Методическая статья

Моделирование in vitro отложения жира при стеатозном заболевании печени, ассоциированном с метаболической дисфункцией

DOI:

10.3791/66810

⸱

19 июля 2024 г.

 ,  ,  ,  , 
1Inner Mongolia Medical University, 2Xilin Gol League Mongolian Medical Hospital, 3National and local Joint Mongolian Medicine R & D Engineering Center, 4Inner Mongolia Minzu University, 5Affiliated Hospital of Inner Mongolia Minzu University, 6Traditional Chinese & Mongolian Medical Research Institute of Inner Mongolia

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье описывается использование клеток HepG2, индуцированных олеиновой кислотой, в качестве модели стеатотического заболевания печени, связанного с метаболической дисфункцией.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Распространенность стеатотической болезни печени, связанной с метаболической дисфункцией (MASLD), резко возросла из-за изменений в экономических моделях и образе жизни, что привело к серьезным проблемам со здоровьем. В предыдущих отчетах изучалось создание животных и клеточных моделей для MASLD, подчеркивая различия между ними. В этом исследовании клеточная модель была создана путем индуцирования накопления жира в MASLD. Клетки HepG2 стимулировали ненасыщенной жирной кислотой олеиновой кислотой в различных концентрациях (0,125 мМ, 0,25 мМ, 0,5 мМ, 1 мМ) для эмуляции MASLD. Эффективность модели оценивали с помощью анализа набора для подсчета клеток-8, окрашивания Oil Red O и анализа содержания липидов. Это исследование было направлено на создание простой в эксплуатации клеточной модели для клеток MASLD. Результаты анализа набора для подсчета клеток-8 показали, что выживаемость клеток HepG2 зависела от концентрации олеиновой кислоты с ГИ50 1,875 мМ. Жизнеспособность клеток в группах 0,5 мМ и 1 мМ была достоверно ниже, чем в контрольной группе (P < 0,05). Кроме того, с помощью окрашивания Oil Red O и анализа содержания липидов изучалось отложение жира при различных концентрациях олеиновой кислоты (0,125 мМ, 0,25 мМ, 0,5 мМ, 1 мМ) на клетках HepG2. Содержание липидов в группах 0,25 мМ, 0,5 мМ и 1 мМ было достоверно выше, чем в контрольной группе (P < 0,05). Кроме того, уровни триглицеридов в группах ОА были значительно выше, чем в контрольной группе (P < 0,05).

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стеатозное заболевание печени, ассоциированное с метаболической дисфункцией (MASLD), включает в себя целый ряд состояний, включая простой стеатоз, неалкогольный стеатогепатит (НАСГ), цирроз печени и гепатоцеллюлярную карциному 1,2,3,4,5,6, все они связаны с факторами, отличными от употребления алкоголя7. MASLD является наиболее распространенным заболеванием печени, вызванным метаболическим повреждением печени, поражающим почти четверть населения мира 8,9,10,11,12. Хотя точный патогенез MASLD до сих пор не выяснен, различные теории пытаются объяснить его развитие. Одно из преобладающих представлений предполагает отход от классической теории «двух попаданий» в сторону модели «множественных попаданий»1. Центральное место в этих гипотезах занимает роль инсулинорезистентности, которая, как полагают, имеет решающее значение в патогенезе MASLD13. Исследования показывают, что резистентность к инсулину в гепатоцитах приводит к повышению уровня свободных жирных кислот, впоследствии образуя триглицериды, хранящиеся в печени14,15.

Исследователи использовали модели как in vivo , так и in vitro для моделирования отложения жира в MASLD; Тем не менее, полное воспроизведение его патомеханизма остается сложной задачей. Несмотря на это ограничение, эти модели сыграли важную роль в изучении потенциальных терапевтических мишеней для MASLD. Тем не менее, разработка стабильной модели MASLD имеет решающее значение. Несмотря на то, что животные модели эффективны, они отнимают много времени и денег, что подчеркивает растущий интерес к клеточным моделям in vitro . В этих моделях часто используются одна или несколько свободных жирных кислот, таких как олеиновая кислота (ОА) и пальмитиновая кислота, для воссоздания MASLD, вызванной диетой. Среди них клеточная линия гепатобластомы человека HepG2 часто используется для создания in vitro клеточных моделей MASLD.

