В этом протоколе представлена подробная методологическая основа для основанного на электропорации трансгенеза сердечных клеток в развивающихся сердцах мышей. Представленные здесь видеоматериалы облегчат изучение этой универсальной техники.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Эффективный подход к трансгенезу для доставки генов в эмбриональное сердце мыши
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Сердце млекопитающих — сложный орган, формирующийся в процессе развития с помощью очень разнообразных популяций клеток-предшественников. Происхождение, сроки пополнения и судьба этих прародителей имеют жизненно важное значение для правильного развития этого органа. Молекулярные механизмы, которые управляют морфогенезом сердца, имеют важное значение для понимания патогенеза врожденных пороков сердца и эмбриональной регенерации сердца. Классические подходы к исследованию этих механизмов использовали создание трансгенных мышей для оценки функции конкретных генов во время развития сердца. Тем не менее, трансгенез у мышей является сложным, трудоемким процессом, который часто не может быть выполнен для оценки роли конкретных генов в развитии сердца. Чтобы решить эту проблему, мы разработали протокол эффективной электропорации и культивирования эмбриональных сердец мышей, что позволяет с помощью транзиторного трансгенеза быстро оценить влияние усиления или потери функции генов, участвующих в развитии сердца. Используя эту методологию, мы успешно сверхэкспрессировали Meis1 в эмбриональном сердце, отдавая предпочтение трансфекции эпикардиальных клеток, демонстрируя возможности метода.
Введение
Сердце – это первый орган, который формируется во время эмбрионального развития. Этот процесс включает в себя пространственно-временную координацию различных популяций клеток-предшественников из различных областей эмбриона. Все это происходит в то время, когда развивающееся сердце продолжает биться и функционировать, подчеркивая замечательную координацию, необходимую для его формирования 1,2,3. Учитывая решающую роль сердца, строгая регуляция на клеточном и молекулярном уровнях имеет важное значение для его правильного формирования 4,5. Выявление механизмов, контролирующих развитие сердца, представляет большой интерес, поскольку они имеют решающее значение для раскрытия врожденных пороков сердца, которые поражают значительное числопациентов во всем мире. Кроме того, понимание развития сердца имеет решающее значение для расшифровки регенерации сердца, поскольку послеродовое сердце млекопитающих сохраняет регенеративную способность, которая теряется или затрудняется во взрослом возрасте. Следовательно, препарирование молекулярных регуляторов развития сердца является обязательным условием для продвижения исследований врожденных пороков сердца и регенерации сердца.
В стремлении к достижению этой цели все большее внимание уделяется исследованию роли эпикарда в развитии и регенерации сердца9. Эпикард представляет собой тонкий слой мезотелиальной ткани, который составляет самый внешний слой сердца млекопитающих (Рисунок 1). Недавние исследования показали важность эпикарда при повреждении сердца, показав, что эта ткань способна посылать сигналы пролиферации кардиомиоцитам в пораженной области, чтобы смягчить повреждение10,11. Несмотря на важность эпикарда, проведение дальнейших молекулярных исследований было затруднено из-за его огромной гетерогенности. Эксперименты с РНК одиночных клеток выявили гетерогенность эпикарда, содержащего несколько клеточных субпопуляций с различными транскриптомными сигнатурами 12,13,14,15,16. Таким образом, стратегия скрининга потенциальных регуляторов сердечного развития должна учитывать разнообразие эпикардиальных клеток-предшественников.
В этом смысле способность мышиной модели к генетической модификации способствовала идентификации многочисленных генов, имеющих решающее значение для развития сердца, что позволило создать мутантные линии с усилением функции (GOF) или потерей функции (LOF) определенных генов. Однако такие подходы предполагают значительные вложения времени и экспериментальных ресурсов; Поэтому они непрактичны при оценке роли большого числа генов-кандидатов. Кроме того, гены развития часто проявляют плейотропные функции в различных тканях или необходимы для раннего эмбрионального развития, что затрудняет интерпретацию их вклада в развитие в конкретном процессе. Несмотря на то, что можно нацелить функцию гена на определенные структуры или временные точки развития, это обычно требует использования более сложных генетических конструкций, которые может быть трудно создать или которые вообще недоступны.
