Этот протокол представляет собой доступное руководство по сбору, хранению и размораживанию мононуклеарных клеток периферической крови, пригодное для последующих анализов и таких рабочих процессов, как проточная цитометрия и секвенирование РНК. Также демонстрируются коллекции плазмы и баффи-пальто.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение и криоконсервация высокожизнеспособных мононуклеарных клеток периферической крови человека из цельной крови: руководство для начинающих
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) обычно используются в биомедицинских исследованиях иммунной системы и ее реакции на болезни и патогены. В этом подробном протоколе описывается оборудование, расходные материалы и этапы выделения, криоконсервирования и размораживания высококачественных и высокожизнеспособных PBMC из цельных клеток крови, пригодных для последующих применений, таких как проточная цитометрия и секвенирование РНК. Также описаны протоколы обработки плазмы и охристого покрова из цельной крови параллельно и одновременно с ПМЦ. Этот простой в использовании пошаговый протокол, в котором используется центрифугирование градиента плотности для выделения PBMC, сопровождается контрольным списком расходных материалов, оборудования и этапов подготовки. Этот протокол подходит для лиц с любым предыдущим опытом работы с лабораторными методами и может быть реализован в клинических или исследовательских лабораториях. Высококачественная жизнеспособность клеток и секвенирование РНК были получены в результате сбора PBMC операторами, не имевшими предварительного лабораторного опыта использования этого протокола.
Введение
Этот протокол демонстрирует доступный метод и рабочий процесс для выделения мононуклеарных клеток периферической крови (ПМЦ) из цельной крови. Этот протокол особенно предназначен для начинающих научных техников, студентов и сотрудников клинических лабораторий с целью облегчения сбора и криоконсервации PBMC без предварительного обучения лабораторным методам.
В этом протоколе используется центрифугирование для разделения компонентов цельной крови по плотности. Цельная кровь состоит из четырех основных компонентов, перечисленных в порядке убывания плотности: эритроциты/эритроциты (~45% об....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Протокол исследования был одобрен Программой защиты человека UCSD и KUMC и соответствует Хельсинкской декларации. Все лица дали информированное согласие на участие и забор крови.
1. Переработка и криоконсервация МПМК
- За день до забора крови распечатайте контрольный список материалов и реагентов, перечисленных в таблице 2 , и подготовьте и промаркируйте его соответствующим образом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был разработан для сбора 6 пробирок для центрифугирования с градиентом плотности. Из каждой пробирки получается примерно 12 миллионов PBMC, из которых пример....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
После сбора и криоконсервации PBMC жизнеспособность размороженных PBMC, моноцитов и лимфоцитов из 56 уникальных образцов оценивали методом проточной цитометрии с использованием реагентов, перечисленных в таблице 4, в соответствии с инструкциями производителей (рис. 2A-F). Была достигнута средняя ± жизнеспособность SD PBMCs, моноцитов и лимфоцитов в 94 ± 4,0%, 98 ± 1,1% и 93 ± 5,6% соответственно (рис. 2G). Измерение жизнеспособн.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол сбора и криоконсервации PBMC был успешно реализован лицами, имеющими и не имеющими предварительного обучения в исследовательской лаборатории. В нашей заявке FACS и РНК-секвенирование высокожизнеспособных моноцитов, выделенных из хранящихся PBMC, привело к получению высококачественных последовательностей.
Основным преимуществом этого протокола является его доступность. В методе, представленном в протоколе, используются пробирки, предварительно упа.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют соответствующих финансовых или нефинансовых интересов, которые можно было бы раскрыть.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить пациентов, которые добровольно дали свое согласие, время и донорство образцов крови. Мы также выражаем признательность доктору Патрику Мориарти, Джули-Энн Даттон и Марку Макклеллену из Медицинского центра Канзасского университета за их сотрудничество и внедрение этого протокола в удаленном центре. CY получил исследовательскую поддержку в рамках гранта NIH 1K08HL150271.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1000 &микро; L Tips | Gilson | F174501 | Требуется примерно 3 наконечника на пациента/состояние лечения для PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| 15 мл пробирки | Biopioneeer | CNT-15 | Для хранения растворов 2/3 2 необходимых на пациента/условия лечения для PBMC/плазмы/Buffy Coat Collection |
| 2 мл криовиалов | Globe Scientific | 3012 | Требуется около 40 криовиалов на одного пациента/состояние лечения для PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| 20 &m; L Tips | Gilson F174201 | Для использования при подсчете клеток; необходимый объем зависит от используемого метода подсчета клеток. 1 наконечник необходим на 1 мл необъединенных замороженных PBMC для размораживания | |
| 50 мл конической трубки | CEM Corporation | 50-187-7683 | требуется 2 на пациента / условия лечения для PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection 3 необходим на 1 мл необъединенных замороженных PBMC для размораживания |
| CD14 Antibody | Biolegend | 325621 | |
| CD16 Антитело | Biolegend | 360723 | |
| CD19 Антитело | Biolegend | 363007 | |
| CD3 Антитело | Biolegend | 300405 | |
| CD56 Антитело | Biolegend | 318303 | |
| CD66b Антитело | Biolegend | 305103 | |
| Cell Strainer | Biopioneeer | DGN258367 | 1 необходимо на 1 мл необъединенных замороженных PBMC для размораживания |
| CPT Пробирка для подготовки мононуклеарных клеток | BD Biosciences 362753 | необходимо 6 пробирок на пациента/условия лечения для PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection | |
| Cryo Freezer Box | Southern Labware | SB2CC-81 | Вмещает 81 пробирку 1 необходима на пациента/условие лечения для PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Cryotube Rack | Fisherbrand | 05-669-45 | Вмещает до 50 криовиальных растворов |
| DMSO | Invitrogen | 15575020 | Примерно 2,5 мл требуется на одного пациента/состояние лечения для PBMC/плазмы/Buffy Coat Collection |
| ДНКазы/РНКазы Дистиллированная вода | Invitrogen | 10977015 | Примерно 2 мл требуется на одного пациента/состояние лечения для PBMC/плазмы/Buffy Coat Collection Требуется примерно 9 мл на 1 мл замороженных PBMC, подлежащих размораживанию |
| .EDTA Tubes | BD Biosciences | 366643 | 1 пробирка необходима на пациента/условие лечения для PBMC/плазмы/Buffy Coat Collection |
| Flavopiridol | Sigma-Aldrich | F3055-5MG | |
| HLA-DR Антитело | Biolegend | 307609 | |
| сывороточный альбумин человека | GeminiBio | 800-120 | Требуется примерно 25 мл на пациента или условие лечения для сбора PBMC/плазмы/Buffy Coat |
| Human Trustain FcX | Biolegend | 422301 | |
| изопропанол | Sigma-Aldrich | W292912-1KG-K | Для использования в принтере этикеток Mr. Frosty |
| Phomemo | M110-WH | ||
| Live-Dead Stain | Biolegend | 423105 | |
| Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0001 | Вмещает до 18 пробирок. 2 Mr. Frostys требуется на пациента/состояние лечения для PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Multidispense Pipette | Brandtech | 705110 | |
| Multidispense Pipette Tips | Brandtech | 705744 | Требуется примерно 3 наконечника на пациента/состояние лечения для PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| P1000 Pipette | Gilson | F144059M | |
| P20 Пипетка | Gilson | F144056M | Для использования при подсчете клеток; необходимый объем зависит от используемого метода подсчета клеток. |
| Этикетки для принтера | Phomemo | PM-M110-3020 | Требуется примерно 45 этикеток на одного пациента/состояние лечения для PBMC/плазмы/Buffy Coat Collection Требуется примерно 5 этикеток на 1 мл необъединенных замороженных PBMC для размораживания |
| РНКаза ЭДТА (0,5 М) | Invitrogen | AM9260G | Приблизительно 40 &; Необходимо разморозить 1 мл замороженных PBMC |
| РНКазы PBS (10X) | Invitrogen | AM9625 | Примерно 1 мл на 1 мл замороженных PBMC для размораживания |
| РНКазин | Promega | N2111 | |
| RPMI | Corning | 10-040-CV | Примерно 80 мл необходимо на пациента или условия лечения для PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-7M | Требуется примерно 5 на пациента/условия лечения для держателя пробирки для сбора пробирок PBMC/плазмы/Buffy Coat |
| Endicott-Seymour | 14-781-15 | Вмещает до 80 пробирок CPT/EDTA |
Ссылки
- Mathew, J., Sankar, P., Varacallo, M. Physiology, Blood Plasma. , StatPearls Pubs. Treasure Island, Florida. (2018).
- Van Oost, B., Van Hien-Hagg, I. H., Timmermans, A. P., Sixma, J. J. The effect of thrombin on the density distribution of blood platelets: Detection of activated platelets in the circulat....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
