Этот протокол представляет собой комплексный и эффективный метод анализа восстановления кости нижней челюсти. Мы описываем воспроизводимую технику нестабилизированного перелома нижней челюсти на мышиной модели, позволяющую анализировать процесс эндохондрального восстановления кости с минимальным повреждением тканей и потерей костной массы.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Менее инвазивная техника лечения нестабилизированного перелома нижней челюсти на мышиных моделях
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
У мышей могут быть сделаны нестабилизированные переломы нижней челюсти, что позволяет анализировать восстановление кости в режиме эндохондрального окостенения. Чтобы наиболее точно отразить этот процесс in vivo, необходимо иметь стандартизированный протокол, чтобы избежать чрезмерной потери костной массы и повреждения мягких тканей, особенно в нижней челюсти, анатомической области, характеризующейся минимальным доступом. Насколько нам известно, мы впервые описываем менее инвазивный протокол нестабилизированного перелома нижней челюсти у мышей. Взрослых мышей обезболивают изофлураном и получают предоперационную дозу бупренорфина путем подкожного введения. Выполняется подчелюстной доступ, при этом разрез кожи делается вдоль нижней границы нижней челюсти. Жевательная мышца приподнята в наднадкостничной плоскости вдоль ветви нижней челюсти с помощью надкостничного лифта. Вертикальный и полный перелом ветви выполняется от базилярной границы до короноидной выемки (между мыщелковым и короноидным отростками) с использованием пьезоэлектрического костного хирургического аппарата под солевой сывороткой орошения у базилярного края и ножниц для завершения перелома ветви нижней челюсти. Кожный доступ закрывается шелковыми швами. Эта детальная процедура при нестабилизированных переломах нижней челюсти предлагает эффективную процедуру, позволяющую свести к минимуму потерю костной массы и повреждение мягких тканей. Этот метод обеспечивает успешные и стабильные результаты, точно отражающие процесс эндохондрального восстановления костей на мышиных моделях.
Введение
Восстановление кости подразумевает под собой как мембранозные, так и эндохондральные процессы окостенения, в зависимости от стабилизации перелома или остеотомии. Восстановление кости после стабилизированной костной остеотомии или переломов основано на мембранозном окостенении, в то время как нестабилизированные переломы или плохо стабилизированные остеотомии консолидируются в соответствии с режимом эндохондрального окостенения1. Мембранозное восстановление кости характеризуется формированием кости путем прямой дифференцировки мезенхимальных клеток в остеобласты, тогда как эндохондральное восстановление кости включает в себя образование транзиторного хрящевого шаблона, который дифференцируется в остеобласты с образованием костной каллуса2.
Восстановление кости зависит от многочисленных тканевых и клеточных взаимодействий; На него также влияют факторы, специфичные для конкретного места, и сила, оказываемая на каллус3. Нижнечелюстная кость - это подвижная кость, поддерживающая жевательные силы, в основном образованная кортикальной костью. На процесс восстановления кости нижней челюсти влияет место и направление перелома. Хорошо известно, что мышечные травмы и травмы надкостницы могут повлиять на консолидацию кости, а также на значительную потерю костной массы в месте перелома 4,5,6.
Анализ эндохондрального восстановления нижнечелюстной кости подразумевает стандартизированные и воспроизводимые протоколы для ценных, непредвзятых сравнений. Что касается литературы, то лишь немногие авторы сообщают о протоколах нестабилизированных переломов нижней челюсти у мышей моделей 3,7, и в основном с передним направлением на уровне моляров8. Разрабатывая эту методику, мы стремимся избежать мышечных травм и травм надкостницы и ограничить потерю костной массы в месте перелома, чтобы наилучшим образом проанализировать процесс эндохондрального восстановления кости без искажающих факторов. Кроме того, целью разработки новой методики перелома нижней челюсти у мышей было свести к минимуму послеоперационную боль и смерть животных, частую при такой хирургии у мелких животных. Впервые мы описываем менее инвазивный протокол для нестабилизированного перелома нижней челюсти на уровне ветви у мышей. Этот протокол in vivo позволяет избежать чрезмерного повреждения мышц и надкостницы или потери костной массы в месте перелома и помогает снизить уровень послеоперационной боли и риск смерти животного.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этот протокол соответствует рекомендациям по уходу за животными Imagine Institute и был одобрен этическими комитетами и министерством Франции (APAFIS 26995).
1. Животные
- Определите количество животных в группе. Мы рекомендуем 12 животных в группе. Определите пол и возраст мышей. Этот протокол адаптирован для 6-недельных мышей C57BL/6J (самцов или самок).
- Дайте животным, не менее чем за 1 неделю до процедуры, пищевую добавку гель для акклиматизации.
