Методическая статья

Менее инвазивная техника лечения нестабилизированного перелома нижней челюсти на мышиных моделях

1.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66824

⸱

27 сентября 2024 г.

 ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular and Physiopathological Bases of Osteochondrodysplasia, Imagine Institute, Université de Paris Cité, 2SFR Necker INSERM, LEAT antenne Imagine

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол представляет собой комплексный и эффективный метод анализа восстановления кости нижней челюсти. Мы описываем воспроизводимую технику нестабилизированного перелома нижней челюсти на мышиной модели, позволяющую анализировать процесс эндохондрального восстановления кости с минимальным повреждением тканей и потерей костной массы.

Аннотация

У мышей могут быть сделаны нестабилизированные переломы нижней челюсти, что позволяет анализировать восстановление кости в режиме эндохондрального окостенения. Чтобы наиболее точно отразить этот процесс in vivo, необходимо иметь стандартизированный протокол, чтобы избежать чрезмерной потери костной массы и повреждения мягких тканей, особенно в нижней челюсти, анатомической области, характеризующейся минимальным доступом. Насколько нам известно, мы впервые описываем менее инвазивный протокол нестабилизированного перелома нижней челюсти у мышей. Взрослых мышей обезболивают изофлураном и получают предоперационную дозу бупренорфина путем подкожного введения. Выполняется подчелюстной доступ, при этом разрез кожи делается вдоль нижней границы нижней челюсти. Жевательная мышца приподнята в наднадкостничной плоскости вдоль ветви нижней челюсти с помощью надкостничного лифта. Вертикальный и полный перелом ветви выполняется от базилярной границы до короноидной выемки (между мыщелковым и короноидным отростками) с использованием пьезоэлектрического костного хирургического аппарата под солевой сывороткой орошения у базилярного края и ножниц для завершения перелома ветви нижней челюсти. Кожный доступ закрывается шелковыми швами. Эта детальная процедура при нестабилизированных переломах нижней челюсти предлагает эффективную процедуру, позволяющую свести к минимуму потерю костной массы и повреждение мягких тканей. Этот метод обеспечивает успешные и стабильные результаты, точно отражающие процесс эндохондрального восстановления костей на мышиных моделях.

Введение

Восстановление кости подразумевает под собой как мембранозные, так и эндохондральные процессы окостенения, в зависимости от стабилизации перелома или остеотомии. Восстановление кости после стабилизированной костной остеотомии или переломов основано на мембранозном окостенении, в то время как нестабилизированные переломы или плохо стабилизированные остеотомии консолидируются в соответствии с режимом эндохондрального окостенения1. Мембранозное восстановление кости характеризуется формированием кости путем прямой дифференцировки мезенхимальных клеток в остеобласты, тогда как эндохондральное восстановление кости включает в себя образование транзиторного хрящевого шаблона, который дифференцируется в остеобласты с образованием костной каллуса2.

Восстановление кости зависит от многочисленных тканевых и клеточных взаимодействий; На него также влияют факторы, специфичные для конкретного места, и сила, оказываемая на каллус3. Нижнечелюстная кость - это подвижная кость, поддерживающая жевательные силы, в основном образованная кортикальной костью. На процесс восстановления кости нижней челюсти влияет место и направление перелома. Хорошо известно, что мышечные травмы и травмы надкостницы могут повлиять на консолидацию кости, а также на значительную потерю костной массы в месте перелома 4,5,6.

Анализ эндохондрального восстановления нижнечелюстной кости подразумевает стандартизированные и воспроизводимые протоколы для ценных, непредвзятых сравнений. Что касается литературы, то лишь немногие авторы сообщают о протоколах нестабилизированных переломов нижней челюсти у мышей моделей 3,7, и в основном с передним направлением на уровне моляров8. Разрабатывая эту методику, мы стремимся избежать мышечных травм и травм надкостницы и ограничить потерю костной массы в месте перелома, чтобы наилучшим образом проанализировать процесс эндохондрального восстановления кости без искажающих факторов. Кроме того, целью разработки новой методики перелома нижней челюсти у мышей было свести к минимуму послеоперационную боль и смерть животных, частую при такой хирургии у мелких животных. Впервые мы описываем менее инвазивный протокол для нестабилизированного перелома нижней челюсти на уровне ветви у мышей. Этот протокол in vivo позволяет избежать чрезмерного повреждения мышц и надкостницы или потери костной массы в месте перелома и помогает снизить уровень послеоперационной боли и риск смерти животного.