Чтобы преодолеть эти ограничения, мы представляем методологию электропорации эмбриональных сердец мышей для транзиторного трансгенеза (рис. 2). В сочетании с культурой ex vivo и флуоресцентно-активируемой сортировкой клеток (FACS) эта стратегия демонстрирует свои возможности через транзиторный GOF Meis1, хорошо охарактеризованный ген, участвующий в развитии и регенерации сердца 17,18,19. В данной статье также исследуются другие потенциальные применения этой методологии, а также обсуждаются ее преимущества и ограничения, а также сравнение с существующими протоколами для транзиторной модуляции экспрессии генов. Мы считаем, что представленная структура и наглядные примеры улучшат понимание биологии эпикарда во время развития и болезни.
Рисунок 1: Эмбриональные слои сердца мыши. Принципиальная схема коронального изображения эмбрионального сердца мыши E13-14. Три основных клеточных слоя сердца представлены желтым (эндокард), красным (миокард) и синим (эпикардом) цветом. Перикард представлен коричневой линией. Четыре камеры сердца сокращенно обозначаются как ЛЖ – левый желудочек; ПЖ, правый желудочек; Лос-Анджелес, левое предсердие; РА, правое предсердие. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Схематический обзор протокола электропорации сердца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных CNIC и соответствуют действующему законодательству, включая Директиву ЕС 2010/63EU и Рекомендацию 2007/526/EC, как это предусмотрено испанским законодательством в соответствии с Real Decreto 53/2013. Для этого протокола использовались самки мышей дикого типа CD-1 в возрасте 15-21 недели. Подробная информация об используемых животных, реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.
1. Плазмида и подготовка инструмента
- Сначала приготовьте смесь для электропорации, добавив желаемую плазмидную ДНК в лед в конечной концентрации 1 г/л. Затем завершите смесь, добавив сахарозу в конечную концентрацию 6% (растворенную в PBS), биосовместимый краситель в дозе 0,01% и добавьте PBS до конечного объема 30 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: На один образец используется примерно 1-2 мкл электропорационной смеси. Масштабируйте пропорции электропорационной смеси в соответствии с количеством образцов в эксперименте. Помните, что ДНК для электропорации должна быть очищена от бактериальной культуры, обеспечивая оптимальную стабильность и минимальное количество загрязнений. Для получения более подробной информации о плазмидах, использованных в этом исследовании, обратитесь к разделу репрезентативных результатов. - Приготовьте питательную среду, добавив модифицированную среду Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 2% буфером Hepes и 1% пенициллином/стрептомицином. Выдерживайте среду в инкубаторе при температуре 37 °C до использования. Кроме того, нагрейте 1x PBS при 37 °C вместе со средой для выращивания.
- Подготовьте иглы, растянув стеклянный капилляр диаметром 20 мкм с помощью съемника пипетки при следующих условиях: нагрев = 550; pull = 100; скорость = 250; время = 120. Конечный диаметр после вытягивания должен составлять примерно 5-8 мкм.
- Установите параметры электропоратора на пять циклов по 50 мс при напряжении 40 В с интервалом 900 мс. Подготовьте электроды, ротовую пипетку и тупую иглу (рисунок 3A). Вооружите пипетку иглой для загрузки ДНК (рисунок 3А).
2. Вскрытие эмбрионов и экстракция сердца
- Установите нечто среднее между мышами дикого типа CD-1. На следующее утро выберите самок с вагинальной пробкой и отметьте это время как эмбриональный день E0,5. Усыпить животных на эмбриональные сутки Е12-12,5 путем вывиха шейки матки (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами).
- Аккуратно извлеките матку из мышки и поместите ее в сухое бумажное полотенце. После этого разрежьте матку с помощью тонких ножниц, вставив кончик ножниц в мезометрическую сторону и медленно проведя краем лезвия по всей длине. Выдержите децидуаны и перенесите их в питательную среду. Более подробную информацию можно найти в работе Behringer et al.20.
- Препарируйте децидуаи для извлечения эмбрионов, затем поместите эмбрионы в чашку Петри диаметром 60 мм с теплой питательной средой. С помощью тонких щипцов аккуратно разрежьте хвост и голову эмбриона так, чтобы от тела остался только ствол. Стадия эмбрионов может быть проверена путем оценки анатомических особенностей, как описано Wong et al.21.
- Затем с осторожностью удалите как можно больше ткани из ствола эмбриона, не повреждая сердце или легочные артерии и артерии аорты. Как только сердце будет обнажено, немедленно поместите его в новую, теплую среду для выращивания и держите в инкубаторе при температуре 37 °C до электропорации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание температуры сердца имеет решающее значение для его выживания. Следите за тем, чтобы среда всегда была теплой, и меняйте ее каждые 5-10 минут. С другой стороны, с образцами можно работать без сохранения стерильности, так как это не повлияет на эффективность процедуры. Обратите внимание, что питательная среда содержит антибиотики.
