Методическая статья

Выделение и криоконсервация высокожизнеспособных мононуклеарных клеток периферической крови человека из цельной крови: руководство для начинающих

DOI:

10.3791/66794

⸱

25 октября 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, University of California San Diego, 2Department of Medical Biochemistry, Amsterdam Immunity and Infection: Inflammatory diseases; Amsterdam Cardiovascular Sciences: Atherosclerosis and Ischemic Syndrome, Amsterdam UMC location University of Amsterdam, 3Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California San Diego, 4Division of Clinical Immunology & Rheumatology, Department of Medicine, Heersink School of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 5Comprehensive Arthritis, Musculoskeletal, Bone and Autoimmunity Center, Heersink School of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 6Department of Medicine, University of California San Diego

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол представляет собой доступное руководство по сбору, хранению и размораживанию мононуклеарных клеток периферической крови, пригодное для последующих анализов и таких рабочих процессов, как проточная цитометрия и секвенирование РНК. Также демонстрируются коллекции плазмы и баффи-пальто.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) обычно используются в биомедицинских исследованиях иммунной системы и ее реакции на болезни и патогены. В этом подробном протоколе описывается оборудование, расходные материалы и этапы выделения, криоконсервирования и размораживания высококачественных и высокожизнеспособных PBMC из цельных клеток крови, пригодных для последующих применений, таких как проточная цитометрия и секвенирование РНК. Также описаны протоколы обработки плазмы и охристого покрова из цельной крови параллельно и одновременно с ПМЦ. Этот простой в использовании пошаговый протокол, в котором используется центрифугирование градиента плотности для выделения PBMC, сопровождается контрольным списком расходных материалов, оборудования и этапов подготовки. Этот протокол подходит для лиц с любым предыдущим опытом работы с лабораторными методами и может быть реализован в клинических или исследовательских лабораториях. Высококачественная жизнеспособность клеток и секвенирование РНК были получены в результате сбора PBMC операторами, не имевшими предварительного лабораторного опыта использования этого протокола.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол демонстрирует доступный метод и рабочий процесс для выделения мононуклеарных клеток периферической крови (ПМЦ) из цельной крови. Этот протокол особенно предназначен для начинающих научных техников, студентов и сотрудников клинических лабораторий с целью облегчения сбора и криоконсервации PBMC без предварительного обучения лабораторным методам.

В этом протоколе используется центрифугирование для разделения компонентов цельной крови по плотности. Цельная кровь состоит из четырех основных компонентов, перечисленных в порядке убывания плотности: эритроциты/эритроциты (~45% объема), лейкоциты (<1% объема), тромбоциты (<1% объема) и плазма (~55% объема)1,2,3,4,5,6. Лейкоциты можно подразделить на две категории в зависимости от характеристик их ядер: круглые или многоядерные6. PBMC определяются как белые кровяные клетки с круглыми ядрами и состоят из следующих типов клеток: лимфоциты (Т-клетки, В-клетки, NK-клетки), дендритные клетки и моноциты6. К многоядерным лейкоцитам относятся гранулоциты, которые состоят из следующих типов клеток: нейтрофилы, базофилы и эозинофилы6. Многоядерные лейкоциты более плотные, чем PBMC6. Плотность каждого компонента цельной крови подробно изложена в таблице 1.

В этом протоколе цельная кровь собирается в центрифугирующие пробирки с градиентом плотности. Эти пробирки содержат предварительно упакованную среду градиента плотности, которая имеет плотность 1,077 г/мл. После центрифугирования более плотные клетки, включая многоядерные лейкоциты и эритроциты, отделяют от PBMC и тромбоцитов средой градиента плотности (рис. 1A)6,7. Затем PBMC и фракция тромбоцитов собирают, промывают и центрифугируют для удаления тромбоцитов. Полученные очищенные PBMC собираются и хранятся при температуре -80 °C или в жидком азоте. Криоконсервированные PBMC могут быть жизнеспособно разморожены и непосредственно использованы в последующих анализах или дополнительно обработаны для выделения определенных типов составляющих клеток.

Этот протокол был оптимизирован для высококачественного секвенирования РНК из высокожизнеспособных PBMC. В данной статье PBMC были выделены и крионированы, полученные от пациентов в амбулаторной клинике. Впоследствии моноциты были выделены из PBMC с помощью FACS и проанализированы с помощью секвенирования РНК. Тем не менее, протокол может быть широко адаптирован к другим экспериментальным потребностям, таким как культивирование клеток, редактирование генов, функциональные исследования ex-vivo, анализы отдельных клеток, фенотипирование с помощью проточной цитометрии или цитометрии по времени полета, выделение ДНК/РНК или белков, слайды для иммуногистохимии, среди прочего 8,9,10,11,12,13,14,15; 16,17,18.