Протокол

Этот протокол соответствует рекомендациям по уходу за животными Imagine Institute и был одобрен этическими комитетами и министерством Франции (APAFIS 26995).

1. Животные

  1. Определите количество животных в группе. Мы рекомендуем 12 животных в группе. Определите пол и возраст мышей. Этот протокол адаптирован для 6-недельных мышей C57BL/6J (самцов или самок).
  2. Дайте животным, не менее чем за 1 неделю до процедуры, пищевую добавку гель для акклиматизации.

2. Хирургическое вмешательство

  1. Подготовьте необходимый материал. В автоклаве находятся инструменты: ножницы, игольчатый привод, щипцы, вкладыш и наконечник пьезоэлектрического аппарата костной хирургии, а также элеватор. Подготовьте стерильные перчатки, шелковые шовные материалы (4/0), бритву, ватную марлю, 10% раствор повидон-йода, стол с подогревом, изофлуран и маску для ингаляции изофлураном.
  2. Готовят бупренорфин в дозе 0,1 мг/кг, разведенный в стерильной инъекционной физиологической сыворотке. Введите бупренорфин путем подкожной инъекции иглой 25G за 30 минут до операции.
  3. Подготовьте нагревательную пластину (37 °C), положите на нее поролоновую подложку, а маску для морды зафиксируйте маленькими иглами или скотчом.
  4. Поместите мышь в резервуар с изофлураном для индукции, с диффузией изофлурана (4%). Проверьте глубину анестезии, выполнив защемление пальца ноги. При достаточной индукции будет наблюдаться отсутствие педального рефлекса.
  5. Поместите мышь под наркозом на спину на нагревательную пластину, покрытую стерильным полем, при которой температура должна сохраняться при температуре 37 °C в течение всей процедуры. Расположите маску на рыле для непрерывной ингаляции изофлурана (поддержание на уровне 2,5%). Зафиксируйте конечности мыши с помощью скотча.
  6. Наносите глазную смазку двусторонне, чтобы предотвратить сухость глаз, вызванную общей анестезией. Сбрейте подчелюстные волосы, наденьте стерильные перчатки, продезинфицируйте кожу несколькими мазками 10% раствора повидон-йода и спирта.
  7. Выполните подчелюстной кожный доступ, как описано ниже.
    1. Микроножницами выполните разрез кожи от нижнечелюстного угла до 1/3 заднего - 2/3 переднего соединения горизонтальной ветви нижней челюсти.
    2. Рассеките подкожные ткани, чтобы обнажить жевательную мышцу.
  8. Удаляют жевательную мышцу прикрепления с помощью надкостничного элеватора от нижней границы нижней челюсти.
  9. Поднимите жевательную мышцу в субнадкостничной плоскости вдоль ветви нижней челюсти с помощью руля высоты.
  10. Создать небольшую остеотомию (длиной 3 мм) на нижней границе нижней челюсти с помощью пьезоэлектрического аппарата для хирургии костей под солевым раствором (максимум 10 мл/мин) на нижней границе нижней челюсти, спереди от нижнечелюстного угла, в задней части вогнутости (рис. 1, рис. 2).
  11. Найдите заднюю границу нижней челюсти и короноидную выемку (с помощью микроножниц или щипцов) и завершите перелом с помощью небольших прямых ножниц, вставленных вдоль ветви нижней челюсти, чтобы избежать дополнительного отверстия жевательной мышцы и травмы. Чтобы обеспечить правильную ориентацию перелома, расположите ножницы перпендикулярно нижней границе нижней челюсти.
  12. Убедитесь, что перелом полностью завершен: во время мягкой мобилизации 2 сегментов щипцами следует наблюдать полную подвижность между двумя костными сегментами.
  13. Закройте кожный подход шелковыми нитями (4/0) с разделенными швами. В надкостнице не нужно накладывать швы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, кожный доступ может быть сшит другими неадсорбируемыми шовными материалами (например, полипропиленовыми шовными материалами).
  14. Выполните боковую рентгенографию головного мозга, чтобы подтвердить направление перелома (Рисунок 3).
    1. Снова поместите мышь в резервуар с изофлураном для короткой реиндукции перед выполнением рентгена. Затем поместите мышь в вытянутом положении, на боковой стороне, так, чтобы голова была слегка гиперэкстензией для рентгенологического анализа.
    2. В случае перелома, расположенного слишком кпереди, на уровне нижнечелюстного моляра или когда перелом отделил нижнечелюстной угол (рис. 4), наблюдайте аномальное увеличение объема костной мозоли. В этих случаях исключите животных из исследования, чтобы избежать любой предвзятости в анализе.
  15. Проверяйте мышей, пока они не придут в сознание, прежде чем поместить их обратно в клетку.

