Методическая статья

Выделение микроглии гипоталамуса из свежеперфузированного мозга взрослой мыши методом магнитно-активируемой сортировки клеток

2.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66769

⸱

6 сентября 2024 г.

 ,  ,  , 
1University of Bordeaux, INSERM, Neurocentre Magendie

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем протокол выделения микроглиальных клеток из гипоталамуса мыши (или эквивалентных небольших структур мозга) с помощью магнитно-активированной сортировки клеток (MACS) за относительно короткое время. Отсортированная по методу MACS микроглия гипоталамуса может быть использована для анализа ex vivo и может быть покрыта для выполнения анализов in vitro .

Аннотация

Микроглии, как резидентные макрофаги мозга, необходимы для поддержания гомеостаза мозга. Они формируют нейронные цепи во время развития, исследуют окружающую среду на предмет мусора или мертвых клеток, а также реагируют на инфекции и повреждения в мозге, среди многих других функций. Тем не менее, их важная роль в развитии нервной системы, синаптической пластичности и патофизиологии не была полностью определена, что подчеркивает необходимость дальнейших исследований. Чтобы получить более полное представление о роли микроглии в этих процессах, нам необходимо изолировать микроглию и охарактеризовать ее генетически, метаболически и функционально. Тем не менее, выделение микроглии от взрослых мышей, особенно от небольших структур мозга, является сложной задачей, поскольку они представляют собой небольшой процент от общего числа клеток мозга, а выход выделенной микроглии часто слишком низок. Магнитная изоляция микроглии с помощью микрогранул CD11b+ позволяет нам сортировать микроглиальные клетки гипоталамуса только что перфузированного мозга взрослой мыши. Используемый в настоящее время метод позволяет добиться относительно высокой чистоты и выхода продукции за короткий период времени при сохранении жизнеспособности клеток.

Введение

Микроглия соответствует 5-20% от общего числа нервных клеток и является единственными глиальными клетками, которые происходят из эритромиелоидных предшественников в желточном мешке и начинают колонизировать развивающийся мозг примерно на эмбриональный день E9.5 1,2. Это долгоживущие клетки, обладающие способностью к медленному самообновлению, независимо от клеток, полученных из костного мозга3. Являясь одними из наиболее высокодинамичных клеток, они способны приобретать различные фенотипы в ответ на контекстуальные и экологические сигналы 2,4. Среди сигналов, способных модулировать их активность, наиболее сильными являются повреждение центральной нервной системы (ЦНС), активность нейронов, а также питательные вещества. Растущее количество исследований демонстрирует ключевую роль микроглии в развитии травм, нейродегенеративных заболеваний и ожирения 2,5,6. Тем не менее, точная роль микроглии как в физиологических процессах, так и в патофизиологии требует дальнейшего изучения. Поэтому их транскрипционная, метаболическая и функциональная характеристика в различных условиях имеет большое значение и требует их выделения, так как исследования in situ пригодны для локализации и качественного сравнения ДНК, РНК и белков, а также морфологической характеристики микроглии.

Существуют различные методы выделения микроглии, среди которых градиентный метод Перколля7, сортировка клеток с помощью проточной цитометрии (FACS)8 и сортировка магнитно-активированных клеток (MACS). Выбор подходящего метода зависит от целей исследования и требуемого уровня чистоты для последующих применений. Выделение чистой микроглии из мозга взрослой мыши, особенно из небольших структур мозга, таких как гипоталамус, является сложной задачей из-за ограниченного количества микроглиальных клеток. Автоматизированная щадящая диссоциация гипоталамуса с использованием технологии Miltenyi позволяет очищать относительно высокий выход микроглии за короткое время с возможностью одновременной обработки до восьми образцов с помощью gentleMACS Octo Dissociator.

Гомогенизация тканей сопровождается очисткой микроглии с помощью колоночной технологии MACS и сверхмагнитных наноразмерных гранул CD11b+. Таким образом, все образцы обрабатываются точно таким же образом, в результате чего получаются неповрежденные клетки CD11b+. Следует отметить, что CD11b присутствует не только в микроглии, но также экспрессируется на других клетках миелоидной линии, включая макрофаги имоноциты9. Чтобы ограничить это, перфузия мозга ледяным физиологическим раствором перед экстракцией гипоталамуса (см. протокол шаг 2.6) обеспечивает элиминацию большинства миелоидных клеток, оставляя только потенциально небольшую часть резидентных макрофагов или тех, которые прилипают к кровеносным сосудам. Резидентные макрофаги и моноциты здоровой равновесной ЦНС составляют незначительный процент от общего числа иммунных клеток головного мозга (~10% и <2% соответственно)10,11. Таким образом, когда клетки мозга сортируются с помощью гранул CD11b+, можно выделить как микроглию, так и макрофаги, хотя подавляющее большинство из них являются микроглией.

