Разработка недорогого электрода для эпимизиальной электромиографии: упрощенный рабочий процесс изготовления и тестирования

Краткое содержание

Наша цель состояла в том, чтобы предоставить обновленное, простое в использовании руководство по изготовлению и тестированию электродов эпимизиальной электромиографии. С этой целью мы предоставляем инструкции по поиску материалов и подробный пошаговый обзор процесса изготовления и тестирования.

Аннотация

Электромиография (ЭМГ) является ценным диагностическим инструментом для выявления нервно-мышечных аномалий. Имплантируемые эпимизиальные электроды обычно используются для измерения сигналов ЭМГ в доклинических моделях. Несмотря на то, что существуют классические источники, описывающие принципы изготовления эпимизионных электродов, существует скудная иллюстративная информация, переводящая теорию электродов на практике. Чтобы исправить эту проблему, мы предоставляем обновленное, простое в использовании руководство по изготовлению и тестированию недорогих эпимизиальных электродов.

Электроды были изготовлены путем складывания и вставки двух платино-иридиевых фольг в предварительно вырезанную силиконовую основу для формирования контактных поверхностей. Затем к каждой контактной поверхности были приварены проволоки из нержавеющей стали с покрытием для формирования выводов электродов. Наконец, для герметизации электрода использовалась силиконовая смесь. Тестирование ex vivo было проведено для сравнения нашего изготовленного по индивидуальному заказу электрода со стандартным электродом в солевой ванне, где были обнаружены высокие уровни согласования сигналов (синусоида [внутриклассовая корреляция - ICC= 0,993], квадрат [ICC = 0,995], треугольник [ICC = 0,958]) и временная синхронность (синус [r = 0,987], квадрат [r = 0,990], треугольник [r = 0,931]) во всех формах сигнала. Низкие уровни импеданса электродов также были количественно определены с помощью спектроскопии электрохимического импеданса.

Также была проведена оценка производительности in vivo , в ходе которой широкая латеральная мышца крысы была хирургически обработана с помощью специально изготовленного электрода, а сигнализация была получена во время ходьбы в гору и вниз по склону. Как и ожидалось, пиковая активность ЭМГ была значительно ниже при ходьбе вниз по склону (0,008 ± 0,005 мВ), чем при подъеме в гору (0,031 ± 0,180 мВ, p = 0,005), что подтверждает валидность устройства. Надежность и биосовместимость устройства также поддерживались последовательной сигнализацией во время ровной ходьбы через 14 и 56 дней после имплантации (0,01 ± 0,007 мВ, 0,012 ± 0,007 мВ соответственно; p > 0,05) и отсутствием гистологического воспаления. В совокупности мы обеспечиваем обновленный рабочий процесс для изготовления и тестирования недорогих эпимизионных электродов.

Введение

Электромиография (ЭМГ) является мощным инструментом для изучения электрической активности мышц. Записи ЭМГ могут быть особенно полезны на доклинических моделях животных для оценки эффективности вмешательств по лечению нервно-мышечной дисфункции. В этих моделях имплантируемые биосовместимые электроды обычно используются для оценки нейрофизиологического интерфейса между моторными нейронами и мышечными волокнами. Эти имплантируемые электроды могут обеспечивать локализованные измерения мышечного возбуждения и могут быть разнообразными с точки зрения конфигурации, формы и материала, при этом оптимальная конструкция в конечном итоге диктуется местоположением и предполагаемым использованием.

Несмотря на их пригодность для оценки мышечного возбуждения в доклинических моделях, использование эпимизиальных электродов может быть ограничено стоимостью. В результате многие исследователи используют изготовленные по индивидуальному заказу эпимизиальные электроды, которые производятся собственными силами. Несмотря на то, что существуют ресурсы, подробно описывающие основные аспекты изготовления, тестирования и использования электродов ^1,2, существует потребность в обновленном руководстве с подробным описанием источника, изготовления и валидации эпимизионных электродов с использованием современных методов. Основываясь на фундаментальных работах Леба и Ганса³ и других ученых в области теории электродов, мы представляем современные инструкции по поиску и изготовлению недорогих эпимизиальных электродов и проверяем их производительность в серии экспериментов ex vivo и in vivo. Цель состоит в том, чтобы предложить дружественное руководство для других членов научного сообщества по поиску, изготовлению и тестированию недорогих эпимизиальных электродов для использования на животных, что позволит более широко количественно оценить мышечное возбуждение в доклинических моделях.

В этом протоколе мы предоставляем инструкцию по поиску, изготовлению и тестированию эпимизиальных электродов для использования на животных в современной электрофизиологической лаборатории. Параметры электродов, выбранные для изготовления, такие как форма, размеры, площадь контактной поверхности, расстояние между электродами, длина выводов и т. д., были выбраны в соответствии с нашими экспериментальными потребностями и были сопоставимы с коммерчески доступным стандартным эпимизионным электродом (см. Таблицу материалов). Мы рекомендуем другим группам изменить эти параметры в соответствии со своими потребностями, а также выбрать надежный электрод, который соответствует их сценарию использования.