В дополнение к сбору PBMC из центрифугирующих пробирок с градиентом плотности, в этом протоколе рассматривается, как собирать плазму и охристую оболочку с помощью центрифугирования с использованием пробирки ЭДТА. После центрифугирования цельная кровь разделяется на плазму, эритроциты и тонкий межевой слой, называемый охристой оболочкой, содержащей лейкоциты (рис. 1B)6. Охристая шерсть обычно используется для экстракции ДНК и последующих геномных анализов19,20. Плазменный слой содержит бесклеточные компоненты цельной крови и может быть использован для анализа биомаркеров21,22.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол исследования был одобрен Программой защиты человека UCSD и KUMC и соответствует Хельсинкской декларации. Все лица дали информированное согласие на участие и забор крови.

1. Переработка и криоконсервация МПМК

  1. За день до забора крови распечатайте контрольный список материалов и реагентов, перечисленных в таблице 2 , и подготовьте и промаркируйте его соответствующим образом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был разработан для сбора 6 пробирок для центрифугирования с градиентом плотности. Из каждой пробирки получается примерно 12 миллионов PBMC, из которых примерно 50% и 20% будут живыми лимфоцитами и моноцитами соответственно. Масштабируйте в соответствии с экспериментальными потребностями. Обратите внимание, что абсолютное количество клеток может существенно отличаться в зависимости от пациента или условий лечения.
  2. Используя стандартную технику флеботомии, соберите цельную кровь в 6 пробирок центрифугирования градиента плотности и 1 пробирку ЭДТА до полного заполнения, примерно 6 мл объема.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуются образцы от нескольких пациентов или условия лечения, собранные пробирки могут храниться до 4 часов, а затем обрабатываться одновременно.
  3. После сбора центрифугируйте все пробирки при давлении 1 800 x g в течение 20 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к дополнительному видео 1 для демонстрации работы с центрифугой.
  4. После центрифугирования осторожно откройте пробирку для центрифугирования с градиентом плотности. С помощью трансферной пипетки удалите и выбросьте полупрозрачный желтый слой, содержащий плазму. Не тревожьте туманный слой клеток непосредственно над градиентом плотности среды. Будьте осторожны, оставляя избыток плазмы, а не выбрасывая PBMC. Повторите для всех пробирок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования пробирки, содержащей среду с градиентом плотности, плазма и PBMC будут находиться выше среды с градиентом плотности; Эритроциты и гранулоциты осядут на дно. Визуализация приведена на рисунке 1A .
  5. С помощью новой трансферной пипетки пипетка осторожно поднимает и опускает оставшийся объем клеток и остаточной плазмы в каждой пробирке вверх и вниз в несколько раз выше градиента плотности.
  6. После ресуспендирования пипеткой ресуспендированное содержимое пробирки в коническую пробирку с маркировкой объемом 50 мл. Повторите для всех трубок.
  7. Налейте раствор 1 (RPMI Medium) в пробирку объемом 50 мл до тех пор, пока он не достигнет отметки 50 мл.
  8. При необходимости повторяйте шаги с 1.4 по 1.7 для каждого пациента или состояния лечения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что разные образцы не смешиваются, и используйте новую пипетку для переноса, чтобы избежать загрязнения.
  9. Центрифугируйте пробирку объемом 50 мл при давлении 300 x g в течение 10 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол сбора плазмы и баффи, подробно описанный в разделе 2, может быть завершен в течение этого времени.
  10. Выбросьте как можно больше надосадочной жидкости. Постукивайте по мере необходимости, чтобы удалить остатки капель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования гранула содержит PBMC, а надосадочная жидкость содержит тромбоциты и остаточную плазму.
  11. Налейте 15 мл пробирки Раствора 2 (RPMI Medium + 12,5% сывороточный альбумин человека + 1 мкМ флавопиридол) в 50 мл конической пробирки, содержащей гранулу PBMC. Аккуратно переверните трубку, чтобы повторно суспендировать клеточную гранулу.
  12. Аспирируйте 15 мл раствора 3 (среда RPMI + 11,25% альбумин сыворотки крови + 1 мкМ флавопиридол + 10% ДМСО) с помощью переводной пипетки. Добавьте по каплям в тюбик объемом 50 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор 3 содержит ДМСО, который токсичен для клеток при комнатной температуре. Не добавляйте раствор 3 до тех пор, пока он не будет готов к немедленной обработке.
  13. Аккуратно переверните трубку 3 раза, чтобы перемешать.
  14. Наполните каждый предварительно маркированный и предварительно охлажденный криовиал 1 мл PBMC с помощью дозирующей пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнительном видео 2 показано, как работать с дозатором с несколькими дозаторами.
  15. Поместите криовиалы в предварительно охлажденный контейнер для заморозки. Затем переместите контейнер в морозильную камеру при температуре -80 °C.
  16. При необходимости повторите шаги 1.9–1.13 для каждого пациента или состояния лечения.
  17. Храните криовиалы в контейнере для заморозки не менее 12 часов, затем переложите их в маркированный ящик для хранения при температуре -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы перенесите замороженные криовиалы в жидкий азот (<-135 °C) для длительного хранения.