2. Хирургическое вмешательство
- Подготовьте необходимый материал. В автоклаве находятся инструменты: ножницы, игольчатый привод, щипцы, вкладыш и наконечник пьезоэлектрического аппарата костной хирургии, а также элеватор. Подготовьте стерильные перчатки, шелковые шовные материалы (4/0), бритву, ватную марлю, 10% раствор повидон-йода, стол с подогревом, изофлуран и маску для ингаляции изофлураном.
- Готовят бупренорфин в дозе 0,1 мг/кг, разведенный в стерильной инъекционной физиологической сыворотке. Введите бупренорфин путем подкожной инъекции иглой 25G за 30 минут до операции.
- Подготовьте нагревательную пластину (37 °C), положите на нее поролоновую подложку, а маску для морды зафиксируйте маленькими иглами или скотчом.
- Поместите мышь в резервуар с изофлураном для индукции, с диффузией изофлурана (4%). Проверьте глубину анестезии, выполнив защемление пальца ноги. При достаточной индукции будет наблюдаться отсутствие педального рефлекса.
- Поместите мышь под наркозом на спину на нагревательную пластину, покрытую стерильным полем, при которой температура должна сохраняться при температуре 37 °C в течение всей процедуры. Расположите маску на рыле для непрерывной ингаляции изофлурана (поддержание на уровне 2,5%). Зафиксируйте конечности мыши с помощью скотча.
- Наносите глазную смазку двусторонне, чтобы предотвратить сухость глаз, вызванную общей анестезией. Сбрейте подчелюстные волосы, наденьте стерильные перчатки, продезинфицируйте кожу несколькими мазками 10% раствора повидон-йода и спирта.
- Выполните подчелюстной кожный доступ, как описано ниже.
- Микроножницами выполните разрез кожи от нижнечелюстного угла до 1/3 заднего - 2/3 переднего соединения горизонтальной ветви нижней челюсти.
- Рассеките подкожные ткани, чтобы обнажить жевательную мышцу.
- Удаляют жевательную мышцу прикрепления с помощью надкостничного элеватора от нижней границы нижней челюсти.
- Поднимите жевательную мышцу в субнадкостничной плоскости вдоль ветви нижней челюсти с помощью руля высоты.
- Создать небольшую остеотомию (длиной 3 мм) на нижней границе нижней челюсти с помощью пьезоэлектрического аппарата для хирургии костей под солевым раствором (максимум 10 мл/мин) на нижней границе нижней челюсти, спереди от нижнечелюстного угла, в задней части вогнутости (рис. 1, рис. 2).
- Найдите заднюю границу нижней челюсти и короноидную выемку (с помощью микроножниц или щипцов) и завершите перелом с помощью небольших прямых ножниц, вставленных вдоль ветви нижней челюсти, чтобы избежать дополнительного отверстия жевательной мышцы и травмы. Чтобы обеспечить правильную ориентацию перелома, расположите ножницы перпендикулярно нижней границе нижней челюсти.
- Убедитесь, что перелом полностью завершен: во время мягкой мобилизации 2 сегментов щипцами следует наблюдать полную подвижность между двумя костными сегментами.
- Закройте кожный подход шелковыми нитями (4/0) с разделенными швами. В надкостнице не нужно накладывать швы.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, кожный доступ может быть сшит другими неадсорбируемыми шовными материалами (например, полипропиленовыми шовными материалами). - Выполните боковую рентгенографию головного мозга, чтобы подтвердить направление перелома (Рисунок 3).
- Снова поместите мышь в резервуар с изофлураном для короткой реиндукции перед выполнением рентгена. Затем поместите мышь в вытянутом положении, на боковой стороне, так, чтобы голова была слегка гиперэкстензией для рентгенологического анализа.
- В случае перелома, расположенного слишком кпереди, на уровне нижнечелюстного моляра или когда перелом отделил нижнечелюстной угол (рис. 4), наблюдайте аномальное увеличение объема костной мозоли. В этих случаях исключите животных из исследования, чтобы избежать любой предвзятости в анализе.
- Проверяйте мышей, пока они не придут в сознание, прежде чем поместить их обратно в клетку.
3. Послеоперационный уход
- Подготовьте клетку для мышей без гранул и твердого обогащения, чтобы избежать любых жевательных сил.
- Изолируйте прооперированную мышь в одной клетке на1-ю неделю до полного заживления кожи. Через 1 неделю после операции группа оперировала самок мышей вместе в одной клетке.
- Вводите бупренорфин (0,1 мг/кг) подкожно через 4 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч после процедуры.
- Кормите мышей мягким диетическим гелем в течение всех послеоперационных периодов с 0-го дня до окончания периода консолидации (т.е. 28 дней), чтобы избежать боли и вторичного смещения перелома.
- Ежедневно взвешивайте мышей с 0-го по 4-й день после перелома, утром, до инъекции бупренорфина, а затем 3 раза в неделю до жертвоприношения животных (через 14 дней после перелома).