Конечный выход микроглии и поддержание ее жизнеспособности позволяют проводить анализы ex vivo, а также in vitro, с преимуществом анализа конкретных областей мозга, представляющих интерес. Последние данные показали, что популяция микроглии очень неоднородна, представляя специфическую для региона экспрессию генов и морфологические характеристики и функцию 2,12,13. Таким образом, текущий протокол направлен на изоляцию и анализ микроглии взрослого человека в зависимости от региона. Действительно, мы можем охарактеризовать генетические, транскрипционные и трансляционные профили микроглии гипоталамуса у взрослых с помощью таких методов, как ОТ-кПЦР и секвенирование РНК, а также выполнить функциональный анализ in vitro.

Протокол

Все описанные эксперименты на животных были проведены в строгом соответствии с рекомендациями Европейского Союза (2013/63/EU) и одобрены местным этическим комитетом Университета Бордо (CEEA50) и Министерством высшего образования, исследований и инноваций Франции (нетехническое резюме утвержденного проекта NTS-FR-619193 v.1, 23-12-2022).

Следующий протокол выполняется на взрослых мышах C57BL/6 со средним возрастом 2-4 месяца. Тем не менее, его можно проводить у мышей всех возрастов и состояний, учитывая, что иммунный клеточный ландшафт ЦНС может быть изменен и процент резидентных макрофагов и моноцитов может быть увеличен (например, при старении и нейродегенерации).

1. Приготовление растворов

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие объемы и растворы строго относятся к выделению клеток Cd11b+.

  1. Определите общий необходимый объем D-PBS/0,5% альбумина бычьей сыворотки (BSA) в зависимости от количества образцов. Приготовьте раствор с использованием коммерчески доступного D-PBS с кальцием и магнием и порошком BSA (см. Таблицу материалов).
  2. Подготовьте помеченные пробирки для диссоциации (С-пробирки) и заполните каждую из них 1900 мкл буфера Z, входящего в комплект для диссоциации тканей мозга у взрослого человека (см. Таблицу материалов). Разморозьте ферменты и держите их на льду вместе со всеми буферами, необходимыми для следующих шагов.
  3. Приготовьте и положите на лед соответствующий объем 1x фосфатно-солевого буфера (PBS) (см. Таблицу материалов), необходимый для перфузии (шаг 2.6). Рассчитайте 10 мл на каждое животное плюс 10% излишка.
  4. Для анализа ОТ-кПЦР приготовьте буфер для количественной ПЦР на образец: 2,5 мкл тиоглицерина + 250 мкл буфера для лизиса, используя коммерчески доступный набор для очистки РНК (см. Таблицу материалов).
  5. Для количественного определения белка готовят буфер для лизиса, разбавляя коктейль ингибиторов фосфатазы и коктейль ингибиторов протеазы 1:100 в буфере для экстракции млекопитающих (см. Таблицу материалов).
  6. Для определения активных форм кислорода (АФК) и анализа на фагоцитоз приготовьте 1x HBSS из коммерчески доступного 10x HBSS (см. Таблицу материалов). Затем подготовьте буфер FACS, добавив 0,2% BSA к 1x HBSS.

2. Удаление головного мозга

  1. Успокоить животное дозой 20 мг/кг ксилазина; Затем усыпьте мышь с помощью передозировки 400 мг/кг пентобарбитала и поместите ее лежа на спине в лоток для препарирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие комбинации анестетиков для усыпления животного также могут работать.
  2. Наполните шприц объемом 10 мл 10 мл ледяного 1x PBS и прикрепите его к игле для бабочки 21 G.
  3. Как только мышь полностью обезболилась (убедитесь, защипнув лапы, чтобы убедиться в отсутствии реакции), дыхание остановилось, а сердце находится в фибрилляции, наложите на кожу щипцы и вскройте ножницами грудную полость, на уровне последних ребер и грудины.
  4. С помощью ножниц сделайте глубокий надрез по бокам грудной клетки по направлению к верхней части грудной клетки, чтобы обнажить сердце.
  5. Введите иглу 21 G в дистальную часть левого желудочка (убедитесь, что примерно 1/3 иглы находится внутри желудочка). Сразу же сделайте надрез через правое предсердие с помощью ножниц.
  6. Добавьте 10 мл ледяного 1x PBS, чтобы очистить мозг от любых циркулирующих иммунных клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Визуально проверьте мозг, чтобы убедиться, что он чистый и хорошо проработанный.
  7. Отрежьте голову мыши, осторожно извлеките мозг и поместите его на чашку Петри, наполненную льдом и покрытую алюминиевой фольгой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чашка Петри и фольга помогают увидеть части мозга. Полезно поддерживать прохладную среду во время измельчения мозговых частей, чтобы ограничить метаболическую активность.
  8. Изолируйте гипоталамус с помощью щипцов и разрежьте его на мелкие кусочки бритвенными лезвиями.
    1. Чтобы идентифицировать и препарировать гипоталамус, поместите мозг вверх ногами так, чтобы кора головного мозга была вентральной, а гипоталамус был виден дорсально на верхней поверхности. Отделите гипоталамус, который расположен в нижней части мозга по обе стороны от третьего желудочка, с помощью изогнутых щипцов. Средний вес гипоталамуса у взрослых мышей C57BL/6 составляет 15 мг.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Части мозга должны быть как можно меньше (<0,5 мм). Разрезание на мелкие кусочки является критически важным шагом, поскольку это позволяет лучше диссоциировать и получить более высокий выход клеток.
  9. Соберите кусочки гипоталамуса в диссоциационные трубки (С-трубки), предварительно заполненные 1900 мкл буфера Z (шаг 1.2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить хороший выход клеток микроглии, достаточный для проведения анализов, объедините минимум два (для количественного определения белка) или три (для количественного определения белка) или три (для количественной ПЦР и РНКсеквировки) гипоталамов на пробирку.