2. Обработка плазмы и охристого покрытия из пробирок ЭДТА

  1. Центрифугируйте при давлении 1 800 x g в течение 10 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования верхний слой состоит из плазмы, нижний содержит эритроциты, а на границе раздела будет охристая оболочка. Визуализация приведена на рисунке 1B .
  2. С помощью новой переводной пипетки наберите как можно больше плазмы, не нарушая охристый слой шерсти. Затем распределите 0,5 мл аликвот в предварительно помеченные криовиалы. Аспирируйте охристый слой шерсти и перенесите его на криовиальный слой с соответствующей маркировкой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые виды плазмы и эритроцитов могут загрязнять коллекцию охристой шерсти.
  3. При необходимости повторите шаг 2.2 для каждого пациента или условия лечения.
  4. После сбора храните криовалиал в морозильной камере при температуре -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно хранить в жидком азоте (<-135 °C) для длительного хранения.

3. Размораживание PBMC

  1. За день до размораживания распечатайте контрольный список материалов и реагентов, перечисленных в таблице 3 , и подготовьте и промаркируйте его соответствующим образом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был разработан для размораживания 1 1,5 мл пробирки, содержащей 1 мл PBMC. Из каждой пробирки получается примерно 2 миллиона PBMC, из которых примерно 50% и 20% будут живыми лимфоцитами и моноцитами соответственно. Масштабируйте в соответствии с экспериментальными потребностями. Обратите внимание, что абсолютное количество клеток может существенно отличаться в зависимости от пациента или условий лечения.
  2. Замороженные ПМК переложить из хранилища с помощью сухого льда и разморозить в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 4 минут или непосредственно перед тем, как оттают кристаллы льда.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При желании можно взять аликвоту для подсчета клеток и измерения жизнеспособности, как подробно описано в разделе 4.
  3. После размораживания добавьте по 1 мл раствора 4 (PBS + 2 mM EDTA) в каждый криовиал. Затем вылейте содержимое в предварительно маркированную пробирку объемом 50 мл, содержащую 10 мл раствора 4 на каждую размороженную пробирку PBMC. Нажмите, чтобы удалить остатки капель.
  4. Поместите клеточный фильтр на пустую пробирку объемом 50 мл, а затем вылейте клеточную суспензию через клеточный фильтр.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости слегка постучите, чтобы нарушить поверхностное натяжение.
  5. Центрифугируйте каждую пробирку, содержащую процеженные клетки, при давлении 400 х г в течение 7 мин при комнатной температуре.
  6. После центрифугирования вылейте надосадочную жидкость, содержащую ДМСО. Постукивайте по мере необходимости, чтобы удалить остатки капель.
  7. Ресуспендируйте клеточную гранулу в желаемую среду, подходящую для последующих экспериментальных нужд (например, среды для клеточных культур, коктейль антител для проточной цитометрии и т.д.).

4. Подсчет клеток и жизнеспособность

  1. Сразу после размораживания замороженных PBMC на шаге 3.2 пипеткой введите 20 мкл клеток в пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте равный объем 0,4% раствора Trypan Blue и осторожно перемешайте пипеткой вверх и вниз 3-4 раза.
  2. Используя автоматический счетчик клеток, следуйте протоколу производителя для подсчета клеток и оценки жизнеспособности. Убедитесь, что учитывается коэффициент разбавления, равный 2.
    Примечание: Как описано в другом месте, гемоцитометр может быть использован в качестве альтернативного метода оценки количества клеток и жизнеспособности23.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После сбора и криоконсервации PBMC жизнеспособность размороженных PBMC, моноцитов и лимфоцитов из 56 уникальных образцов оценивали методом проточной цитометрии с использованием реагентов, перечисленных в таблице 4, в соответствии с инструкциями производителей (рис. 2A-F). Была достигнута средняя ± жизнеспособность SD PBMCs, моноцитов и лимфоцитов в 94 ± 4,0%, 98 ± 1,1% и 93 ± 5,6% соответственно (рис. 2G). Измерение жизнеспособности с помощью исключения Trypan Blue дало среднюю жизнеспособность 88 ± 7,5% и количество клеток 2,3 x 106 ± 1,9 x 106. Анализ проточной цитометрии также показал, что живые моноциты составляют 17 ± 5,9%, а лимфоциты — 53 ± 13,0% от общего количества ПМЦ.

Впоследствии моноциты сортировали из размороженных PBMC из 59 уникальных образцов с помощью проточной цитометрии и отправляли на библиотечную подготовку и секвенирование РНК, как описано в другом месте24. Среднее ± общее количество последовательностей SD в 18,0 ± 16,3 млн было достигнуто при выравнивании 93 ± 6,3% прочтении и 49,6 ± 1,4% GC (рис. 3A-B). Среднее значение ± процент уникально картированных прочтений SD составил 88 ± 3,6% при подмножестве из 56 уникальных образцов. Эти параметры демонстрируют, что высокожизнеспособные PBMC, пригодные для последующих применений, включая высококачественное секвенирование РНК, могут быть получены операторами с любым уровнем лабораторной подготовки, использующими этот протокол.

