Методическая статья

Оптимизированная и стандартизированная процедура получения высококачественных аденоассоциированных вирусных векторов с высоким титром с использованием платформы клеточной фабрики

DOI:

10.3791/66741

⸱

3 мая 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Pediatric Surgery, Department of Surgery, Children's Hospital of Pittsburgh, University of Pittsburgh School of Medicine, 2North Allegheny High School, 3Wright State University Boonshoft School of Medicine, 4College of Engineering, University of Michigan

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

По мере того, как область генной терапии продолжает развиваться, растет потребность в инновационных методах, которые могут решить эти проблемы. Здесь представлен уникальный метод, который оптимизирует процесс генерации высокопроизводительных и высокочистых векторов AAV с использованием платформы фабрики ячеек, отвечающей стандартам качества для исследований in vivo .

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Доклинические исследования в области генной терапии, особенно на грызунах и крупных животных, требуют производства векторов AAV с высоким выходом и чистотой. Традиционные подходы в исследовательских лабораториях часто предполагают широкое использование тарелок для клеточных культур для культивирования HEK293T клеток, что может быть как трудоемким, так и проблематичным процессом. Здесь представлен уникальный собственный метод, который упрощает этот процесс с помощью конкретной платформы фабрики ячеек (или ячеек-стеков, CF10). Интеграция двухфазного разделения полиэтиленгликоля/водного раствора с йодиксаноловым градиентным ультрацентрифугированием улучшает как выход, так и чистоту генерируемых векторов AAV. Чистота векторов AAV проверяется с помощью SDS-PAGE и окрашивания серебром, а соотношение полных и пустых частиц определяется с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Этот подход предлагает эффективную платформу клеточной фабрики для производства векторов AAV с высоким выходом в сочетании с улучшенным методом очистки для удовлетворения требований к качеству исследований in vivo .

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Векторы аденоассоциированных вирусов (AAV) стали незаменимым инструментом в исследованиях в области генной терапии, предлагая уникальное сочетание эффективности и безопасности для доставки генов. Традиционные методы получения AAV в лабораторных условиях сыграли ключевую роль в углублении нашего понимания и применения геннойтерапии2. Тем не менее, эти методы, хотя и являются основополагающими, демонстрируют определенные ограничения и проблемы, особенно с точки зрения выхода, эффективности времени и качества получаемых векторов, в частности, соотношения полных и пустыхчастиц3.

Традиционная процедура производства AAV в первую очередь включает трансфекциюклеток HEK2934. Этот процесс, обычно проводимый в чашках для клеточных культур, требует, чтобы клетки были трансфицированы плазмидой, содержащей интересующий ген, вместе с хелперной плазмидой и капсидной плазмидойAAV 5,6. После трансфекции клетки производят частицы AAV, которые затем собираются и очищаются 5,6. Процесс очистки часто включает в себя ультрацентрифугирование, что является критическим этапом в получении векторов AAV высокой чистоты7. Ультрацентрифугирование, в частности, с использованием хлорида цезия (CsCl) или градиента йодиксанола, является стандартным методом отделения частиц AAV от клеточного мусора и других примесей8. Этот шаг имеет решающее значение для достижения желаемой чистоты и концентрации векторов AAV, что напрямую влияет на их эффективность в доставке генов8. Несмотря на широкое распространение, традиционное ультрацентрифугирование имеет свои недостатки. Например, выход векторов AAV из этого метода может быть вариабельным и часто низким, что создает значительные проблемы, когда требуются большие количества векторов с высоким титром, особенно для исследований in vivo или моделей крупных животных9.

Еще одним важным аспектом качества вектора AAV является соотношение полных и пустых частиц10. Препараты AAV часто содержат смесь этих частиц; Однако только полные частицы содержат терапевтический генетический материал. Наличие высокой доли пустых частиц может значительно снизить эффективность доставкигенов10. Таким образом, оценка и оптимизация соотношения полных и пустых частиц является ключевым параметром при оценке эффективности векторов AAV. Традиционные методы, хотя и способны производить векторы AAV, часто испытывают трудности с последовательным контролем этого соотношения, что приводит к вариациям активности вектора10.

Здесь представлен уникальный метод, который оптимизирует процесс получения высокопродуктивных и высокочистых векторов AAV с использованием платформы клеточной фабрики, свободной от использования трудоемких HEK293T клеточных культур в клеточных чашках, интегрируя двухфазное разделение полиэтиленгликоля/водного воды с градиентным ультрацентрифугированием йодиксанола. Чистота вектора AAV подтверждается с помощью SDS-PAGE и окрашивания серебром, а соотношение полных и пустых частиц определяется с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), что соответствует стандартам качества исследований in vivo 11.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Подробная информация о реагентах, плазмидах и оборудовании, использованных в исследовании, приведена в таблице материалов. Состав используемых буферов приведен в Дополнительном файле 1.

1. Плазмидный препарат

  1. Трансформация плазмид (pAAV-GOI, pHelper, pAAV-Cap) в кишечной палочке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Любой штамм E.coli может быть использован для амплификации плазмид. Для некоторых плазмид специальные компетентные клетки, такие как NEB stable, могут улучшить выход плазмид. В этом протоколе используются три плазмиды: pAAV-GOI: pAAV-CMV-GFP, pHelper: pAdDeltaF6 и pAAV-Cap: pAAV-RC6.
  2. Выращивайте бактерии в средах LB, содержащих соответствующие селективные антибиотики, в оптимальном объеме при 37 °C в течение 16-18 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании стабильных клеток NEB культивируйте при 30 °C в течение 18-20 часов.
  3. Соберите плазмидную ДНК путем центрифугирования кишечной палочки. питательная среда при 4000 x g, 4 °C, в течение 15 мин.
  4. Осторожно перелейте надосадочную жидкость из бутылки центрифуги в контейнер для отходов и очистите плазмидную ДНК из гранулы с помощью набора для очистки плазмид без эндотоксинов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вы наливаете его медленно и избегайте разбрызгивания.
  5. Измерьте концентрацию и чистоту ДНК с помощью спектрофотометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте чистоту ДНК, проверив соотношение OD260/OD 280 . Соотношение для чистой ДНК составляет около 1,8. Концентрация ДНК должна быть выше 1 г/л для более поздней стадии котрансфекции. Сделайте запасы бактериального глицерина, добавив 500 мкл ночной культуры к 500 мкл 50% глицерина в криовиале и храните при -80 °C.

2. Подготовка HEK293T клеток

  1. Засейте HEK293T клетки с помощью среды с высоким содержанием глюкозы DMEM, содержащей 10% FBS, в 10-слойную клеточную фабрику (CF10) и дайте клеткам вырасти в инкубаторе в течение ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проходы ячеек 293T должны быть меньше 10, чтобы обеспечить оптимальные условия для надежного производства AAV. По возможности не добавляйте антибиотики в питательные среды в это время. CF10 имеет примерно в 42 раза большую площадь поверхности роста по сравнению с 150-миллиметровой чашкой для клеточных культур. Засейте клетки той же плотности в чашке для клеточных культур диаметром 150 мм, чтобы можно было проверить рост клеток под микроскопом. Приготовьте 1075 мл клеточной суспензии, добавьте 25 мл клеточной суспензии в чашку диаметром 150 мм, а оставшуюся часть добавьте в CF10.
  2. Проверьте слияние клеток на следующий день перед трансфекцией.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны достичь 80%-90% конфлюенции во время трансфекции при наблюдении под микроскопом.

3. Трехкратная трансфекция плазмид AAV

  1. Рассчитайте необходимое количество каждой плазмиды (pAAV-GOI, pHelper, pAAV-серотип), чтобы иметь молярное соотношение 1,2:1:1 с 2,5-5 мг общей ДНК на CF10.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Молярное соотношение трех плазмид может варьироваться для оптимальной эффективности трансфекции. Лучше протестировать его в небольших условиях, прежде чем переходить к этой настройке CF10. В качестве примера для создания вируса AAV6-CMV-GFP используются pAAV-CMV-GFP, pAdDeltaF6 и pAAV-RC6. Формула калькулятора PEI приведена в таблице 1.
  2. Добавьте 350 мл OptiMEM в стерильный флакон объемом 500 мл.
  3. Добавьте все три плазмидные ДНК во флакон с Opti-MEM. Хорошо перемешайте.
  4. Добавьте 15 мл раствора полиэтиленимина (ПЭИ) 1 мг/мл (соотношение 1:3 мкг ДНК к мкг ПЭИ). Энергично встряхивайте смесь OptiMEM/ДНК/PEI вверх и вниз в течение 30 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Делать пузыри - это нормально.
  5. Выдержать смесь при комнатной температуре в течение 10-15 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более длительная инкубация может снизить эффективность трансфекции.
  6. Добавьте раствор OptiMEM/DNA/PEI во флакон объемом 1 л, содержащий 700 мл DMEM с низким содержанием глюкозы с 10 мМ HEPES и 2% FBS. Хорошо перемешайте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании низкий уровень глюкозы в DMEM показал лучшую продукцию вектора AAV после ко-трансфекции. Добавление HEPES помогает поддерживать клетки в лучшем состоянии. Перемешивайте, медленно вращая бутылку. Избегайте создания слишком большого количества пузырей.
  7. Извлеките CF10 из инкубатора и высосьте среду в контейнер для отходов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Положите CF10 на поверхность внутри вытяжки и постепенно поднимайте одну сторону вверх, медленно пылесосьте среду, не отсоединяя элементы.
  8. Осторожно добавьте трансфектантную смесь в CF10. Убедитесь, что все десять слоев покрыты средой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте 25 мл трансфектирующей смеси в чашку диаметром 150 мм. Следите за клетками ежедневно до сбора урожая. Добавьте оставшуюся трансфективную смесь в CF10, медленно выливая. Вращайте CF10 очень осторожно и обеспечьте одинаковый объем для каждого слоя.
  9. Верните CF10 в инкубатор на 72-96 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте 150-миллиметровую мониторную тарелку, чтобы решить, когда следует собирать векторы AAV. Когда клетки становятся очень легко отделяющимися при полной загрузке AAV, наступает время сбора урожая.

4. Сбор векторов AAV

  1. Извлеките вирус через 3-4 дня после перефикации, энергично встряхивая CF10. Налейте среду в конические пробирки объемом 250 мл и раскрутите вирус при 4000 x g в течение 20 минут при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для серотипа AAV6, используемого в этом протоколе, 80% AAV будет оставаться в основном связанным с клеточным материалом в грануле. А 20% AAV были выделены в СМИ. Эти пропорции могут отличаться для других серотипов AAV.
  2. Фильтруйте осветленную надосадочную жидкость с фильтрующей установкой 0,45 мкм и сохраните ее для осадков.
  3. Промойте CF10 500 мл буфера DPBS 1x и центрифугируйте при 4000 x g в течение 20 минут при 4 °C.
  4. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью вакуумной системы и аспирационной пипетки. Добавьте 20 мл буфера для лизиса AAV на CF10 при -80 °C до очистки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перенесите лизат AAV в коническую пробирку объемом 50 мл для последующей экстракции AAV.
  5. Выньте отфильтрованную надосадочную жидкость, добавьте 40% раствор PEG-2,5 M NaCl до конечной концентрации 8% PEG и инкубируйте в холодном помещении на орбитальном ротаторе не менее 3 часов или на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для 100 мл надосадочной жидкости добавьте 25 мл 40% раствора PEG-2,5 М NaCl.
  6. Осадите вирус путем центрифугирования при 4000 x g в течение 30 мин при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Переложите смесь в конические пробирки объемом 250 мл для центрифугирования.
  7. Аспират для удаления надосадочной жидкости и добавьте 5-10 мл буфера для ресуспензии AAV HEPES для суспензии гранул. Переложите в коническую пробирку объемом 50 мл для продолжения очистки или храните при температуре -80 °C.

5. Добыча AAV

  1. Разморозьте вирусную гранулу на водяной бане при температуре 37 °C в течение 10-15 минут с помощью шейкера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вихревой перегрузите лизат AAV до полного плавления.
  2. Заморозьте в ванне с 100% этанолом -80 °C в течение 20-30 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, цикл заморозки может быть выполнен с помощью холодного стакана из 100% этанола, окруженного сухим льдом.
  3. Выполните замораживание/размораживание 3-4 раза, а между ними при необходимости сделайте вихрь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот цикл можно приостановить на этапе заморозки. Храните лизат AAV при температуре -80 °C до начала последующей работы.
  4. Разморозьте лизат AAV (с шага 5.3) и ресуспендированный AAV (с шага 4.7)» на водяной бане при температуре 37 °C в течение 10-15 минут с помощью шейкера и сделайте вихрь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что он полностью растаял, и перемешайте.
  5. Добавьте бензоназную нуклеазу (250 единиц/μл) к лизату AAV и ресуспендируйте AAV до конечной концентрации 50 единиц/мл. Вихревой раствор.
  6. Выдерживать на водяной бане при температуре 37 °C с встряхиванием в течение 30 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Достаньте 10% аликвоты дезоксихолата натрия на водяной бане, чтобы дать время раствориться, нагрейте и тщательно перемешайте.
  7. Добавьте 10% дезоксихолат натрия до конечной концентрации 0,5% и выдерживайте при 37 °C при включенном шейкере в течение 30 минут.
    Примечание: Дезоксихолат натрия использовался для усиления высвобождения AAV из клеток.
  8. Распределите исходный раствор AAV по центрифужным пробиркам объемом 2 мл и центрифугируйте при давлении 14 000 x g в течение 10 минут при 4 °C.
  9. Перенесите надосадочную жидкость в коническую пробирку объемом 50 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пипетку объемом 1 мл для переноса надосадочной жидкости. Выбросьте гранулы.
  10. Добавьте равное количество хлороформа и извлеките AAV путем вортексирования в течение 1-2 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор должен стать непрозрачным, белым, молочным.
  11. Перелейте молочный раствор в центрифужные пробирки объемом 2 мл и равномерно распределите. Центрифуга при 14 000 x g в течение 10 мин при 4 °C.
  12. Аккуратно извлеките верхний розовый слой пипеткой и переложите его в новую коническую пробирку объемом 50 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не нарушайте слои хлороформа/белка.
  13. Измерьте окончательный объем с помощью пипетки. В соответствии с диаграммой объема первичных AAV-PEG-сульфатов (Таблица 2) смешайте соответствующие объемы 50% (NH4)2SO4 и 40% раствор PEG. Вихрь в течение 2 мин.
  14. Переложите смесь в центрифужные пробирки объемом 2 мл для равномерного распределения. Центрифуга при 14 000 x g в течение 10 мин при 4 °C
  15. Соберите нижний слой с помощью иглы 22 G и шприца объемом 3 мл. Соберите AAV в коническую пробирку объемом 50 мл и храните ее при температуре 4 °C для последующего ультрацентрифугирования с градиентом йодиксанола.

6. Очистка AAV методом йодиксанолового градиентного ультрацентрифугирования

  1. Приготовьте йодиксаноловые градиенты перед загрузкой AAV в соответствии с количеством используемых ультрацентрифугирующих пробирок (Таблица 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для наблюдения за слоями использовался феноловый красный.
  2. Медленно переложите каждый раствор в полипропиленовую ультрацентрифужную пробирку с круглым верхом с быстрым запайкой с помощью шприца объемом 10 мл, прикрепленного к длинной игле 16 G. Избегайте образования пузырей.
  3. Осторожно добавьте до 17 мл раствора AAV поверх градиента с помощью шприца 22 G. Используйте диализный буфер AAV, чтобы долить трубку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте раствор AAV, загрузив капли в стену в ультрацентрифужную пробирку. Не нарушайте слои с градиентом.
  4. Запечатайте ультрацентрифужные пробирки с помощью электрического запайщика.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сбалансируйте пробирки перед отправкой в ультрацентрифугу с разницей в ±0,2 г.
  5. Центрифуга при давлении 350 000 x g в течение 2 ч в роторе Ti70 при 4 °C.
  6. Осторожно снимите пробирки с ротора и поместите их в штатив для ультрацентрифужных пробирок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что градиенты не нарушены.
  7. Соберите фракции AAV, выполнив следующие действия:
    1. Стабилизируйте трубку на держателе подставки.
    2. Проколите ультрацентрифужные пробирки немного ниже границы раздела 40%-60% с помощью иглы 19 G, прикрепленной к шприцу объемом 10 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отверстие иглы должно быть направлено вверх, лицом к 40% градиенту.
    3. Проделайте отверстие в верхней части трубки иглой 16 G.
    4. Соберите до 5 мл на пробирку. Избегайте скопления белковых загрязнений на границе раздела 25%-40%.
    5. Повторите для каждой ультрацентрифужной пробирки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Переложите фракции AAV в коническую пробирку объемом 50 мл.

7. Второй раунд ультрацентрифугирования йодиксаноловыми градиентами

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг не является обязательным. Этот шаг направлен на уменьшение коэффициента пустого AAV для получения более качественного полного AAV-капсида.

  1. Разбавьте AAV >1:1 с помощью диализного буфера AAV.
    ПРИМЕЧАНИЕ: AAV, собранный в ходе первого раунда ультрацентрифугирования, содержал 40% слой йодиксанола. Он должен быть разбавлен не менее чем на 50%, чтобы его можно было загрузить поверх 30% слоя йодиксанола.
  2. Выложите каждый раствор (Таблица 4) в ультрацентрифугирующую пробирку с помощью иглы 16 G и медленно прикрепите шприц объемом 10 мл. Избегайте образования пузырей.
  3. Осторожно добавьте 20 мл разбавленного раствора AAV поверх градиента с помощью шприца 22 G. Используйте диализный буфер AAV, чтобы долить трубку.
  4. Повторите шаги с 6.4 по 6.7.

8. Диализ и концентрация AAV

  1. Перенесите вирус AAV в диализную кассету с помощью новой иглы 18 G и шприца объемом 10 мл. Медленно вводите вирус в кассету и удаляйте из нее воздух.
  2. Добавьте полосу для перемешивания в стакан с диализным буфером AAV и поместите его на тарелку для перемешивания.
  3. Поместите диализную кассету в диализный буфер с помощью поплавкового буя. Перемешайте при 4 °C. Замените диализный буфер AAV 2-3 раза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте достаточный буфер, чтобы позволить кассете плавать и выполнить замену буфера. Накройте стакан алюминиевой фольгой.
  4. С помощью шприца объемом 10 мл, прикрепленного к игле 18 G, соберите вирус из кассеты в центробежный фильтрующий блок.
  5. Центрифуга при 4 000 x g в течение 15-30 мин при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Промойте AAV диализным буфером AAV 2-3 раза. Концентрируйте AAV до тех пор, пока ~200 мкл оставшегося количества не окажется на поверхности фильтра.
  6. Соберите концентрированный AAV из фильтрующего блока. Промойте фильтр еще 300 мкл диализного буфера AAV и перенесите его в концентрированный AAV.
  7. Отфильтруйте вирус через шприц-фильтр 0,22 мкм с помощью туберкулинового шприца с люэровским скольжением объемом 1 мл. Чтобы обеспечить наименьшую потерю объема, с помощью шприца объемом 10 мл протолкните воздух через фильтр 2-3 раза.
  8. Храните очищенный вирус AAV при температуре 4 °C временно для титрования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Титруйте вирус, аликвоту, и храните при температуре -80 °C в течение 1 недели.