3. Диссоциация тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги должны выполняться на льду. Ни в коем случае не делайте вихревую суспензию клетки; Тщательно перемешивайте только с помощью пипетки объемом 1 000 μл.

  1. Приготовьте ферментную смесь 2 согласно таблице 1 (расчет общего объема для всех пробирок + 10% избытка). В каждую С-пробирку добавьте 50 мкл фермента, содержащегося в смеси 1 (см. Таблицу 1) и 30 мкл смеси ферментов 2. Все ферменты входят в состав набора для диссоциации тканей мозга у взрослых (см. Таблицу материалов).
  2. Закройте С-образные трубки и поместите их вверх ногами в диссоциатор с нагревательными кронштейнами в соответствии с инструкциями производителя. Запустите программу 37C_ABDK_02.
  3. Приготовьте защелкивающиеся пробирки объемом 15 мл (см. Таблицу материалов) с ситочками 70 мкм на них. Смочите ситечко 2 мл D-PBS.
  4. Когда программа диссоциации/разложения будет завершена, опорожните С-образную пробирку на ситечко и потрите наконечником объемом 200 мкл, чтобы уменьшить потерю клеток за счет увеличения фильтрации клеток и снижения адгезии тканевого гомогената к фильтру.
  5. Промойте пробирку 2 x 5 мл D-PBS, вылейте промывку на ситечко и поцарапайте наконечником объемом 200 мкл между промывками.
  6. Центрифугировать при 300 × г в течение 10 мин при 4 °C и полностью аспирировать надосадочную жидкость. Осторожно ресуспендируйте клеточную гранулу с соответствующим объемом холодного D-PBS в соответствии с таблицей 1.
  7. Немедленно тщательно перемешайте с 450 мкл градиентного реагента плотности (раствор для удаления мусора, см. Таблицу материалов) и очень аккуратно посыпьте 2 мл холодного D-PBS (см. Таблицу 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения слоев с различным градиентом плотности, D-PBS необходимо аккуратно накладывать каплю за каплей, с наименьшим возможным «возмущением», по 1 мл за раз с помощью пипетки объемом 1 мл.
  8. Центрифуга при 3 000 × g в течение 10 мин при 4 °C с медленным ускорением и медленным торможением (если 9 эквивалентно полному объему, используйте 5).
  9. Формируются три фазы. Полностью вдохните две верхние фазы и откажитесь от них. Следите за тем, чтобы не отсасывать третью нижнюю фазу.
  10. Наполните 1800 мкл холодной D-PBS и аккуратно переверните трубку 3 раза.
  11. Центрифугируйте при 1 000 × g в течение 10 минут при 4 °C с полным ускорением и полным тормозом и полностью аспирируйте надосадочную жидкость. Осторожно ресуспендируйте клеточную гранулу путем медленного пипетирования вверх и вниз 2 мл D-PBS/BSA.