КомпонентПлотностьЦитата
ПлазмаОт 1,022 г/мл до 1,026 г/мл1
ТромбоцитовОт <1,061 г/мл до >1,070 г/мл2
МПМП<1,077 г/мл6
Нейтрофилы низкой плотности*<1,077 г/мл3
Гранулоциты (нейтрофилы*, базофилы и эозинофилы)>1,077 г/мл6
Эритроцитов1,11 г/мл4

Таблица 1: Компоненты цельной крови перечислены в порядке убывания плотности.

Рейгант/МатериалКоличество (за 6 трубок CPT и 1 трубку EDTA)КончикПредостережения
Трубки CPT6Этикетка в соответствии с идентификатором пациента или образца.
Трубка ЭДТА1Этикетка в соответствии с идентификатором пациента или образца.
Коническая трубка 50 мл2В дополнение к идентификатору пациента или образца наклейте этикетку на 1 пробирку для PBMC и 1 пробирку для отходов.
Криовиальные операции39Метка 30 для PBMC, 8 для плазмы ЭДТА и 1 для охристой шерсти. Можно использовать не все криовиальные аппараты.
Мистер Фрости2Заполните изопропанолом до половины и предварительно охладите на ночь при температуре -20°C.Изопропанол является легковоспламеняющимся раздражителем. Держите подальше от искр/пламени. Избегайте вдыхания и обращайтесь в перчатках и осторожно.
Флавопидол100 мкл запаса 1000XДля приготовления 1000X флавопиридола суспензию 5 мг флавопиридола в 1,14 мл ДМСО до концентрации 10 мМ. Разложите по 200 мкл в отдельные контейнеры, затем заморозьте. Для использования разморозьте отдельные аликвоты и разведите 1:10 в дистиллированной воде, не содержащей ДНКазы/РНКазы, а затем используйте в качестве раствора 1000X.Флавопирудол является раздражающим средством. Обращайтесь в перчатках и осторожно.
Решение 150 млRPMI Средний.
Чтобы приготовить 50 мл стокового раствора, используйте 50 мл RPMI Medium.
Решение 215 млRPMI Medium + 12,5% альбумин сыворотки крови человека + 1 мкМ флавопиридол.
Для приготовления 50 мл стокового раствора используйте 25 мл среды RPMI + 25 мл альбумина сыворотки крови человека + 50 мкл 1000X флавопиридола.		Флавопирудол является раздражающим средством. Обращайтесь в перчатках и осторожно.
Решение 315 млRPMI Medium + 11,25% сывороточный альбумин человека + 1 мкМ флавопиридол + 10% ДМСО.
Для приготовления 50 мл стокового раствора используйте 22,5 мл среды RPMI + 22,5 мл HSA + 5 мл ДМСО + 50 мкл 1000X флавопиридола.		Флавопиролидол является раздражителем, а ДМСО токсичен и легко всасывается через кожу. Обращайтесь в перчатках и осторожно.

Таблица 2: Контрольный перечень реагентов и материалов, которые необходимо подготовить и маркировать для сбора и криоконсервации PBMC.

Рейгант/МатериалКоличество (на 1 мл аликвоты замороженных ПМЦ)КончикПредостережения
Решение 410 млPBS + 2 мМ ЭДТА

Для приготовления 50 мл стокового раствора используйте 5 мл 10X PBS + 200 мкл 0,5М ЭДТА + 44,8 мл дистиллированной воды, не содержащей ДНКазы/РНКазы
Коническая трубка 50 мл3В дополнение к идентификатору пациента или образца пометьте 1 пробирку для предварительно процеженных PBMC, 1 для предварительно процеженных PBMC и 1 для отходов. Заполните пробирку с маркировкой для предварительно окрашенных ПМК 9 мл раствора 4 на мл замороженных ПМК
Тюбик 1,5 мл1Для подсчета клеток; этикетка с идентификатором пациента или образца
0,4% раствор трипана синего20 μлДля подсчета клеток; можно добавить в пробирку объемом 1,5 мл заранее накануне.Трипановый синий является канцерогеном. Обращайтесь в перчатках и осторожно.

Таблица 3: Контрольный перечень реагентов и материалов для подготовки и маркировки для размораживания и подсчета PBMC.

Реагент/материалКоличество (за миллион ячеек)
Пятно от живого мертвеца5 μл
Человеческое доверие FcX5 μл
Антитела к CD35 μл
Антитела к CD195 μл
Антитела к CD565 μл
Антитела к CD66b5 μл
Антитела к HLA-DR5 μл
Антитела к CD145 μл
Антитела к CD162,5 мкл
РНК100 единиц

Таблица 4: Таблица реагентов для выделения моноцитов из ПБМК методом проточной цитометрии.