3. Электропорация сердца и культивирование ex vivo
- Загрузите примерно 10 μл плазмидной смеси (приготовленной на шаге 1.1) в иглу, осторожно отсасывая вверх с помощью ротовой пипетки.
- Подготовьте одно сердце для электропорации, поместив его в чистую чашку Петри диаметром 60 мм со стерильным 1x PBS, нагретым до 37 °C. Поместите чашку под препарирующий микроскоп (рисунок 3A).
- Подготовьте электроды, отрегулировав расстояние между положительным и отрицательным полюсами примерно до 4 мм (Рисунок 3B).
ПРИМЕЧАНИЕ: 4 мм — это расстояние до апертуры, на котором сердечки мыши E12.5 помещаются в электроды, используемые в этой работе. Рассмотрите возможность изменения этого расстояния в зависимости от размера образца или спецификаций электродов. - Аккуратно проколите самый поверхностный слой сердца иглой в ротовой пипетке. Осторожно нанесите пипеткой 1-2 мкл плазмидной смеси и извлеките иглу. Многократные инъекции могут быть выполнены для обеспечения оптимального проникновения, а также для увеличения количества электропорированных ячеек.
- Удерживайте электроды на месте так, чтобы сердце находилось между обоими полюсами (рисунок 3C). Затем проводят электропорацию сердца при указанных выше условиях.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения максимальной эффективности электропорации имеется возможность переключения полярности электродов и подачи еще одного импульса. - Перенесите электропорированное сердце в новую 12-луночную пластину, содержащую 1 мл питательной среды, и поместите ее при температуре 37 °C, 5%CO2.
- Повторяйте шаги с 3.1 по 3.6 до тех пор, пока все образцы в эксперименте не будут подвергнуты электропоре. Наконец, инкубируйте все сердца в инкубаторе при температуре 37 °C, 5%CO2, в течение 24 ч или до анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: В наших руках сердца могут быть оставлены в культуре на срок до 48 часов без видимых признаков разрушения (Дополнительный фильм 1; Дополнительный фильм 2; Дополнительный рисунок 1).
Рисунок 3: Установка электропорации. (А) Установка, используемая для электропорации. Красными стрелками обозначены электропоратор, электроды и чашка Петри, в которую электропорируются сердца. (А') Деталь иглы электропорации, как показано на рисунке (A) белым прямоугольником. (B) Подробная информация о скорректированном расстоянии до электродов, используемых в сердцах E12.5. (В) Схематическое изображение электропорации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
4. Сортировка клеток и иммуногистохимический анализ
- Для анализа образцов с помощью сортировки клеток приготовьте среду для расщепления ткани, смешав 400 мкл либеразы (5 мг/мл), 300 мкл диспазы (0,1 г/мл), 4 мкл CaCl2 (0,4 мкМ), 50 мкл MgCl2 (5 мкМ) и доведите до 10 мл DMEM. Держите на льду до использования. Каждому сердцу требуется примерно 1 мл пищеварительной среды. Отрегулируйте объемы в соответствии с количеством образцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для иммуногистохимии непосредственно зафиксируйте сердце в 1,5 мл 4% PFA в течение 2 ч при ЛТ или на ночь при 4 °C. На следующий день промойте сердца 3 раза с помощью PBS и приступайте к последующим гистологическим процедурам и процедурам иммуноокрашивания. Подробный протокол иммуногистохимии см. в Morris et al.22. - Переложите каждое сердце в культуре в новую пробирку, содержащую 1 мл ледяной среды для разложения.
- Чтобы облегчить диссоциацию, измельчите ткань, аккуратно прикладывая удовольствие шприцем 3-4 раза, и немедленно инкубируйте в горячей плите при температуре 37 °C, 600 об/мин в течение 45 минут.
- Отфильтруйте смесь для разложения через сетчатое фильтр 70 μм в новую пробирку и дайте ей опорожниться под действием силы тяжести. Затем отключите сквозной объем и снова отфильтруйте его с помощью клеточного сетчатого фильтра 40 мкм в новую пробирку объемом 50 мл.
- Добавьте 500 мкл фетальной бычьей сыворотки (FBS) и доведите до 30 мл с помощью холодного DMEM.
- Центрифугируйте смесь при плотности 240 х г в течение 10 минут при комнатной температуре.
- Выбросьте надосадочную жидкость и положите пробирку объемом 50 мл вверх дном на бумажное полотенце для полного высыхания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это удобный момент для приостановки эксперимента, заморозив клеточную гранулу. Если это так, ресуспендируйте клетки с 10% ДМСО в FBS и храните при -80 °C. - Для сортировки клеток ресуспендируйте клетки в 300 мкл сортировочного буфера (1% FBS, 1% пенициллин/стрептомицин в PBS) и добавьте 0,3 мкл DAPI (1000x). Выполните сортировку ячеек.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Чтобы продемонстрировать эффективность этого метода при проведении экспериментов по усилению функции (GOF) для соответствующих регуляторов развития сердца, была проведена электропорация с гиперэкспрессией транскрипционного фактора Meis1. Для этого из эмбрионов E9.5 была выделена РНК, а для получения комплементарной ДНК (кДНК) была проведена обратная транскрипция. Используя кДНК в качестве матрицы, кодирующую последовательность Meis1 клонировали (Дополнительная таблица 1) в экспрессирующу...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В целом, описанная здесь методология предлагает надежную основу для экспрессии трансгенных конструкций в развивающемся эпикарде (рисунок 4B), как показано на примере сверхэкспрессии Meis1 (рисунок 4C). При наличии соответствующих конструкций этот протокол может быть использован для временной оценки влияния либо усиления функции (GOF), либо потери функции (LOF) конкретного гена. LOF может быть реализован в методике путем трансфекции плазмиды, нацеленной на ген-ка...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Благодарности
Это исследование было поддержано грантом RTI2018-097617-J-I00 от испанского Ministerio de Ciencia e Innovación и Acción 9 от Universidad de Jaén до O.H.O. Grant PGC2018-096486-B-I00 от испанского Ministerio de Ciencia e Innovación и грантом H2020-MSCA-ITN-2016-722427 от программы EU Horizon 2020 для M.T. JMG был поддержан стипендией PhD от Министерства науки Испании и Fundación Severo Ochoa (PRE2022-101884). Как CNIC, так и CBMSO поддерживаются Министерством науки Испании, а CNIC поддерживается Фондом ProCNIC.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| #55 Щипцы | Dumont | 11295-51 | |
| 12-луночный прозрачный планшет для культивирования клеток с плоским дном | BD Falcon | 353043 | |
| тиски 35 мм | Grandado | Артикул 8798771617573 | |
| 40 µ m Клеточный фильтр | Fischer Scientific | 08-771-1 | |
| 50 мл пробирки | BD Falcon | 352070 | |
| 70 &; m Клеточный фильтр | Corning | CLS431751 | |
| Анти-GFP поликлональное антитело | Invitrogen | A10262 | Использовано 1:1000 разведение |
| Anti-Myosin 4 (MF20) Моноклональное антитело | Invitrogen | 14-6503-82 | 1:500 разведение использовано |
| CD1 Wild Type мыши | Предоставлено Animalary Unit (CNIC) | ||
| Расщепленная каспаза-3 (Asp175) Антитела | Клеточная сигнализация Технологии | 9661 | 1:400 используемое разведение |
| DAPI | Cell Signalling Technologies | 4083 | 1:1000 разведение используемое |
| Диспаза/коллагеназа | Рош | 10269638001 | |
| дистиллированная вода | |||
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 10313021 | |
| фетальная сыворотка крупного рогатого скота | Invitrogen | 10438-026 | |
| CO2-инкубатор Heracell 150i | Thermo Scientific | 51032720 | |
| Leica Стереоскопический микроскоп S8AP0 | Leica | 11524102 | |
| Liberase | Roche | 5401119001 | |
| Пуллер для микропипеток Модель P-97 | Sutter Instrument | SU-P-97 | |
| pCAG экспрессия плазмиды | Addgene | #89689 | |
| Пенициллин-стрептомицин | Invitrogen | 15070-063 | |
| Чашки Петри 35 × 10 мм | BD Falcon | 351008 | |
| чашки Петри 60 × 15 мм | BD Falcon | 353002 | |
| фенол Red | Merck | P3532 | |
| Наконечники | Повторно использовано со старого лабораторного оборудования | ||
| Эмбрион сывороточной культуры крысы, самцы крыс SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| Рекомбинантный антивильмовский опухолевый белок 1 (WT1) антитело | Abcam | ab89901 | 1:300 разведение используется |
| Квадратный волновой электропоратор CUY21SC | Nepa Gene | CUY664-10X15 | |
| Sterile PBS | Предоставлен и автоклавирован техническим блоком | ||
| Sucrose | Millipore | 84100 | |
| Пинцетные электроды с переменным зазором | Nepa Gene | CUY650P5 |
Ссылки
- Tyser, R. C., et al. Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat. eLife. 5, e17113(2016).
- Tyser, R. C. V., et al. Characterization of a common progenitor pool of the epicardium and myocardium. Science. 371 (6533), 2986(2021).
- Sendra, M., Domínguez, J., Torres, M., Ocaña, O. Dissecting the complexity of early heart progenitor cells. J Cardiovasc Dev Dis. 9 (1), 5(2021).
- Ivanovitch, K., Temiño, S., Torres, M. Live imaging of heart tube development in mouse reveals alternating phases of cardiac differentiation and morphogenesis. eLife. 6, e30668(2017).
- Ai, D., et al. Canonical Wnt signaling functions in second heart field to promote right ventricular growth. PNAS. 104 (22), 9319-9324 (2007).
- Zimmerman, M. S., et al. regional, and national burden of congenital heart disease, 1990-2017: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet Chil Adolesc Heal. 4 (3), 185-200 (2020).
- Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: Cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 529-541 (2013).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Cao, J., Poss, K. D. The epicardium as a hub for heart regeneration. Nat Rev Cardiol. 15 (10), 631-647 (2018).
- Zhou, B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. JCI. 121 (5), 1894-1904 (2011).
- Van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., Van Den Hoff, M. J. B. Cardiac regeneration from activated epicardium. PLOS One. 7 (9), e44692(2012).
- Hesse, J., et al. Single-cell transcriptomics defines heterogeneity of epicardial cells and fibroblasts within the infarcted murine heart. eLife. 10, e65921(2021).
- Streef, T. J., Smits, A. M. Epicardial contribution to the developing and injured heart: Exploring the Cellular composition of the epicardium. Front Cardiovasc Med. 8, 750243(2021).
- Sanchez-Fernandez, C., et al. Understanding epicardial cell heterogeneity during cardiogenesis and heart regeneration. J Cardiovasc Dev Dis. 10 (9), 376(2023).
- Quijada, P., et al. Coordination of endothelial cell positioning and fate specification by the epicardium. Nat Commun. 12 (1), 4155(2021).
- Mantri, M., et al. Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis. Nat Commun. 12 (1), 1771(2021).
- Paul, S., Zhang, X., He, J. Q. Homeobox gene Meis1 modulates cardiovascular regeneration. Semin Cell Dev Biol. 100, 52-61 (2020).
- Stankunas, K., et al. Pbx/Meis deficiencies demonstrate multigenetic origins of congenital heart disease. Circ Res. 103 (7), 702-709 (2008).
- Liu, Y., et al. Transcription factor Meis1 act as a new regulator of ischemic arrhythmias in mice. J Adv Res. 39, 275-289 (2022).
- Behringer, R. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Lab Press. Cold Spring Harbor, New York. (2014).
- Wong, M. D., et al. 4D atlas of the mouse embryo for precise morphological staging. Development. 142 (20), 3583-3591 (2015).
- Morris, L., Klanke, C., Lang, S., Lim, F. Y., Crombleholme, T. TdTomato and EGFP identification in histological sections: Insight and alternatives. Biotech Histochem. 85 (6), 379-387 (2010).
- Schiaffino, S., Rossi, A. C., Smerdu, V., Leinwand, L. A., Reggiani, C. Developmental myosins: expression patterns and functional significance. Skelet. Muscle. 5 (1), 22(2015).
- Eissa, N., et al. Stability of reference genes for messenger RNA quantification by real-time pcr in mouse dextran sodium sulfate experimental colitis. PLOS One. 11 (5), e0156289(2016).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Lai, S. R., Andrews, L. G., Tollefsbol, T. O. RNA interference using a plasmid construct expressing short-hairpin RNA. Methods Mol Biol. 405, 31-37 (2007).
- Carmona, R., Barrena, S., López Gambero, A. J., Rojas, A., Muñoz-Chápuli, R. Epicardial cell lineages and the origin of the coronary endothelium. FASEB J. 34 (4), 5223-5239 (2020).
- Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P. F. M., Mentink, M. M. T., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions. Circ Res. 82 (10), 1043-1052 (1998).
- Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. Transfection types, methods and strategies: A technical review. Peer J. 9, e11165(2021).
- Kałużna, E., Nadel, A., Zimna, A., Rozwadowska, N., Kolanowski, T. Modeling the human heart ex vivo-Current possibilities and strive for future applications. JTERM. 16 (10), 853-874 (2022).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Dyer, L. A., Patterson, C. A novel ex vivo culture method for the embryonic mouse heart. J Vis Exp. (75), e50359(2013).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