3. Послеоперационный уход

  1. Подготовьте клетку для мышей без гранул и твердого обогащения, чтобы избежать любых жевательных сил.
  2. Изолируйте прооперированную мышь в одной клетке на1-ю неделю до полного заживления кожи. Через 1 неделю после операции группа оперировала самок мышей вместе в одной клетке.
  3. Вводите бупренорфин (0,1 мг/кг) подкожно через 4 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч после процедуры.
  4. Кормите мышей мягким диетическим гелем в течение всех послеоперационных периодов с 0-го дня до окончания периода консолидации (т.е. 28 дней), чтобы избежать боли и вторичного смещения перелома.
  5. Ежедневно взвешивайте мышей с 0-го по 4-й день после перелома, утром, до инъекции бупренорфина, а затем 3 раза в неделю до жертвоприношения животных (через 14 дней после перелома).
  6. Оцените послеоперационное благополучие животных для оптимизации послеоперационного ухода за животными. Используйте шкалу баллов, приведенную в таблице 1 , чтобы оценить послеоперационное состояние животного и адаптировать последующее наблюдение. Когда > 1 балла, вводится инъекция бупренорфина, а при > 3 балла и/или в случае потери веса > 20% от дооперационного веса, несмотря на обогащение пищей, необходимо обсудить эвтаназию (Таблица 1).

Результаты

Что касается хирургических процедур in vivo , то для оптимального выполнения этой процедуры нестабилизированного перелома нижней челюсти на мышиной модели требуется специальное обучение и подготовка.

Эта методика при нестабилизированном переломе нижней челюсти позволяет изучить процесс восстановления эндохондральной кости. После эвтаназии образцы нижней челюсти были собраны в 4% параформальдегиде (24 ч). После полной декальцинации с помощью ЭДТА pH 8 срезы погружали в парафин. Выполняли сагиттальные серийные срезы, депарафинизированные в растворе депарафинизации, а затем регидратированные перед окрашиванием Sirus Red/Alcian Blue с использованием стандартных протоколов. Гистологические снимки подтвердили формирование мягкой мозоли с хрящевой матрицей (рис. 5). Заживление кости завершается через 4 недели после перелома, о чем свидетельствуют микрокомпьютерные анализы. Мы предлагаем изучать процесс восстановления костной ткани в различных ключевых точках от начала формирования костной мозоли (например, каждые 7 дней (7, 14, 21) или чаще в зависимости от цели исследования) до окончания заживления кости (т.е. на 28-й день) с помощью гистоморфологического и морфометрического микрокомпьютерного томографий.

