PyOKR: полуавтоматический метод количественной оценки способности отслеживания оптокинетических рефлексов

James K. Kiraly; Scott C. Harris; Timour Al-Khindi; Felice A. Dunn; Alex L. Kolodkin

doi:10.3791/66779

Методическая статья

PyOKR: полуавтоматический метод количественной оценки способности отслеживания оптокинетических рефлексов

DOI:

10.3791/66779

⸱

12 апреля 2024 г.

James K. Kiraly¹ , Scott C. Harris² , Timour Al-Khindi¹ , Felice A. Dunn² , Alex L. Kolodkin¹

¹Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, The Johns Hopkins Kavli Neuroscience Discovery Institute, The Johns Hopkins University School of Medicine, ²Department of Ophthalmology, University of California, San Franciso

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы опишем PyOKR, полуавтоматический метод количественного анализа, который напрямую измеряет движения глаз в результате зрительных реакций на движение двумерного изображения. Пользовательский интерфейс и алгоритм анализа на основе Python обеспечивают более высокую пропускную способность и более точные количественные измерения параметров отслеживания движения глаз по сравнению с предыдущими методами.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изучение поведенческих реакций на визуальные стимулы является ключевым компонентом понимания функции зрительной системы. Одной из заметных реакций является оптокинетический рефлекс (OKR), высококонсервативное врожденное поведение, необходимое для стабилизации изображения на сетчатке. OKR обеспечивает надежное считывание возможностей отслеживания изображений и был тщательно изучен для понимания схем и функций зрительных систем у животных с различным генетическим происхождением. OKR состоит из двух фаз: медленной фазы слежения, когда глаз следует за стимулом к краю зрительной плоскости, и компенсаторной быстрой фазовой саккады, которая сбрасывает положение глаза на орбите. Предыдущие методы количественной оценки коэффициента усиления, хотя и надежны, трудоемки и могут быть субъективными или произвольными. Чтобы получить более быструю и воспроизводимую количественную оценку способности отслеживания движения глаз, мы разработали новую полуавтоматическую программу анализа PyOKR, которая позволяет количественно оценивать двумерное движение по отслеживанию движения глаз в ответ на любой направленный стимул, в дополнение к возможности адаптации к любому типу видеоокулграфического оборудования. Этот метод обеспечивает автоматическую фильтрацию, выбор медленных фаз отслеживания, моделирование вертикальных и горизонтальных векторов глаза, количественную оценку прироста движения глаз относительно скорости стимула и организацию полученных данных в удобную электронную таблицу для статистических и графических сравнений. Этот конвейер количественного и оптимизированного анализа, легко доступный через импорт PyPI, обеспечивает быстрое и прямое измерение реакций OKR, тем самым облегчая изучение визуальных поведенческих реакций.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стабилизация изображения основана на точных глазодвигательных реакциях для компенсации глобального оптического потока, возникающего во время самостоятельного движения. Эта стабилизация обусловлена в первую очередь двумя двигательными реакциями: оптокинетическим рефлексом (OKR) и вестибуло-окулярным рефлексом (VOR)^1,2,3. Медленное глобальное движение по сетчатке индуцирует OKR, который вызывает рефлекторное вращение глаза в соответствующем направлении для стабилизации изображения ^1,2. Это движение, известное как медленная фаза, прерывается компенсаторными саккадами, известными как быстрая фаза, в которой глаз быстро перезагружается в противоположном направлении, чтобы обеспечить новую медленную фазу. Здесь мы определяем эти быстрофазные саккады как движения, отслеживающие взгляд (ETM). В то время как VOR полагается на вестибулярную систему для вызова движений глаз для компенсации движений головы³, OKR инициируется в сетчатке возбуждением ON и последующей передачей сигналов в вспомогательную оптическую систему (AOS) в среднем мозге ^4,5. Из-за своей прямой зависимости от цепей сетчатки, OKR часто используется для определения способности к визуальному отслеживанию как в исследовательских, так и в клинических условиях ^6,7.

OKR был широко изучен в качестве инструмента для оценки основных зрительных способностей ^2,6,8, развития DSGC ^9,10,11,12^, глазодвигательных реакций¹³ и физиологических различий между генетическими фонами⁷. OKR оценивают у животных с фиксированной головой, которым предъявляли движущийся стимул¹⁴. Глазодвигательные реакции обычно фиксируются с помощью различных видеоинструментов, а движения, отслеживающие движение глаз, фиксируются в виде волн OKR в горизонтальном и вертикальном направлениях⁹. Для количественной оценки способности к отслеживанию были описаны два основных показателя: усиление отслеживания (скорость движения глаза относительно скорости стимула) и частота ETM (количество быстрых фазовых саккад за определенный период времени). Расчет усиления исторически использовался для непосредственного измерения угловой скорости глаза для оценки способности к слежению; Однако эти расчеты трудоемки и могут быть произвольно получены на основе методов видеоокулографии и последующей количественной оценки. Для более быстрой оценки OKR подсчет частоты ETM был использован в качестве альтернативного метода измерения остроты трекинга⁷. Несмотря на то, что это обеспечивает довольно точную оценку способности отслеживания, этот метод опирается на косвенную метрику для количественной оценки медленной фазовой реакции и вносит ряд погрешностей. К ним относятся смещение наблюдателя при определении саккады, зависимость от временных последовательных саккадических реакций в течение заданной эпохи и неспособность оценить величину медленной фазовой реакции.