Разделение компонентов крови на диаграмме центрифугирования градиента плотности; плазма, PBMCs, охристые слои шерсти.
Рисунок 1: Компоненты цельной крови, разделенные центрифугированием в центрифугировании с градиентом плотности или пробирках ЭДТА. (A) Центрифугирование цельной крови в центрифугирующих пробирках с градиентом плотности приводит к разделению плазмы, тромбоцитов и PBMC над средой градиента плотности с многоядерными и эритроцитами ниже среды градиента плотности. (B) Центрифугирование цельной крови в пробирках с ЭДТА приводит к разделению плазмы в самом верхнем слое, эритроцитов в нижнем слое и охристой оболочки на границе раздела. Создано с помощью Biorender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Графики рассеяния проточной цитометрии; ПМЦ, моноциты, лимфоциты; Анализ жизнеспособности, график типов клеток.
Рисунок 2: Жизнеспособность размороженных криоконсервированных PBMC оценивали с помощью окрашивания живым/мертвым потоком и проточной цитометрии. (A) Обломки, обозначенные звездочкой *, исключаются из PBMC с помощью прямого и бокового разброса. (B) Репрезентативный анализ живых/мертвых целых PBMC (C) Pan-моноциты классифицируются как HLA-DR-положительные и отрицательные для следующих FITC-меченых поверхностных антигенов: CD3, CD19, CD56 и CD66b. (D) Репрезентативный анализ живых/мертвых моноцитов. (E) Лимфоциты, гейтированные следующими мечеными FITC поверхностными антигенами: CD3, CD19, CD56 и CD 66b. (F) Репрезентативный анализ живых/мертвых лимфоцитов. (G) Процент жизнеспособности каждого типа клеток количественно определен на основе 56 образцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Графики анализа данных FastQC; Миллион последовательностей против выравниваемого, GC распределения контента.
Рисунок 3: Качество секвенирования РНК моноцитов, отсортированных из криоконсервированных PBMC. Было секвенировано 56 уникальных образцов и получено в среднем ± SD 18,0 ± 16,3 млн последовательностей. (A) Выравнивание было высоким: 92,5% ± 6,3% последовательностей совпадали с референсным геномом. (B) Содержание GC в этих последовательностях составило 49,6 ± 1,4%. Создано с помощью FastQC25. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительное видео 1: Демонстрация использования центрифуги Нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительное видео 2: Демонстрация работы с мультидиспенсерным дозатором. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол сбора и криоконсервации PBMC был успешно реализован лицами, имеющими и не имеющими предварительного обучения в исследовательской лаборатории. В нашей заявке FACS и РНК-секвенирование высокожизнеспособных моноцитов, выделенных из хранящихся PBMC, привело к получению высококачественных последовательностей.

Основным преимуществом этого протокола является его доступность. В методе, представленном в протоколе, используются пробирки, предварительно упакованные твердой градиентной средой. В результате цельная кровь может быть собрана непосредственно в пробирку, а затем немедленно обработана для выделения PBMC. Требуется относительно небольшое количество готовых растворов и специализированного оборудования, что облегчает сотрудничество между исследовательской лабораторией, где могут быть приготовлены реагенты, и клинической лабораторией, где собираются и обрабатываются образцы. Письменные и видеопротоколы ориентированы на операторов любого уровня подготовки.

Несмотря на то, что в этом протоколе используется свежая цельная кровь для выделения PBMC и, следовательно, он имеет относительно высокий ожидаемый выход и чистоту >90%, он может не подходить для применений, требующих исключительно высокой чистоты >98%26,27. Кроме того, получение центрифужных пробирок с градиентом плотности может быть дорогостоящим, особенно если необходимо собрать большое количество образцов.

К альтернативным методам сбора ПБМК относятся использование жидкой градиентной среды плотности или иммуномагнитного истощения28,29. Вкратце, первый включает в себя наслоение предварительно приготовленной среды с градиентом плотности под гепаринизированную цельную кровь с последующим центрифугированием. Последний использует магнитно помеченные антитела для мечения не-PBMC, которые затем сохраняются в магнитной колонке, в то время как немеченые PBMC проходят через нее незатронутыми.

По сравнению с представленным протоколом, использование жидкой среды с градиентом плотности является менее затратным и требует гораздо меньше материала из-за отсутствия пробирок для центрифугирования с градиентом плотности; Выделение PBMC может быть выполнено в стандартной пробирке объемом 50 мл8. Однако этот метод является более сложным, имеет более длительное время обработки и может быть подвержен более высокому риску ошибки пользователя. Во избежание чрезмерного разбавления необходимо добавлять точно гепарин, а среду с градиентом плотности необходимо тщательно наслаивать в нужных количествах, чтобы обеспечить хорошее разделение PBMC26.

По сравнению с представленным протоколом, использование иммуномагнитного истощения обеспечивает более высокий выход и чистоту, меньшую обработку из-за отсутствия центрифугирования, более быстрое время обработки и требует гораздо меньше материала 30,31,32. Однако основным недостатком является то, что этот метод является самым дорогостоящим из трех описанных методов, особенно в больших масштабах.