Чтобы дать читателям относительно быстрое представление о работе электродов, мы также приводим пример протокола испытаний ex vivo с возможностью измерения импеданса электрода. Кроме того, мы приводим пример оценки производительности электродов in vivo. В эксперименте ex vivo специально изготовленный электрод сравнивался с отраслевым стандартом в солевой ванне, чтобы имитировать стабильные физиологические условия. Импеданс также оценивали ex vivo с помощью электрохимической импедансной спектроскопии (ЭИС). Эксперимент in vivo заключался в хирургической имплантации специально изготовленного электрода в латеральную мышцу широкой мышцы (VL) 16-недельной самки крысы породы Лонг Эванс (HsdBlu: LE, Envigo) для измерения сигнала ЭМГ в условиях, вызывающих высокий или низкий сигнал (подъем, ходьба под гору). Для оценки надежности изготовленного по индивидуальному заказу электрода сигнализация ЭМГ была получена во время горизонтальной ходьбы после полного хирургического восстановления и до жертвоприношения (через 14 дней и 56 дней после имплантации соответственно). Окрашивание гематоксилин-эозином (H&E) было проведено на инструментированной мышце для оценки биосовместимости электрода, изготовленного по индивидуальному заказу.

Протокол

Процедура in vivo была проведена с одобрения Комитета по институциональному уходу за животными и их использованию при Мичиганском университете (#PRO00010765 одобрения IACUC) и в соответствии с рекомендациями Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Поиск и изготовление электродов

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 представлена общая сводка всех ключевых этапов изготовления с QR-ссылкой, которая содержит дополнительные визуальные инструкции.

1. Закупайте биосовместимые электродные материалы непосредственно у производителя в больших количествах для изготовления. Смотрите таблицу материалов, которая содержит все компоненты электродов и подробную информацию о поставщиках.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что силиконовая основа, силиконовый герметик и платино-иридиевая контактная фольга биосовместимы, чтобы избежать неблагоприятного иммунного ответа и обеспечить хроническую имплантацию. Чтобы обосновать экономические преимущества собственного производства, мы представляем подробный анализ стоимости изготовленного по индивидуальному заказу эпимизиального электрода в сравнении с отраслевым стандартом (Таблица материалов).
2. Подготовьте режущий и фальцевальный кондуктор (Дополнительный файл 1, Дополнительный файл 2). Используйте выбранное программное обеспечение для 3D-печати для проектирования режущих и складывающихся приспособлений для серийного производства идентичных эпимизионных электродов.
   1. Спроектируйте режущий кондуктор таким образом, чтобы обеспечить одинаковый размер и расстояние между перфорациями силиконовой основы для равной площади контактной поверхности и расстояния между электродами на всех электродах.
   2. Создайте складной кондуктор для складывания платино-иридиевых контактных поверхностей и упрощения размещения фольги в силиконовой основе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предоставляются файлы Gcode; Изменяйте размеры и технические характеристики режущего и складывающегося кондуктора в соответствии с экспериментальными потребностями.
3. Проколотируйте силиконовую основу. Поместите силиконовую основу на режущий кондуктор и прикрепите ее скотчем. Перфорируйте силикон с помощью направляющих в режущем приспособлении с помощью ножа X-acto для размещения контактной пленки.
4. Вставьте фольгу в силиконовую основу, чтобы сформировать контактные поверхности. Сложите биосовместимую, предварительно нарезанную платино-иридиевую контактную фольгу (1,25 мм x 5 мм) в U-образную форму с помощью складного приспособления. Затем направьте плечи сложенной фольги в перфорированные пазы в силиконовой основе, чтобы создать контактные поверхности электрода. Таким образом, вставьте все 12 фольг в силиконовую основу; Оставьте одну колонку открытой между электродами, чтобы обеспечить правильное расстояние.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта конфигурация позволит изготовить 6 биполярных эпимизиальных электродов; Редактирование режущего приспособления при необходимости может увеличить производительность.
5. Снимите силиконовую основу с режущего приспособления. Наложите кусок хирургической ленты на контактные поверхности, чтобы удерживать фольгу на месте. Затем снимите силиконовую основу с режущего приспособления, переверните, чтобы обнажить рукава U-образной фольги, и сложите один рукав U-образной фольги заподлицо с силиконовой основой.
6. Подсоедините электродные провода. Приготовьте проволоку из нержавеющей стали с перфторалкокси (PFA), разрезав ее до нужной длины. Затем обнажите один конец проволоки из нержавеющей стали на ~ 1 см с помощью имеющейся в продаже зажигалки. Расположите оголенный конец проволоки из нержавеющей стали на внутренней стороне развернутого плеча фольги. Приварите проволоку из нержавеющей стали к рукаву фольги с помощью сварочного аппарата Micro TIG (длительность импульса = 0, энергия сварного шва = 25).
7. Осмотрите интерфейс «свинец-фольга». Проверьте соединение проволоки с фольгой, натянув проволоку из нержавеющей стали. Если соединение держится, сложите рукав фольги вниз заподлицо с силиконовой основой и снимите ленту, окаймляющую силиконовый лист.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Примените натяжение, которое является репрезентативным для натяжения, приложенного в указанном сценарии использования.
8. Запечатайте электрод. Чтобы добиться более жидкой консистенции, смешайте 1 г биосовместимого жидкого силикона с 0,75 мл толуола. Наберите смесь с помощью шприца с тупым наконечником 18 г и нанесите его на сварную сторону каждого электрода, чтобы загерметизировать заднюю часть электродов.
   ВНИМАНИЕ: Толуол легко воспламеняется, может привести к летальному исходу при проглатывании или попадании в дыхательные пути и вызывает раздражение кожи. Работайте под вытяжным шкафом и держите подальше от открытого огня.
9. Разделите партию на отдельные электроды. Дайте силикон-толуолу застыть в течение 72 часов, прежде чем работать с электродом. Далее с помощью ножниц разрезаем силиконовую основу на отдельные электроды размером 10 х 5 мм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Размер электрода будет зависеть от размеров режущего приспособления и конкретного случая использования. Автоклав и/или очистка электродов в ультразвуковой ванне.

Рисунок 1. Этапы изготовления электродов. (А) Перфорируйте силиконовую основу. (B) Сформируйте U-образную фольгу с помощью складного приспособления. (C) Вставьте U-образную фольгу в перфорированную силиконовую основу. (D) Силиконовая основа содержит 12 фольг, образующих 6 биполярных электродов. (E) Наклейте хирургическую ленту на основание, чтобы закрепить фольгу во время снятия с режущего приспособления. (F) Снимите силиконовую основу с режущего приспособления. (G) Очистите проволоку из нержавеющей стали с покрытием PFA и приварите к вертикальному кронштейну фольги с помощью сварочного аппарата Micro TIG. (H) Выровняйте оголенные провода, нанесите силикон-толуоловый герметик и дайте застыть. (I) Разделите силиконовую основу на отдельные электроды и очистите в ультразвуковой ванне. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

2. Тестирование ex vivo

1. Подключите электроды к записывающему устройству. Закрепите каждый электродный подводящий провод в канале на интерфейсной плате электродов (EIB). Повторите этот шаг (используя тот же EIB) для выбранного стандартного электрода для сравнения. Подключите EIB к платформе сбора данных с помощью магнитной кабельной системы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартный электрод может быть любым электродом, который считается надежным и подходит для экспериментальных потребностей.
2. Заземлить ЕИБ. Очистите один конец нержавеющей стали с покрытием из PFA и выполните точечную сварку к источнику заземления (например, винту из нержавеющей стали). Прикрепите подводящий провод заземления к той же интерфейсной плате электродов в назначенном положении «заземление».
3. Установите солевую ванну. Наполните стеклянный стакан (250 мл) 180 мл физиологического раствора физиологического раствора (0,9% стерильного физиологического раствора)⁴. Погрузите изготовленные по индивидуальному заказу и стандартные для отрасли эпимизионные электроды в ванну с солевым раствором и закрепите их в устойчивом положении. Затем погрузите источник заземления в солевую ванну и закрепите его положение. Наконец, погрузите и закрепите два стимулирующих игольчатых электрода в солевой ванне и подключите стимулирующие электроды к генератору сигналов.
4. Используйте генератор сигналов для оценки согласования сигналов и временной синхронизации. Используйте генератор сигналов для подачи повторяющихся сигналов с выбранным напряжением и частотой (0,1 В и 5 Гц) в солевую ванну через стимулирующие электроды (Рисунок 2). Подавайте сигналы различных форм (синусоидальные, квадратные и треугольные) для сравнения записанных сигналов между специально изготовленным эпимизионным электродом относительно отраслевого стандарта.
5. Оценивайте производительность в неформальной обстановке и визуально в режиме реального времени, чтобы оценить степень изменения сигналов между электродами. Выполнение внутриклассовых корреляций (ICC) и корреляций Пирсона для оценки согласования сигналов и временной синхронности соответственно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для целей нашего анализа было отобрано 8 000 образцов с частотой 4 000 Гц и отфильтровано в режиме реального времени с помощью фильтра Баттерворта высоких и низких частот (верхние частоты = 75 Гц; низкие частоты = 2 кГц).
6. Измерьте импеданс электрода. Чтобы измерить импеданс электродов, соберите EIS на изготовленных по индивидуальному заказу электродах (например, 10 электродов) на частотах 10 Гц-31 кГц⁵ с помощью потенциостата, используя процедуру, описанную ниже Richie et al.⁶. См. Sarolic et al. для получения дополнительной информации об измерении импеданса электродов на биполярных электродах⁷.
7. Следуя процедуре Richie et al., погрузите эпимизиальный электрод на 1 мм в 1x фосфатно-солевой буфер (PBS). Используйте хлорид серебра (Ag|AgCl) электрод сравнения и стержень из нержавеющей стали в качестве противоэлектрода для завершения цепи.
8. Приостановка работы Ag|AgCl электрод сравнения и стержень из нержавеющей стали в 1x PBS с помощью зажима для стакана. Подсоедините электрод сравнения к опорному точке используемой импедансной системы и подключитесь к входу противоэлектрода используемой импедансной системы.
9. Используйте потенциостат для сканирования импеданса 1 кГц. Частота развертки 1 кГц при_{среднеквадратичном} напряжении 0,01 В в одной синусоидальной осциллограмме. В течение первых 5 секунд сканирования установите потенциостат на 0 В, чтобы стабилизировать записанный сигнал. Используйте программное обеспечение, связанное с потенциостатом, для записи измерений.