9. Титрование вируса AAV

ПРИМЕЧАНИЕ: Количественная полимеразная цепная реакция TaqMan (qPCR) использовалась для титрования очищенного AAV.

  1. Обрабатывайте векторы AAV ДНКазой I и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут, затем инкубируйте при 95 °C в течение 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве примера реакции 10 мкл используется 2 мкл образца вируса AAV, 1 мкл ДНКазы, 1 мкл ДНКазного буфера и 6 мкл H2O. Может быть выполнен в амплификаторе с ПЦР-пробирками.
  2. Подготовьте наборы грунтовок, предназначенные для области вставки AAV.
    Примечание: Мишенями могут быть промотор, трансген и репортер в конструкции AAV. Капсюли перечислены в таблице 5.
  3. Подготовьте стандарты ДНК-плазмид (10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 и 0,0001 пг/мкл) и отрицательный контроль (H2O).
  4. Приготовьте мастер-смесь для количественной ПЦР, включая праймеры, в соответствии с инструкциями производителя.
  5. Поместите стандарты и образцы в трех экземплярах на ПЦР-планшет. Добавьте смесь для количественной ПЦР в стандарты и образцы. Запечатайте планшет и выполните реакцию количественной ПЦР в соответствии с инструкциями производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Условия реакции зависят от материалов/реагентов и инструмента. Применимы быстрые и обычные циклы ПЦР.
  6. Вычислить титр вируса AAV.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация образца в этом протоколе составляет 1/10 разбавления от исходных образцов.
  7. Аликотируйте вирус AAV в пробирках объемом 1,5 мл и храните при температуре 4 °C до одного месяца и храните при температуре -80 °C в течение длительного времени.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте циклов замораживания/размораживания при хранении. При использовании для экспериментов in vivo не используйте размораживание более двух аликвот.

10. Контроль качества AAV

ПРИМЕЧАНИЕ: Вирусы AAV характеризовали по чистоте путем окрашивания серебром SDS-PAGE с использованием геля SDS-PAGE и окрашивали с помощью коммерчески доступного набора для окрашивания.

  1. Денатурация 3 x 109 vg образца вируса AAV с буфером Laemmli.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте эталонный вирус AAV в качестве контроля. Используется референсный полный капсид AAV6-CMV-GFP.
  2. Загрузите денатурированный AAV на гель SDS-PAGE с градиентом 4%-20% и работайте при напряжении 180 В в течение 50 минут.
  3. Снимите гель с пластины для электрофореза. Окрашивайте гель набором для окрашивания серебром в соответствии с инструкцией производителя.
  4. Проверьте капсидные белки AAV VP1, VP2 и VP3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чистый вирус AAV содержит только капсидный белок VP1, VP2 и VP3. Если они не чистые, на геле будут видны другие белковые полосы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проводилась просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) рекомбинантных вирионов AAV, окрашенных негативным окрашиванием, для оценки морфологической целостности и соотношения полных/пустых.
  5. Возьмите ЭМ-сетку с помощью пинцета и сядьте на скамейку блестящей стороной сетки вверх.
  6. Нанесите 5 мкл образца AAV на сетку и дайте ему высохнуть путем выпаривания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости разбавьте AAV. 1012 вг/мл – это средний титр. На высыхание сетки может уйти 30-60 минут.
  7. Промойте сетку пипетированием, капля за каплей, добавив на решетку около 200 μл H2O.
  8. Удалите лишнюю воду, медленно положив хроматографическую бумагу вертикально рядом с сеткой.
  9. Нанесите 5 мкл 2% раствора уранилацетата на решетку. Высиживайте в течение 5 минут и снимите фитиль, как упоминалось выше. Дайте сетке высохнуть.
  10. Визуализируйте частицы AAV под просвечивающим электронным микроскопом (с 50 000-кратным увеличением). Вирусные капсиды с вирусным геномом будут выглядеть как однородные белые шестиугольники, в то время как пустые капсиды будут выглядеть как шестиугольники с белым ободком, но темным центром.
  11. Наугад посчитайте не менее 100 частиц, чтобы определить примерный процент полных и полных. пустые частицы AAV.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом подробном пошаговом протоколе продемонстрирована стандартизированная платформа для создания высококачественного вируса AAV с высоким титром и CF10 в условиях крупномасштабной исследовательской лаборатории. По сравнению с обычными чашками для культивирования клеток, CF10 обеспечивает удобный способ культивирования большого количества клеток и производства вируса AAV (Рисунок 1). Было протестировано несколько условий культивирования, чтобы определить, могут ли клетки в оптимальной среде способствовать производству вируса. Низкоглюкозный DMEM с добавлением 10 мМ HEPES и 2% FBS показал наилучшую выработку AAV.