Несмотря на то, что этот протокол надежен, некоторые важные шаги могут потребовать дополнительного внимания. На протяжении всего протокола следите за тем, чтобы образцы не смешивались и помещались в пробирки с соответствующей маркировкой, особенно при одновременной работе с несколькими пациентами или состояниями. Для шага 1.4 убедитесь, что PBMC не отбракованы; Избыток плазмы приведет только к снижению концентрации PBMC, что менее критично для поддержания жизнеспособности и качества пробы. Кроме того, наличие осадков в собранных PBMC позволяет предположить, что кусочки среды градиента плотности были смещены. Делайте пипетку аккуратнее на шаге 1.5, чтобы предотвратить эту проблему. На этапах 1.10 и 3.6 убедитесь, что гранула центрифугированной ячейки не выброшена. Быстрая работа имеет решающее значение для этапов 1.12 и 3.3, так как раствор 3 содержит ДМСО, который токсичен для клеток при комнатной температуре33. Также важно отметить, что хранение PBMC в жидком азоте рекомендуется при температуре -80°C. Длительное хранение при температуре -80°C было связано со снижением жизнеспособности клеток и изменением экспрессии генов34,35.

Этот протокол может быть адаптирован в соответствии с экспериментальными потребностями. Добавление флавопиридола, ингибитора синтеза РНК-полимеразы и мРНК, в растворы 2 и 3 предназначено для предотвращения любых манипуляций и артефактов, вызванных напряжением, с помощью РНК-секвенирования36. Тем не менее, флавопидол может быть исключен, если желательны функциональные исследования или исследования ex vivo с использованием PBMC.

Плазма, собранная из пробирок ЭДТА, будет загрязнена ЭДТА, хелатирующим агентом. В результате плазма ЭДТА непригодна для анализов, включающих коагуляцию или ионы кальция37,38. При желании слой плазмы в пробирках с градиентом плотности после центрифугирования может быть собран на шаге 1.4. Эти пробирки содержат гепарин натрия в качестве антикоагулянта, который может быть удален с добавлением гепариназы39. Примечательно, что гепарин ингибирует обратную транскриптазу и амплификацию ПЦР, что делает собранную плазму непригодной для экспериментов ПЦР без добавления гепарин-блокатора40.

Собранный охристый слой из пробирок ЭДТА не хранится в растворе, содержащем ДМСО или флавопидидол. ДМСО играет важную роль в снижении образования кристаллов льда и гибели клеток41. Флавопирол важен для ингибирования синтеза РНК36. Таким образом, охристая шерсть непригодна для ex vivo и транскриптомных анализов. При желании шаги с 1.6 по 1.15 могут быть выполнены с использованием собранной охристой оболочки с целью максимизации жизнеспособности клеток и ингибирования синтеза РНК.