Индукция ОА стимулирует клетки HepG2 к репликации жирового отложения, аналогичного MASLD, методу с хорошо зарекомендовавшей себя историей. Цель данного исследования состояла в том, чтобы продемонстрировать жизнеспособность, окрашивание маслом Red O (ORO), содержание липидов и уровень триглицеридов (TG) в клетках HepG2, обработанных 0,25 мМ OA. Цель этого эксперимента состояла в том, чтобы предоставить дополнительные доказательства для развития исследований по моделированию МАЖБП.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробную информацию обо всех материалах, инструментах и реагентах, используемых в данном протоколе, см. в Таблице материалов .

1. Культура клеток

  1. Культивирование клеток HepG2 в колбах для культивирования, содержащих модифицированную среду Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки [FBS], 100 единиц/мл пенициллина и 100 μг/мл стрептомицина). Поддерживайте температуру колб с культуральными культурами при температуре 37 °C в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 .

2. Влияние олеиновой кислоты на жизнеспособность клеток, измеренное с помощью набора для подсчета клеток-8

  1. Растворите определенный объем ОА в диметилсульфоксиде (ДМСО) до достижения концентрации 200 мМ. Храните раствор при температуре -20 °C для дальнейшего использования.
  2. Затравите клетки HepG2 в 96-луночный планшет при плотности клеток 6 × 10по 3 клетки в лунке. Добавьте по 100 мкл DMEM в каждую лунку. Инкубируйте и культивируйте клетки при 37 °C в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 в течение 24 часов. Разделите клетки HepG2 на две группы:
    1. Контрольная группа: добавить среду для культивирования клеток.
    2. Группа ОА: добавляют ОА в среду для культивирования клеток для достижения конечных концентраций 0,125 мМ, 0,25 мМ, 0,5 мМ и 1 мМ.
  3. Через 24 ч после первоначальной инкубации отбраковать надосадочную жидкость из каждой лунки и добавить ОА в соответствии с указанной группировкой, добавив 100 мкл на лунку. Для контрольной группы добавьте по 100 мкл среды для культивирования клеток в каждую лунку. Продолжайте инкубацию клеток еще 24 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что в каждой группе есть шесть повторяющихся скважин. Чтобы предотвратить испарение, добавьте 100 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) во внешнее кольцо лунок в 96-луночной пластине.
  4. После 24 ч инкубации добавьте в каждую лунку по 10 мкл набора для подсчета клеток-8 (CCK-8), осторожно перемешайте и инкубируйте в течение 2 ч в темноте. Извлеките 96-луночный планшет из инкубатора, поместите его в считыватель микропланшетов и измерьте значение поглощения на длине волны 450 нм (A450). Значения GI50 подсчитывались в соответствии с OD.

3. Окрашивание маслом Red O для наблюдения за внутриклеточным образованием липидных капель

  1. Семена клеток HepG2 в 6-луночные клеточные культуральные планшеты с плотностью 5 × 105 клеток в лунку и культивирование планшетов в инкубаторе с постоянной температурой в течение 24 ч. На рисунке 1 приведено визуальное представление описанных шагов.
  2. После 24 ч культивирования клеток добавьте 2 мл среды для культивирования клеток, содержащей ОА, в каждую лунку, достигая конечных концентраций 0,125 мМ, 0,25 мМ, 0,5 мМ и 1 мМ. Еще через 24 ч удалите среду для клеточных культур из каждой лунки и дважды промойте PBS. Добавьте по 1 мл фиксатора ORO в каждую лунку и инкубируйте в течение 30 минут.
  3. Приготовьте раствор для окрашивания ORO, смешав раствор для окрашивания А с раствором для окрашивания В в соотношении 3:2. Дайте смеси постоять при комнатной температуре в течение 10 минут, затем отфильтруйте ее один раз через фильтр 0,45 мкм. Храните отфильтрованный раствор в центрифужной пробирке, защищенной от света до использования.
  4. Выбросьте фиксатор и дважды промойте дистиллированной водой. Добавьте по 1 мл 60% изопропанола в каждую лунку и инкубируйте в течение 30 с. Выбросьте 60% раствора изопропанола и добавьте 1 мл свежеприготовленного раствора для окрашивания ORO в каждую лунку перед инкубацией в течение 20 минут. Выбросьте окрашивающий раствор ORO, добавьте в каждую лунку по 1 мл 60% изопропанола и выдержите 30 с. Смойте 5 раз водой, чтобы удалить излишки красителя.
  5. Накройте клетки дистиллированной водой и понаблюдайте под микроскопом. Как только изображения будут собраны, слейте жидкость с пластины и дайте ей высохнуть. Затем добавьте по 2 мл изопропанола в каждую лунку и встряхивайте пластину на орбитальном шейкере в течение 10 минут. Переложите жидкость в новую 96-луночную пластину, по 16 лунок в каждой группе, добавив по 100 мкл на лунку. Рассчитайте содержание липидов путем измерения оптической плотности (OD) каждой лунки с помощью считывателя микропланшетов с длиной волны 510 нм (A510).

4. Влияние различных концентраций олеиновой кислоты на общий триглицерид в надосадочной жидкости клеток HepG2

  1. Уравновесьте набор при комнатной температуре в течение 20 минут и подготовьте необходимые пластины для эксперимента.
  2. Соберите надосадочную жидкость для клеток и центрифугируйте в дозе 1570 × г в течение 10 мин. Установка стандартных скважин и испытание пробных скважин. Добавьте в стандартные лунки 50 μл стандартной концентрации ([S0 → S5] с последующей концентрацией: 0, 0,5, 1, 2, 4, 8 ммоль/л). В дополнение к пустой и стандартной лункам добавьте в лунки для проб по 10 мкл различных проб, после чего добавьте в каждую лунку по 40 мкл разбавителя пробы. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл детектирующего антитела-пероксидазы хрена, запечатайте пластинчатой мембраной и инкубируйте при 37 °C в течение 1 ч в духовке постоянной температуры.
  3. Выбросьте надосадочную жидкость, промокните насухо на непыльной бумаге и промойте каждую лунку 1x моющим раствором. Оставить настаиваться при комнатной температуре на 1 минуту. Повторите процесс стирки 5 раз.
  4. Добавьте в каждую лунку по 50 мкл субстрата А и по 50 мкл субстрата В. Аккуратно перемешайте и выдерживайте в течение 15 минут при температуре 37 °C. Добавьте 50 мкл концевого раствора в каждую лунку и измерьте значение наружного диаметра каждой лунки на длине волны 450 нм (А450) в течение 15 минут.
  5. Построите график концентрации стандарта по оси x и соответствующего значения поглощения (OD) вдоль оси y, чтобы выполнить линейную регрессию и вывести уравнение кривой для расчета значения концентрации каждого образца.

5. Статистический анализ

  1. Определите существенные различия в количественных данных.
  2. Вычислите среднее значение ± стандартного отклонения (SD) и графически представьте данные. Считайте , что P < 0,05 является статистически значимым.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Влияние олеиновой кислоты на жизнеспособность клеток
Клетки HepG2 подвергались воздействию различных концентраций ОА (0 мМ, 0,125 мМ, 0,25 мМ, 0,5 мМ, 1 мМ), что приводило к снижению выживаемости клеток при 0,125 мМ, 0,25 мМ, 0,5 мМ и 1 мМ по сравнению с 0 мМ. Статистическая значимость наблюдалась при 0,5 мМ (P < 0,05) и 1 мМ (P < 0,05) по сравнению с 0 мМ. Результаты влияния ОА на жизнеспособность клеток, оцененные с помощью набора CCK-8, показаны на рисунке 2. Значение GI50 для клеток HepG2, обработанных ОА, было рассчитано как 1,875 мМ.

Окрашивание маслом Red O для наблюдения за внутриклеточным образованием липидных капель
Окрашивание ОРО является широко используемым методом визуализации липидов16,17. Следовательно, образование липидных капель в клетках HepG2, инкубированных с ОА в течение 24 ч, наблюдалось под микроскопом после окрашивания ОРО. Как показано на рисунках 3 и 4, интенсивность красного окрашивания в клетках, обработанных ОА, была выше, чем в необработанных. Красные липидные капли присутствовали в плазме клеток HepG2 после лечения ОА, при этом количество липидных капель и липидов увеличивалось с повышением концентраций ОА (рис. 5).