Чтобы решить эти проблемы с помощью существующих подходов к оценке OKR и обеспечить высокую пропускную углубленную количественную оценку параметров OKR, мы разработали новый метод анализа для количественной оценки осциллограмм OKR. Наш подход использует доступную программную платформу на основе Python под названием «PyOKR». С помощью этого программного обеспечения можно изучать моделирование и количественную оценку медленных фазовых откликов OKR более глубоко и с повышенной параметризацией. Программное обеспечение обеспечивает доступную и воспроизводимую количественную оценку реакций на множество визуальных стимулов, а также двумерное визуальное отслеживание в ответ на горизонтальное и вертикальное движение.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты на животных, проведенные в Медицинской школе Университета Джона Хопкинса (JHUSOM), были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) при JHUSOM. Все эксперименты, проведенные в Калифорнийском университете в Сан-Франциско (UCSF), были проведены в соответствии с протоколами, утвержденными Программой институционального ухода за животными и их использования UCSF.

1. Сбор поведенческих данных

Записывайте движения глаз OKR с помощью выбранного метода видеоокулографии для генерации волновых данных (т. е. временного ряда угла взгляда глаза в сферических координатах).
ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные данные, собранные в JHUSOM, были получены с помощью операции по имплантации постыля головы и видеоокулографии, как описано ранее ^9,13 (Рисунок 1). Репрезентативные данные, собранные из UCSF, были получены с помощью операции по имплантации головного столба и метода видеоокулографии, как описано ранее на^{рисунке 10} (рис. 7).
1. Обратите внимание на параметры стимула и записи: частоту кадров записи, скорость и направление стимула, а также промежутки времени между и после эпох стимулов. Для синусоидальных стимулов также обратите внимание на амплитуду и частоту волны стимула.
Экспорт собранных волновых данных в формате . CSV-файл, содержащий данные о горизонтальных и вертикальных волнах (по азимуту и углу места).
1. Организация волновых данных в виде разделителей табуляцией . CSV-файл с двумя столбцами, содержащий горизонтальные данные (epxWave) и вертикальные данные (epyWave).

2. Установка аналитического программного обеспечения

Скачайте и установите Python.
1. Для контроля графиков установите Spyder через Anaconda.
2. Чтобы убедиться, что графики работают правильно в Spyder, перейдите в Инструменты > Настройки > Консоль Ipython > Графика > Графический бэкенд. Установите для параметра Встроенный значение Автоматически.
Создание новой среды Anaconda с помощью Python.
Установите PyOKR через PyPi с помощью pip install PyOKR для установки последней версии вместе с зависимостями пакета (Supplementary Coding File 1 и Supplementary Coding File 2)
Если используется компьютер с Windows, запустите OKR_win импорта PyOKR как o, а затем o.run().
Если используется компьютер Mac, запустите OKR_osx импорта PyOKR как o , а затем o.run().

3. Анализ волновых данных

Инициализация анализа и импорт файлов
1. Запустите o.run() в .py скрипте, чтобы открыть пользовательский интерфейс.
2. В разделе «Файл» используйте функцию «Открыть » или команду Ctrl+O [команда iOS] , чтобы открыть браузер, который позволит пользователю выбрать нужный файл wave.
3. В разделе Файл используйте кнопку Экспорт папки или команду Ctrl+E , чтобы открыть браузер папок, который позволит выбрать выходную папку, в которую будут экспортированы окончательные анализы.
4. Введите имя файла окончательного анализа в поле Выходной файл в рекомендуемом формате, например AnimalGenotype_AnimalNumber_Analysis.
5. Задайте программу для отдельного животного с помощью команды Задать тему в разделе Файл или команды Ctrl+S , чтобы инициализировать набор данных для отдельного животного.
Определение параметров волнового файла
1. Чтобы начать настройку параметров стимула, определите направленность в разделе Выбрать направление стимула , выбрав одно из четырех сторон света. Для синусоидальных стимулов выберите тот, который содержит (Горизонтальный) или (Вертикальный) соответственно, при этом кардинальное направление определяет начальное направление синусоидальной волны.
2. Установите тип стимула в разделе Выберите тип стимула : Однонаправленный, Осцилляторный или Наклонный.
3. После установки направленности импортируйте либо собственный набор данных о положении стимула (Import own stimulus vector data), либо автоматически сгенерируйте вектор на основе параметров (Generate stimulus vector from parameters). Если вы импортируете вектор стимула, перейдите к пункту 3.2.3.1, а затем перейдите к шагу 3.3. Если вы генерируете вектор стимула, перейдите к следующим шагам.
  1. Если вы импортируете собственные векторные данные, импортируйте значения расстояния до стимула (т.е. временной ряд, описывающий, как далеко стимул перемещается между каждым соседним кадром захвата) в том же формате, который описан в шаге 3.2.1. Кроме того, анализируйте весь набор данных как одну эпоху, а не разбивайте его на отдельные эпохи, так как функциональность для подмножества импортируемого значения стимула не была добавлена с версии PyOKR v1.1.2.
4. В разделе Параметры стимула задайте параметры стимула, используемого для сбора данных.
  1. Установите продолжительность времени отсутствия стимула в начале (голова) и в конце (хвост) данного испытания с помощью функции «Орел и решка».
  2. Установите количество времени, в течение которого стимул отображается, количество времени отсутствия стимула после и общее количество эпох в рамках данного испытания с помощью Длины эпохи, Продолжительности после стимуляции и Числа эпох соответственно.
  3. Для однонаправленных и косых стимулов установите скорость стимула в градусах в секунду с помощью параметров «Горизонтальная скорость» и «Вертикальная скорость».
  4. Установите скорость съемки камеры сбора данных с помощью параметра Частота кадров захвата.
  5. Для синусоидальных стимулов сгенерируйте синусоидальную волну для моделирования колебательных стимулов с частотой и амплитудой.
5. После параметризации создайте соответствующую модель на основе введенной выше информации о стимуле с помощью функции Создать вектор стимула из параметров.
6. Выберите заданную эпоху для входного стимула с помощью функции Выбрать эпоху для сканирования файла всей волны.
Контролируемый выбор этапов отслеживания
1. Чтобы определить области медленного отслеживания, автоматически выбирайте быстрые фазовые саккады с предварительной корректировкой , щелкнув «Неотфильтрованные данные » или «Отфильтрованные данные», которые пометят потенциальные саккады на основе максимальных изменений скорости.
2. В разделе «Неотфильтрованные данные» убедитесь, что саккады выбраны точно с помощью синей точки. Если автоматический выбор неточен, вручную удалите точки с помощью левой кнопки мыши (ЛКМ) или добавьте точки с помощью правой кнопки мыши (ПКМ). Когда быстрые фазовые саккады выбраны правильно, сохраните точки с помощью средней кнопки мыши (MMB) и закройте график.
3. Если требуется автоматическая фильтрация, установите пороговое значение Z-score и нажмите «Отфильтрованные данные », чтобы автоматически отфильтровать саккады. При необходимости используйте тот же ручной контроль, который описан в шаге 3.3.2, чтобы удалить любой шум.
4. После правильного выбора саккады нажмите Point Adjustment , чтобы выбрать область для удаления. Измените верхнюю и нижнюю точки с помощью аналогичной схемы управления, описанной ранее в шаге 3.3.2. Редактирование верхних (зеленых) точек с помощью ЛКМ или ПКМ и редактирование нижних (красных) точек с помощью ЛКМ или Shift+ПКМ. Когда точки размещены правильно, используйте MMB для сохранения точек.
  ПРИМЕЧАНИЕ: при использовании Mac регулировка нижней и верхней точек осуществляется двумя отдельными кнопками и выполняется по той же схеме управления, которая описана в шаге 3.3.2.
Анализ фаз медленного отслеживания
1. Задайте порядок полиномиальной модели с помощью инструмента Задать порядок полиномов , чтобы определить модель полинома, которая будет подогнана к отдельным медленным фазам.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Для однонаправленных или косвенных стимулов значением по умолчанию является 1, так как линейность необходима для расчета усиления слежения. Для синусоидальных стимулов для моделирования кривой волны требуется более высокий порядок, по умолчанию 15.
2. Чтобы проанализировать кривую, выберите Final Analysis (Окончательный анализ), чтобы создать модели медленной фазы (Рисунок 2) для выбранных медленных фаз (см. Рисунок 2A-D) и рассчитать расстояния, скорости и коэффициенты отслеживания, усредненные по эпохе (Рисунок 2E).
3. Чтобы просмотреть двумерный (2D) или трехмерный (3D) график выбранных областей, выберите «Просмотреть 2D-график » или «Просмотреть 3D-график » соответственно.
4. Выберите Добавить эпоху , чтобы сохранить собранные значения, созданные на шаге 3.4.2. Чтобы просмотреть все добавленные значения для данного животного, а также средние значения для собранных испытаний, выберите Просмотреть текущий набор данных.
5. После добавления эпохи циклически просмотрите оставшуюся часть файла с помощью команды Выбрать эпоху, следуя шагам с 3.3.1 по 3.4.4.
6. После того, как волновой файл будет полностью проанализирован, повторите этот процесс для всех остальных файлов для данного животного, открывая новые файлы, устанавливая соответствующие параметры и анализируя их соответствующим образом. Повторяя шаги 3.2.1-3.4.5 для каждого файла, сгенерируйте окончательный набор данных, содержащий все волновые данные для данного животного.
Окончательный экспорт данных
1. После завершения анализа данных для данного животного со всеми указаниями или стимулами экспортируйте набор данных с помощью функции Экспорт данных.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Исходный набор данных будет экспортирован на основе имени выходного файла и сохранен по пути, заданному выходной папкой , в виде CSV, содержащего данные об отдельных эпохах с общим средним значением для каждого параметра стимула.
2. После экспорта отдельного животного повторно инициализируйте набор данных с помощью Ctrl+S, а затем повторите все предыдущие шаги для анализа нового животного.
3. При необходимости реорганизуйте все выходные данные, собранные для нескольких животных, для упрощения анализа с помощью команды «Сортировать данные » на вкладке «Анализ ».
  ПРИМЕЧАНИЕ: Эта функция компилирует и сортирует все средние значения для всех проанализированных файлов животных, хранящихся в выходной папке, чтобы упростить создание графиков и статистических сравнений. Сортировка зависит от именования файлов в версии 1.1.2. Используйте рекомендуемую схему именования, описанную в шаге 3.1.4 для каждого файла (например, WT_123_Analysis).

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы проверить описанный выше метод анализа, мы количественно оценили усиление слежения за OKR на волновых трассах, собранных у мышей дикого типа и условного нокаут-мутанта с известным дефицитом отслеживания. Кроме того, чтобы проверить более широкую применимость нашего метода анализа, мы проанализировали следы, полученные от отдельной когорты мышей дикого типа, полученных с использованием другого метода видеоокулографии. Автоматическая фильтрация саккад облегчает обработку и анализ данных OKR (рис. 3). Используя записи однонаправленных и синусоидальных стимулов (рис. 1D), мы рассчитали выигрыш, отслеживающий OKR в четырех кардинальных направлениях (рисунок 2F) для диких животных (n = 13) до однонаправленных стимулов, а также отслеживающий рост в ответ на горизонтальные и вертикальные синусоидальные стимулы (рисунок 4). Несоответствие в отслеживающей способности относительно направления стимула как для однонаправленных, так и для синусоидальных стимулов последовательно наблюдается у всех мышей дикого типа, с одинаково устойчивыми горизонтальными ответами, которые демонстрируют значительно более высокие достижения отслеживания, чем вертикальные ответы, как было описано². Кроме того, асимметричное отслеживание между восходящими и нисходящими ответами также наблюдается у мышей дикого типа, использующих оба метода видеоокулографии, о чем сообщалось ранее ^2,10. Относительные величины и согласованность выигрыша от отслеживания по сравнению с опубликованными характеристиками ответов OKR указывают на то, что выигрыш от отслеживания, рассчитанный с помощью программного обеспечения, точно отражает способность отслеживания. В дополнение к расчетам однонаправленного усиления, горизонтальное и вертикальное движение глаз может быть смоделировано одновременно (рис. 5), что позволяет трехмерно реконструировать движение глаз в ответ на заданный стимул. Это обеспечивает дополнительную возможность количественной оценки, которая полезна для будущих исследований, изучающих перекрестно связанные горизонтальные и вертикальные реакции⁹.

Чтобы проверить полезность программного обеспечения для выявления значительных изменений в поведении в различных экспериментальных условиях, мы повторно проанализировали наши опубликованные^{данные,} чтобы подтвердить, что дефицит вертикального отслеживания, оцененный в этом исследовании путем ручного подсчета саккад с быстрой фазой, отражается на отслеживании достижений с использованием методологии, представленной здесь. Предыдущая работа показала, что генетическая инактивация в сетчатке транскрипционного фактора T-box транскрипционного фактора 5 (Tbx5) путем условного нокаута с использованием протокадгерина 9-Cre (Pcdh9-Cre) вызывает специфическую потерю направленных вверх ON-селективных ганглиозных клеток (up-oDSGCs), и что Tbx5 Flox/Flox (Tbx5f/f); Мутанты Pcdh9-Cre демонстрируют специфическую потерю вертикального отслеживания OKR⁹. Количественный анализ с использованием описанного здесь метода показывает, что Tbx5f/f; Животные Pcdh9-Cre сохраняют нормальные горизонтальные приросты слежения (рисунок 6A), аналогичные описанным ранее и полученным путем ручного подсчета саккад быстрой фазы (ETM) (рисунок 2F); тем не менее, эти мыши демонстрируют значительную потерю вертикального отслеживания с почти нулевым приростом в ответ как на восходящие, так и на нисходящие стимулы (рис. 6B, C). Кроме того, анализ синусоидальных реакций подтверждает, что животные Tbx5 cKO демонстрируют больший прогресс в горизонтальном отслеживании, демонстрируя при этом значительно меньшее вертикальное отслеживание (рисунок 6D-F). Повторный анализ этого ранее описанного фенотипа с использованием PyOKR демонстрирует точность и чувствительность этой новой методологии, которая позволяет количественно сравнивать ответы OKR у мышей различных генетических линий.

Наконец, мы проанализировали вертикальные трассировки OKR дикого типа, собранные в UCSF, чтобы проверить полезность программного приложения с различными методами видеоокулографии и параметрами стимулов. Данные из UCSF были собраны с помощью полусферической проекционной системы, в которой движущиеся решетки представляются мыши через отражение проектора с длиной волны 405 нм на полусферу, окружающую голову животного¹⁰ (рисунок 7A). Однонаправленные вертикальные решетки представляли мышам со скоростью 10 градусов в секунду, а ответы OKR регистрировались с интервалом в 60 секунд (рис. 7B, C). Вертикальные следы были количественно проанализированы с помощью PyOKR, а восходящие ответы сравнивались с нисходящими (рис. 7D). Как^{и ожидалось}, восходящая реакция была значительно сильнее, чем нисходящая. тем не менее, результаты слежения были несколько снижены по сравнению со следами, зарегистрированными в JHUSOM (рисунок 2F). Кроме того, количественная оценка синусоидальных реакций была проанализирована с помощью PyOKR (рис. 7E), и значительная асимметрия вертикальных реакций на синусоидально движущиеся стимулы отражается в рассчитанных приростах (рис. 7F). Различия между значениями усиления, собранными в JHUSOM и UCSF, могут быть связаны с различиями между параметрами стимула, включая разную скорость, типы и длины волн стимула; тем не менее, общая согласованность, которую мы наблюдаем при анализе данных, полученных с использованием каждого метода сбора, показывает, что наш PyOKR может быть легко адаптирован за пределами нашей системы сбора данных JHUSOM OKR и применен к другим записям OKR, независимо от методов видеоокулографии. Эти результаты демонстрируют, что описанная здесь программная платформа является точной и может быть применена в целом для изучения глазодвигательных реакций, позволяя проводить точные количественные сравнения среди животных, принадлежащих к разным группам, для дальнейшего изучения схемы стабилизации визуального изображения.

figure-results-1
Рисунок 1: Сбор данных об ответе OKR. (A) Аппарат виртуальной арены OKR для поведенческой стимуляции, как описано ранее ^9,13. Четыре монитора окружают животное с неподвижной головой (1), отображая непрерывно движущийся шахматный стимул (2). Виртуальный барабан может демонстрировать однонаправленное движение во всех четырех кардинальных направлениях, а также колебательные синусоидальные стимулы. Левый глаз мыши освещается инфракрасным (ИК) светом и записывается камерой (3) для записи реакций зрительной системы, отраженных при отслеживании глаз. (B) Анализ отслеживания взгляда происходит путем захвата зрачка и отражения роговицы, генерируемого инфракрасным светом. Сбор данных и расчет движений глаз в ответ на виртуальный барабан выполняли, как описано ранее ^9,13. (C) Схема векторов глаза, движущихся по вертикали (волна Y) и горизонтали (волна X). (D) Образцы следов отслеживающей реакции глаза на однонаправленное движение вверх и назад, а также вертикальное и горизонтальное синусоидальное движение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Следящий анализ однонаправленных визуальных откликов. (A-D) Идентификация и выбор медленных фаз слежения для анализа усиления. Образцы однонаправленных следов показаны с визуальными реакциями на движение вперед (A), назад (B), вверх (C) и вниз (D) по отношению к глазу мыши. Медленные фазы обозначаются добавлением красных и зеленых точек, описанных в Шаге 3 для удаления саккад, а выбранные медленные фазы выделяются желтым цветом. Полиномиальные регрессии накладываются на трассы в виде линий. (E) Количественная оценка следов образцов (A-D), организованных в считывании PyOKR. Для каждой трассы вычисляются общие скорости XY и соответствующие коэффициенты усиления, независимо от направленности. При однонаправленных откликах эти суммарные скорости обычно отражают индивидуальную скорость в определенном направлении; Однако для синусоидальных реакций это значение будет отражать среднюю общую скорость глаза. Горизонтальная и вертикальная составляющие скорости разбиваются на части, чтобы показать скорость в каждом соответствующем направлении. Затем на основе представленных скоростей стимула рассчитывается усиление. (F) Рассчитанные выгоды от отслеживания диких животных (n = 13) по четырем сторонам света по сравнению с их соответствующей количественной оценкой ETM. Данные представлены в виде среднего ± SD. Данные анализируются с помощью одностороннего ANOVA с множественными сравнениями. *p<0.05, **p<0.01,***p<0.005, ****p<0.0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Автоматическая фильтрация саккад облегчает обработку и анализ данных OKR. (A-D) Автоматическая фильтрация трасс с рисунка 2A-D удаляет саккады и моделирует только медленное фазовое движение, устраняя быстрые изменения скорости и сшивая медленные фазы вместе. Конечный наклон представляет собой общее движение глаз за данную эпоху. (E) Количественная оценка выгод от отфильтрованных данных выборки, организованная в считывании PyOKR. (F) Сравнение значений усиления между нефильтрованными и отфильтрованными глазковыми дорожками образца не выявило существенных различий. Данные представлены в виде среднего ± SD. Данные анализируются с помощью U-критерия Манна-Уитни между нефильтрованными и отфильтрованными результатами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
(A,B) Вертикальные (A) и горизонтальные (B) реакции глаз на синусоидально движущиеся стимулы могут быть смоделированы относительно определенных параметров колебательного стимула. Выбранные области помечаются желтым цветом с наложением полиномиальной аппроксимации поверх кривой. Модель стимула представлена в виде оранжевой синусоидальной волны позади следа, чтобы можно было определить, что представляет собой стимул в каждой точке. (C) Расчеты усиления синусоидальных откликов дикого типа (n = 7) отражают асимметричные отклики между горизонтальной и вертикальной способностью отслеживания. Данные представлены в виде среднего ± SD. Данные анализируются с помощью одностороннего ANOVA с множественными сравнениями. **p<0.01,***p<0.005. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Направленное отслеживание может быть смоделировано в его горизонтальной и вертикальной составляющих. (А) Вертикальная составляющая волны слежения за глазами в ответ на восходящий стимул. (В) Горизонтальная составляющая волны, отслеживающей взгляд, в ответ на восходящий стимул. (C) Общая траектория глаза как в вертикальном, так и в горизонтальном направлениях. (D) Трехмерная модель вектора движения глаза во времени в ответ на движение вниз. Необработанные данные трассировки отображаются красным цветом, а регрессионная модель траектории — синим. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-6
Рисунок 6: Анализ OKR в Tbx5f/f; Мыши Pcdh9-Cre демонстрируют значительный дефицит в однонаправленном вертикальном отслеживании. (A) Tbx5f/f; Животные Pcdh9-Cre не демонстрируют существенных изменений в горизонтальном следе. (В,В) Tbx5f/f; Животные Pcdh9-Cre демонстрируют значительное снижение прироста в своих вертикальных реакциях: вверх (B) и вниз (C). (Д,Э) Синусоидальные ответы Tbx5f/f; Pcdh9-Cre животных в ответ на горизонтальные (D) и вертикальные (E) колебательные стимулы. f) количественная оценка Tbx5f/f; Осцилляторные отклики PCDH9-Cre демонстрируют значительное увеличение усиления горизонтального слежения, но уменьшают вертикальные отклики. Данные представлены в виде среднего ± SD. Данные проанализированы с помощью U-тестов Манна-Уитни. *p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-7
Рисунок 7: Применение PyOKR к данным, полученным с помощью альтернативных методов видеоокулографии. (A) Аппарат для стимуляции виртуального барабана OKR, как описано¹⁰. DLP-проектор с длиной волны 405 нм отражается через выпуклое зеркало на полусферу, создавая виртуальный барабан, который окружает поле зрения животного. Движения глаз измеряются с помощью NIR-камеры, расположенной за пределами полусферы. Однонаправленные и синусоидальные решетки показаны животному, закрепленному на голове, в вертикальных направлениях. (В,В) Для количественного анализа определяются восходящие (В) и нисходящие (С) фазы слежения. Медленные фазы выделены желтым цветом. (D) Выигрыш от отслеживания, рассчитанный по вертикальному отслеживанию диких животных (n=5) с использованием описанных здесь методов. Наблюдается способность к асимметричному слежению, при значительном снижении слежения вниз. (E) Осцилляторная реакция на синусоидальные стимулы, смоделированная для количественной оценки преимуществ слежения у животных дикого типа (n=8). Медленные фазы выделены желтым цветом. (F) Количественная оценка синусоидального прироста показывает уменьшение нисходящего прироста по сравнению с восходящим приростом. Данные представлены в виде среднего ± SD. Данные проанализированы с помощью U-тестов Манна-Уитни. *p<0.05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Файл дополнительного кодирования 1: PyOKR Windows Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл кодирования 2: PyOKR Mac Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PyOKR дает несколько преимуществ для изучения зрительных реакций, отраженных в движениях глаз. К ним относятся точность, доступность и опции сбора данных, а также возможность включения параметризации и переменной скорости стимула.

Оценка усиления прямого отслеживания взгляда обеспечивает точную характеристику движения глаз, которая является более прямым количественным показателем, чем традиционный ручной подсчет быстрых фазовых саккад (ETM). Несмотря на свою полезность, подсчет саккад обеспечивает косвенную оценку фактического следящего движения. Программная платформа PyOKR обеспечивает прямое количественное определение скоростей слежения с учетом дополнительных параметров, включая амплитуды саккады и длину медленных фаз. Кроме того, подсчет саккад в быстрой фазе основан на оценке частоты саккады в течение определенного периода времени, требуя, чтобы каждый след практически не содержал шума, включая случайные саккады от стресса животных. Эти факторы приводят к тому, что многие собранные следы становятся непригодными для использования и, следовательно, значительно увеличивают время для сбора данных для точной оценки отслеживания движения глаз. Тем не менее, описанное здесь программное обеспечение решает эту проблему путем прямой количественной оценки отдельных медленных фаз в пределах данной трассы и вычисления усиления в мгновенных точках вдоль трассы. Это достигается путем сравнения скорости движения глаза со скоростью стимула в данной точке. Поскольку саккадическая частота больше не является определяющим параметром для анализа, шум может быть легко удален под наблюдением пользователя, что снижает влияние шума на качество анализа. Это обеспечивает более пригодные для использования собранные данные и, более высокую статистическую мощность при анализе этих данных, повышение точности и воспроизводимости при количественной оценке отслеживания движения глаз и характеристике параметров OKR для отдельных мышей и различных групп мышей. Автоматическая фильтрация саккад на основе быстрых изменений скорости движения глаз, обнаруженных с помощью метода Z-оценки, также была использована для характеристики усиления слежения¹⁰. Чтобы внедрить этот метод фильтрации в программное обеспечение, мы включили этот тип фильтрации скорости, но с дополнительными инструментами, такими как параметризация пороговых значений и ручное управление саккадами, чтобы уменьшить потенциальные ошибки, возникающие при этом подходе. Если для анализа используются необработанные следы вместо автоматической фильтрации, быстрые изменения в движении глаз, вызванные саккадами, морганиями или дистрессом мыши, идентифицируются по максимальным изменениям скорости с помощью оценки плотности гауссова ядра скорости следа. Это позволяет автоматически выбирать сегментирующие области и, в конечном итоге, удалять их на основе ручного контроля со стороны пользователя. Ручной контроль обеспечивает более высокую устойчивость к зашумленным следам, позволяя пользователям быстро корректировать ложноположительные или ложноотрицательные показания для быстрого изменения глаз. Кроме того, поскольку PyOKR использует полиномиальные аппроксимации для моделирования общего движения глаз в заданном направлении, шум в отдельных точках сглаживается, что позволяет оценить скорость траектории с некоторым допуском на шум в трассе. Только в случае крайне низкого качества данных по всей трассе или неправильной калибровки во время сбора данных программное обеспечение не сможет выполнить точный анализ данных. В целом, объединяя инструменты контроля со стороны пользователя, фильтрации и мгновенного расчета коэффициента усиления, описанное здесь программное приложение PyOKR генерирует отслеживающие усиления с высокой точностью и более прямыми метриками по сравнению с предыдущими методами.

PyOKR также имеет множество функций, которые позволяют настраивать анализ OKR в соответствии с потребностями пользователя. Ввод параметров стимула, а также исходных векторов стимула позволяет пользователю точно определить любой желаемый стимул. Они могут включать в себя однонаправленные, синусоидальные или косые стимулы, все из которых программное обеспечение может использовать для создания точных улучшений отслеживания соответствующих визуальных реакций. Благодаря параметризации стимулов по данной методике можно надежно и надежно генерировать мгновенные усиления, рассчитанные на каждом кадре, с высокой точностью независимо от вводимого стимула. Хотя данные об косых стимулах здесь не анализировались, точное усиление может быть рассчитано с помощью разложенных векторов скорости XY для реконструкции косого угла, что позволяет точно рассчитать усиление косых стимулов. Благодаря доступной параметризации настроек стимулов, наш инструмент широко применим для трассировки волн в ответ на любой визуальный стимул. Кроме того, программное обеспечение обеспечивает более высокую производительность и воспроизводимость количественного анализа по сравнению с предыдущими методами. Сортировка по трассам OKR занимает много времени и труда; Тем не менее, оптимизированный пользовательский интерфейс PyOKR способен легко просматривать множество трассировок с более высокой скоростью, чем это было возможно ранее. Это не только позволяет ускорить количественное определение следов, но и выявляет дополнительные параметры OKR, включая прямую количественную оценку скоростей глаз, векторные компоненты движения глаз и мгновенные выигрыши относительно стимула как в горизонтальной, так и в вертикальной составляющих вектора движения. Кроме того, учитывая автоматическую идентификацию саккад и расчет скоростей слежения, обеспечиваемых нашим методом, потенциальная систематическая ошибка экспериментатора при анализе данных значительно снижается по сравнению с другими методами количественной оценки, такими как ручной подсчет ETM или автоматическая фильтрация трасс, которые могут генерировать ложноотрицательные результаты. Кроме того, можно генерировать и автоматически компилировать большие объемы поведенческих данных для упрощения последующего анализа. С помощью функций экспорта и сортировки данных, доступных в PyOKR, данные отслеживания нескольких животных и условий могут быть автоматически обработаны, что обеспечивает организованное хранение данных, а также быстрый статистический анализ. Для проведения экспериментов, в которых используется несколько условий в течение одного сеанса записи, таких как манипуляции со схемой или визуальные реакции, мы рекомендуем собирать данные в дискретных волновых файлах или подмножествах эпох, которые позволяют хранить отдельные наборы данных на основе независимых переменных, представляющих интерес, полученных в ходе этого одного сеанса записи. Например, если вы тестируете различия в реакциях на разные частоты синусоидальных волн в рамках экспериментальной парадигмы, мы рекомендуем сохранять разные параметры в разных волновых файлах для отдельного анализа, таких как WT_1_Freq0.1Analysis, WT_1_Freq0.2Analysis и WT_1_Freq0.3Analysis. В текущей версии, после анализа эпох, отсутствует функция выбора отдельных значений эпох в наборе данных, хотя она может быть добавлена в будущем при необходимости.

Наконец, наш метод может быть адаптирован к нескольким методам сбора видеоокулографии и предоставляет надежную аналитическую платформу, которую можно легко адаптировать к конкретным потребностям лаборатории. Анализируя данные OKR дикого типа и существующих мутантных OKR, а также данные OKR дикого типа, собранные с использованием различных методов и стимулов, мы показываем, что наш инструмент анализа способен: а) количественно отслеживать OKR от любого направленного стимула с высокой точностью и пропускной способностью; б) выявление поведенческих различий зрительной системы, возникающих в результате генетических нарушений; и в) оценка данных визуального слежения с помощью различных методов видеоокулографии. Доступность и общая адаптивность нашей аналитической платформы облегчают дальнейшее изучение реакций OKR и улучшат поведенческие исследования, которые характеризуют сборку и динамику нейронных цепей в контексте глазодвигательных реакций.

Для получения точных измерений и последующего анализа полезных данных необходимо выполнить несколько этапов сбора данных. Мы рекомендуем собирать данные OKR в течение нескольких сеансов, чтобы позволить животному акклиматизироваться к аппарату поведенческого тестирования и снизить влияние стресса животного на поведенческие реакции; однако чрезмерная регистрация может привести к потенцированию ответа OKR¹³, поэтому рекомендуется проявлять осторожность при разработке режимов тестирования. Во время сбора данных OKR правильная калибровка видеоокулграфического оборудования имеет решающее значение для точной количественной оценки, поскольку качество анализируемых данных является прямой функцией обрабатываемой трассы. Важно отметить, что использование интегрированной среды разработки Spyder необходимо для контроля графов через Matplotlib. Учитывая доступность и структуру нашей платформы, у других есть все необходимые инструменты для расширения возможностей программного обеспечения и адаптации этой платформы к различным поведенческим экспериментальным парадигмам.

В заключение мы опишем здесь новый, доступный и универсальный инструмент для анализа поведенческих реакций OKR более глубоко и с большей количественной мощностью, чем это доступно в настоящее время при использовании существующих методологий. PyOKR может быть легко использован начинающими пользователями Python и содержит установленный конвейер анализа и интерфейс для быстрого и точного анализа волн OKR с повышенной точностью и воспроизводимостью. Адаптируемость этого программного обеспечения обеспечивает гибкую структуру, которую пользователи могут легко настроить в соответствии со своими конкретными потребностями и процедурами сбора данных. Мы ожидаем, что этот количественный метод будет способствовать изучению глазодвигательных реакций и углубит наше понимание развития и функционирования нейронных схем, которые управляют поведением зрительной системы.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана R01 EY032095 (ALK), преддокторской стипендией VSTP 5T32 EY7143-27 (JK), F31 EY-033225 (SCH), R01 EY035028 (FAD и ALK) и R01 EY-029772 (FAD).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
C57BL/6J мыши	Jackson Labs	664
Igor Pro	WaveMetrics	RRID: SCR_000325
MATLAB	MathWorks	RRID: SCR_001622
Камера записи оптокинетических рефлексов - JHUSOM	Custom-built	N/A	Как описано в Al-Khindi et al.(2022)⁹ и Kodama et al. (2016)¹³
Камера записи оптокинетических рефлексов - UCSF	Custom-built	N/A	Как описано в Harris and Dunn, 2015¹⁰
Python	Python Software Foundation	RRID: SCR_008394
Tbx5 flox/+ мыши	Подарок от B. Bruneau	N/A	Как описано в Al-Khindi et al.(2022)⁹
tg(pcdh9-cre)NP276Gsat/mmucd	MMRRC	Акция MMRRC # 036084-UCD; RRID: MMRRC_036084-UCD

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stahl, J. S. Using eye movements to assess brain function in mice. Vision Res. 44 (28), 3401-3410 (2004).
Kretschmer, F., Tariq, M., Chatila, W., Wu, B., Badea, T. C. Comparison of optomotor and optokinetic reflexes in mice. J Neurophysiol. 118, 300-316 (2017).
Bronstein, A. M., Patel, M., Arshad, Q. A brief review of the clinical anatomy of the vestibular-ocular connections - How much do we know. Eye. 29 (2), 163-170 (2015).
Simpson, J. I. The accessory optic system. Ann Rev Neurosci. 7, 13-41 (1984).
Hamilton, N. R., Scasny, A. J., Kolodkin, A. L. Development of the vertebrate retinal direction-selective circuit. Dev Biol. 477, 273-283 (2021).
Dobson, V., Teller, D. Y. Visual acuity in human infants: a review and comparison of behavioral and electrophysiological studies. Vision Res. 18 (11), 1469-1483 (1978).
Cahill, H., Nathans, J. The optokinetic reflex as a tool for quantitative analyses of nervous system function in mice: Application to genetic and drug-induced variation. PLoS One. 3 (4), e2055(2008).
Cameron, D. J., et al. The optokinetic response as a quantitative measure of visual acuity in zebrafish. J Vis Exp. (80), e50832(2013).
Al-Khindi, T., et al. The transcription factor Tbx5 regulates direction-selective retinal ganglion cell development and image stabilization. Curr Biol. 32 (19), 4286-4298 (2022).
Harris, S. C., Dunn, F. A. Asymmetric retinal direction tuning predicts optokinetic eye movements across stimulus conditions. eLife. 12, 81780(2015).
Sun, L. O., et al. Functional assembly of accessory optic system circuitry critical for compensatory eye movements. Neuron. 86 (4), 971-984 (2015).
Yonehara, K., et al. Congenital Nystagmus gene FRMD7 is necessary for establishing a neuronal circuit asymmetry for direction selectivity. Neuron. 89 (1), 177-193 (2016).
Kodama, T., Du Lac, S. Adaptive acceleration of visually evoked smooth eye movements in mice. J Neurosci. 36 (25), 6836-6849 (2016).
Stahl, J. S., Van Alphen, A. M., De Zeeuw, C. I. A comparison of video and magnetic search coil recordings of mouse eye movements. J Neurosci Methods. 99 (1-2), 101-110 (2000).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

PyOKR: полуавтоматический метод количественной оценки способности отслеживания оптокинетических рефлексов

В этой статье

Краткое содержание

Аннотация

Введение

Протокол

Результаты

Обсуждение

Раскрытие информации

Благодарности

Материалы

Ссылки

Перепечатки и разрешения

Теги

Похожие статьи