4. Магнитная изоляция CD11b+ клеток

  1. Центрифугировать при 300 × г в течение 10 мин при 4 °C и полностью аспирировать надосадочную жидкость. Осторожно ресуспендируйте клеточную гранулу в 90 мкл буфера D-PBS/BSA.
  2. Добавьте 10 мкл смеси CD11b и микрогранул и хорошо перемешайте пипеткой.
  3. Выдерживать 15 минут при температуре 2-8 °C в холодильнике, не на льду; промыть ячейки, добавив 1 мл D-PBS/BSA, и центрифугировать при 300 × г в течение 10 мин при 4 °C; полностью аспирировать надосадочную жидкость. Осторожно восстановите суспендию в 500 мкл D-PBS/BSA.
  4. Запустите программу POSSEL2 на сепараторе, следуя инструкциям на экране. Поместите маленькие столбики (см. Таблицу материалов) в магнитное поле.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для сортировки магнитных элементов можно выбрать как маленькие, так и большие столбцы в соответствии со средним ожидаемым количеством ячеек. Малые колонки имеют вместимость до 1 × 107 помеченных ячеек, а большие колонки до 1 ×10 8. При выделении клеток из небольших структур, таких как гипоталамус, рекомендуется выделять небольшие колонки. Объемы реагентов отличаются при использовании больших колонок (см. инструкцию производителя).
  5. Смочите колонны (см. Таблицу материалов) 500 мкл D-PBS/BSA. Если отрицательная фракция клеток (CD11b-) необходима для дальнейшего анализа, поместите под колонки сборную пластину, а затем нанесите на колонки клеточную суспензию.
  6. Выполните три этапа промывки, добавляя 500 μL D-PBS/BSA за раз в колонку, каждый раз ожидая, пока буфер пройдет через колонку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: важно не допустить пересыхания верхней части колонны, поэтому рекомендуется не ждать, пока пройдет весь буфер.
  7. Перекачиваем общий сток фракции CD11b- из колодцев сборной тарелки в 15-миллилитровые пробирки.
  8. Извлеките колонку из сепаратора, поместите ее на пробирку объемом 5 мл и внесите в колонку пипеткой 1 мл D-PBS/BSA.
  9. Немедленно промойте фракцию ячейки с магнитной меткой, плотно приложив плунжер, входящий в комплект колонны.
  10. В конце концов, подсчитайте CD11b+ клетки с помощью гемацитометра или любого другого метода; Ожидайте ~15 000 клеток на гипоталамус.
  11. Центрифугируйте клеточную суспензию при 300 ×г в течение 10 мин при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.

5. Анализы

  1. Для анализа методом ОТ-кПЦР суспендируйте клеточные гранулы с помощью буфера для количественной ПЦР (для приготовления см. шаг 1.3) и храните пробирки при температуре -80 °C до экстракции мРНК. Выделите общую РНК, затем обработайте и проанализируйте ее в соответствии с рекомендациями MIQE14. Наконец, синтезируйте кДНК и выполните кПЦР с помощью устройства ОТ-ПЦР. Смотрите Таблицу материалов для всех используемых коммерчески доступных наборов.
  2. Для количественного определения белка промойте клеточные гранулы D-PBS (без BSA) не менее 2 раз, чтобы устранить BSA. Затем ресуспендируйте клеточные гранулы из двух гипоталамов с 20 мкл буфера для лизиса. Проведите количественное определение белка с помощью набора для анализа белка (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы следовали инструкциям производителя15 для количественного определения белков для проведения анализа активности серин/треонинкиназ.
  3. Для обнаружения активных форм кислорода (АФК) в клетках микроглии ресуспендируйте гранулу в 1x HBSS. Обрабатывайте клетки в соответствии с протоколом производителя набора для анализа проточной цитометрии (см. Таблицу материалов). Затем ресуспендируйте обработанные клетки в 200 мкл буфера FACS (для приготовления см. шаг 1.5) и выполните FACS для обнаружения клеток, подвергшихся окислительному стрессу.
  4. Для анализа на фагоцитоз отсортированные клетки в D-PBS/BSA инкубируют с флуоресцентными латексными шариками (см. Таблицу материалов) в течение 30 минут. Отрегулируйте количество бусин так, чтобы в среднем на ячейку приходилось 4 бусины. Затем центрифугируют при 300 × г в течение 7 мин при 4 °C, ресуспендируют в 200 мкл буфера FACS и считывают флуоресцентное излучение с помощью FACS (λex 575 нм; λem 610 нм).

Результаты

Оценка конечного выхода зависит от уровня чистоты и количества выделенных клеток и может быть определена с помощью ОТ-кПЦР, подсчета клеток и количественного определения белка. Чистота выделенных магнитных клеток гипоталамуса была подтверждена анализом экспрессии генов CD11b, C1qa, Gad1 и GFAP с помощью ОТ-кПЦР (рис. 1). CD11b и C1qa преимущественно экспрессируются микроглией в равновесном состоянии, ЦНС16 и Gad1 и GFAP служат нейронным и астроцитарным маркером соответственно. Общая кДНК из одного гипоталамуса варьировала от 55 до 98 нг. Примечательно, что только положительная фракция проявляла экспрессию CD11b и C1qa, что указывает на отсутствие какой-либо потенциальной потери клеток микроглии в отрицательной фракции. Грунтовки приведены в таблице 2.