Рисунок 2: Испытание ex vivo : Солевая ванна, содержащая изготовленный по индивидуальному заказу электрод, стандартные электроды, два стимулирующих электрода и источник заземления. Согласование сигналов и временная синхронность оценивались путем подачи синусоидальных, прямоугольных и треугольных волн в соленую ванну от генератора сигналов и записи сигналов, обнаруженных соответствующими электродами, с помощью платформы сбора данных. ПРИМЕЧАНИЕ: Электрохимическая импедансная спектроскопия не изображена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

3. Тестирование in vivo

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура тестирования in vivo описывает наш экспериментальный вариант использования. Рекомендуется, чтобы изготовленные по индивидуальному заказу эпимизиальные электроды тестировались in vivo таким образом, чтобы это соответствовало предполагаемым условиям эксперимента.

1. Просмотр хирургической информации; Ознакомьтесь с информацией для хирургов, которые изучают процесс имплантации хронических нейронных записывающих электродов с использованием следующих ресурсов ^8,9.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая, что основное внимание в нашей рукописи уделяется изготовлению и тестированию электродов, здесь мы приводим только краткий обзор хирургических методов, используемых в нашей лаборатории для тестирования электродов in vivo .
2. Выберите крысу, которую будут оснастывать (например, самку крысы Лонг Эванса в возрасте 16 недель). Предложите крысе пройти 1-недельный период лабораторной акклиматизации перед акклиматизацией на беговой дорожке. После лабораторной акклиматизации постепенно подвергайте крысу воздействию беговой дорожки грызунов со скоростью до 16 м/мин.
3. Подготовьте ЭИБ, сначала прикрепив к нему специально изготовленный эпимизиальный электрод, прикрепив каждый электродный провод к каналу на ЭИБ. Чтобы заземлить EIB, обнажите один конец проволоки из нержавеющей стали с покрытием PFA и выполните точечную сварку к выбранному заземлению (например, винту из нержавеющей стали). Далее прикрепите провод заземления к тому же EIB в обозначенном положении «заземления».
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы защитить электрод во время работы с контрольно-измерительными приборами, оберните его защитным покрытием (например, парапленкой).
4. Перед началом операции продезинфицируйте все хирургические инструменты, а также операционную область. Используйте герметичные асептические хирургические принадлежности и автоклавируйте все хирургические инструменты, которые не находятся в стерильной упаковке. Создайте стерильное операционное поле с помощью хирургической простыни.
5. Обезболивайте животное с помощью индукционной камеры с 3-5% изофлураном и 1 л/мин кислорода и поддерживайте через носовой конус с 2% изофлураном и 500 мл кислорода во время подготовки крысы. После достижения хирургической плоскости анестезии, оцененной с помощью щипки на пальце ноги, нанесите глазную мазь, контролируйте частоту дыхания (70-110 вдохов/мин) и оцените температуру тела с помощью ректального зонда.
6. Затем побрейте место операции машинками для стрижки животных и удалите мусор с места операции. После того, как операционная область будет выбрита, продезинфицируйте место операции с помощью хлоргексидина, изопропилового спирта и повидон-йода, протирая от центра к внешней стороне операционной области. Применяйте анальгетики по мере необходимости и одобрения и обеспечивайте тепло для поддержания температуры тела (37,5-38,5 °C). После подготовки поместите крысу в стереотаксическую рамку и установите стерильное поле.
7. Для правильной хирургической подготовки хирурга необходимо тщательно вымыть руки с использованием мыла и/или дезинфицирующего средства (хлоргексидина). Наденьте надлежащие СИЗ: маску, стерильные перчатки и одноразовый халат/топ для скраба. Надевайте новые стерильные перчатки, если по каким-либо причинам нарушена техника асептики.
8. Чтобы вставить инструмент на правую VL, с помощью скальпеля сделайте разрез длиной 3-5 см на переднебоковой части правой задней конечности и используйте тупое рассечение для идентификации мышцы VL.
9. Сделайте разрез в сагиттальной плоскости диаметром 1 см вдоль коронкового шва и обнажите череп. С помощью тонкой пары щипцов сделайте подкожный тоннель от правой задней конечности к основанию черепа. С помощью щипцов захватите электрод и проведите электрод к VL.
10. Используйте костяное сверло, чтобы сделать отверстие в кальварии (убедитесь, что характеристики сверла соответствуют характеристикам винта заземления). Закрепите винт заземления и прикрепите EIB к черепу с помощью стоматологического цемента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшое количество перекиси водорода может быть применено для увеличения пористости черепа и улучшения адгезии стоматологического цемента.
11. Определив мышцу VL, имплантируйте специально изготовленный эпимизиальный электрод, имплантированный на одной линии с мышечными волокнами с использованием нерассасывающейся мононити 4-0. Закройте разрез с помощью зажимов для раны или наложения швов.
12. После закрытия извлеките животное из наркоза и поместите его по отдельности в чистую сухую клетку для животных. Дайте крысе восстановиться на подогреваемой подушке и контролируйте температуру и частоту дыхания крысы каждые 15 минут, пока животное не сможет передвигаться. Лечите послеоперационную боль путем введения одобренного анальгетика в течение нескольких дней после применения инструментов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: крыса должна содержаться индивидуально до полного выздоровления.
13. По прошествии 14-дневного периода проведите тестирование электродов in vivo , чтобы оценить достоверность изготовленного по индивидуальному заказу эпимизионного электрода для фиксации физиологических изменений в мышечной активности. Поместите крысу с приборами на беговую дорожку для грызунов и произвольно подвергайте ее ходьбе вверх и вниз по склону, что приводит к увеличению или уменьшению сигнализации ЭМГ VL (наклон 16°, снижение под углом 16° со скоростью 16 метров в минуту). Соберите продольные данные (например, за 14 дней и 56 дней после установки контрольно-измерительных приборов) для обеспечения надежности с течением времени.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 14- и 56-дневные оценки были выбраны, так как период в 14 дней позволяет полностью восстановиться после хирургического вмешательства, а период в 56 дней превышает наш экспериментальный график. Мы рекомендуем другим проверять производительность и надежность электродов с помощью временных рамок, которые повторяют их экспериментальный график перед использованием. Скорость (16 м/мин) и условия ходьбы (уклон 16°, уклон 16°) были подобраны в соответствии с установленными условиями повышенного и пониженного возбуждения VL в данной модели¹⁰.
14. Измените параметры сбора данных в соответствии с потребностями эксперимента. Захватывайте сигналы ЭМГ во время ходьбы с частотой 2 000 Гц с помощью платформы сбора данных и синхронизируйте их с системой захвата движения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании другого устройства сбора данных соберите ЭМГ и захват движения в соответствии с инструкциями производителя и в соответствии с экспериментальными потребностями.
15. Извлекайте данные о походке за 25 секунд из каждого условия ходьбы и экспортируйте их в настраиваемый скрипт Python для дальнейшей обработки и анализа сигналов. Корректируйте базовую линию (ноль), выпрямляйте и сглаживайте с помощью алгоритма среднеквадратичного значения с шириной ячейки 50 мс. Применение алгоритма обнаружения пиков для выбора пиков RMS-EMG для использования в последующем анализе данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы кратко описали методы предварительной обработки и анализа данных ЭМГ, поскольку этот шаг сильно варьируется из-за языков программирования и программного и аппаратного обеспечения для сбора данных ЭМГ. Мы рекомендуем авторам обратиться к следующим ресурсам для получения дополнительной информации^: 3,11,12,13.