Влияние различных концентраций олеиновой кислоты на общий триглицерид в надосадочной жидкости клеток HepG2
Экспериментальные данные, представленные на рисунке 6, показали, что по сравнению с контрольной группой, обработка клеток HepG2 различными концентрациями ОА (0,125 мМ, 0,25 мМ, 0,5 мМ, 1 мМ) приводила к достоверному увеличению содержания ТГ в клеточной супернатанте в группе ОА (P < 0,05).

figure-results-1
Иллюстрация 1: Технологическая схема окрашивания Oil Red O. Сокращения: OA = олеиновая кислота; OD = оптическая плотность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Влияние олеиновой кислоты на жизнеспособность клеток, оцененное с помощью набора для подсчета клеток-8. Каждый столбик представляет среднее значение ± SD (n = 6). *P < 0,05. Сокращение: ОА = олеиновая кислота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Окрашивание масляным красным цветом изображений нескольких временных точек (направления 3, 6, 9 и 12 часов). Образование липидных капель было обнаружено с помощью инвертированного микроскопа для культивирования клеток при 40-кратном увеличении. Масштабная линейка = 500 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4: Влияние олеиновой кислоты на капли липидов в клетках, оцененное с помощью окрашивания Oil Red O. Образование липидных капель было обнаружено с помощью инвертированного микроскопа для культивирования клеток при 40-кратном увеличении. Масштабная линейка = 250 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-5
Рисунок 5: Влияние олеиновой кислоты на содержание липидов в клетках, оцениваемое по значению оптической плотности. Представлены относительные кратные изменения значений оптической плотности в разных группах. Каждый столбец представляет среднее значение ± SD (n = 16). *P < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-6
Рисунок 6: Влияние различных концентраций олеиновой кислоты на общий уровень триглицеридов в надосадочной жидкости клеток HepG2. Относительные кратные изменения представлены в значении уровней триглицеридов в разных группах. Каждый столбец представляет среднее значение ± SD (n = 3). *P < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MASLD является клинико-патологическим синдромом, характеризующимся чрезмерным внутриклеточным отложением жира в гепатоцитах из-за факторов, выходящих за рамки алкоголя и других установленных агентов, повреждающих печень18. MASLD неразрывно связан с приобретенным метаболическим стрессом повреждением печени, в частности, связанным с резистентностью к инсулину и генетической предрасположенностью. Для эффективного изучения и скрининга препаратов на MASLD крайне важно выбрать подходящую экспериментальную модель. Создание клеточной модели особенно важно в исследованиях MASLD, способствуя более глубокому пониманию патологических механизмов и оценке новых эффектов лекарств.

Этот протокол описывает in vitro модель MASLD, созданную с помощью ОА-индуцированных клеток HepG2. Окрашивание ОРО и анализ содержания липидов служат критическими методами для создания этой модели. Кроме того, оценка жизнеспособности клеток и общего содержания ТГ в клеточных надосадочных зонтах имеет важное значение для оценки соответствующей концентрации ОА. Диагностическим критерием для MASLD является наличие более 5% ТГ, хранящихся в клетках печени19,20. Модели клеток MASLD в основном опираются на клетки HepG2 21,22,23,24,25,26,27,28, известные своим успешным использованием при построении моделей жировой дегенерации печени в различных отечественных и международных исследованиях. Несмотря на происхождение из клеток гепатомы, клетки HepG2 имеют много общих фенотипических характеристик с гепатоцитами и легко культивируются иразмножаются. Такие тесты, как набор CCK-8, окрашивание ORO, содержание липидов и измерение общего ТГ, предлагают простые, объективные и разумные подходы к оценке жизнеспособности клеток, накопления жира и содержания липидов у испытуемых. В этом контексте ОА согласуется с патогенезом MASLD31, где избыточная энергия сохраняется в форме липидов, когда потребление энергии превышает потребление.