- Оцените послеоперационное благополучие животных для оптимизации послеоперационного ухода за животными. Используйте шкалу баллов, приведенную в таблице 1 , чтобы оценить послеоперационное состояние животного и адаптировать последующее наблюдение. Когда > 1 балла, вводится инъекция бупренорфина, а при > 3 балла и/или в случае потери веса > 20% от дооперационного веса, несмотря на обогащение пищей, необходимо обсудить эвтаназию (Таблица 1).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Что касается хирургических процедур in vivo , то для оптимального выполнения этой процедуры нестабилизированного перелома нижней челюсти на мышиной модели требуется специальное обучение и подготовка.
Эта методика при нестабилизированном переломе нижней челюсти позволяет изучить процесс восстановления эндохондральной кости. После эвтаназии образцы нижней челюсти были собраны в 4% параформальдегиде (24 ч). После полной декальцинации с помощью ЭДТА pH 8 срезы погружали в парафин. Выполня...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Методика позволяет реализовать нестабилизированные переломы нижней челюсти на мышиной модели в рамках минимального открытого доступа за короткое время процедуры (около 10 минут или менее). Эта кратковременная процедура ограничивает риск заболеваемости и смерти животных, особенно у мелких животных, таких как мыши. Для получения сопоставимых результатов при анализе процесса эндохондрального восстановления кости следует уделять особое внимание выполнению переломов нижней челюсти в одном нап...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Исследование частично поддерживается отделом филантропии Mutuelles AXA через кафедру «Голова и сердце» и ANR BonyBrain. Мы выражаем признательность всем участникам платформы SFR Necker INSERM US24, LEAT Imagine, Париж, Франция, за их вклад в реализацию процедуры.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Бупренорфин : Buprecare 0,3 мг/кг | Элеватор для ухода за | ||
| OBWEGESER ширина 6 мм Длина 17,5 см | Щипцы Collin Medical | HA 5905 | |
| Пластина для подушечек MORIA 11 см N° 5 | MORIA | 9906 | |
| Нагревательный стол Bioseblab 55 см x 33 см | Bioseblab | 707 | |
| Иглодержатель : Micro Halsey Иглодержатель - Металл | LABODERM | 21,100 | |
| Neo Clear | Merck Millipore, Дармштадт, Германия | 109843 | |
| Ocry Gel Tube 10 г (смазка для глаз) | tvm lab | 3.70045E+12 | |
| Пьезотом 2 ASS FINAL | ACTEON | X57402 | |
| Вставка из пьезотома Пьезоцизия PZ3 | ACTEON | F87574 | |
| Ножницы микро | MORIA | MC52 | |
| Шелковые нити PERMA HAND SEIDE / MERSILK | ETHICON | REF 18501G | |
| Прямые ножницы | MORIA | 4877A | |
| Ветфлуран (изофлуран) 250 мл | VIRBAC | VET066 (Centravet) |
Ссылки
- Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. J Ortho Res. 20 (5), 1091-1098 (2002).
- Bahney, C. S., et al. Cellular biology of fracture healing. J Ortho Res. 37 (1), 35-50 (2019).
- Yu, Y. Y., Lieu, S., Hu, D., Miclau, T., Colnot, C. Site specific effects of zoledronic acid during tibial and mandibular fracture repair. PLoS One. 7 (2), e31771(2012).
- Landry, P. S., Marino, A. A., Sadasivan, K. K., Albright, J. A. Effect of soft-tissue trauma on the early periosteal response of bone to injury. J Trauma. 48 (3), 479-483 (2000).
- Colnot, C. Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration. J Bone Miner Res. 24 (2), 274-282 (2009).
- Julien, A., et al. Direct contribution of skeletal muscle mesenchymal progenitors to bone repair. Nat Commun. 12 (1), 2860(2021).
- McGuire, C., Boudreau, C., Prabhu, N., Hong, P., Bezuhly, M. Piezosurgery versus conventional cutting techniques in craniofacial surgery: A systematic review and meta-analysis. Plast Reconstr Surg. 149 (1), 183-195 (2022).
- Wong, S. A., et al. Chondrocyte-to-osteoblast transformation in mandibular fracture repair. J Orthop Res. 39 (8), 1622-1632 (2021).
- Vercellotti, T. Technological characteristics and clinical indications of piezoelectric bone surgery. Minerva Stomatol. 53, 207-214 (2004).
- Wong, S. A., et al. Chondrocyte-to-osteoblast transformation in mandibular fracture repair. J Orthop Res. 39 (8), 1622-1632 (2021).
- Tian, Y., et al. HIF-1α regulates osteoclast activation and mediates osteogenesis during mandibular bone repair via CT-1. Oral Dis. 28 (2), 428-441 (2022).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