Кроме того, незначительные уровни нейрональных и астроцитарных маркеров гарантируют, что подавляющее большинство выделенных клеток являются микроглией, поскольку резидентные макрофаги и моноциты составляют лишь 10% от общего объема иммунных клеток здорового мозга10,11. Эти результаты доказывают эффективность магнитного отбора и открывают путь к применению ОТ-кПЦР для оценки уровней экспрессии всех генов, представляющих интерес, в свежеотсортированных микроглиальных клетках гипоталамуса. Аналогичным образом, анализ РНК-секвенирования может быть выполнен на гипоталамо-сортированной микроглии, чтобы получить всестороннее представление об их транскриптоме.

Количество выделенных клеток было определено путем подсчета клеток и составило ~15 000 клеток на гипоталамус (упомянуто в шаге протокола 4.10). Кроме того, была количественно определена концентрация белка в отсортированной микроглии, что выявило среднюю концентрацию 0,5 мкг/мкл в клетках CD11b+ , выделенных из двух объединенных гипоталамов (рис. 2). Эти знания позволяют проводить различные анализы в зависимости от минимального порога белка. Кроме того, объединяя больше гипоталами, можно достичь более высокой концентрации, расширяя область анализа потенциала. Белки, извлеченные из микроглии гипоталамуса, облегчают использование различных методов, включая иммунологические анализы AlphaLISA и анализы активности киназы.

Кроме того, описанный протокол позволяет исследователям проводить несколько анализов ex vivo , что позволяет исследовать активность микроглии и ее роль в гипоталамусе как в физиологическом, так и в патологическом контексте. Количественная оценка продукции АФК представляет собой важнейший аспект микроглиального иммунного ответа17. Таким образом, после разделения микроглия может быть обработана коммерчески доступными реагентами, которые позволяют обнаруживать АФК в живых клетках за счет проявления повышенного флуоресцентного сигнала при окислении. Микроглии, магнитно выделенной из трех объединенных гипоталамов, достаточно для обнаружения АФК с помощью FACS, как показано на рисунке 3A, хотя наши результаты показывают довольно высокую вариабельность продукции клеток АФК среди проанализированных нами условий. Примечательно, что с помощью вышеупомянутого коммерческого набора (см. Таблицу материалов) мы также смогли оценить жизнеспособность отсортированных клеток Cd11b+ благодаря окрашиванию мертвых клеток, которое демонстрирует увеличение флуоресценции при связывании ДНК. В частности, наши данные показывают, что 99% клеток являются живыми (рис. 3B). Для различения живых и мертвых клеток, а также окислительно стрессованных и нестрессовых клеток использовались стратегии стробирования на основе их флуоресцентных свойств.

Еще одной важной особенностью микроглиальной активности является фагоцитоз, динамичный и строго регулируемый процесс, который играет ключевую роль в иммунном надзоре, восстановлении тканей и общем гомеостазе центральнойнервной системы. Примечательно, что клетки Cd11b+ , отсортированные с помощью магнитно-связанных гранул, могут быть культивированы в течение 24 ч, а затем инкубированы с флуоресцентными латексными микрогранулами в различные моменты времени для оценки изменений в фагоцитарной активности в различных условиях, либо с помощью FACS, либо с помощью флуоресцентной микроскопии. Свежеотсортированная микроглия также может подвергаться воздействию флуоресцентных шариков или любого типа pHrodo-связанных частиц (например, синаптосом) непосредственно внутри пробирки, а фагоцитоз может быть оценен с помощью анализа FACS.

В частности, мы инкубировали непосредственно в пробирке, содержащей отсортированную клеточную суспензию, микроглию, выделенную из двух объединенных гипоталамов, или целый мозг с флуоресцентными латексными шариками. Микроглия, которая фагоцитировала по крайней мере одну флуоресцентную бусину, может быть отличина от нефагоцитарных клеток с помощью проточной цитометрии, поскольку фагоцитарная микроглия будет демонстрировать усиленную флуоресценцию. Для гейтинга использовали отрицательные контрольные составы, не инкубированные с бусинами. В обоих наших экспериментальных условиях (мыши, которых кормили чау-чау в сравнении с пищей с высоким содержанием жиров (HFD)) мы наблюдали очень низкий процент фагоцитарной микроглии (рис. 4A). Тем не менее, этот результат показан здесь, чтобы продемонстрировать эффективность этого метода, который, что примечательно, позволяет также дифференцировать клетки, которые фагоцитировали 1 бусину, 2 бусины, 3 бусины и так далее (рис. 4B). Наконец, все омиксные подходы могут быть применены к изолированной гипоталамической микроглии. Мы предлагаем объединить три гипоталамуса, чтобы иметь достаточное количество клеток для выполнения этих анализов.