Исследователи использовали OA 23,28,31,32,33, пальмитиновую кислоту34,35 и комбинации олеиновой/пальмитиновой кислоты26,36 для воспроизведения модели MASLD. Как пальмитиновая кислота, так и ОА способствуют жировой дистрофии печени и накоплению ТГ. Пальмитиновая кислота, наиболее распространенная насыщенная жирная кислота в организме человека, проявляет значительную липотоксичность, приводя к накоплению липидов в гепатоцитах, увеличению внутриклеточных активных радикалов кислорода и гибели или некрозуклеток. И наоборот, ОА приводит к более выраженному внутриклеточному отложению ТГ (рис. 6) и меньшей клеточной модуляции38. Таким образом, исследователи часто используют ОА-индуцированные клетки HepG2 для создания in vitro моделей MASLD. Как описано в пункте 2.2.2 протокола, крайне важно нагреть решение открытого доступа при его добавлении. В этом исследовании окрашивание ORO и анализ содержания липидов были основаны на отложении липидов в клетках HepG2, что эффективно поддерживает исследование моделей MASLD in vitro со сложными механизмами и сокращает время и стоимость, необходимые для исследований.

ORO легко связывается с TG в форме капель, образуя окрашивание от оранжевого до красного, указывающее на жир, с интенсивностью цвета в зависимости от концентрации липидов. Однако окрашивающий раствор ORO нестабилен и склонен к выпадению осадков, что делает его непригодным для предварительного приготовления. Таким образом, окрашивающий раствор ORO был приготовлен после этапа протокола 3.2, с соблюдением мер предосторожности для предотвращения воздействия света во время подготовки и инкубации (этапы протокола 3.2, 3.3). На этапе протокола 3.5 выбор изображений в нескольких временных точках (3, 6, 9 и 12 часов) представляет собой ключевую модификацию эксперимента, которая имеет важное значение для повышения точности результатов. Несмотря на то, что повышенные концентрации ОА влияют на выживаемость клеток, что является ограничением данного метода, было продемонстрировано, что соответствующая концентрация ОА обеспечивает жизнеспособность клеток.

В этом исследовании использовался комплексный подход с использованием набора CCK-8, окрашивания ORO, анализа содержания липидов и измерения общего TG для создания и валидации модели MASLD. Набор CCK-8 был использован для оценки влияния лекарств на жизнеспособность клеток, что послужило важным этапом валидации. В будущем эта модель является перспективной для скрининга лекарственных препаратов и исследования механизмов, направленных на понимание патогенеза MASLD и выявление потенциальных терапевтических мишеней. Для дальнейшего обеспечения качества и надежности валидации уровни экспрессии белков-мишеней, задействованных в модели, будут проанализированы с использованием вестерн-блоттинга и количественного анализа полимеразной цепной реакции.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящее исследование было предоставлено в рамках программы «Исследование по ключевым вопросам лечебного эффекта кумыса на региональные болезни монгольской медицины» в 2018 году при поддержке проекта программы «Наука и технологии» Департамента науки и технологий автономного района Внутренняя Монголия.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,22 & микро; m фильтрMillex
0,25% Трипсин-ЭДТА (1x) Трипсин-ЭДТАGibco25200-056
0,45 &; m фильтрMillex
2 мл Кригенные флаконыCORNING430659
25 см2 Колба для клеточных культурCORNING430639
6-луночный планшет для клеточной культурыCORNING3516
96-луночный планшет для клеточной культурыCORNING3599
Планшет для анализа кровиShanghai Jing Jing Биохимический реагент & Instrument Co.
Набор для подсчета клеток-8 анализовBeijing Solarbio Science & Технологическая компания, ООО Инкубатор CA1210-1000T
CO2NUAIRENU-5710E
  Диметилсульфоксид ДМСО Пекин Соларбио Наука и Технологическая компания, ООО D8371
Модифицированная среда Dulbecco EagleGibco8122691
оборудование для мечения ферментов TecanSpark
Фетальная бычья сыворотка, сертифицированнаяGibco10099141
клеток HepG2Пекин Северный Китай Чуанлянь Научно-исследовательский институт биотехнологии (BNCC)221031
Человеческий триглицерид (ТГ) ИФА инструкцияНанкинский институт биоинженерии Цзячэн20170301
Инвертированный микроскоп для клеточных культурLeicaDMi1 
ИзопропанолТяньцзинь Чжиюань Химический реагент Ко.
Набор для красных пятен, для культивируемых клетокBeijing Solarbio Science & Технологическая компания, ООО G1262
Олеиновая кислота Сангон Биотек (Шанхай) Ко., Лтд.
Пенициллин, стрептомицин,программное обеспечение
SPSS 24.0Statistics
02270113 линия 2021030141A502071 Gibco 15140122