Было протестировано несколько протоколов для очистки AAV. Большинство процедур имеют низкий выход вируса и примесь капсидов AAV. Здесь был разработан пересмотренный протокол очистки, объединяющий AAV как из клеточных гранул, так и из питательных сред (Рисунок 2). Мы обнаружили, что 80% AAV находилось в клетках, а еще 20% AAV находилось в питательных средах, которые секретировались из клеток. Обе части AAV были обработаны ДНКазой для удаления свободной ДНК. Дезоксихолат натрия использовался для дальнейшего высвобождения AAV из клеток. Затем AAV экстрагировали с помощью экстракции хлороформа с последующим водным двухфазным разделением. Эти шаги позволили удалить большинство белковых загрязнителей. AAV остается растворимым в фазе сульфата аммония.

Оставшиеся загрязнения удаляли с помощью прерывистого йодиксанолового градиентного ультрацентрифугирования (рис. 3А). Градиент также был полезен при удалении пустых капсидов AAV, особенно при втором раунде ультрацентрифугирования с градиентом йодиксанола.

Чистоту вируса AAV определяли путем окрашивания серебром. Когда были получены три основные полосы, соответствующие белку капсида AAV, VP1, VP2 и VP3, с чистотой более 90%, вирус AAV был пригоден для использования in vivo (рисунок 3B). Отношение полного капсида AAV к пустому капсиду было получено с помощью TEM (рисунок 3C). Только полный капсид с трансгенной вставкой позволит экспрессировать трансген в целевой ткани. Большая часть пустого капсида также может вызвать иммунный ответ на капсид AAV. Эти проверки качества необходимы для каждого вируса AAV, который производится и очищается перед использованием.

figure-results-1
Рисунок 1: Схематическое изображение получения AAV методом тройной трансфекции HEK293T клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Схематическое изображение очистки AAV. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Очистка AAV с помощью градиентного ультрацентрифугирования йодиксанола и проверка чистоты вируса AAV. (A) Слои градиента йодиксанола и положение иглы для забора. (B) Репрезентативный гель для оценки содержания капсида и чистоты. M: молекулярный маркер; R: референсный полный капсид AAV6; S1: капсид AAVDJ собственного производства с одним раундом ультрацентрифугирования; S2: капсид AAVDJ собственного производства с двумя раундами ультрацентрифугирования; S3: капсид AAV6 собственного производства. (C) Электронное микроскопическое изображение AAV. Вирус собирается после очистки. Вирусные капсиды, содержащие вирусный геном, выглядят как однородные белые шестиугольники, в то время как пустые капсиды выглядят как шестиугольники с белым ободком, но темным центром. Масштабная линейка: 100 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Калькулятор PEI для упаковки AAV. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Объемная диаграмма необработанных AAV-PEG-сульфатов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 3: Приготовление градиента йодиксанола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 4: Приготовление йодиксанол градиента второго цикла. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 5: Праймеры для титрования AAV. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительный файл 1: Состав буферов, использованных для исследования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь представлен технически усовершенствованный протокол для крупномасштабного производства векторов AAV с высоким титром и высокого качества с использованием платформы клеточной фабрики (CF10), представляющий собой значительное усовершенствование по сравнению с традиционными методами тарелки для клеточных культур. Использование клеточных фабрик упрощает процесс культивирования больших объемов клеток, способствуя более эффективному производству AAV-вирусов1. Кроме того, при оптимизации условий культивирования, в частности с низким содержанием глюкозы DMEM с добавлением 10 мМ HEPES и 2% FBS, было подтверждено значительное увеличение продукции вируса, что указывает на решающую роль клеточной среды в выходе вируса.

Пересмотренный протокол очистки, который сочетает в себе AAV как из клеточных гранул, так и из питательных сред, решает общую проблему низкого выхода вируса и примесей, наблюдаемую во многих существующих протоколах. Этапы экстракции хлороформа и водного двухфазного разделения эффективно удаляют большинство белковых загрязнителей, при этом AAV остается растворимым в фазе сульфата аммония. Улучшение как выхода, так и чистоты векторов AAV при использовании двухфазного разделения ПЭГ/водное в сочетании с йодиксаноловым градиентным ультрацентрифугированием, в отличие от традиционных методов градиентного ультрацентрифугирования, может быть связано с улучшением начального разделения с помощью двухфазного разделения ПЭГ/водная вода, уточнением чистоты с помощью градиентного ультрацентрифугирования йодиксанола и снижением соочистки загрязняющих веществ12. Во-первых, внедрение двухфазного разделения ПЭГ/водная среда перед ультрацентрифугированием значительно улучшает первоначальное отделение частиц AAV от клеточного мусора и других загрязнителей. ПЭГ, высокомолекулярный полимер, при смешивании с водным раствором образует две отдельные фазы13. Векторы AAV имеют тенденцию к преимущественному разделению на одну из этих фаз (обычно богатую ПЭГ фазу), в то время как многие загрязнители и примеси разделяются на другие13. Такое селективное разделение эффективно концентрирует частицы AAV и удаляет значительную часть примесей еще до ультрацентрифугирования, тем самым увеличивая выход и снижая нагрузку загрязняющих веществ, поступающих на стадию ультрацентрифугирования13. Во-вторых, йодиксаноловое градиентное ультрацентрифугирование еще больше повышает чистоту векторов AAV. Йодиксанол, неионная изоосмолярная градиентная среда, обеспечивает более бережное и контролируемое разделение по сравнению с традиционными градиентами CsCl14. При этом градиенте частицы AAV мигрируют в положение градиента, соответствующее их плотностиплавучести14. Важно отметить, что этот процесс эффективен для отделения полных капсидов AAV (содержащих генетическую полезную нагрузку) от пустых капсидов (без генетического материала), что является важнейшим фактором, определяющим качество вектора. Изоосмолярная природа йодиксанола также сохраняет целостность капсидов AAV лучше, чем гиперосмолярные агенты, такие как CsCl, что потенциально приводит к более высокому выходу интактных, функциональных векторов14. Наконец, традиционные методы ультрацентрифугирования, особенно те, которые используют градиенты CsCl, иногда могут осуществлять совместную очистку загрязняющих веществ, которые имеют плотности, аналогичные плотности плавучести векторов AAV15. Используя секционирование PEG в качестве предварительного этапа, нагрузка таких загрязнителей значительно снижается перед ультрацентрифугированием13. Это снижение концентрации загрязняющих веществ означает, что градиент йодиксанола может работать более эффективно и избирательно при очистке векторов AAV, что приводит к более высокой чистоте15.

Чистота и качество векторов AAV тщательно оцениваются с помощью окрашивания серебром и TEM11. Наблюдение трех основных полос, соответствующих белкам капсида AAV VP1, VP2 и VP3, с чистотой более 90%, указывает на пригодность этих векторов AAV для использования in vivo. ПЭМ-анализ для определения соотношения полных и пустых капсидов особенно важен, так как высокая доля пустых капсидов может привести к снижению эффективности доставки генов и потенциальных иммунных реакций. Эта проверка качества, хотя и необходима, усложняет процедуру и может потребовать дополнительных технических знаний.

В заключение следует отметить, что протокол предлагает значительные технические достижения в производстве векторов AAV, особенно с точки зрения масштабируемости и чистоты. Тем не менее, сложности, связанные с процессом очистки, и потребность в специализированном оборудовании и опыте все еще могут быть незначительным ограничением для его применения в определенных исследовательских условиях. Дальнейшее уточнение и упрощение этих методов может сделать этот подход более доступным и широко применимым в области исследований в области генной терапии.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ТЗ разработал эксперименты. Эксперименты проводили TZ, VD, SB и JP. TZ и VD генерировали данные и анализировали их. Рукопись написали TZ и YX. ТЗ и ГГ отредактировали рукопись. Эта работа была поддержана Детской больницей UPMC в Питтсбурге.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
293T/17 клетокATTCCRL-11268
0,5 М ЭДТАMilliporeSigma324506-100мл
1 мл шприц Henke-JectFisherScientific 14-817-211
10% плуроновый раствор F68Fisher Scientific24-040-032
10x Трис/Глицин/SDS БуферBiorad1610732
1М HEPESFisher Scientific15-630-080
2% раствор уранилацетатаЭлектронная микроскопия науки22400-2
4%– 20% сборные протеиновые гелиbiorad4561094
40% раствор ПЭГSigmaP1458-50ML
AAV6 референсные полные капсидыCharles River LaboratoriesRS-AAV6-FL
раствор для отслойки аккутазных клетокFisher ScientificA6964-100ML
бензоназаSigmaE1014-25KU
BioLite Клеточная культура Посуда обработанная 150 ммFisher Scientific12-556-003
Центробежный фильтрующий блокMilliporeSigmaUFC905024
Corning  Фильтры для шприцев PESFisher Scientific09-754-29
Кассеты для диализа, 10 K MWCOFisher ScientificPI66810
Одноразовые фильтрующие блоки PES 1 л 0,2 &; mFisher ScientificFB12566506
Одноразовые фильтрующие блоки PES 1 л 0,45 &; mFisher ScientificFB12566507
Одноразовые фильтрующие блоки PES 500 мл 0,2 &; mFisher ScientificFB12566504
DMEM с высоким содержанием глюкозыFisherScientific 10-569-044
DMEM с низким содержанием глюкозыFisher Scientific10567022
DNaseNEBM0303S
DPBS 1xFisher Scientific14-190-250
Фетальная сыворотка бовина (FBS)BiowestS1620
формвар/углерод 300 меш, медьэлектронная микроскопия наукиFCF300-Cu-50
глицеринSigmaG5516-1L
KClSigmaP9541-500G
LB агарSigmaL2897-250G
LB бульонFisher ScientificBP9732-500
MgCL2· 6H2OSigmaM9272-100G
NEB стабильные компетентные клеткиNEBC3040H
Nest Biofactory 10 камерMidSci771302
NucleoBond Xtra Maxi EFMacherey-Nagel740424
Opti-MEMFisher Scientific31-985-088
OptiPrep Density Gradient MediumMillipore SigmaD1556-250ml
pAAV-CMV-GFPAddgene105530
pAAV-DJCell BioLabVPK-420-DJ
pAAV-RC6Cell BioLabVPK-426
pAdDeltaF6Addgene112867
PEG 8000PromegaV3011
PEI MaxPolysciences, Inc49553-93-7
Pen-StrepFisher Scientific15-140-163
Фенол красныйMillipore Sigma1.07242.0100
Набор для прокалывания серебряной морилкиThermo Fisher Scientific24612
QuickSeal TubeFisher ScientificNC9144589
Sodium ChlorideSigma1162245000
Дезоксихолат натрия Millipore SigmaD6750-100G
Taqman Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific4444557
тип 70 Ti Титановый ротор с фиксированным угломнаклона Beckman Coulter337922
западный промокательный субстратThermoFisher 32209
(Английский)