На основании ретроспективного анализа этой процедуры, выполненного на 58 мышах дикого типа (фон C57BL/6J), процент успешности протокола составил 86,3%, а коэффициент исключения — 13,7%. Исключение было обусловлено преждевременной спонтанной гибелью в раннем послеоперационном периоде (3%), решением об эвтаназии у мышей с критическим баллом (1%; оценка > 3 и/или в случае потери массы тела > 20%), или в случае аномального положения остеотомии, с аномальным расколом нижнечелюстного угла (5%), или при переломе на молярном уровне (n=1/58). В последнем случае наблюдалась инфекция с аномальным расщеплением перелома на молярном уровне (n= 1/58; Таблица 2).

figure-results-1
Рисунок 1: Изображение подчелюстного кожного доступа восходящей ветви нижней челюсти. Нижняя граница нижней челюсти разбивается с помощью пьезотомной вставки, что позволяет свести к минимуму потерю костной ткани (стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Окрашивание нижней челюсти мыши. Вид сбоку нижней челюсти мыши дикого типа в возрасте 6 недель (окрашена ализариновым красным / альцианским синим окрашиванием): 1. Мыщелок, 2. Короноидный отросток, 3. Короноидная выемка, 4. Угловой отросток, 5. Задняя граница ветви, 6. Базилярная (или нижняя) граница нижней челюсти. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Рентгеновский снимок черепа мыши. Боковые рентгеновские снимки черепа 6-недельной мыши дикого типа (сагиттальный вид), показывающие вид нижней челюсти мыши без перелома (слева) и вид нижней челюсти мыши с переломом и направление нестабилизированного перелома нижней челюсти (стрелки), от нижней границы до короноидной выемки, расположенной спереди до мыщелка (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4. Рентгенография черепа мыши в неоптимальных условиях. Боковые рентгеновские снимки черепа 6-недельной мыши дикого типа (сагиттальный вид), показывающие аномальный перелом нижнечелюстного угла (стрелки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Репрезентативные результаты. Результаты на 14-й день после перелома у мышей дикого типа (C57BL/6J). Репрезентативные 3D-изображения корональной короны реконструированной компьютерной томографии места перелома нижней челюсти, на которых видна костная мозоль (белые стрелки). Репрезентативные изображения хряща мозоли (окрашивание Sirus Red/Alcian Blue), подтверждающие наличие эндохондрального процесса восстановления кости. Сокращения: B = кость, C = хрящ. Масштабная линейка: 200 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

012
Животный аспектНормальныйУменьшение количества туалетовВзъерошенные волосы, выгнутые назад
ПоведениеНормальныйГипомобильностьГипомобильность, снижение приема пищи, снижение массы тела > 10 %
Клинические признакиНормальныйРубцовое воспалениеОткрытый рубец, инфекция

Таблица 1. Шкала оценки послеоперационного благополучия.

n = 58 мышей
Процент успеха86.3 %
Процент исключения :13.7 %
Преждевременная самопроизвольная смерть3%
Критическая оценка < 3, и/или потеря веса > 20 %1%
Аномальный перелом расщепленного угла нижней челюсти5%
Аномальный раскол перелома, на молярном уровне1.7 %

Таблица 2. Показатели успешности и исключения протокола.

Обсуждение

Методика позволяет реализовать нестабилизированные переломы нижней челюсти на мышиной модели в рамках минимального открытого доступа за короткое время процедуры (около 10 минут или менее). Эта кратковременная процедура ограничивает риск заболеваемости и смерти животных, особенно у мелких животных, таких как мыши. Для получения сопоставимых результатов при анализе процесса эндохондрального восстановления кости следует уделять особое внимание выполнению переломов нижней челюсти в одном направлении без аномального расщепления нижнечелюстного угла, так как этот нежелательный эффект может аномально увеличить объем костной мозоли и задержать период консолидации. Этот протокол при переломе нижней челюсти не влияет на рост резцов нижней челюсти после операции. Чтобы повысить эффективность этого протокола, мы советуем экспериментатору сначала провести упражнение на усыпленных животных аналогичного возраста и препарировать его сразу после перелома нижней челюсти, чтобы при необходимости непосредственно визуализировать направление перелома.