figure-results-1
Рисунок 1: Оценка чистоты клеток CD11b+ методом ОТ-кПЦР. Количественное определение в отсортированных клетках экспрессии мРНК интегрина CD11b, субкомпонента комплемента C1q субъединицы A C1q, декарбоксилазы глутаминовой кислоты Gad1 и глиального фибриллярного кислого белка GFAP нормализовано по уровням мРНК генов хозяйствования Eef1a1 и Sdha. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Количественное определение белка из клеток гипоталамуса после сортировки клеток. Количественная оценка концентрации белка в CD11b+ и CD11b-клетках. Как CD11b+, так и CD11b-клетки лизировали в 20 мкл лизисисного буфера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Обнаружение АФК в микроглиальных живых клетках. Количественное определение (А) клеток, подвергшихся окислительному стрессу, и (В) живых клеток в популяции отсортированных Cd11b+ клеток с помощью графиков относительного контура FACS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Количественная оценка фагоцитарной активности микроглии. (A) Количественная оценка фагоцитарных клеток в клетках Cd11b+ , отсортированных из двух гипоталамов или одного мозга, с помощью графика относительного контура FACS. (B) Процентное соотношение фагоцитарных клеток в соответствии с количеством фагоцитированных гранул с помощью графика относительного контура FACS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Ферментный микс 2
Фермент АБуфер YФермент Р
10 μл20 μл50 μл
Д-ПБСРешение для удаления мусораНаложение D-PBS
Структура 15-100 мг1000 мкл450 мкл2 мл

Таблица 1: Приготовление диссоциационной смеси (объемы относятся к одному образцу) и градиентных слоев.

ГеныБелокВперёдОбратный
ИтгамИнтегрин альфа М (CD11b)CTCATCACTGCTGGCCTATACAAGCAGCTTCATTCATCATGTCCTT
СдхаСукцинатдегидрогеназный комплекс флавопротеин субъединица АCCCTCTCATATGTGGACATCAACAAGGTCTTGTCGATAACAGGT
С1КАКомпонент комплемента 1, субкомпонент q, альфа-полипептидCGAGGTGTGGATCGAAAAGGGAAGATGCTGTCGGCTTCAGT
Гад1глутаматдекарбоксилаза 1GACCAATCTCTGTGACTCGCTTAGCTGGTCAGTGTATCGGAGGTCTT
Gfapглиальный фибриллярный кислый белокAGGTCCGCTTCCTGGAACAGGGCTCCTTGGCTCGAA

Таблица 2: Последовательности праймеров ОТ-кПЦР.

Проточная цитометрия сортировки клеток (FACS)Магнитно-активируемая сортировка клеток (MACS)
Биохимические антитела с флуоресцентной меткойМагнитные шарики, конъюгированные с антителами
Дифференцировка за пределами маркеров клеточной поверхностиДифференцировка только по маркерам клеточной поверхности
Значительный начальный урожайСкромная начальная доходность
Медленнее, чем MACS, для одновременной обработки большого количества образцовБыстрее, чем FACS, для одновременной обработки большого количества образцов
Менее щадящий, чем MACSМягче, чем FACS

Таблица 3: Представление характеристик и ограничений FACS и MACS

Обсуждение

Текущий протокол представляет собой выделение микроглии гипоталамуса из только что перфузированного мозга взрослой мыши с помощью магнитно-активируемой сортировки клеток. Представленные выше результаты подтверждают чистоту и жизнеспособность выделенных клеток, а также эффективность данного метода для функциональной характеристики микроглии ex vivo, например, посредством фагоцитарной активности и количественного определения продукции АФК. Классические методы выделения специфической клеточной популяции также могут быть использованы для микроглиальных клеток. Фракционирование по градиенту плотности является хорошо известным методом разделения различных ячеек и их частиц в соответствии с их размером и/или плотностью. Этот метод может быть применен для выделения и культивирования первичной микроглии. Однако очищение микроглии взрослого человека требует дальнейшей сортировки выделенных клеток мозга с помощью флуоресцентно-активируемой или иммуномагнитной сортировки клеток.

В частности, FACS полагается на биохимические антитела, помеченные флуоресцентными метками, чтобы помечать клетки и различать их в соответствии с большим количеством переменных, выходящих за рамки поверхностных маркеров, таких как их размер и метаболический статус. Тем не менее, процесс очистки клеток может быть более медленным и не таким щадящим, увеличивая количество мертвых клеток, а также требуя существенного начального выхода. Поэтому малое количество микроглии гипоталамуса уже является ограничивающим фактором. MACS использует магнитные шарики, конъюгированные с определенными антителами против конкретных клеточных эпитопов, и может работать со скромным начальным выходом, облегчая регионоспецифичные исследования микроглиальной динамики. Из-за сильного магнитного поля микрошариков требуется минимальная маркировка; следовательно, он мягче, чем FACS, обеспечивая поддержание целостности клеток. Кроме того, MACS работает быстрее, чем FACS, когда требуется одновременная обработка большого количества образцов. Это дает явное преимущество в поддержании высокой жизнеспособности клеток, которая также может быть достигнута за счет небольшого начального выхода (Таблица 3).