4. Тестирование на биосовместимость

1. После окончания лонгитюдного сбора ЭМГ (или в выбранный момент времени) усыпьте крысу с использованием соответствующих и одобренных методов (например, асфиксия с использованием CO₂ с последующей двусторонней торакотомией).
2. После эвтаназии извлеките двусторонние мышцы ВЛ путем создания разреза на переднебоковых правой и левой задних конечностях. Мгновенно заморозьте в жидком азоте и храните при температуре -80 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы электрод оставался на инструментируемой мышце (например, на правой VL) во время извлечения. В качестве альтернативы можно отметить субэлектродную область или извлечь только мышцу из субэлектродной области. Это не относится к контралатеральной/контрольной мышце.
3. С помощью криостата можно вырезать последовательные поперечные сечения мышц (7 мкм) из области непосредственно под электродно-фасциальной границей раздела. Вырежьте срезы из мышечного живота контралатерального ВЛ в качестве контрольного. Подробнее о криосекции см. в Kumar et al.¹⁴.
4. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E); см. Wang et al. для получения подробной информации о окрашивании H&E на поперечных срезах скелетных мышц¹⁵.
5. Исследуйте окрашенные срезы (инструментальные и контрольные) с помощью светового микроскопа с 20-кратным увеличением. Анализируйте гистологические изменения без учета происхождения образцов. Оцените состояние здоровья тканей с использованием следующих патологических признаков: инфильтрация иммунных клеток, внутреннее накопление мионуклеаров, фиброгенез и фрагментация сарколеммы.