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alisi, A., Feldstein, A. E., Villani, A., Raponi, M. Pediatric nonalcoholic fatty liver disease: a multidisciplinary approach. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9 (3), 152-161 (2012).
  2. Anania, C., Perla, F. M., Olivero, F., Pacifico, L., Chiesa, C. Mediterranean diet and nonalcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 24 (19), 2083-2094 (2018).
  3. Bessone, F., Razori, M. V., Roma, M. G. Molecular pathways of nonalcoholic fatty liver disease development and progression. Cell Mol Life Sci. 76 (1), 99-128 (2019).
  4. Katsiki, N., Mikhailidis, D. P., Mantzoros, C. S. Non-alcoholic fatty liver disease and dyslipidemia: An update. Metabolism. 65 (8), 1109-1123 (2016).
  5. European Association for the Study of the Liver (EASL); European Association for the Study of Diabetes (EASD); European Association for the Study of Obesity (EASO). EASL-EASD-EASO Clinical Practice Guidelines for the Management of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease. Obes Facts. 9 (2), 65-90 (2016).
  6. Chalasani, N., et al. The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).
  7. Díaz, L. A., Arab, J. P., Louvet, A., Bataller, R., Arrese, M. The intersection between alcohol-related liver disease and nonalcoholic fatty liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 20 (12), 764-783 (2023).
  8. Cotter, T. G., Rinella, M. Nonalcoholic fatty liver disease 2020: The state of the disease. Gastroenterology. 158 (7), 1851-1864 (2020).
  9. Lonardo, A., et al. Metabolic mechanisms for and treatment of NAFLD or NASH occurring after liver transplantation. Nat Rev Endocrinol. 18 (10), 638-650 (2022).
  10. Papatheodoridi, M., Cholongitas, E. Diagnosis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD): Current concepts. Curr Pharm Des. 24 (38), 4574-4586 (2018).
  11. Van Herck, M. A., Vonghia, L., Francque, S. M. Animal models of nonalcoholic fatty liver disease-a starter's guide. Nutrients. 9 (10), 1072(2017).
  12. Wieckowska, A., Feldstein, A. E. Diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease: invasive versus noninvasive. Semin Liver Dis. 28 (4), 386-395 (2008).
  13. Stein, L. L., Dong, M. H., Loomba, R. Insulin sensitizers in nonalcoholic fatty liver disease and steatohepatitis: Current status. Adv Ther. 26 (10), 893-907 (2009).
  14. Milić, S., Lulić, D., Štimac, D. Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: biochemical, metabolic and clinical presentations. World J Gastroenterol. 20 (28), 9330-9337 (2014).
  15. Neuschwander-Tetri, B. A., Caldwell, S. H. Nonalcoholic steatohepatitis: summary of an AASLD Single Topic Conference. Hepatology. 37 (5), 1202-1219 (2003).
  16. Du, J., Zhao, L., Kang, Q., He, Y., Bi, Y. An optimized method for Oil Red O staining with the salicylic acid ethanol solution. Adipocyte. 12 (1), 2179334(2023).
  17. Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by Oil Red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nat Protoc. 8 (6), 1149-1154 (2013).
  18. Estes, C., Razavi, H., Loomba, R., Younossi, Z., Sanyal, A. J. Modeling the epidemic of nonalcoholic fatty liver disease demonstrates an exponential increase in burden of disease. Hepatology. 67 (1), 123-133 (2018).
  19. Watkins, P. A., Ellis, J. M. Peroxisomal acyl-CoA synthetases. Biochim Biophys Acta. 1822 (9), 1411-1420 (2012).
  20. Heeren, J., Scheja, L. Metabolic-associated fatty liver disease and lipoprotein metabolism. Mol Metab. 50, 101238(2021).