Основные проблемы выделения микроглии из гипоталамуса, которые могут быть эффективно решены с помощью технологии MACS, включают достижение достаточного конечного выхода и обеспечение сохранения целостности клеток. Необходимое количество клеток зависит от характера выбранного анализа после изоляции. Например, изучение функциональной роли микроглии in vitro требует значительного количества клеток. Это подчеркивает важность первоначального пула одной и той же области мозга у разных мышей с идентичными условиями, прежде чем приступать к процессу изоляции. И наоборот, такие методы, как высокоточное секвенирование одиночных клеток, не требуют большой популяции клеток, и, в свою очередь, объединение нескольких мышей не требуется.

Чтобы максимизировать выход клеток, крайне важно придерживаться определенных шагов в протоколе. Эффективная диссоциация инициируется разрезанием гипоталамуса на мелкие кусочки, а затем обеспечением их сохранения в буфере на дне трубки во время процесса. Кроме того, сочетание механической диссоциации с ферментативной деградацией внеклеточного матрикса обеспечивает значительно высокий выход клеток. Тем не менее, мы должны быть крайне осторожны с интерпретацией результатов, поскольку ферментативная диссоциация, выполненная при 37 °C, может вызвать транскрипционные и трансляционныеизменения. Для предотвращения технически опосредованных изменений можно использовать соответствующий контроль с ингибиторами транскрипции и трансляции19. Также можно приступать к ферментативной диссоциации при более низкой температуре, например, в холодном помещении (эффективность может быть снижена), хотя диссоциация может больше зависеть от механического воздействия, чем от ферментативного. После диссоциации клеточную суспензию предварительно промывают и переносят в сетчатые фильтры, а также проводят еще две тщательные промывки пробирок для предотвращения потери клеток. Еще одним важным этапом является удаление мусора и миелина, достигаемое центрифугированием с градиентом плотности и образованием различных слоев. Следовательно, достижение значительного конечного выхода требует тщательного обращения как с гипоталамической тканью, так и с клеточной суспензией, поддерживая их всегда на льду, чтобы замедлить метаболизм и сохранить их фенотип in vivo .

Кроме того, есть определенные моменты, с которыми мы должны быть чрезвычайно осторожны, чтобы достичь максимальной чистоты микроглии и сохранить фенотип клеток микроглии. Перфузия, проводимая при температуре 4 °C, имеет решающее значение для элиминации всех циркулирующих CD11b+ клеток, обеспечивая наивысшую потенциальную чистоту микроглии. Однако в случае нарушения гематоэнцефалического барьера более высокий процент циркулирующих иммунных клеток может колонизировать мозг, мешая изучению самой микроглии. Чтобы смягчить эту проблему, альтернативный подход включает в себя реализацию вторичного раунда магнитной изоляции с использованием микрогранул, которые конъюгированы с антителом CD45. CD45 является маркером клеточной поверхности, проявляющим высокую экспрессию в макрофагах20 , и последующий поток этого круга включает только клетки микроглии. Эта стратегия использования двух раундов магнитной изоляции усиливает специфичность процесса; Тем не менее, это требует дополнительного времени, что создает потенциальный риск нарушения клеточной целостности и/или фенотипа микроглии. Следовательно, решающим фактором для сохранения функциональных характеристик и целостности клеток является быстрая изоляция мозговой ткани и удержание ее на льду до тех пор, пока не начнется процесс диссоциации. Таким образом, этот аналитический подход улучшает понимание функции и поведения микроглии, предоставляя ценную информацию об их динамических реакциях в гипоталамусе.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