Несмотря на то, что этот протокол был разработан для секвенирования РНК, дополнительные потенциальные применения PBMC, собранных и криоконсервированных с использованием этого протокола, включают культивирование клеток, редактирование генов, функциональные исследования ex-vivo, анализы отдельных клеток, фенотипирование с помощью проточной цитометрии или цитометрии по времени полета, выделение ДНК/РНК или белков, слайды для иммуногистохимии и другие.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют соответствующих финансовых или нефинансовых интересов, которые можно было бы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить пациентов, которые добровольно дали свое согласие, время и донорство образцов крови. Мы также выражаем признательность доктору Патрику Мориарти, Джули-Энн Даттон и Марку Макклеллену из Медицинского центра Канзасского университета за их сотрудничество и внедрение этого протокола в удаленном центре. CY получил исследовательскую поддержку в рамках гранта NIH 1K08HL150271.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1000 &микро; L TipsGilsonF174501Требуется примерно 3 наконечника на пациента/состояние лечения для PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
15 мл пробиркиBiopioneeerCNT-15Для хранения растворов 2/3
2 необходимых на пациента/условия лечения для PBMC/плазмы/Buffy Coat Collection
2 мл криовиаловGlobe Scientific3012Требуется около 40 криовиалов на одного пациента/состояние лечения для PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
20 &m; L TipsGilson F174201Для использования при подсчете клеток; необходимый объем зависит от используемого метода подсчета клеток. 1 наконечник необходим на 1 мл необъединенных замороженных PBMC для размораживания
50 мл конической трубкиCEM Corporation50-187-7683требуется 2 на пациента / условия лечения для PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
3 необходим на 1 мл необъединенных замороженных PBMC для размораживания
CD14 AntibodyBiolegend325621
CD16 АнтителоBiolegend360723
CD19 АнтителоBiolegend363007
CD3 АнтителоBiolegend300405
CD56 АнтителоBiolegend318303
CD66b АнтителоBiolegend305103
Cell StrainerBiopioneeerDGN2583671 необходимо на 1 мл необъединенных замороженных PBMC для размораживания
CPT Пробирка для подготовки мононуклеарных клетокBD Biosciences 362753необходимо 6 пробирок на пациента/условия лечения для PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryo Freezer BoxSouthern LabwareSB2CC-81Вмещает 81 пробирку
1 необходима на пациента/условие лечения для PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryotube RackFisherbrand05-669-45Вмещает до 50 криовиальных растворов
DMSOInvitrogen15575020Примерно 2,5 мл требуется на одного пациента/состояние лечения для PBMC/плазмы/Buffy Coat Collection
ДНКазы/РНКазы Дистиллированная водаInvitrogen10977015Примерно 2 мл требуется на одного пациента/состояние лечения для PBMC/плазмы/Buffy Coat Collection
Требуется примерно 9 мл на 1 мл замороженных PBMC, подлежащих размораживанию
.EDTA TubesBD Biosciences3666431 пробирка необходима на пациента/условие лечения для PBMC/плазмы/Buffy Coat Collection
FlavopiridolSigma-AldrichF3055-5MG
HLA-DR АнтителоBiolegend307609
сывороточный альбумин человекаGeminiBio800-120Требуется примерно 25 мл на пациента или условие лечения для сбора PBMC/плазмы/Buffy Coat
Human Trustain FcXBiolegend422301
изопропанолSigma-AldrichW292912-1KG-KДля использования в принтере этикеток Mr. Frosty
PhomemoM110-WH
Live-Dead StainBiolegend423105
Mr. FrostyThermo Scientific5100-0001Вмещает до 18 пробирок.
2 Mr. Frostys требуется на пациента/состояние лечения для PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Multidispense PipetteBrandtech705110
Multidispense Pipette TipsBrandtech705744Требуется примерно 3 наконечника на пациента/состояние лечения для PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
P1000 PipetteGilsonF144059M
P20 ПипеткаGilsonF144056MДля использования при подсчете клеток; необходимый объем зависит от используемого метода подсчета клеток.
Этикетки для принтераPhomemoPM-M110-3020Требуется примерно 45 этикеток на одного пациента/состояние лечения для PBMC/плазмы/Buffy Coat Collection
Требуется примерно 5 этикеток на 1 мл необъединенных замороженных PBMC для размораживания
РНКаза ЭДТА (0,5 М)InvitrogenAM9260GПриблизительно 40 &; Необходимо разморозить 1 мл замороженных PBMC
РНКазы PBS (10X)InvitrogenAM9625Примерно 1 мл на 1 мл замороженных PBMC для размораживания
РНКазинPromegaN2111
RPMICorning10-040-CVПримерно 80 мл необходимо на пациента или условия лечения для PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Transfer PipettesFisherbrand13-711-7MТребуется примерно 5 на пациента/условия лечения для держателя пробирки для сбора пробирок PBMC/плазмы/Buffy Coat
Endicott-Seymour14-781-15Вмещает до 80 пробирок CPT/EDTA
без

