 мл 100% EtOH в закрытой конической пробирке объемом 50 мл. Переверните в течение 15 минут, добавьте раствор до 360 мл теплого dH2O и перемешивайте на пластине для перемешивания в течение 20 минут. Отфильтруйте раствор перед использованием.
    4. На 3-й день следуйте процедуре окрашивания, описанной в Таблице 2, и наклейте на срезы ткани DPX.
  6. Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза dUTP nick end labeling (TUNEL)
    1. Увлажните и распределите ткань в dH2O, затем инкубируйте предметные стекла при 4% FA в течение 5 минут. Переместите предметные стекла в раствор H2O2 и метанола (CH3OH) (1:10) и инкубируйте в течение 15 минут. Промойте предметные стекла в течение 2 х 3 с в 0,1 М ПБ и поместите их в кюветы, содержащие 0,1 М ПБ.
    2. Приготовьте раствор TUNEL на льду в соответствии с инструкцией производителя. Добавьте раствор на предметные стекла (50 μл на срез ткани) и инкубируйте в камере влажности при температуре 37 °C в течение 2 ч.
    3. После 1 ч инкубации приготовьте раствор ABC, как описано в шаге 2.4.9, и инкубируйте при комнатной температуре.
    4. Через 2 часа переместите предметные стекла в раствор TUNEL STOP (300 мМ NaCl, 30 мМ цитрат натрия) на 10 минут и погрузите предметные стекла для промывки 3 x 3 с в 10 мМ раствор PBS. Инкубируйте предметные стекла в растворе АВС в течение 1 ч.
    5. Готовят сульфат кобальта (1,55 г безводного CoSO4 в 100 мл dH2O) и гексагидрат хлорида никеля (2,38 г NiCl2·6H2O в 100 мл dH2O). Приготовьте раствор DAB Co-Ni (10 мМ PB + 25 мг DAB + 1 мл/100 мл Co + 1 мл/100 мл Ni). Отфильтруйте раствор под вакуумом и держите его в темноте. Непосредственно перед тем, как залить раствор DAB в кюветы, добавьте 16,7 мкл H2O2 на 50 мл кюветы.
    6. Через 1 ч переместите предметные стекла в кюветы DAB и инкубируйте ~3 минуты при комнатной температуре, постоянно проверяя интенсивность окрашивания. Остановите реакцию, переместив предметные стекла в кюветы, содержащие 10 мМ ПБ. Постирайте, погрузив 2 x 3 s в dH2O и дайте участкам ткани высохнуть, прежде чем покрывать их DPX.
  7. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E)
    1. Увлажните и распределите ткань в dH2O и дайте срезам высохнуть на воздухе.
    2. Погрузите предметные стекла в гематоксилин на 2 мин.
      ВНИМАНИЕ: Гематоксилин может вызвать раздражение глаз и кожи. Носите соответствующие СИЗ.
    3. Промойте предметные стекла в проточной воде из-под крана в течение 5 минут, обесцветьте в кислом спирте в течение 1 секунды и промойте в водопроводной воде.
    4. Противоотварное окрашивание в 0,5% эозина (1,5 г растворенного в 300 мл 95% EtOH) в течение 30 с.
      ВНИМАНИЕ: Эозин легко воспламеняется и может вызвать раздражение глаз и кожи. Приготовьте растворы в шкафу биобезопасности и наденьте соответствующие СИЗ.
    5. Обезвоживайте участки ткани с градиентом EtOH: 50%, 70%, 95% и, наконец, 100% EtOH, каждый в течение 3 минут. Переместите предметные стекла в ксилол на 2 х 5 минут. Покровное стекло с DPX.

3. Гистологические и иммуногистохимические оценки при невропатиологии и повреждении легких

ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка может быть выполнена в следующих областях: кора, пириформная кора, наружная капсула, стриатум, гиппокамп и таламус (Рисунок 2). Для мозга с E18.5 также может быть включено мозолистое тело, поскольку дифференцировка клеток еще не завершена, а глиальные клетки не мигрировали во все области мозга. Оценщик должен быть слеп к группам лечения.

  1. Гибель клеток TUNEL+
    1. Используя обычный микроскоп, подсчитайте клетки, положительные на окрашивание TUNEL с двусторонней стороны при 20-кратном увеличении во всех областях мозга (рис. 2).
    2. Оцените три случайно выбранных оптических поля для каждой области мозга и рассчитайте среднее количество клеток на каждую область мозга.
  2. Оценка морфологии по Нисслю
    1. Делайте снимки целых тканей с помощью цветной камеры с 1-кратным увеличением и сохраняйте их в формате TIFF или в другом желаемом формате. Импортируйте изображения в ImageJ для дальнейшего анализа.
    2. Наметьте интересующие области мозга (например, кору головного мозга и гиппокамп) и измерьте с помощью инструмента от руки (рис. 2).
    3. Для получения измерений ткани применяют формулу: (мм2 × 400 мкм) = объем × 100 (пересмотрено32).
  3. Индекс микроглиального разветвления
    1. Используя микроскоп с квадратной сеткой 0,049 мм x 0,049 мм, при 40-кратном увеличении подсчитывайте количество тел клеток IBA-1+ в пределах сетки (C) и среднее количество ветвей, пересекающих линии сетки (B). Проделайте это в трех случайно выбранных полях (см. рисунок 3) для каждой области мозга, показанной на рисунке 2.
    2. Используйте формулу (B2/ C) для расчета индекса микроглиального разветвления.
  4. Оптическая светимость для интенсивности окрашивания GFAP
    1. Используя указанное программное обеспечение (Table of Materials) и цветную камеру с 40-кратным увеличением, захватите три случайно выбранных поля в каждой области мозга (рис. 2). Нажмите Ctrl+H , чтобы получить гистограмму, отображающую среднее значение и стандартное отклонение (SD). Запишите среднее значение и значение SD в таблицу. Захватите контрольное изображение только окружающего стекла (т.е. без ткани) и запишите средние значения и значения SD, как и раньше.
    2. Используйте следующую формулу для вычисления значений оптической светимости (OLV) в электронной таблице:
      OLV = (среднее значение стекла − стандартное отклонение стекла) − (среднее значение [среднее значение на изображение − стандартное отклонение на изображение])
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например:
      Окружающее стекло
      Среднее ± SD = 143,5 ± 8,56
      Область мозга (например, кора головного мозга)
      1. 136,7 ± 10,6
      2. 140,6 ± 10,4
      3. 137,4 ± 11,3
      OLV = (143,5 - 8,56) - (среднее значение [136,7 - 10,6], [140,6 - 10,4], [137,4 - 11,3])
      ОЛВ = 134,94 - 127,47
      ОЛВ = 7,47
    3. Усредните каждое значение по региону, по животному, а затем по опытной группе.
  5. Оценка морфологии легких
    1. Захватывайте срезы H&E с 40-кратным увеличением (три оптических поля на слайд, измеряйте воздушное пространство на поле), сохраняйте в формате TIFF (или эквиваленте) и импортируйте изображения в ImageJ. Случайным образом выберите поля, которые репрезентативны для всего отдела легких.
    2. С помощью инструмента «От руки» очертите воздушные пространства и запишите результаты измерений (Рисунок 4A). Найдите среднее значение трех воздушных пространств на поле, затем между тремя полями на секцию и, в конечном итоге, между тремя секциями на выборку.
  6. Приток нейтрофилов в легкие
    1. Сделайте образцы изображений с помощью цветной камеры с 40-кратным увеличением, три раза на каждый срез легочной ткани, и сохраните исходный файл в формате TIFF или в другом желаемом формате. Импортируйте изображения в ImageJ и вручную подсчитайте отдельные нейтрофилы в трех полях одного и того же легкого. Рассчитайте среднее количество нейтрофилов в легком.

Результаты

В этом протоколе представлена мышиная модель восходящей вагинальной инфекции и описаны методы оценки неонатальной невропатологии и респираторных исходов. Процедура индуцирования восходящей вагинальной инфекции должна быть быстрой (в течение 5 минут), а мыши должны восстановиться в течение нескольких минут. У плотин симптомы инфекции развились примерно через 24 часа25 минут. Это включает в себя медленные движения, пилоэрекцию и сгорбленную осанку. Приблизительное среднее время родов у инфицированных мышей составило 40,3 ч после введения E. coli (среднее значение в контрольной группе PBS 52,7 ч), что происходило на E18.5 по сравнению с досрочными родами в контрольной группе PBS на E19.531. Процент живорожденных детенышей в помете снижался (со 100% до 71,4%) при инфекции, как и их выживаемость в течение 7 дней после родов (Рисунок 5)25. При использовании биолюминесцентных бактерий визуализация может отслеживать распространение инфекции у самок и детенышей. Бактерии наблюдались в матке, плодных оболочках, плаценте и у некоторых плодов в течение 18 ч после введения (рис. 6), а медиаторы воспаления, измеренные с помощью количественной ПЦР и ИФА, были повышены в этих тканях, а также в перинатальных тканях детенышей, таких как мозг, легкие и кишечник 25,29,31.

Серия невропатологических оценок, таких как оценка морфологии, гибели клеток, активации микроглии и активации астроцитов, была проведена на плодах и новорожденных с использованием гистологии и иммуногистохимии 25,31,33. Также можно оценить легочную ткань (Рисунок 4 и Рисунок 7). Положительное окрашивание TUNEL предполагает деградацию ДНК, более позднюю стадию гибели клеток34. Мы наблюдаем значительное увеличение окрашивания TUNEL в коре головного мозга, пириформной коре, наружной капсуле, гиппокампе и таламусе в головном мозге детенышей, подвергшихся воздействию инфекции E. coli во время беременности (рис. 8A, B)31. Меченые IBA-1 микроглии, резидентные иммунные клетки мозга, могут быть классифицированы по их морфологическому состоянию, при этом разветвление предполагает фенотип покоя, в то время как активированные и фагоцитарные клетки становятся амебоидными или округлымипо форме. Таким образом, вместо количественной оценки клеток микроглии мы представляем стратегию оценки их фенотипа в качестве индикатора их состояния. Мы наблюдаем увеличение разветвлений IBA1+ в наружной коре и стриатуме у щенков E. coli по сравнению с группой PBS (рис. 8C, D)31. Меченые GFAP реактивные астроциты, которые могут быть связаны с воспалением и неврологическими повреждениями, были увеличены в пириформной коре и внешней капсуле у щенков E. coli (рис. 8E,F)31,36,37. Окрашивание по Нисслю позволяет оценить грубые морфологические изменения структуры мозга; Крезиловый фиолетовый является стандартным гистологическим окрашивателем для нейронов и помечает как экстра ядерные гранулы РНК, так и ядра клеток. В группе кишечной палочки мы наблюдаем уменьшение толщины коры головного мозга (рис. 9)31. Аналогичным образом, H&E, которые соответственно окрашивают ядро и цитоплазму клеток, позволяют оценить морфологию легких (рис. 4)31. Мы наблюдаем увеличение воздушного пространства у мышей, подвергшихся воздействию E. coli, а также увеличение количества нейтрофилов Ly6G+, что указывает на воспаление (рис. 7)31.

Для анализа данных время до доставки анализировалось с помощью непарного t-критерия, если данные были нормально распределены. Для процентных данных для живорожденных щенков сначала потребовалось преобразование квадратного корня из арксинуса, чтобы преобразовать пропорциональное распределение (ограниченное диапазоном от 0 до 1) в нормальное распределение, что является одним из требований для выполнения t-критерия. Выживаемость детенышей анализировалась с помощью теста Log-rank (Mantel-Cox). Для гистологии и иммуногистохимии использовали либо U-критерий Манна-Уитни, либо множественные t-тесты с коррекцией Уэлша, в зависимости от типа данных и того, были ли они распределены нормально. Для получения достаточной статистической мощности мы рекомендуем использовать не менее пяти плотин на одну группу обработки.

figure-results-1
Рисунок 1: Интравагинальное введение Escherichia coli и график лечения для индуцирования преждевременных родов и неонатальной заболеваемости у мышей. (A) E. coli [1], за которой следует 20% плуроновый гель F127 [2], вводят во влагалище мыши с помощью стерильного наконечника пипетки объемом 200 мкл. В интроитус добавляют порошок хинина [3]. (B) E. coli вводится во влагалище на 16,5-й день эмбриона. Ткани, такие как легкие и мозг, могут быть собраны во время внутриутробного или неонатального периода. Сокращение: EN = эмбриональный день N; PN = послеродовой день N; PBS = фосфатно-солевой буфер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Области мозга, оцененные на предмет невропатологии. Пример окрашивания по Нисслю мозга новорожденного щенка и области, которые можно было бы оценить на невропатологию. Все области мозга могут быть оценены на TUNEL, IBA-1 и GFAP. Мы решили оценить морфологию коры головного мозга и гиппокампа с помощью метода Ниссля. Увеличение: 1x. Масштабная линейка = 1,5 мм. Сокращения: TUNEL = терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза dUTP nick end labeling; IBA-1 = воспалительный фактор аллотрансплантата 1; GFAP = глиальный фибриллярный кислый белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Положительная оценка индекса окрашивания IBA-1 и разветвления. Чтобы количественно оценить индекс разветвления клеток IBA-1+ , подсчитайте количество тел клеток в пределах сетки и среднее число ветвей, пересекающих горизонтальные и вертикальные линии сетки. Сокращение: IBA-1 = воспалительный фактор аллотрансплантата 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Измерения воздушного пространства в легких детенышей (окрашивание H&E). (A) Очертите воздушное пространство и измерьте с помощью инструмента «От руки» в ImageJ. (B) Средняя площадь воздушного пространства увеличивается у детенышей, подвергшихся воздействию E. coli, по сравнению с PBS. (C) Репрезентативные изображения H&E легких щенков, подвергшихся воздействию PBS и E. coli в утробе матери. Увеличение: 40x. Масштабная линейка = 59,5 мкм. Сокращения: H = гематоксилин; Е = эозин. n = 2 из 4 пометов. *p < 0,05. Этот рисунок был адаптирован из Boyle et al.31. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Влияние интравагинальной кишечной палочки на время родов и выживаемость детенышей. (A) Время до родов сокращается в присутствии E. coli. (B) Процент детенышей, рожденных живыми, значительно снижается и (C) выживаемость детенышей снижается у щенков, подвергшихся воздействию E. coli. Время до сдачи: n = 8-10 пометов в группе; живорожденные щенки: n = 10-17 пометов в группе; Выживаемость детенышей: N = 10-12 пометов в группе. *p < 0,05, ***p < 0,001. Этот рисунок был адаптирован из Boyle et al.31. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-6
Рисунок 6: Биолюминесцентная визуализация для мониторинга распространения кишечной палочки . (A) Биолюминесцентная E. coli поднимается из влагалища в рога матки в течение 48 ч. (B) Рассеченные рога матки обнаруживают инфекцию E. coli в течение 18 ч, (C) так же как плацента и плодные оболочки. Этот рисунок был адаптирован из Suff et al.25 и Boyle et al.31. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-7
Рисунок 7: Окрашивание Ly6G на нейтрофилы в легких плода. (A) Окрашивание на Ly6G (положительный: стрелки) для оценки притока нейтрофилов у плодов, подвергшихся воздействию PBS и E. coli . (B) Среднее количество клеток Ly6G+ значительно увеличено у плодов E. coli . Увеличение: 40x. Масштабная линейка = 59,5 мкм. n = 10 из 5 литров на группу. *p < 0,05. Сокращения: Ly6G = Лимфоцитарный антиген 6 сложный локус G6D. Этот рисунок был адаптирован из Boyle et al.31. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-8
Рисунок 8: Примеры окрашивания TUNEL, IBA1 и GFAP. (A) Окрашивание TUNEL на предмет гибели клеток в постнатальном мозге щенка, подвергшегося воздействию PBS или E. coli. (B) Среднее количество клеток TUNEL+ увеличивается в коре головного мозга, пириформной коре, наружной капсуле, гиппокампе и таламусе. (C) Иммуногистохимия IBA1 для микроглии в группах PBS и E. coli . (D) Индекс разветвления, как мера активации микроглии, увеличивается в наружной капсуле и стриатуме у детенышей E. coli . (E) Окрашивание GFAP для астроцитов, (F) которое увеличивается в пириформной коре и наружной капсуле у детенышей E. coli . Масштабная линейка = 59,5 мкм. Сокращения: GFAP = глиальный фибриллярный кислый белок; TUNEL = терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза dUTP nick для мечения; Pyr = Пириформная кора; EC = внешняя капсула; Str = стриатум; Бедро = гиппокамп; тал = таламус; всего = все регионы; CA = рог аммония; OLV = значения оптической светимости. Иммуногистохимические анализы: n = 5-7 из 5 пометов в группе. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, н.с. - незначимые. Этот рисунок был адаптирован из Boyle et al.31. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-9
Рисунок 9: Пример положительного и отрицательного окрашивания по Нисслю и оценки морфологии. (A) Окрашивание по Нисслю постнатального мозга щенка для оценки структуры и морфологии тканей. (В) Не оказывает влияния на ширину мозга, но (В) толщина коры головного мозга уменьшается у щенков, подвергшихся воздействию кишечной палочки. (D) Нет разницы в объеме гиппокампа. Увеличение: 1x. Масштабная линейка = 1,5 мм. n = 5-7 из 5 пометов в группе. **p < 0,01. Этот рисунок был адаптирован из Boyle et al.31. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Первичное антителоРазбавлениеВторичное антитело/разведениеРазбавление
Кролик анти-GFAP1:6000Козий антикролик1:100
Кролик анти-IBA11:1000Козье противокрысиное средство1:100
Мышь anti-Ly6G1:1000Козий антикролик1:100

Таблица 1: Антитела для иммуногистохимии.

ШагРеагентВремя (мин)
1Морилка NISSL10
2Пресная дистиллированная вода2
3Пресная дистиллированная вода2
470% EtOH2
590% EtOH2
696% этиленоксида2
796% EtOH с 3-5 каплями ледяной уксусной кислоты2-5 (ПРОВЕРЯЙТЕ ПОСТОЯННО)
8100% EtOH2
9Изопропанол2
10Ксилол2
11Ксилол2
12Ксилол2

Таблица 2: Процедура Ниссля.

Обсуждение

В данной работе мы описываем индукцию новой мышиной модели преждевременных родов и неонатальной заболеваемости посредством бактериального вагинального восхождения. Мы выбрали E. coli K1, так как она является частой причиной неонатального сепсиса и менингита и передается вертикально от матери к плоду 38,39,40. Ключом к успеху этой модели является использование термочувствительного геля Pluronic, который предотвращает утечку бактериальной суспензии из влагалища, позволяя инфекции утвердиться и подняться в матку. Поскольку в этой модели используются живые бактерии, полученные из изолята септицемии, крайне важно внимательно следить за плотинами27. Если животные отказываются двигаться или есть или не заботятся о своих детенышах (например, пренебрегают гнездованием и кормлением), их необходимо немедленно гуманно принести в жертву.

В большинстве случаев симптомы, связанные с инфекцией, исчезают в течение 24 ч после родов. Также важно знать, что различные серотипы E. coli и других штаммов бактерий будут по-разному влиять на продолжительность беременности, степень инфекции/воспаления и неонатальный исход. Мы предлагаем проводить эксперименты с предварительными дозами с различными КОЕ при использовании новых бактериальных серотипов/штаммов, чтобы определить минимальную концентрацию, необходимую для желаемого фенотипа, и установить строгие гуманные конечные точки для предотвращения страданий. Следует проявлять крайнюю осторожность при доставке живого патогена; Позвольте литературе служить руководством по надлежащему использованию этих организмов при моделировании восходящей инфекции.

Штамм мышей также важен, так как их иммунная система отличается. Например, время и КОЕ, используемые в этой модели, не имеют одинаковых результатов при выполнении на мышах C57BL/6. Мы решили использовать мышей C57BL/6 Tyrc-2J , поскольку эксперименты показали значительно большее количество инфекций у этого штамма по сравнению с CD-1, BALB/c и C57BL/6. Кроме того, есть данные о том, что черный мех гасит биолюминесцентные сигналы, что является полезным измеримым результатом в этой модели29. Оптимальный суточный день беременности для введения бактерий также может отличаться в зависимости от патогена и штамма мыши. Существует огромная гетерогенность в доклинических моделях ПТБ; Следовательно, важно учитывать эти переменные для получения воспроизводимых результатов17.

Еще одним фактором является продолжительность времени, в течение которого животные подвергаются воздействию анестезии. Поскольку чрезмерное воздействие во время беременности связано с нейротоксичностью у щенков, важно свести время пребывания под анестезией к минимуму (например, максимум 5 минут) и всегда включать контроль, подвергающийся воздействию одной и той же среды и обработанный носителем вещества 41,42,43. Дополнительные контрольные группы, полезные для этой модели, включают нелеченную интравагинальную доставку только плуронового геля и только анестезию.

Иммуногистохимия широко используется в качестве экспериментального инструмента для идентификации различных белков и клеток, а также может быть использована для характеристики структуры и связей в мозге. В этой статье мы описываем, как анализировать ключевые клетки центральной нервной системы, которые связаны с нейровоспалением и неврологическими травмами. Мы также представляем методы оценки клеточного апоптоза и гистологических окрасок, которые полезны для измерения морфологии мозга и легких. Важные соображения для обеспечения успеха этих протоколов начинаются с осторожного использования ручки PAP; если PAP-ручка будет касаться ткани, окрашивание не удастся, но если параметр будет слишком широким, участки могут высохнуть за ночь. Точно так же влажностная камера должна содержаться во влажной среде, чтобы избежать пересыхания секций.

При выполнении окрашивания по Нисслю наиболее критичной является стадия ледяной уксусной кислоты; Разделы нужно постоянно проверять. Когда основные структуры мозга становятся видимыми, эти участки необходимо немедленно переместить в EtOH, чтобы остановить реакцию. Мы решили оценить кору головного мозга и гиппокамп, так как сообщалось об уменьшении толщины коры головного мозга и уменьшении объема гиппокампа у недоношенных новорожденных человека и других животных моделей, но морфологические изменения можно было оценить и в других областях 44,45,46,47. Пристальное внимание также следует уделить разработке окрашивания DAB. Это должно быть рассчитано по времени и поддерживаться постоянно между экспериментами.

Анализ данных является наиболее распространенным ограничением иммуногистохимии из-за сложности количественной оценки результатов, которые часто считаются субъективными. Несмотря на то, что анализ GFAP выполняется с использованием компьютерных оптических измерений светимости, непоследовательное окрашивание может повлиять на эти измерения. Кроме того, оценка морфологии мозга и легких включает в себя ручные измерения, основанные на суждениях наблюдателя. Чтобы избежать несоответствия, мы повторяем эти оценки дважды и за короткий промежуток времени. Чтобы еще больше уменьшить любую систематическую ошибку, важно, чтобы оценщик был слеп к группам лечения. Низкая иммунореактивность также может быть ограничивающим фактором. Отсутствие сигнала может свидетельствовать об отсутствии интересующего антигена или о том, что это может быть связано со сбоем протокола. Чтобы решить эту проблему, мы включаем образец ткани, который может действовать как положительный контроль, где это возможно, и повторяем процедуру окрашивания, когда наблюдаем слабый или отсутствующий сигнал, чтобы убедиться, что это не было результатом экспериментальной ошибки.

В дополнение к описанным протоколам могут быть выполнены иммунологические анализы тканей матери, плода и новорожденного с помощью количественной ПЦР и ИФА. Мы наблюдали повышенный уровень воспалительной мРНК и белка у животных, подвергшихся воздействию инфекции 25,31,48. Мы предполагаем, что неонатальная невропатология, которую мы демонстрируем гистологически, может быть результатом воспаления мозга, легких и кишечника плода25,31. Другие невропатологические оценки, которые мы проводили, включают основной белок миелина (MBP) для исследования миелинизации и NeuN для окрашивания ядер нейронов 25,31. В дополнение к этому, можно оценить другие маркеры нейтрофилов и микроглии, чтобы лучше понять фенотип и поведение этих клеток после контакта с инфекцией в утробематери 49,50. Кроме того, могут быть проведены поведенческие тесты для определения долгосрочного воздействия на потомство.

Эта модель не лишена ограничений. Например, мы видим различия в патологии как между пометами, так и внутри них. Это может быть результатом использования живой бактерии там, где распространение инфекции невозможно контролировать. Следовательно, характер и охват восходящей инфекции в рога матки варьируются и часто асимметричны. Еще одним ограничением является патогенность кишечной палочки, которая иногда может привести к тому, что самки становятся слишком нездоровыми, чтобы заботиться о своих детенышах. Мыши также не являются лучшей моделью повреждения легких, поскольку альвеологенез происходит постнатально, а не пренатально, как у человека51. Мы не смогли накачать легочные ткани во время сбора образцов, что могло повлиять на наши результаты. Тем не менее, наши результаты согласуются с изменениями, наблюдаемыми на животных моделях БЛД у новорожденных52,53.

Эта модель повторяет постулированное состояние человека, при котором бактериальная инфекция поднимается из влагалища в матку, стимулируя ранние роды. После нашей первоначальной публикации этой модели другие компании воспроизвели или создали аналогичные модели, что еще больше подчеркивает воспроизводимость и актуальность данной методологии19,54. Важно отметить, что эта модель демонстрирует общие показатели заболеваемости, с которыми сталкиваются недоношенные новорожденные, в то время как другие модели потерпели неудачу. Это может быть связано с использованием бактериального штамма, который специфически связан с неонатальным сепсисом. ЛПС, который чаще всего используется для индукции преждевременных родов на животных моделях, является смертельным для щенков, поэтому неонатальные исходы не могут быть измерены18. Другие модели восходящей инфекции также испытывали трудности с получением выживших детенышей или демонстрацией неонатальной заболеваемости 19,20,21,22,23,24,55,56. Клинически значимые животные модели, подобные описанной нами, имеют основополагающее значение для понимания патофизиологии преждевременных родов и для разработки инновационных вмешательств, которые улучшат неонатальные исходы.

Раскрытие информации

Авторы не раскрывают соответствующую информацию.

Благодарности

Кишечная палочка K1 A192PP-luxABCDE был любезно подарен профессором Питером Тейлором из Университетского колледжа Лондона. Рисунок 1 и рисунок 3 были созданы в BioRender.com году. Это исследование было поддержано стипендией Wellcome Clinical Research Career Development Fellowship 222970/Z/21/Z (N.S.), Action Medical Research and Borne grant GN2647 (N.S., S.N.W., and D.P.); и грант «Благополучие женщин» RG2365 (A.K.B., N.S., M.H., S.N.W. и D.P.).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Анти-GFAP, кроликAgilent TechnologiesZ033429-2
Анти-IBA1, rabbit Вако019-19741
Anti-Ly6G, мышьBioLegend127601
AVT-Horn 184 3CCD камераSony
Биотин-16-DUTPMerck11093070910
Прямоугольные покрытия из боросиликатного стеклаFisherScientific12363128
Ацетат Кресил ФиолетThermoFisher Scientific405760100
Cryostat CM1900Leica
Стеклянный кювет  MerckBR472700
Диаминобензидин (DAB)Generon40480004-3
Диспартирующие щипцы, нержавеющая сталь, 10 см, зубчатая, изогнутаяWorld Precision Instruments Ltd15915
Рассекивающие щипцы, нержавеющая сталь, 10 см, зубчатая, прямаяWorld Precision Instruments Ltd15914
Ножницы для вскрытия, длиной 10 см, прямыеWorld Precision Instruments Ltd14393
DPX Merck100579
ЭозинСигма-ОлдричHT110116
Формальдегидный раствор с буфером 4%Merck100496
Антитела IgG против коз (H+L), биотинилированноеVector LaboratoriesBP-9100-50
Антитела IgG против крыс у коз (H+L), биотинилированноеVector LaboratoriesBA-9400-1.5
GraphPad Prism v.8 Программное обеспечение GraphPad
H2O2Сигма-Олдрич7722-84-1
ГематоксилинСигма-ОлдричMHS16
ImageJНациональные институты здравоохранения
Изофлуран (IsoFlo)Зоетис50019100
IVIS Lumina II In Vivo Imaging System/Программное обеспечение для живых изображенийПеркин Элмер/Реввити
МикрослайдыVWRISO8037/I
Optimas 6.51 Медиа Кибернетика Инк.
ПараформальдегидСигма-Олдрич158127
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) Thermo Fisher Scientific (Life Technologies)14190094
Pluronic F-127 Сигма-ОлдричP2443
ХининНаучные лабораторные материалыQ0132
Гидрофобный барьерный пап-пен ReadyProbesThermo Fisher Scientific R3777
Гидроксид натрияHoneywellS8045
Монобазовый натрий-фосфат безводныйFisherScientificBP329-1
СахарозаMerckS9378
Терминальная трансфераза  Merck3333574001
VECTASTAIN ABC-HRP Kit, пероксидазаVector LaboratoriesPK-4000
Ксилены (гистологический класс) Сигма-Олдрич534056

Ссылки

  1. WHO. WHO: recommended definitions, terminology and format for statistical tables related to the perinatal period and use of a new certificate for cause of perinatal deaths. Modifications recommended by FIGO as amended October 14, 1976. Acta Obstet Gynecol Scand. 56 (3), 247-253 (1977).
  2. Liu, L., et al. Global, regional, and national causes of under-5 mortality in 2000–15: an updated systematic analysis with implications for the sustainable development goals. Lancet. 388 (10063), 3027-3035 (2016).
  3. Chawanpaiboon, S., et al. regional, and national estimates of levels of preterm birth in 2014: a systematic review and modelling analysis. Lancet Glob Health. 7 (1), e37-e46 (2019).
  4. Unicef. Levels and trends in child mortality report 2017. , Unicef. (2017).
  5. Blencowe, H., et al. National, regional, and worldwide estimates of preterm birth rates in the year 2010 with time trends since 1990 for selected countries: a systematic analysis and implications. Lancet. 379 (9832), 2162-2172 (2012).
  6. Jung, E., et al. The fetal inflammatory response syndrome: the origins of a concept, pathophysiology, diagnosis, and obstetrical implications. Semin Fetal Neonatal Med. 25 (4), 101146(2020).
  7. Humberg, A., et al. Preterm birth and sustained inflammation: consequences for the neonate. Semin Immunopathol. 42 (4), 451-468 (2020).
  8. Boyle, A. K., Rinaldi, S. F., Norman, J. E., Stock, S. J. Preterm birth: inflammation, fetal injury and treatment strategies. J Reprod Immunol. 119, 62-66 (2017).
  9. Romero, R., Dey, S. K., Fisher, S. J. Preterm labor: one syndrome, many causes. Science. 345 (6198), 760-765 (2014).
  10. Goldenberg, R. L., Culhane, J. F., Iams, J. D., Romero, R. Epidemiology and causes of preterm birth. Lancet. 371 (9606), 75-84 (2008).
  11. Jones, H. E., et al. Differing prevalence and diversity of bacterial species in fetal membranes from very preterm and term labor. PLoS One. 4 (12), e8205(2009).
  12. Cobo, T., et al. Characterization of vaginal microbiota in women with preterm labor with intra-amniotic inflammation. Sci Rep. 9 (1), 18963(2019).
  13. Romero, R., et al. Microbial invasion of the amniotic cavity in patients with suspected cervical incompetence: prevalence and clinical significance. Am J Obstet Gynecol. 167 (4 Pt 1), 1086-1091 (1992).
  14. Mendz, G. L., Kaakoush, N. O., Quinlivan, J. A. Bacterial aetiological agents of intra-amniotic infections and preterm birth in pregnant women. Front Cell Infect Microbiol. 3, 58(2013).
  15. DiGiulio, D. B., et al. Prevalence and diversity of microbes in the amniotic fluid, the fetal inflammatory response, and pregnancy outcome in women with preterm pre-labor rupture of membranes. Am J Reprod Immunol. 64 (1), 38-57 (2010).
  16. DiGiulio, D. B. Diversity of microbes in amniotic fluid. Semin Fetal Neonatal Med. 17 (1), 2-11 (2012).
  17. Miller, F. A., Sacco, A., David, A. L., Boyle, A. K. Interventions for infection and inflammation-induced preterm birth: a preclinical systematic review. Reprod Sci. , (2022).
  18. Migale, R., et al. Specific lipopolysaccharide serotypes induce differential maternal and neonatal inflammatory responses in a murine model of preterm labor. Am J Pathol. 185 (9), 2390-2401 (2015).
  19. Spencer, N. R., et al. Development of a mouse model of ascending infection and preterm birth. PLoS One. 16 (12), e0260370(2021).
  20. Pavlidis, I., et al. Cervical epithelial damage promotes Ureaplasma parvum ascending infection, intrauterine inflammation and preterm birth induction in mice. Nat Commun. 11 (1), 199(2020).
  21. Vornhagen, J., et al. Group B streptococcus exploits vaginal epithelial exfoliation for ascending infection. J Clin Invest. 128 (5), 1985-1999 (2018).
  22. Bernardini, R., et al. Neonatal protection and preterm birth reduction following maternal group B streptococcus vaccination in a mouse model. J Matern Fetal Neonatal Med. 30 (23), 2844-2850 (2017).
  23. Tantengco, O. A. G., et al. Modeling ascending Ureaplasma parvum infection through the female reproductive tract using vagina-cervix-decidua-organ-on-a-chip and feto-maternal interface-organ-on-a-chip. Faseb J. 36 (10), e22551(2022).
  24. Randis, T. M., et al. Group B streptococcus β-hemolysin/cytolysin breaches maternal-fetal barriers to cause preterm birth and intrauterine fetal demise in vivo. J Infect Dis. 210 (2), 265-273 (2014).
  25. Suff, N., et al. Ascending vaginal infection using bioluminescent bacteria evokes intrauterine inflammation, preterm birth, and neonatal brain injury in pregnant mice. Am J Pathol. 188 (10), 2164-2176 (2018).
  26. Mushtaq, N., Redpath, M. B., Luzio, J. P., Taylor, P. W. Treatment of experimental Escherichia coli infection with recombinant bacteriophage-derived capsule depolymerase. J Antimicrob Chemother. 56 (1), 160-165 (2005).
  27. Achtman, M., et al. Six widespread bacterial clones among Escherichia coli K1 isolates. Infect Immun. 39 (1), 315-335 (1983).
  28. Winson, M. K., et al. Engineering the luxCDABE genes from Photorhabdus luminescens to provide a bioluminescent reporter for constitutive and promoter probe plasmids and mini-Tn5 constructs. FEMS Microbiol Lett. 163 (2), 193-202 (1998).
  29. Suff, N. The use of cervical gene therapy for the prevention of infection-related preterm birth [Ph. D. Thesis]. , University College London. (2017).
  30. Boyle, A. K., Rinaldi, S. F., Rossi, A. G., Saunders, P. T. K., Norman, J. E. Repurposing simvastatin as a therapy for preterm labor: evidence from preclinical models. Faseb J. 33 (2), 2743-2758 (2019).
  31. Boyle, A. K., et al. Ascending vaginal infection in mice induces preterm birth and neonatal morbidity. Am J Pathol. 195 (5), 891-906 (2025).
  32. Kendall, G. S., Robertson, N. J., Iwata, O., Peebles, D., Raivich, G. N-methyl-isobutyl-amiloride ameliorates brain injury when commenced before hypoxia ischemia in neonatal mice. Pediatr Res. 59 (2), 227-231 (2006).
  33. Rocha-Ferreira, E., et al. Curcumin: novel treatment in neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Front Physiol. 10, 1351(2019).
  34. Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. Detection of apoptosis by TUNEL assay. Methods Mol Biol. 887, 41-47 (2012).
  35. Lier, J., Streit, W. J., Bechmann, I. Beyond activation: characterizing microglial functional phenotypes. Cells. 10 (9), (2021).
  36. Schmidt-Kastner, R., Wietasch, K., Weigel, H., Eysel, U. T. Immunohistochemical staining for glial fibrillary acidic protein (GFAP) after deafferentation or ischemic infarction in rat visual system: features of reactive and damaged astrocytes. Int J Dev Neurosci. 11 (2), 157-174 (1993).
  37. Pekny, M., Pekna, M. Astrocyte reactivity and reactive astrogliosis: costs and benefits. Physiol Rev. 94 (4), 1077-1098 (2014).
  38. Witcomb, L. A., Collins, J. W., McCarthy, A. J., Frankel, G., Taylor, P. W. Bioluminescent imaging reveals novel patterns of colonization and invasion in systemic Escherichia coli K1 experimental infection in the neonatal rat. Infect Immun. 83 (12), 4528-4540 (2015).
  39. Obata-Yasuoka, M., Ba-Thein, W., Tsukamoto, T., Yoshikawa, H., Hayashi, H. Vaginal Escherichia coli share common virulence factor profiles, serotypes and phylogeny with other extraintestinal E. coli. Microbiology (Reading). 148 (Pt 9), 2745-2752 (2002).
  40. Bonacorsi, S., Bingen, E. Molecular epidemiology of Escherichia coli causing neonatal meningitis. Int J Med Microbiol. 295 (6-7), 373-381 (2005).
  41. Hartling, L., Liang, Y., Lacaze-Masmonteil, T. Chorioamnionitis as a risk factor for bronchopulmonary dysplasia: a systematic review and meta-analysis. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. 97 (1), F8-F17 (2012).
  42. Liang, G., et al. Isoflurane causes greater neurodegeneration than an equivalent exposure of sevoflurane in the developing brain of neonatal mice. Anesthesiology. 112 (6), 1325-1334 (2010).
  43. Yang, B., et al. Comparison of neurodegeneration and cognitive impairment in neonatal mice exposed to propofol or isoflurane. PLoS One. 9 (6), e99171(2014).
  44. Schmitz-Koep, B., et al. Decreased cortical thickness mediates the relationship between premature birth and cognitive performance in adulthood. Hum Brain Mapp. 41 (17), 4952-4963 (2020).
  45. Nagy, Z., Lagercrantz, H., Hutton, C. Effects of preterm birth on cortical thickness measured in adolescence. Cereb Cortex. 21 (2), 300-306 (2011).
  46. Dimitrova, R., et al. Preterm birth alters the development of cortical microstructure and morphology at term-equivalent age. Neuroimage. 243, 118488(2021).
  47. Dada, T., et al. Mouse model of intrauterine inflammation: sex-specific differences in long-term neurologic and immune sequelae. Brain Behav Immun. 38, 142-150 (2014).
  48. Suff, N., et al. Cervical gene delivery of the antimicrobial peptide, human beta-defensin (HBD)-3, in a mouse model of ascending infection-related preterm birth. Front Immunol. 11, 106(2020).
  49. McKenna, E., et al. Neutrophils: need for standardized nomenclature. Front Immunol. 12, 602963(2021).
  50. Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes. Front Cell Neurosci. 14, 198(2020).
  51. Jackson, C. M., et al. Pulmonary consequences of prenatal inflammatory exposures: clinical perspective and review of basic immunological mechanisms. Front Immunol. 11, 1285(2020).
  52. Durrani-Kolarik, S., et al. miR-29b supplementation decreases expression of matrix proteins and improves alveolarization in mice exposed to maternal inflammation and neonatal hyperoxia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 313 (2), L339-L349 (2017).
  53. Nguyen, L., et al. Sex-differences in LPS-induced neonatal lung injury. Sci Rep. 9 (1), 8514(2019).
  54. Zhang, Y., Edwards, S. A., House, M. Cerclage prevents ascending intrauterine infection in pregnant mice. Am J Obstet Gynecol. , (2023).
  55. Kammala, A. K., et al. Extracellular vesicles-mediated recombinant IL-10 protects against ascending infection-associated preterm birth by reducing fetal inflammatory response. Front Immunol. 14, 1196453(2023).
  56. Tantengco, O. A. G., et al. Inflammatory response elicited by Ureaplasma parvum colonization in human cervical epithelial, stromal, and immune cells. Reproduction. 163 (1), 1-10 (2021).

Перепечатки и разрешения

Теги

Escherichia coli
Моделирование восходящей вагинальной инфекции, преждевременных родов и неонатальной заболеваемости у мышей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.