Мезенхимальные предшественники, мигрирующие из соседних мышц в костную мозоль, способствуют восстановлению кости6. Было показано, что надкостница и мышечная травма влияют на консолидацию костной ткани 5,6. Кроме того, обширные мышечные участки приводят к повышенному риску кровотечения и могут привести к послеоперационной инфекции. Пьезохирургия получила значительное развитие в области хирургии черепно-лицевых костей; Сообщалось, что он имеет более низкие показатели травмирования мягких тканей и послеоперационной боли по сравнению с обычными остеотомиями 7,9. Чтобы свести к минимуму травму жевательной мышцы и надкостницы, мы использовали пьезохирургию для инициирования перелома на нижней границе нижней челюсти и завершили перелом ножницами на верхнем уровне ветви, чтобы избежать обширного участка жевательной мышцы. Это подразумевает контроль положения задней границы нижней челюсти и короноидной выемки перед разрушением верхней части ветви ножницами. Мы не столкнулись с трудностями в завершении перелома с помощью маленьких прямых ножниц после того, как начали его с помощью пьезохирургии на нижнем крае нижней челюсти. Мы испытали эту процедуру на взрослых мышах с различным генетическим фоном (C57BL/6J, CD1 (результаты не показаны)), с разной плотностью костей и размерами нижней челюсти (прогнатизм, микрогнатия). Тем не менее, мы советуем проверить, подходит ли длина ножниц для перелома верхней ветви только один раз, чтобы избежать аномальных трещин.

Риск кровотечения при этой процедуре сведен к минимуму благодаря такому минимальному открытому доступу. В случае чрезмерного кровотечения, которое может возникнуть во время мышечного подъема, короткое сжатие хирургического места марлей останавливает кровотечение. Потенциальный риск инфицирования операционного участка может возникнуть в случае перелома коренного зуба, когда перелом нижней челюсти расположен слишком кпереди; этот побочный эффект может быть обнаружен на послеоперационных боковых рентгеновских снимках. В этом случае животное должно быть исключено из исследования. Послеоперационная инфекция операционного участка также может быть вызвана гематомой; Это можно предотвратить путем наложения отдельных кожных швов, что позволяет проводить спонтанную эвакуацию при возникновении аномального кровотечения перед операцией. Общая анестезия изофлураном по сравнению с внутрибрюшинным введением позволяет избежать чрезмерной смертности, связанной с неблагоприятными травматическими эффектами внутрибрюшинных инъекций. В нашем опыте мы не наблюдали ни одной смерти животных, непосредственно связанной с общей анестезией изофлураном.

У мышей может наблюдаться послеоперационное снижение потребления пищи. В случае недостаточного приема пищи или недостаточного набора веса в гель можно добавить просеянный порошок гранул. Для улучшения послеоперационного приема пищи мы рекомендуем давать гель с гранулами пищевой добавки не менее чем за 1 неделю до процедуры размещения. Мы рекомендуем проводить дополнительные рентгеновские снимки во время наблюдения (каждую неделю, во время наблюдения) и во время жертвоприношения, чтобы оценить потенциальное смещение перелома. При непатологических состояниях консолидация кости завершается через 4 недели после перелома.

Несколько авторов описали различные протоколы для нестабилизированных переломов нижней челюсти у мышей 3,10,11. Инструменты, используемые для выполнения остеотомии, могут быть разными, а именно сверла, хирургическим пинцетом и т.д. Однако использование сверл может привести к большей потере костной массы и травмам мягких тканей. Насколько нам известно, эта процедура нестабилизированных переломов нижней челюсти является первой, которая объединила пьезохирургию и ножницы для завершения остеотомии. Преимущество этого метода заключается в том, что он сохраняет мягкие ткани и позволяет проводить точную остеотомию с минимальной потерей костной массы.

Как и у всех методик, у этого метода есть некоторые ограничения. Мы предпочитали выполнять перелом с помощью ножниц после его инициации с помощью пьезоэлектрической хирургической вставки, чтобы избежать любого расширенного участка жевательной мышцы и травмы надкостницы, которые могут усугубить потенциальную задержку консолидации и/или образование псевдоартроза. Однако этот метод подразумевает контроль положения короноидной выемки без полной визуализации ветви нижней челюсти для выполнения перелома в том же направлении. Таким образом, ожидается кривая обучения, в зависимости от хирургического опыта. Кроме того, направление перелома нижней челюсти на рентгеновских снимках может быть трудно визуализировать в зависимости от рентгеновского аппарата. Мы не использовали микрокомпьютерную томографию in vivo для подтверждения направления перелома, так как она могла поставить под угрозу восстановление мышей из-за увеличения продолжительности общей анестезии.