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Arjomandnejad, M., Dasgupta, I., Flotte, T. R., Keeler, A. M. Immunogenicity of recombinant adeno-associated virus (AAV) vectors for gene transfer. BioDrugs. 37 (3), 311-329 (2023).
  2. Liu, Y., Siriwon, N., A Rohrs, J., Wang, P. Generation of targeted adeno-associated virus (AAV) vectors for human gene therapy. Curr Pharm Des. 21 (22), 3248-3256 (2015).
  3. Bilal, A. S., et al. Optimization of large-scale Adeno-Associated Virus (AAV) production. Curr Protoc. 3 (5), e757(2023).
  4. Rashnonejad, A., Chermahini, G. A., Li, S., Ozkinay, F., Gao, G. Large-scale production of adeno-associated viral vector serotype-9 carrying the human survival motor neuron gene. Mol Biotechnol. 58, 30-36 (2016).
  5. Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).
  6. Challis, R. C., et al. Publisher Correction: Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nat Protoc. 14 (8), 2597-2597 (2019).
  7. Mueller, C., Ratner, D., Zhong, L., Esteves-Sena, M., Gao, G. Production and discovery of novel recombinant adeno-associated viral vectors. Curr Protoc Microbiol. 26 (1), 14(2012).
  8. Guo, P., Wiersch, J., Xiao, X., Gittes, G. Simplified purification of AAV and delivery to the pancreas by intraductal administration. Methods Mol Biol. 1950, 373-387 (2019).
  9. Berns, K. I., Srivastava, A. Next generation of adeno-associated virus vectors for gene therapy for human liver diseases. Gastroenterol Clin North Am. 48 (2), 319-330 (2019).
  10. Khasa, H., Kilby, G., Chen, X., Wang, C. Analytical band centrifugation for the separation and quantification of empty and full AAV particles. Mol Ther Methods Clin Dev. 21, 585-591 (2021).
  11. Chen, H. Comparative observation of the recombinant adeno-associated virus 2 using transmission electron microscopy and atomic force microscopy. Microsc Microanal. 13 (5), 384-389 (2007).
  12. Burnham, B., et al. Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors. Hum Gene Ther Methods. 26 (6), 228-242 (2015).
  13. Kato, M., et al. In situ-formable, dynamic crosslinked poly (ethylene glycol) carrier for localized adeno-associated virus infection and reduced off-target effects. Commun Biol. 6 (1), 508(2023).
  14. Sena-Esteves, M., Gao, G. Enrichment of fully packaged virions in column-purified recombinant adeno-associated virus (rAAV) preparations by iodixanol gradient centrifugation followed by anion-exchange column chromatography. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (2), 095638(2020).
  15. Matsumoto, M., Wangelin, J. R., Murphy, M. L. Purification of avian encephalomyelitis virus by ultracentrifugation in a nonlinear cesium chloride gradient. Avian Dis. 22 (3), 496-502 (1978).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

AAV VectorsCell Factory PlatformHigh Titer ProductionHEK293T CellsIodixanol GradientPolyethylene Glycol PurificationSDS PAGE AnalysisTransmission Electron MicroscopyViral PurityGene Therapy

Похожие статьи