Это исследование описывает комбинированный протокол магнитно-резонансной томографии (МРТ) и импульсного сфокусированного ультразвука низкой интенсивности (FUS), использующий живых крыс с катетеризацией яремных вен для мониторинга открытия гематоэнцефалического барьера (ГЭБ).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Мониторинг открытия гематоэнцефалического барьера у крыс с помощью доклинической системы фокусированного ультразвука
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Мозг имеет высокоселективный полупроницаемый барьер крови, называемый гематоэнцефалическим барьером (ГЭБ), который препятствует доставке терапевтических макромолекулярных агентов в мозг. Интеграция низкоинтенсивного импульсного сфокусированного ультразвука (FUS) под контролем МРТ с предварительным впрыском микропузырьков является перспективным методом неинвазивной и нетоксичной модуляции ГЭБ. МРТ может обеспечить превосходное контрастирование мягких тканей и различные количественные оценки, такие как проницаемость сосудов, перфузия и пространственно-временное распределение контрастных веществ МРТ. Примечательно, что методы МРТ с контрастным усилением с МРТ-контрастными веществами на основе гадолиния показали себя золотым стандартом для обнаружения отверстий ГЭБ. В этом исследовании изложена комплексная методология, включающая протоколы МРТ и процедуры на животных для мониторинга открытия ГЭБ в модели крысы. Модель на крысе обеспечивает дополнительное преимущество использования катетера яремной вены, что способствует быстрому введению лекарств. Доклинический преобразователь FUS со стереотаксическим контролем облегчает уточнение и оптимизацию процедур на животных и протоколов МРТ. Полученные методы характеризуются воспроизводимостью и простотой, что устраняет необходимость в специализированных хирургических знаниях. Данное исследование призвано внести вклад в оптимизацию доклинических процедур на крысовых моделях и стимулировать дальнейшие исследования модуляции ГЭБ для усиления терапевтических вмешательств при неврологических расстройствах.
Введение
ГЭБ регулирует движение ионов, молекул и клеток между кровеносными сосудами и тканями мозга1. Эта функция позволяет поддерживать функцию и здоровье нейронов, предотвращая доставку терапевтических макромолекулярных агентов к тканям мозга. Ограниченная проницаемость ГЭБ может привести к снижению эффективности и результативности лечения опухолей головного мозга и нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз и болезнь Альцгеймера2. Следовательно, различные подходы, такие как усиленная конвекцией доставка, прямые внутричерепные инъекции, осмотические разрушения и улучшенный дизайн лекарств, были исследованы для обхода ГЭБ для контролируемой доставки терапевтических агентов3,4,5.
Однако эти подходы имеют внутренние ограничения, такие как инвазивность, риск инфекции, риск кровотечения, гетерогенность и быстрый отток лекарств. Низкоинтенсивный импульсный сфокусированный ультразвук (FUS) с введением микропузырьков является перспективным неинвазивным методом, позволяющим локализовать и обратимое разрушение ГЭБ. Механические эффекты ультразвука в сочетании с микропузырьками могут временно изменять проницаемость ГЭБ (т.е. открытие ГЭБ)6,7. Для дальнейшего прогресса в лечении с использованием вскрытия ГЭБ необходимы эксперименты in vivo на мелких животных.
В этом исследовании мы представили протоколы МРТ и процедуры на животных для мониторинга открытия ГЭБ в модели крысы. Протокол включал модель крысы с катетером яремной вены, канюлированным коммерческой организацией (см. таблицу материалов). Модель катетеризации яремных вен на крысах обладает потенциальными преимуществами быстрого введения лекарств, тестов гемодинамического мониторинга и стабильной катетеризации. Вскрытие ГЭБ осуществлялось с помощью доклинической системы ФУЗИ. Эта система, специально разработанная для открывания BBB в моделях мелких животных, таких как крысы и мыши, включает в себя основные компоненты, такие как настольная система, управляющий компьютер, датчик, дегазатор воды и сопутствующие аксессуары. Использование этой доклинической системы FUS со стереотаксическим контролем не только повышает точность, но и оптимизирует процедуры на животных и протоколы МРТ, способствуя воспроизводимости и простоте общего экспериментального протокола.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты на животных в этом исследовании были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Калифорнийского университета в Сан-Франциско (UCSF). В данном исследовании использовались самцы крыс породы Спрэг-Доули (200-250 г). Крысы содержались и ухаживали в соответствии с рекомендациями Национального института здравоохранения по уходу за животными и их использованию у мышей и крыс. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.
1. Подготовка животных
ПРИМЕЧАНИЕ: Для внутренних процедур животные были доставлены в комнату для подготовки и процедуры проводились следующим образом:
- Поместите крыс по отдельности в камеру Lucite и подвергайте воздействию изофлурана (2-3%), смешанного с кислородом, извлеченным из медицинского кислородного баллона, до тех пор, пока они не потеряют сознание (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами).
ПРИМЕЧАНИЕ: Анестезия с использованием изофлурана позволяет реализовать долгосрочный протокол МРТ. - Удалите крыс из камеры и сбрейте шерсть с передней и задней областей шеи с помощью крема для удаления волос (депиляции).
- Нанесите мазь-лубрикант на глаза.
- Поместите нос в носовой конус для поддержания анестезии со спонтанным дыханием (испаритель изофлурана от 2% до 2,5%, расходомер кислорода до 1-1,5 л/мин).
- Поместите крысу под наркозом на операционный стол с подогревом и подтвердите щипцом ноги.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол МРТ включал последовательности с контрастированием, такие как Т1-взвешенная градиентная эхо-визуализация и Т2-взвешенная спин-эхо-визуализация. Эти последовательности проводились как до, так и после введения контрастных веществ на основе гадолиния (ГТР) для оценки проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). Это включает в себя введение контрастных веществ GAD, когда крыса находится в классе МРТ7. Чтобы облегчить этот процесс, использовали катетерную трубку, идущую от катетера, канюлированного у крысы. Удлинитель включал в себя соединитель катетера и полиэтиленовую трубку размером 30 см. Для обеспечения проходимости и предотвращения утечки удлинительную трубку промывали гепаринизированным глицерином (250 МЕ гепарина/1 мл глицерина).
2. Система сфокусированного ультразвука со стереотаксическим наведением
ПРИМЕЧАНИЕ: Животные были перенесены и помещены на стол в стереотаксической системе FUS. Нос крысы помещался в носовой конус для поддержания анестезии. Система FUS состоит из генератора функций, радиочастотного усилителя и осциллографа. Перед настройкой датчика мы обеспечили правильное подключение всех устройств к системе. Настройка преобразователя была завершена с помощью следующих этапов:
- Поместите острый указатель в положение брегмы в черепе и сохраните положение. Положение Bregma можно определить, указав расположение на расстоянии 9,0 мм впереди от Lambda на средней линии8. Лямбда находится в центре линии между двусторонними барабанными перепонками9.
- Поместите ультразвуковой гель на голову крысы, мешок для водяной связи и датчик (частота 1 МГц). Убедитесь, что между кожей крысы, мешком для гидроизоляции и датчиком нет пузырьков воздуха.
- Подключите коаксиальный кабель BNC преобразователя ко входу модуля системы FUS.
- В управляющем компьютере) Нажмите на кнопку «Загрузить», чтобы получить предварительно зарегистрированные изображения крыс; Выбирается ряд очаговых пятен и акустическое давление.
- В управляющем компьютере) Нажмите на тест движения в модуле лечения, чтобы убедиться, что датчик может переключаться между точками в течение периода пакета.
- Настройте параметры ультразвуковой обработки, описанные в шаге 3.
3. Инфузия микропузырьков и ультразвуковая обработка
- Активируем микропузырь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Микропузырь, использованный в этом исследовании, характеризовался диаметром 1,7 мкм и концентрацией 0,2 × 109 частиц на миллилитр10. Флакон с микропузырьками был активирован на основе инструкций по назначению, предоставленных поставщиком, и ранее опубликованного report11.- Приготовьте шприц объемом 5 мл с наконечником люэровского замка и наполните 5 мл 0,9% хлорида натрия без добавок.
- Снимите зеленый колпачок и подсоедините шприц к вентилируемому дозаторному штифту (см. Таблицу материалов), закрутив его по часовой стрелке.
- Снимите защитный кожух и поместите его в центр резиновой пробки флакона. Сильно прижмите до тех пор, пока шип полностью не будет вставлен в пробку.
- Вылейте весь шприц объемом 5 мл во флакон, надавливая на стержень поршня.
- Энергично встряхните флакон в течение 20 секунд, чтобы перемешать все содержимое. Однородная белая жидкость молочного цвета покажет, что образовались липидные микросферы гексафторида серы.
- Для получения необходимой дозы переверните шприц и медленно наберите предполагаемый объем суспензии в шприц объемом 5 мл.
- Используйте инфузионный насос.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инфузионный подход12 использовался для доставки микропузырьков крысам с помощью шприцевого насоса. Шприц, содержащий микропузырьки, был подключен к коннектору катетера, вставленному в крысу. Микропузырьки пропускали через полиэтиленовые трубки, а расход инфузионного насоса устанавливали на уровне 0,66 мл/мин. Такая скорость инфузии позволяет вводить 2 мл микропузырьков из шприца объемом 3 мл в течение 3 минут. Инфузия начиналась перед ультразвуковой обработкой в течение 1 минуты и продолжалась в течение 2-минутного периода ультразвуковой обработки. - Выполните ультразвуковую обработку.
ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании импульсы FUS были выбраны по следующим параметрам: (1) Целевая область: левый гиппокамп; (2) Количество точек: 6 для покрытия гиппокампа в мозге; (3) Длина пакета: 10 мс; (4) Период: 1200 мс; (5) Акустическое давление: 0,65 МПа; (6) "Burst mode" в меню режима ультразвуковой обработки в системе FUS; (7) Время обработки ультразвуком: 120 с.
4. Процедура МРТ с использованием доклинического сканера 3T
- После ультразвуковой обработки животных переложите на стол в доклиническом 3T безкриогенном сканере.
- Расположите крыс в положении лежа. Поддерживайте температуру грелки в сканере, а также контролируйте частоту дыхания с помощью пневматического датчика подушки. Выполните протокол МРТ для проверки различных типов МРТ визуализации (Таблица 1).
- Включите другие методы количественной визуализации, такие как диффузионно-взвешенная визуализация (DWI), картирование T2*, картирование T1 и динамическая МРТ с контрастированием (DCE), в дополнение к МРТ с контрастным усилением, чтобы продемонстрировать их потенциальную практичность для различных визуализирующих исследований. В таблице 1 приведены протоколы МРТ, использованные в данном исследовании.
- Вводите контрастные вещества для МРТ на основе ГАД (Гадавист, 1 ммоль/кг) после взвешенной Т1 последовательности градиентного эхо МРТ и получайте изображения после ГТР.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для крысы массой 200 г мы вводили 200 мкл контрастного вещества для МРТ, а затем 200 мкл физиологического раствора для промывания трубки.
5. Макроскопическое исследование мозга крысы
ПРИМЕЧАНИЕ: После МРТ было введено 2 мл синего раствора Эванса (2% разбавленного фосфатно-солевым буфером), и крысе дали отдохнуть не менее 30 минут, чтобы раствор мог распространиться и циркулировать по всему телу. Впоследствии крыс усыпляли с использованием передозировки изофлурана (5%) для макроскопического исследования мозга (в соответствии с институционально утвержденными протоколами). Для подтверждения эвтаназии требовалось нанесение ударов по пальцам ног и наблюдение за животным на предмет остановки дыхания в течение как минимум 1 минуты. Была проведена процедура перфузии с последующим обследованием мозга крысы. Процедура перфузии сводится к следующему:
- Выполните торакотомию с помощью хирургических ножниц, чтобы обнажить органы в грудной клетке и визуализировать сердечную область.
- Надрежьте (~5 мм) правое предсердие.
- Введите физиологический раствор в левый желудочек с целью перфузии.
- Вскройте кость черепа хирургическими ножницами, чтобы открыть и показать мозг.
Примечание: Адекватная перфузия должна приводить к равномерно яркому внешнему виду мозга, в то время как сохраняющиеся синие области указывают на утечку альбумина, связанную с ГЭБ, как обнаруживается синим цветом Эванса.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В данном исследовании представлен доклинический протокол мониторинга открытия гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) на модели крыс с использованием коммерческой системы фокусированного ультразвука (ФУЗ) для животных. Система ФУЗ была установлена на лабораторном столе или большой передвижной платформе (Рисунок 1). Крыс анестезировали изофлураном в смеси с кислородом через носовую маску в раме с держателем для преобразователя. Гидрофон с резонансной частотой 500 kHz для детектирования акустическ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Был разработан протокол и процедура на животных с использованием модели катетеризации яремной вены на крысах для исследований открытия ГЭБ. Несмотря на то, что существует множество доклинических протоколов, этот протокол включает в себя коммерчески доступную систему FUS и модель крысы, сводя к минимуму процедуры подготовки животных и тем самым обеспечивая экспериментальную воспроизводимость.
В этом протоколе выбор микропузырьков основывался на его стабильности и сохранении при комнатной темпер...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет соответствующих конфликтов интересов, о которых можно было бы заявить.
Благодарности
Это исследование было частично поддержано грантом K99DE032397 Национального института стоматологических и черепно-лицевых исследований (NIDCR), грантом UCSF Department Seed Grant (No 7504831), грантом UCSF RAP (PI: Kazim Narsinh, MD) и Немецким исследовательским обществом (DFG, GA 3535/1-1).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1 мл шприц | BD пластипак | ||
| 20 мл, хлорид натрия 0,9% | Hospira, Inc | 00409-7101-67 | |
| мл шприц | BD пластипак | ||
| 5 мл шприц | BD пластипак | ||
| тупой иглой, 21 г | SAI инфузионные технологии | B21-50 | |
| коннектор катетера, 21 г | SAI инфузия технологии | CC-25-25 | |
| Раствор для катетерного замка | SAI технологии инфузии | Sku# HGS-10 | (500 µ/мл) Глицерин |
| Evans Blue Sigma | aldrich E2129-10g | ||
| ExAblate Neuro | Insightec Inc., Израиль | ||
| Gadavist | Bayer | 2068062 | |
| GE изофлуран Вапорайзер | GE Healthcare | ||
| IPS-12RS Шприцевой насос | Inovenso | IPS-12 | |
| изофлуран USP | Vet один | 501017 | |
| Lumason microbbuble | Bracco Diagnostics Inc | SKJ709700 | |
| самцов крыс Sprague-Dawley (200– 250 г) | Игла Charles River Laboratories | ||
| , 18 г | BD Precisionglide | ||
| Фосфатно-солевой буфер | Mediatech | 21-030-CVR | |
| Полиэтиленовая трубка | BD Intramedic | ||
| доклинический 3T криогенный сканер Bruker Biospin | Bruker | Biospec3T | |
| Rat с катетеризацией яремных вен | Charles River Laboratories | ||
| RK-50 преобразователь сфокусированного ультразвука | FUS Instruments | Tx-50-1000-0 | |
| RK-50 настольная система фокусированного ультразвука | FUS Instruments | ||
| Sonic Concepts Sonic | Concepts Inc., WA, США | ||
| Вентилируемый дозирующий штифт | Б. Браун | 4550560 |
Ссылки
- Daneman, R., Prat, A. The Blood-Brain Barrier. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (1), a020412(2015).
- Meng, Y., et al. Applications of focused ultrasound in the brain: from thermoablation to drug delivery. Nat Rev Neurol. 17 (1), 7-22 (2021).
- Mungur, R., et al. Low-intensity focused ultrasound technique in glioblastoma multiforme treatment. Frontiers in Oncology. 12, 903059(2022).
- Boado, R. J., et al. Pharmacokinetics and brain uptake of a genetically engineered bifunctional fusion antibody targeting the mouse transferrin receptor. Mol Pharm. 7 (1), 237-244 (2010).
- Hendricks, B. K., et al. Novel delivery methods bypassing the blood-brain and blood-tumor barriers. Neurosurgical Focus. 38 (3), E10(2015).
- Hynynen, K., et al. Non-invasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).
- Hynynen, K., et al. Local and reversible blood-brain barrier disruption by non-invasive focused ultrasound at frequencies suitable for trans-skull sonications. NeuroImage. 24 (1), 12-20 (2005).
- Yao, X., et al. Non-invasive, targeted creation of neuromyelitis optica pathology in AQP4-IgG seropositive rats by pulsed focused ultrasound. J Neuropathol Exp Neurol. 78 (1), 47-56 (2019).
- Cecyn, M. N., Abrahao, K. P. Where do you measure the Bregma for rodent stereotaxic surgery. IBRO Neurosci Rep. 15, 143-148 (2023).
- Kotopoulis, S., et al. SonoVue vs. Sonazoid vs. Optison: Which bubble is best for low-intensity sonoporation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Pharmaceutics. 14 (1), 98(2022).
- Bracco Diagnostics Inc. LUMASON (sulfur hexafluoride lipid-type A microspheres) for injectable suspension, for intravenous use or intravesical use. , Lumason - accessdata.fda.gov. (2016).
- Lapin, N. A., et al. Consistent opening of the blood brain barrier using focused ultrasound with constant intravenous infusion of microbubble agent. Sci Rep. 10, 16546(2020).
- Vlachos, F., et al. Permeability dependence study of the focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening at distinct pressures and microbubble diameters using DCE-MRI. Magn Reson Med. 66 (3), 821-830 (2011).
- Singh, A., et al. An all-ultrasound cranial imaging method to establish the relationship between cranial FUS incidence angle and transcranial attenuation in non-human primates in 3D. Sci Rep. 14 (1), 1488(2024).
- Plaksin, M., et al. Magnetic resonance imaging analysis predicts nanoparticle concentration delivered to the brain parenchyma. Commun Biol. 5 (1), 1-11 (2022).
- Singh, A., et al. Guiding and monitoring focused ultrasound mediated blood-brain barrier opening in rats using power Doppler imaging and passive acoustic mapping. Sci Rep. 12 (1), 14758(2022).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