  21. Kim, S. H., et al. Effect of isoquercitrin on free fatty acid-induced lipid accumulation in HepG2 cells. Molecules. 28 (3), 1476(2023).
  22. Lee, M. R., Yang, H. J., Park, K. I., Ma, J. Y. Lycopus lucidus Turcz. ex Benth. attenuates free fatty acid-induced steatosis in HepG2 cells and non-alcoholic fatty liver disease in high-fat diet-induced obese mice. Phytomedicine. 55, 14-22 (2019).
  23. Li, J., et al. Hesperetin ameliorates hepatic oxidative stress and inflammation via the PI3K/AKT-Nrf2-ARE pathway in oleic acid-induced HepG2 cells and a rat model of high-fat diet-induced NAFLD. Food Funct. 12 (9), 3898-3918 (2021).
  24. Li, Y., et al. Protopanaxadiol ameliorates NAFLD by regulating hepatocyte lipid metabolism through AMPK/SIRT1 signaling pathway. Biomed Pharmacother. 160, 114319(2023).
  25. Liu, H., et al. Zeaxanthin prevents ferroptosis by promoting mitochondrial function and inhibiting the p53 pathway in free fatty acid-induced HepG2 cells. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1868 (4), 159287(2023).
  26. Mun, J., et al. Water extract of Curcuma longa L. ameliorates non-alcoholic fatty liver disease. Nutrients. 11 (10), 2536(2019).
  27. Park, M., Yoo, J. H., Lee, Y. S., Lee, H. J. Lonicera caerulea extract attenuates non-alcoholic fatty liver disease in free fatty acid-induced HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice. Nutrients. 11 (3), 494(2019).
  28. Xia, H., et al. Alpha-naphthoflavone attenuates non-alcoholic fatty liver disease in oleic acid-treated HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice. Biomed Pharmacother. 118, 109287(2019).
  29. Alkhatatbeh, M. J., Lincz, L. F., Thorne, R. F. Low simvastatin concentrations reduce oleic acid-induced steatosis in HepG(2) cells: An in vitro model of non-alcoholic fatty liver disease. Exp Ther Med. 11 (2), 1487-1492 (2016).
  30. Cui, W., Chen, S. L., Hu, K. Q. Quantification and mechanisms of oleic acid-induced steatosis in HepG2 cells. Am J Transl Res. 2 (1), 95-104 (2010).
  31. Guo, X., Yin, X., Liu, Z., Wang, J. Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) pathogenesis and natural products for prevention and treatment. Int J Mol Sci. 23 (24), 15489(2022).
  32. Rafiei, H., Omidian, K., Bandy, B. Dietary polyphenols protect against oleic acid-induced steatosis in an in vitro model of NAFLD by modulating lipid metabolism and improving mitochondrial function. Nutrients. 11 (3), 541(2019).
  33. Tie, F., et al. Kaempferol and kaempferide attenuate oleic acid-Induced lipid accumulation and oxidative stress in HepG2 cells. Int J Mol Sci. 22 (16), 8847(2021).
  34. Fang, K., et al. Diosgenin ameliorates palmitic acid-induced lipid accumulation via AMPK/ACC/CPT-1A and SREBP-1c/FAS signaling pathways in LO2 cells. BMC Complement Altern Med. 19 (1), 255(2019).
  35. Wu, X., et al. MLKL-dependent signaling regulates autophagic flux in a murine model of non-alcohol-associated fatty liver and steatohepatitis. J Hepatol. 73 (3), 616-627 (2020).
  36. Scavo, M. P., et al. The oleic/palmitic acid imbalance in exosomes isolated from NAFLD patients induces necroptosis of liver cells via the elongase-6/RIP-1 pathway. Cell Death Dis. 14 (9), 635(2023).
  37. Chavez-Tapia, N. C., Rosso, N., Tiribelli, C. Effect of intracellular lipid accumulation in a new model of non-alcoholic fatty liver disease. BMC Gastroenterol. 12, 20(2012).
  38. Ricchi, M., et al. Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes. J Gastroenterol Hepatol. 24 (5), 830-840 (2009).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

HepG2Oil Red OMASLD in vitro

Похожие статьи