5. Предлагаемый статистический анализ

1. Чтобы оценить производительность изготовленного по индивидуальному заказу эпимиизального электрода в сравнении с отраслевым стандартом, импортируйте данные ex vivo в выбранный статистический пакет. Примените следующие статистические тесты к данным ex vivo , собранным с изготовленных по индивидуальному заказу и стандартных промышленных электродов (например, 8 000 репрезентативных образцов из синусоидальной, треугольной и квадратной осциллограмм). Установите уровень альфа априори на уровне p ≤ 0.05.
   1. Чтобы проверить уровень согласования сигналов между электродами, используйте внутриклассовые корреляции (ICCs) и графики Бланда-Альтмана. Рассчитайте оценки ICC и их 95% доверительные интервалы на основе модели одиночного рейтинга (k = 2), абсолютного согласия, 2-сторонней модели случайных эффектов.
   2. Чтобы проверить степень, в которой запись осциллограмм изменяется с течением времени, также известную как временная синхронность, выполните корреляцию Пирсона со значениями, собранными с помощью изготовленных по индивидуальному заказу и стандартных промышленных электродов.
   3. Сравните среднее импеданс электродов для обеих контактных поверхностей (измеренное на частоте 1 кГц) выбранных электродов, изготовленных по индивидуальному заказу (например, 10 электродов), с импедансом стандартного электрода.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Значения импеданса электродов будут отличаться в зависимости от случая использования и материалов, используемых при изготовлении электродов.
2. Чтобы оценить качество записей in vivo , импортируйте данные, собранные во время ходьбы на беговой дорожке, в выбранный статистический пакет.
   1. Чтобы оценить достоверность изготовленного по индивидуальному заказу электрода во время испытаний in vivo (когда походка крысы нарушалась при ходьбе вверх и вниз по склону, что вызывало физиологические изменения в мышечной активности), выполните t-критерий Уэлча для сравнения средних пиковых значений для условий ходьбы в гору и вниз по склону.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Читателям рекомендуется проводить дополнительные тесты и анализы (например, оценки отношения сигнал/шум (SNR); см. Фундаментальные концепции Delysys в области сбора сигналов ЭМГ), которые не представлены здесь для краткости¹⁶.
   2. Чтобы оценить надежность передачи сигналов электродом с течением времени, оцените продольные данные, собранные в стабильных условиях (ровная ходьба со скоростью 16 м/мин с интервалом 14 и 56 дней после имплантации) с помощью парных t-тестов.

Результаты

Производительность ex vivo
ICC выявили высокий уровень согласованности между изготовленными по индивидуальному заказу и стандартными отраслевыми электродами по всем формам волн (синус [ICC = 0,993], квадрат [ICC = 0,995], треугольник [ICC = 0,958]; p < 0,001). Графики Бланда-Альтмана также выявили высокую степень согласования сигналов между электродами. Графики Бланда Альтмана и корреляции Пирсона обобщены на рисунке 3 с сильными положительными корреляциями между электродами, изготовленными по индивидуальному заказу, и стандартными промышленными электродами. Корреляции Пирсона выявили высокий уровень временной синхронности между изготовленным по индивидуальному заказу и стандартным для отрасли электродом по всем формам волны (синус [r = 0,987], квадрат [r = 0,990], треугольник [r = 0,931]).

Рисунок 3: Результаты тестирования ex vivo . Исходные данные с пользовательских и стандартных промышленных электродов для повторяющейся (A) синусоиды, (D) прямоугольной волны и (G) треугольной волны при 0,1 В и 5 Гц. (B,E,H) Корреляция между измерениями напряжения для пользовательских электродов и электродов MicroProbe для 8 000 образцов соответствующих осциллограмм. (К,Ж,И) График Блэнда Альтмана, оценивающий процентную разницу между пользовательским электродом и электродом MicroProbe по средним значениям соответствующих осциллограмм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Репрезентативный спектр импеданса для изготовленного по индивидуальному заказу эпимизиального электрода показан на рисунке 4. Несмотря на то, что измерения импеданса были собраны в диапазоне от 10 Гц до 31 кГц, результаты представлены на частоте 1 кГц, что является релевантной частотой для регистрации ЭМГ. Промышленный стандарт (электрод сравнения) имел импеданс 2 кОм. Для сравнения, среднее сопротивление 10 изготовленных по индивидуальному заказу эпимизионных электродов составило 3,61 ± 7,95 кОм и 1,63 ± 1,59 кОм при частоте 1 кГц для контактных поверхностей 1 и 2 соответственно.

Рисунок 4: Импеданс. Диаграмма магнитуды Боде, показывающая значение импеданса в Омах (Ω) на частоте ~ 1 кГц для репрезентативного эпимизиального электрода, изготовленного по индивидуальному заказу. Каналы 1 и 2 относятся к контактным поверхностям 1 и 2 соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Выступление in vivo (дополнительное видео S1)
Изготовленный по индивидуальному заказу электрод эффективно улавливал физиологические колебания активности ЭМГ VL, вызванные при различных условиях ходьбы на беговой дорожке. Примечательно, что средняя пиковая активность ЭМГ была значительно ниже при ходьбе вниз по склону (0,008 ± 0,005 мВ), чем при подъеме в гору (0,031 ± 0,180 мВ, p = 0,005), что согласуется с предыдущими результатами¹⁰. Кроме того, парный t-критерий показал, что пиковые значения амплитуды ЭМГ через 14 дней (0,01 ± 0,007 мВ) не показали существенной разницы с таковыми через 56 дней (0,012 ± 0,007 мВ, p > 0,05), что подтверждает долгосрочную надежность устройства (рис. 5). Значительно отличающиеся значения величины ЭМГ при одних и тех же условиях регистрации могут свидетельствовать о повреждении или выходе из строя электрода.

Иллюстрация 5: Надежность электродов in vivo . Диаграмма Тьюки о пиковой амплитуде ЭМГ (мВ) латеральной широкой мышцы во время ходьбы на беговой дорожке (16 м/мин) через 14 дней (T14) и 56 дней (T56) после применения инструментов. Сокращения: ЭМГ = электромиография; ns = не значимый. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Биосовместимость
H&E не выявила признаков воспаления в контрольной мышце (Рисунок 6, левая панель) по сравнению с инструментированной мышцей (Рисунок 6, правая панель). Это не включало явных доказательств инфильтрации иммунных клеток, внутреннего накопления мионуклеаров, фиброгенеза и/или фрагментации сарколеммы между поперечными срезами, извлеченными из контрольной или инструментированной мышцы.

Рисунок 6: Биосовместимость. Гистологическое сравнение контрольной (левой) и инструментальной (правой) латеральных широких мышц, окрашенных гематоксилином и эозином (40x). Масштабные линейки = 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1: Catch_tray.gcode. 3D-печать шаблона ловушек, разработанного как часть складного приспособления для захвата сложенных фольги от складного приспособления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Cutting_jig.gcode. 3D-печать шаблона режущего приспособления, который содержит равномерно расположенные пазы в качестве ориентира для последовательной перфорации силиконовой основы. Режущий кондуктор сконфигурирован для размещения двадцати фольги с образованием десяти биполярных эпимизионных электродов. Тем не менее, в настоящее время мы используем режущий кондуктор для производства партии из шести биполярных электродов, поскольку мы рекомендуем оставлять пространство между электродами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 3: Folding_jig.gcode. 3D-печать шаблона складывающегося приспособления, который позволяет легче складывать платино-иридиевую фольгу для формирования желаемой U-образной формы. При необходимости фальцовка фольги также может быть выполнена вручную. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительное видео S1: Тестирование in vivo . Передача сигналов ЭМГ о ВЛ во время ходьбы вниз (-16°) на моторизованной беговой дорожке со скоростью 16 м/мин с использованием специально изготовленного эпимизионного электрода ЭМГ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Наша цель состояла в том, чтобы оптимизировать процесс изготовления ЭМГ, обеспечив более широкое внедрение и внедрение конструкций эпимизиальных электродов, тем самым способствуя доступности и продвижению нервно-мышечных исследований. С этой целью мы представляем удобное руководство по поиску, изготовлению и тестированию недорогих эпимизиальных электродов на собственном производстве. В надежде поддержать другие исследовательские группы, мы также предоставляем дополнительные шаблоны для 3D-печати, чтобы облегчить производство эпимизионных электродов на собственном производстве для их исследовательских начинаний.

Исследователи, рассматривающие возможность внедрения этих методов изготовления, должны учитывать следующее: 1) параметры электродов, указанные в этом рабочем процессе (форма, размеры, площадь контактной поверхности, расстояние между электродами, длина провода и т. д.), были выбраны в соответствии с нашей экспериментальной моделью и должны быть модифицированы для различных случаев использования, 2) приварка подводящих проводов к контактной фольге является важным этапом, требующим практики для успешного выполнения; Регулировка длительности импульса и энергии сварки во время сварки может повысить успешность, 3) важно приложить напряжение к подводящим проводам и оценить производительность интерфейса после сварки, чтобы проверить соединение свинца с контактной поверхностью, 4) заключительный этап изготовления включает в себя покрытие и герметизацию электрода силиконом, что является простым, но важным процессом для оптимальной работы электрода. Силиконовое покрытие должно быть тонким и относительно гладким, чтобы предотвратить раздражение дермальных тканей во время имплантации, но чрезмерно тонкое покрытие может ухудшить работу электрода. Исследователям рекомендуется изменять соотношение силикон-толуол в соответствии со своими спецификациями, чтобы получить прочный, но тонкий и гладкий слой силиконового герметика.

При оценке характеристик электродов другие должны обратить внимание на следующее: 1) мы привели пример оценки in vivo , но мы рекомендуем читателю использовать процедуру тестирования in vivo , которая имитирует предполагаемый вариант использования их специально изготовленного эпимизионного электрода, 2) наш протокол тестирования in vivo также пространственно не позволял одновременную имплантацию изготовленных по индивидуальному заказу и стандартных для отрасли электродов. Таким образом, согласование сигналов между электродами не могло быть измерено in vivo и, следовательно, не оценивалось, 3) кроме того, наша конфигурация испытаний in vivo не позволяла оценить импеданс электродов после имплантации, 4) важно учитывать, что наши данные были протестированы ex vivo при относительно низких уровнях напряжения (<1 В) из-за наших экспериментальных потребностей. Таким образом, исследователи, которые рассматривают возможность подключения этих электродов, могут захотеть проверить их полезность при более высоких напряжениях. Это соображения, которые другие могут учитывать при тестировании своих собственных эпимизиальных электродов.

Предыдущая работа показала потенциал многоканальных записывающих электродов высокой плотности для более точного декодирования активности моторных нейронов 17,18,19,20. Мы призываем тех, кто заинтересован в разработке и использовании многоканальных эпимизиальных электродов, использовать и расширять предоставляемые нами учебные ресурсы. В дополнение к использованию в качестве регистрирующих электродов, эпимизиальные электроды обычно используются в качестве стимулирующих электродов в экспериментах по нейростимуляции 21,22,23 и контрольных экспериментах по протезированию ^24,25. Тем, кто заинтересован в использовании эпимизиальных электродов для этих целей, мы рекомендуем им использовать нашу работу и проверить стимулирующую способность своих собственных эпимизиальных электродов, изготовленных по индивидуальному заказу.

В целом, количественная оценка электрической активности мышц имеет основополагающее значение для понимания основных механизмов многочисленных патологий и эффективности потенциальных методов лечения. Этот обновленный рабочий процесс представляет собой простое руководство по производству собственных экономичных эпимизиальных электродов, которые можно использовать для надежной количественной оценки этого важного показателя здоровья опорно-двигательного аппарата. Мы надеемся, что эта методология может послужить образцом для других групп при изготовлении и тестировании своих собственных эпимизиальных электродов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
<материалы>прочныеэлектроды
			<сильный>Количество и цена за электрод
Контактная поверхность	Prince и Izant PT90/IR10 1,25 мм x 5 мм фольга	Каталог #1040055	2 за электрод $7.50 за фольгу $15.00 за электрод
Электродная проволока из нержавеющей стали с покрытием PFA	A-M Systems Многожильная проволока из нержавеющей стали с покрытием из PFA 50.8 и микро; m диаметр жилы	Каталог #793500	В зависимости от желаемой длины провода (например, 9-дюймовые подводящие провода x2)<чел/> $128 за катушку длиной 25 футов<чел/> $5.12 за фут<бр/> $0.42 за дюйм (x18)<бр/> $7.68 за электрод
Складной кондуктор	3D-печать (см. файл .gcode)	NA	NA
Герметик для корпуса электрода	Nusil Med-1137 жидкий силикон	Каталог #MED-1137	1 грамм<бр/> $344.66 за 2 унции (59.15 мл)<бр/> $5.83 за электрод
Силиконовая основа	Implantech Alliedsil Silicone Sheeting-Reinwarded, Long Term Implantable (8" x 6") .007 толстый	Каталог #701-07	10 мм x 5 мм лист $225.00 за 8 x 6 дюймов $0.36 за электрод (10 мм x 5 мм)
Разбавитель для смеси герметиков	Толуол 99.5% ACS Реагент 500мл или ксилол ACS 99.5%	Каталог #179418-500 ML	0.75 мл<бр/> $25.53 за 500 мл<бр/> $0.38 за электрод
Шаблон для перфорации силиконовой основы	Режущий приспособление – 3D-печатный (см. файл CAD)	NA	NA
Электрод, изготовленный на заказ: <сильный>$29.25
Стандартный промышленный электрод (патч-электрод EP105 EMG, 2 контакта, односторонний, 7 мм x 4 мм, микрозонд для медико-биологических наук): $ 305.00
Дополнительные материалы для изготовления
			<сильный>Количество и цена за электрод
Программное обеспечение для 3D-печати	Solidworks (Solidworks, 2022)
Micro-Tig welder	Сварочный аппарат Micro-Tig (CD1000SPM, одноимпульсный сварщик для исследований и сопротивления легкому производству, солнечный камень)	SKU  301010	$3,500
Ультразвуковая ванна	Ультразвуковая ванна (Ультразвуковая ванна серии CPX, Fisherbrand).	15-337-403	NA
Ex Vivo Материалы для тестирования
			<сильный>Количество и цена за электрод
Платформа и программное обеспечение для сбора данных	DigitalLynx 4sX Base Cheetah версии 6.0 (Neuralynx Inc.)	Аппаратное и программное обеспечение для сбора	NA
EMG Электродная интерфейсная плата (EIB)	EIB, EIB16-QC, Neuralynx Inc.	31-0603-0007	Генератор сигналов NA
	5 МГц Функциональный генератор, B& K Точность	4005DDS220V	$387.46
Потенциостат	PGSTAT1 потенциостат (EcoChemie, Утрехт, Нидерланды)	NA
Винт из нержавеющей стали	Fine Science Tools	19010-00	$98
Ex Vivo Материалы для тестирования
			<сильный>Количество и цена за электрод
Беговая дорожка для грызунов	Открытая беговая дорожка Exer 3/6, Columbus Instruments	NA	NA
Dental Cement	Excel Formula® Литой стоматологический материал, St. George Technology Inc.	#24211	$125.60
Световой микроскоп	Keyence BZ-X800, Keyence Corporation, Осака, Япония	NA
NA Система захвата движения	Optitrack Color Camera, Optitrack, NaturalPoint Inc.	NA	NA
Алгоритм обнаружения пиков	" SciPy.signal.find_peaks - Руководство по SciPy v1.8.1", 2022	NA	NA
Программное обеспечение для Python	Python Software Foundation. Справочник по языку Python, версия 3.9. Доступно в http://www.python.org		NA
NA Rat	HsdBlu: LE, Envigo	140	NA
Statistical sotware	GraphPad Prism version 10.0.0 (GraphPad Software, Бостон, Массачусетс США)	NA	NA