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mathew, J., Sankar, P., Varacallo, M. Physiology, Blood Plasma. , StatPearls Pubs. Treasure Island, Florida. (2018).
  2. Van Oost, B., Van Hien-Hagg, I. H., Timmermans, A. P., Sixma, J. J. The effect of thrombin on the density distribution of blood platelets: Detection of activated platelets in the circulation. Blood. 62 (2), 433-438 (1983).
  3. Hassani, M., et al. On the origin of low-density neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 107 (5), 809-818 (2020).
  4. Norouzi, N., Bhakta, H. C., Grover, W. H. Sorting cells by their density. PLOS ONE. 12 (7), e0180520(2017).
  5. Manzone, T. A., Dam, H. Q., Soltis, D., Sagar, V. V. Blood volume analysis: A new technique and new clinical interest reinvigorate a classic study. JNMT. 35 (2), 55-63 (2007).
  6. Kleiveland, C. R. The impact of food bioactives on health: In vitro and ex vivo models. , Springer. Cham. 161-167 (2015).
  7. Rosado, M., et al. Advances in biomarker detection: Alternative approaches for blood-based biomarker detection. Adv Clin Chem. 92, 141-199 (2019).
  8. Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Multiple sclerosis: Methods and Protocols. 1304, Humana Press. New York, NY. 53-61 (2016).
  9. Panda, S. K., Ravindran, B. In vitro Culture of Human PBMCs. Bio Protoc. 3 (3), e322(2013).
  10. He, D., et al. Whole blood vs PBMC: Compartmental differences in gene expression profiling exemplified in asthma. Allergy Asthma Clinic Immol. 15, 67(2019).
  11. Pelák, O., et al. Lymphocyte enrichment using CD81-targeted immunoaffinity matrix. Cytometry Part A. 91 (1), 62-72 (2017).
  12. Higdon, L. E., et al. Impact on in-depth immunophenotyping of delay to peripheral blood processing. Clin Exp Immunol. 217 (2), 119-132 (2024).
  13. Liu, Z., et al. Photoactivatable aptamer-CRISPR nanodevice enables precise profiling of interferon-gamma release in humanized mice. ACS Nano. 18 (4), 3826-3838 (2024).
  14. Ren, Z., Li, C., Wang, J., Sui, J., Ma, Y. Single-cell transcriptome revealed dysregulated RNA-binding protein expression patterns and functions in human ankylosing spondylitis. Front Med. 11, 1369341(2024).
  15. Honardoost, M. A., et al. Systematic immune cell dysregulation and molecular subtypes revealed by single-cell-RNA-seq of subjects with type 1 diabetes. Genome Med. 16, 45(2024).
  16. Amini, A., Esmaeili, F., Golpich, M. Possible role of lncRNAs in amelioration of Parkinson's disease symptoms by transplantation of dopaminergic cells. NPJ Parkinsons Dis. 10, 56(2024).
  17. Luo, Y., et al. Sars-Cov-2 spike induces intestinal barrier dysfunction through the interaction between CEACAM5 and Galectin-9. Front Immunol. 15, e1303356(2024).
  18. Zhang, X., Wu, G., Ma, X., Cheng, L. Immune cell alterations and PI3k-PKB pathway suppression in patients with allergic rhinitis undergoing sublingual immunotherapy. Adv Ther. 41 (2), 777-791 (2024).
  19. Rucci, C., et al. Exploring mitochondrial DNA copy number in circulating cell-free DNA and extracellular vesicles across cardiovascular health status: A prospective case-control pilot study. FASEB J. 38 (10), e23672(2024).
  20. Ghamrawi, R., et al. Buffy coat DNA Methylation Profile is Representative of Methylation Patterns in White Blood Cell Types in Normal Pregnancy. Front Bioeng Biotechnol. 9, e782843(2022).
  21. Johansson, C., et al. Plasma biomarker profiles in autosomal dominant Alzheimer's disease. Brain. 146 (3), 1132-1140 (2023).
  22. Bonaterra-Pastra, A., et al. Comparison of plasma lipoprotein composition and function in cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Biomedicines. 9 (1), 72(2021).
  23. Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harb Protoc. (11), prot097980(2019).
  24. Cobo, I., et al. Monosodium urate crystals regulate a unique JNK-dependent macrophage metabolic and inflammatory response. Cell Rep. 38 (10), e110489(2022).
  25. Andrews, S. Fastqc: A quality control tool for high throughput sequence data. , http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2015).
  26. Corkum, C. P., et al. Immune cell subsets and their gene expression profiles from human PBMC isolated by Vacutainer Cell Preparation Tube (CPT™) and standard density gradient. BMC Immunology. 16, 48(2015).
  27. Golke, T., et al. Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield but severely compromise cell viability. Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).
  28. Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Curr Protoc Immunol. 85 (1), 7.1.1-7.1.8 (2009).
  29. Faass, L., et al. Contribution of heptose metabolites and the cag pathogenicity island to the activation of monocytes/macrophages by Helicobacter Pylori. Front Immunol. 12, e632154(2021).
  30. Preobrazhensky, S. N., Bahler, D. W. Immunomagnetic bead separation of mononuclear cells from contaminating granulocytes in cryopreserved blood samples. Cryobiology. 59 (3), 366-368 (2009).
  31. Schenz, J., Obermaier, M., Uhle, S., Weigand, M. A., Uhle, F. Low-density granulocyte contamination from peripheral blood mononuclear cells of patients with sepsis and how to remove it - A technical report. Front Immunol. 12, e684119(2021).
  32. Tessema, B., Riemer, J., Sack, U., König, B. Cellular stress assay in peripheral blood mononuclear cells: factors influencing its results. Int J Mol Sci. 23 (21), 13118(2022).
  33. abc. Chen, X., Thibeault, S. 2013 35th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC), , IEEE. 6228-6231 (2013).
  34. Yang, J., et al. The effects of storage temperature on PBMC gene expression. BMC Immunol. 17, 6(2016).
  35. Ticha, O., Moos, L., Bekeredjian-Ding, I. Effects of long-term cryopreservation of PBMC on recovery of B cell subpopulations. J Immunol Methods. 495, e113081(2021).
  36. Chao, S. -H., Price, D. H. Flavopiridol inactivates P-TEFb and blocks most RNA polymerase II transcription in vivo. J of Biol Chem. 276 (34), 31793-31799 (2001).
  37. Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).
  38. Mohri, M., Rezapoor, H. Effects of heparin, citrate, and EDTA on plasma biochemistry of sheep: Comparison with serum. Res Vet Sci. 86 (1), 111-114 (2009).
  39. Edwards, K., et al. Heparin-mediated PCR interference in SARS-CoV-2 assays and subsequent reversal with heparinase I. J Virol Methods. 327, 114944(2024).
  40. Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13 (3), 133-140 (1999).
  41. Yuan, Y., et al. Efficient long-term cryopreservation of pluripotent stem cells at -80  °C. Sci Rep. 6 (1), 34476(2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

PBMC

Похожие статьи