AN поддерживается Institut Universitaire de France (IUF), Университетом Бордо, Французским фондом исследований мозга (FRC), GLN (Lipid-Nutrition Group) и Национальным исследовательским агентством (ANR, PRC 2023-MicroNRJ). CA был поддержан Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-ARF201809006962). Этот проект получил финансирование в рамках Программы исследований и инноваций Европейского Союза «Горизонт Европа» в рамках MSCA Doctoral Networks 2021, No 101072759 (FuElThEbRaiNIn healtThYaging and age-related diseases, ETERNITY.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Набор для диссоциации мозга у взрослыхMiltenyi130-107-677Набор содержит буфер Z, буфер Y, ферменты A и P, раствор для удаления мусора, буфер A (для растворения фермента A).
Альбумин крупного рогатого скота FrV BSAEuroMedex04-100-812-C
CD11b (Microglia) Микрогранулы, человеческие и мышиные - малый размерMiltenyi130-093-636
CellROX Green Flow Cytometry Anase KitInvitrogenC10492
Центрифужная пробирка, крышка Snap-Pop 15 млCellTreat978449
DPBS, кальций, магний, глюкоза, пируватGibco14287-072
gentleMACS C TubesMiltenyi130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator with HeatersMiltenyi130-096-427
Halt Коктейль ингибиторов фосфатазы (100x)Thermofisher78420
Halt Коктейль ингибиторов протеазы, без ЭДТА (100x)Thermofisher78437
HBSS (10x), кальций, магний, без фенола красныйThermofisher14065056
Латексные шарики, карбоксилат-модифицированный полистирол, флуоресцентный красныйSigma-AldrichL3280
LightCycler  480 SYBR Green I MasterRoche 4707516001Этот реагент использовался для проведения ПЦР.
Ситечки MACS SmartStrainers (70 и микро; m)Miltenyi130-110-916
Micro BCA Protein Analysis KitThermofisher23235
M-PER Mammalian Extraction BufferThermofisher78503
MS КолонкиMiltenyi130-042-201Упоминаются в протоколе как малые колонки.
MultiMACS Cell24 Сепаратор PlusMiltenyi130-098-637
PBSS, pH 7,4 Thermofisher10010023
qScript XLT кДНК SuperMixQuanta biosciences733-1177Набор использовался для синтеза кДНК.
ReliaPrep RNA Miniprep SystemsPromegaZ6011Набор содержит 1-тиоглицерин и буфер BL (в протоколе называется буфером для лизиса) и он использовался для выделения общей РНК.
Vacutainer safety-lok 21 GBecton Dickinson367282

Ссылки

  1. Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front Cell Neurosci. 7, 45(2013).
  2. Paolicelli, R. C., et al. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
  3. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. V. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat Neurosci. 10 (12), 1538-1543 (2007).
  4. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  5. Alexaki, V. I. The impact of obesity on microglial function: immune, metabolic and endocrine perspectives. Cells. 10 (7), 1584(2021).
  6. Gao, C., Jiang, J., Tan, Y., Chen, S. Microglia in neurodegenerative diseases: mechanism and potential therapeutic targets. Sig Transduct Target Ther. 8 (1), 359(2023).
  7. Lee, J. -K., Tansey, M. G. Microglia isolation from adult mouse brain. Microglia: Methods Mol Biol. 1041, 17-23 (2013).
  8. Schwarz, J. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. J Vis Exp. (2015), (2015).
  9. Lee, E., Eo, J. -C., Lee, C., Yu, J. -W. Distinct features of brain-resident macrophages: microglia and non-parenchymal brain macrophages. Mol Cells. 44 (5), 281-291 (2021).
  10. Korin, B., et al. single-cell characterization of the brain's immune compartment. Nat Neurosci. 20 (9), 1300-1309 (2017).
  11. Mrdjen, D., et al. High-dimensional single-cell mapping of central nervous system immune cells reveals distinct myeloid subsets in health, aging, and disease. Immunity. 48 (2), 380-395 (2018).
  12. Grabert, K., et al. Microglial brain region−dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19 (3), 504-516 (2016).
  13. Tan, Y. -L., Yuan, Y., Tian, L. Microglial regional heterogeneity and its role in the brain. Mol Psychiatry. 25 (2), 351-367 (2020).
  14. Bustin, S. A., et al. The MIQE Guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  15. PamGene International B. V. 1160-Preparation-Lysates-of-Cell-Lines-or-Purified-Cells.pdf. PamGene International B. V. , (2022).
  16. Fonseca, M. I., et al. Cell-specific deletion of C1qa identifies microglia as the dominant source of C1q in mouse brain. J Neuroinflamm. 14 (1), 48(2017).
  17. Simpson, D. S. A., Oliver, P. L. ROS generation in microglia: understanding oxidative stress and inflammation in neurodegenerative disease. Antioxidants. 9 (8), 743(2020).
  18. Galloway, D. A., Phillips, A. E. M., Owen, D. R. J., Moore, C. S. Phagocytosis in the brain: homeostasis and disease. Front Immunol. 10, 790(2019).
  19. Marsh, S. E., et al. Dissection of artifactual and confounding glial signatures by single-cell sequencing of mouse and human brain. Nat Neurosci. 25 (3), 306-316 (2022).
  20. DePaula-Silva, A. B., et al. Differential transcriptional profiles identify microglial- and macrophage-specific gene markers expressed during virus-induced neuroinflammation. J Neuroinflammation. 16 (1), 152(2019).

Перепечатки и разрешения

Теги

CD11b
Выделение микроглии гипоталамуса из свежеперфузированного мозга взрослой мыши методом магнитно-активируемой сортировки клеток
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.