Изучение процесса эндохондрального восстановления кости подразумевает реализацию нестабилизированных переломов, что позволяет лучше понять процесс восстановления кости. Этот шаг необходим, если мы хотим рассмотреть доклинические испытания на мышиных моделях с дефектами восстановления кости с целью разработки новых клинических применений для лечения дефектного восстановления кости и псевдоартроза у пациентов в контексте генетических заболеваний или в случае посттравматических или постопухолевых последствий.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Исследование частично поддерживается отделом филантропии Mutuelles AXA через кафедру «Голова и сердце» и ANR BonyBrain. Мы выражаем признательность всем участникам платформы SFR Necker INSERM US24, LEAT Imagine, Париж, Франция, за их вклад в реализацию процедуры.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Бупренорфин : Buprecare 0,3 мг/кгЭлеватор для ухода за
OBWEGESER ширина 6 мм Длина 17,5 смЩипцы Collin MedicalHA 5905
Пластина для подушечек MORIA 11 см N° 5MORIA9906
Нагревательный стол Bioseblab 55 см x 33 смBioseblab707
Иглодержатель : Micro Halsey Иглодержатель - МеталлLABODERM21,100
Neo Clear Merck Millipore, Дармштадт, Германия109843 
Ocry Gel Tube 10 г (смазка для глаз)tvm lab   3.70045E+12
Пьезотом 2 ASS FINALACTEONX57402
Вставка из пьезотома Пьезоцизия PZ3ACTEONF87574
Ножницы микро MORIAMC52
Шелковые нити PERMA HAND SEIDE  / MERSILKETHICONREF 18501G 
Прямые ножницыMORIA4877A
Ветфлуран (изофлуран) 250 млVIRBACVET066 (Centravet)
животными:

Ссылки

  1. Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. J Ortho Res. 20 (5), 1091-1098 (2002).
  2. Bahney, C. S., et al. Cellular biology of fracture healing. J Ortho Res. 37 (1), 35-50 (2019).
  3. Yu, Y. Y., Lieu, S., Hu, D., Miclau, T., Colnot, C. Site specific effects of zoledronic acid during tibial and mandibular fracture repair. PLoS One. 7 (2), e31771(2012).
  4. Landry, P. S., Marino, A. A., Sadasivan, K. K., Albright, J. A. Effect of soft-tissue trauma on the early periosteal response of bone to injury. J Trauma. 48 (3), 479-483 (2000).
  5. Colnot, C. Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration. J Bone Miner Res. 24 (2), 274-282 (2009).
  6. Julien, A., et al. Direct contribution of skeletal muscle mesenchymal progenitors to bone repair. Nat Commun. 12 (1), 2860(2021).
  7. McGuire, C., Boudreau, C., Prabhu, N., Hong, P., Bezuhly, M. Piezosurgery versus conventional cutting techniques in craniofacial surgery: A systematic review and meta-analysis. Plast Reconstr Surg. 149 (1), 183-195 (2022).
  8. Wong, S. A., et al. Chondrocyte-to-osteoblast transformation in mandibular fracture repair. J Orthop Res. 39 (8), 1622-1632 (2021).
  9. Vercellotti, T. Technological characteristics and clinical indications of piezoelectric bone surgery. Minerva Stomatol. 53, 207-214 (2004).
  10. Wong, S. A., et al. Chondrocyte-to-osteoblast transformation in mandibular fracture repair. J Orthop Res. 39 (8), 1622-1632 (2021).
  11. Tian, Y., et al. HIF-1α regulates osteoclast activation and mediates osteogenesis during mandibular bone repair via CT-1. Oral Dis. 28 (2), 428-441 (2022).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи