Методическая статья

Использование введения препарата с помощью микропипеток в качестве альтернативы пероральному зондированию на моделях грызунов

4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66836

⸱

26 июля 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Molecular and Comparative Pathobiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, 4Department of Urology, Johns Hopkins University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье мы описываем введение лекарств с помощью микропипеток (MDA) как альтернативный метод перорального зондирования, который стимулирует исследуемое животное легко принимать лекарства с минимальным стрессом и дискомфортом.

Аннотация

Пероральный зондирование (ОГ) с помощью канюли, прикрепленной к шприцу, является одним из наиболее распространенных методов, используемых для доставки точного дозирования соединений в желудок подопытных животных. К сожалению, этот метод сопряжен с трудностями как для оператора, так и для испытуемого животного. Исследования показали, что ОГ может привести к осложнениям, включая эзофагит, перфорацию пищевода и непреднамеренное введение препаратов для лечения трахеи. Кроме того, ОГ связана с повышением уровня кортикостерона в плазме и кале (из-за стресса), изменением артериального давления и увеличением частоты сердечных сокращений, что может негативно повлиять на результаты исследования или искажать их. Ранее разработанный альтернативный метод, называемый введением лекарств под контролем микропипеток (MDA), стимулирует животное к употреблению средств лечения минимально инвазивным способом. В данной работе мы представляем примеры использования метода MDA с методами лечения, восстановленными в различных транспортных средствах, и демонстрируем эффективную доставку различных методов лечения к нескольким различным линиям мышей. Кроме того, мы демонстрируем, что МДА является методом, который снижает сроки и инвазивность введения препарата и не влияет на состав микробиома кишечника, оцениваемый с помощью количественного анализа основных видов кишечных микроорганизмов. В целом, MDA может предложить менее стрессовую и эффективную альтернативу ОГ.

Введение

Введение лекарственного препарата моделям грызунов обычно достигается с помощью перорального зондирования (ОГ), которое заключается во введении жидкого препарата непосредственно в желудок с помощью канюли, прикрепленной к шприцу, содержащему раствор. Этот метод приводит к последовательной и точной дозировке лечения для животного, но также имеет множество недостатков. ОГ была тщательно изучена на предмет неадекватного моделирования воздействия пищи на человека 1,2. Кроме того, ОГ увеличивает риск непреднамеренных травм верхних отделов пищеварительной системы (перфорация пищевода и желудка), аспирации проводимого лечения и поражения дыхательных путей3. ОГ также связана с дискомфортом4, повышением артериального давления и частоты сердечныхсокращений 5, а также стрессом 6,7, а иногда и смертью8 из-за снижения толерантности животного к зондированию. Эти физиологические изменения могут мешать или искажать экспериментальные результаты; Таким образом, были изучены новые процедуры, позволяющие избежать этих побочных эффектов. В исследованиях использовались альтернативные ОГ процедуры, такие как использование желатина в качестве лекарственного средства9, пероральные растворимые полоски (ОРВ)10, покрытые сахарозой иглы11, гибкие трубки для кормления, пшеничное печенье12, мед13 и гранулы арахисового масла14. К сожалению, эти модификации методики ОГ имеют свои ограничения, в том числе несовместимость с нерастворимыми в воде препаратами, более длительное время подготовки к лечению15, вкусовые качества и стабильность препарата15, а также ознакомление животного с пищей. Кроме того, существует вероятность менее точного дозирования при кормлении животных в неограниченном объеме.

Scarborough et al.7 ранее разработали альтернативный метод перорального лечения у мышей, который они назвали введением лекарств под контролем микропипеток (MDA). Этот способ введения основан на использовании подслащенного раствора сгущенного молока в качестве носителя фармакологических веществ, мотивируя исследуемых животных к легкому потреблению приготовленного носителя и/или лекарственного раствора путем дозирования раствора с помощью одноканальной пипетки и наконечника для пипетки. Чтобы внедрить эту методику, грызуны проходят тренировку (минимум 2 дня), чтобы сократить время работы и позволить исследуемому животному ознакомиться с питьем с наконечника пипетки4. Первоначальные валидационные исследования, проведенные Scarborough et al.7 и Schalbetter et al.16 , показывают, что процедура MDA проста в применении, экономически эффективна, минимально инвазивна и менее стрессовоспособна для животных, чем обычные методы перорального зондирования. Scarborough et al. представили использование метода MDA на мышиной модели материнской иммунной активации (MIA) нарушений развития нервной системы7. Это исследование показало, что фармакокинетические профили мышей, получавших антипсихотический препарат рисперидон с использованием MDA, были сопоставимы с использованием ОГ. Кроме того, МДА не вызывал повышения уровня кортикостерона (гормона стресса) у мышей, а хроническое лечение рисперидоном с использованием метода МДА приводило к дозозависимому снижению индуцированного ММА дефицита социального взаимодействия и гиперчувствительности к амфетамину. В дополнительных исследованиях изучалась эффективность MDA по сравнению с ОГ на моделях мышей17 икрыс 18 . MDA также сравнивали с внутрибрюшинным введением, и было показано, что он так же эффективен при доставке клозапина-N-оксида мышам16. В связи с сообщениями об успехах MDA в снижении стресса у животных и терапевтической эффективности, мы теперь стремимся к дальнейшему изучению метода MDA как эффективного метода доставки лекарств с использованием дополнительных мышиных моделей. В данной статье мы описываем применение метода MDA для лечения различных линий мышей, включая иммунокомпетентные штаммы FVB/NJ и C57BL/6J, а также иммунокомпрометированный штамм NOD.Cg-Prkdcscid Il2rg tm1Wjl/SzJ (NSG) с различными пероральными методами, включая живые бактерии, экспериментальные соединения, поставляемые в нерастворимых в воде растворах (кукурузное масло), и средства контроля транспортных средств. Мы оценили активность и наличие различных методов лечения в сыворотке крови и кале, а также оценили изменения основной микробиоты кишечника по сравнению с методом MDA.

Протокол

Все исследования на животных проводились в соответствии с институциональными рекомендациями и в соответствии с протоколами, утвержденными Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Джонса Хопкинса M021M197 и M023M195. Используемые линии мышей (самцы мышей, возраст 7 недель) описаны в Таблице материалов. Использование самцов мышей было связано с их использованием в продолжающихся исследованиях рака предстательной железы. Метод MDA ранее показал свою эффективность и на самках мышей 7,17. Мыши были рандомизированы по соответствующим клеткам/группам лечения. Мышей обрабатывали в клетках и в произвольном порядке. Экспериментатор, проводивший лечение, был слеп к группе лечения. Номер, присвоенный мыши, относился к ее идентификатору, а не к порядку, в котором с ней обращались. Данные были собраны на протяжении всей временной шкалы исследования и проанализированы в конце, чтобы избежать какой-либо предвзятости. Экспериментальные анализы были слепыми для группы лечения до тех пор, пока не были собраны все данные.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был изменен по сравнению с Scarborough et al.7.

1. Подготовка процедур

  1. Приготовьте раствор сгущенного молока с сахаром (состав: молоко и сахар) и воды молекулярно-биологического класса, используя соотношение молока и воды 3:10. Отмерьте сгущенное молоко с сахаром с помощью конической трубки объемом 15 мл из-за вязкости молока.
  2. С помощью конической трубки объемом 50 мл смешайте воду, пригодную для молекулярной биологии, с подслащенным сгущенным молоком, медленно смешивая 5 мл воды за один раз с молоком.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап выполняется в стерильных условиях с использованием шкафа биобезопасности.
  3. Приготовьте аликвоты молочного раствора (храните их в виде 500 мкл аликвот) и храните аликвоты при температуре 4 °C до смешивания с интересующей лечением.
  4. Восстановите суспендию обработки в соответствующих транспортных средствах в правильной концентрации в зависимости от массы тела животного, прежде чем смешивать их с подслащенным раствором сгущенного молока/воды.

2. Тренинг MDA

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описаны модели мышей; тем не менее, метод MDA может быть расширен по мере необходимости с помощью больших объемов/наконечников для пипеток для более крупных моделей грызунов.

  1. ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Осторожно удерживайте исследуемое животное, удерживая одной рукой за загривок.
  2. Предложите исследуемому животному 100 мкл только раствора сгущенного молока/воды с сахаром (без добавления экспериментальной обработки) с помощью одноканальной пипетки и наконечника пипетки объемом 200 мкл, который направляют ко рту.
  3. Медленно выдавайте раствор молока/воды, чтобы не пропустить рот животного. Убедитесь, что животное легко потребляет молочный раствор в течение 5-15 секунд.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта тренировка проводится в течение как минимум 2 дней подряд (одна тренировка в день), без изменений в объеме проводимой. Для тренировок MDA требовалось мягкое удержание с помощью загривка. Scarborough et al.7 рекомендуют полностью удерживать животное в первый день обучения MDA, а затем удерживать за хвост на второй день. Метод удержания может отличаться для более крупных моделей грызунов. В отличие от них, Vanhecke et al.17 лишь слегка держали мышей за хвост во время тренировки.

3. Лечение у мышей методом MDA

  1. Комбинируйте исследуемую обработку с подслащенным раствором сгущенного молока/воды (см. примеры с валидационными экспериментами [раздел 4 и раздел 5] ниже).
  2. ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Осторожно удерживайте исследуемое животное, удерживая одной рукой за загривок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Scarborough et al.7 сообщают, что мыши больше не нуждаются в ограничении после периода обучения и будут легко пить из наконечника пипетки. Напротив, Vanhecke et al.17 сообщают, что для некоторых методов лечения (например, тамоксифеном), которые могут вызывать легкое отвращение к вкусу, MDA лучше всего проводить, мягко удерживая мышей с помощью загривка во время всех процедур. Это исследование также показало, что размещение животного на спине с помощью мягкого загривка увеличивает время и эффективность потребления лечения.
  3. Введите 100 мкл лечения с помощью одноканальной пипетки и наконечника пипетки объемом 200 мкл, направленного в рот животного, как это делается во время тренировок.
  4. Обрабатывайте одно животное за раз.
  5. После обработки поместите каждое животное обратно в соответствующую клетку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры по методу MDA могут проводиться ежедневно или многократно 7,17.

4. Валидационный эксперимент #1 - пероральная доставка кишечных бактерий мышам с помощью MDA

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается использование метода MDA для пероральной доставки живых бактерий для исследований колонизации кишечника у мышей. В этом репрезентативном пилотном эксперименте грамположительная бактерия Clostridium scindens доставляется мышам C57BL/6J. Мышей лечили антибиотиками (цефокситином) в течение двух дней подряд в питьевой воде перед бактериальным посевом MDA.

  1. Бактериальный посев
    1. В культуре C. scindens штамм ATCC 35704 в усиленном клостридиальном бульоне (RCB) с использованием замороженного глицеринового бульона для инокуляции 500 мкл бактерий в пробирку RCB объемом 7 мл. Выращивайте анаэробно за ночь при 37 °C.
    2. Используйте 500 мкл ночной культуры бактерий для инокуляции новой RCB-трубки и инкубируйте анаэробно в течение 24 часов. Извлеките эту трубку из анаэробной камеры и используйте ее для приготовления бактериальной обработки MDA. Используйте эту же трубку для расчета колониеобразующих единиц на миллилитр (КОЕ/мл).
  2. Расчет C. scindens КОЕ/мл
    1. Разведение культуры C. scindens в соотношении 1:3 с использованием 3,5 мл культуры, инокулированной в 7 мл среды RCB. Используйте образец этого разбавления для получения 20% 1 мл глицерина (1:1), который хранится при -80 °C.
    2. Планшет 100 мкл разведения 1:3 на пластины из усиленного клостридиального агара (RCA). Используйте первое разведение, чтобы затем сделать последующие последовательные разведения, и проведите в общей сложности еще три раза.
    3. После инкубации планшетов RCA подсчитайте колонии и рассчитайте КОЕ. Используйте следующее уравнение для расчета концентрации бактериальных клеток в разведенных и исходных образцах:
      КОЕ в разбавленном образце (клеток/мл) = (количество колоний, подсчитанных на планшете RCA)/(количество разбавленного образца, добавленного в планшет RCA в мл)
      КОЕ в исходном образце (ячейки/мл) = (КОЕ в разбавленном образце)/(разбавление пластины RCA)
  3. Подготовка лечения C. scindens от MDA
    1. Смешайте раствор 50 мкл (1,265 x 106 КОЕ/мл в данном примере) C. scindens + 50 мкл подслащенного раствора сгущенного молока/воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется специфический КОЕ, можно использовать альтернативный метод количественного определения бактериальных клеток, такой как создание стандартной кривой с измерениями оптической плотности (OD) на длине волны 600 нм.
  4. Пероральное лечение мышей с C. scindens с помощью MDA
    1. В дни 1-3 познакомьте мышей с молочным раствором, как описано в разделе 2 (тренинг MDA).
    2. На 4-й день введите 100 мкл C. scindens + молочный раствор или PBS (контроль) + молочный раствор через MDA мышам C57BL/6J. Обработайте мышей один раз в течение всего исследования.
  5. Забор образцов кала
    1. Держите мышь за легкий загривок и подождите, пока она выпустит фекальную гранулу. Соберите фекальные гранулы непосредственно из прямой кишки в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Храните образцы при температуре -80 °C до использования.
  6. C. scindens количественная ПЦР (кПЦР)
    1. Проводят экстракцию фекальной ДНК по ранее опубликованному протоколу19,20.
    2. Определение концентрации ДНК с помощью флуориметра ДНК для высокочувствительного обнаружения. Нормализовать образцы ДНК до 10 нг/мкл и хранить при температуре -20 °C до использования.
    3. Используйте количественно-ПЦР для изучения численности: (i) бактерий C. scindens с использованием консервативных праймеров против гена desA штамма C. scindens ATCC 35704, (ii) общего количества бактерий с использованием праймеров, разработанных против гипервариабельной области V6 бактериального гена 16S рРНК, как описано ранее20,21.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Условия количественной ПЦР и используемые праймеры перечислены в таблице 1. Для оценки копий бактерий desA+ была использована стандартная кривая с использованием ДНК штамма C. scindens ATCC 35704.

5. Валидационный эксперимент #2 - экспериментальная доставка лекарственного препарата мышам с помощью MDA

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается использование метода MDA для доставки экспериментального соединения мышам. В этом репрезентативном пилотном эксперименте метаболит сои эквол (S-эквол) доставляется мышам NSG и FVB/NJ.

  1. Приготовление препарата S-эквол
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как S-эквол, так и диметилсульфоксид (ДМСО) аликвотируются и хранятся при температуре -20 °C до использования.
    1. Восстановите S-эквол в ДМСО в сочетании с кукурузным маслом (90%). Смешайте аликвотированный S-эквол в кукурузном масле (220 μл) с 480 μЛ подслащенного раствора сгущенного молока/воды. Соедините и смешайте этот раствор в помещении для животных, чтобы избежать отделения масла от молока.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если наблюдается расхождение раствора, перемешайте раствор перед обработкой. Доза вводимого S-эквола составляет 25 мг/кг/сут. Все мыши, использованные в этом исследовании, были одинаковы по весу, поэтому они получали одинаковую дозу. Может потребоваться коррекция дозы лечения и превращение ее в несколько препаратов в зависимости от веса исследуемого животного.
    2. Комбинируйте ДМСО с кукурузным маслом (90%). Смешайте аликвотированный ДМСО в кукурузном масле (220 μл) с 480 μЛ подслащенного раствора сгущенного молока/воды. Соедините и смешайте этот раствор в помещении для животных, чтобы избежать отделения масла от молока.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если наблюдается расхождение раствора, перемешайте раствор перед обработкой.
  2. Пероральное лечение мышей S-экволом с использованием MDA
    1. В дни 1 и 2 познакомьте мышей с молочным раствором, как описано в разделе 2 (тренировочное занятие по MDA).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для валидационного эксперимента #1 использовалось время обучения, описанное в Scarborough et al., которое предполагало 3-дневное время акклиматизации. В этом эксперименте было протестировано более короткое время обучения (2 дня) и было обнаружено, что оно не изменяет введение интересующих вас методов лечения.
    2. На 3-43 дни обрабатывайте мышей (i) контролем PBS, (ii) носителем DMSO или (iii) S-экволом, все в сочетании с подслащенным раствором сгущенного молока/воды. Составьте мастер-смесь раствора, чтобы получить однородный раствор лечения для всех исследуемых животных. Вводите в общей сложности 100 мкл каждой мыши один раз в день, 5 дней в неделю, в общей сложности в течение 43 дней.
  3. Забор крови
    1. Соберите кровь после эвтаназии (передозировки углекислого газа) с помощью пункции сердца. Переложите кровь в пробирку-сепаратор сыворотки с микроваркой, смешайте и храните при комнатной температуре (RT) до дальнейшей обработки.
    2. Центрифуга обрабатывает образец крови до полного разделения при концентрации 254 х г в течение 5 минут. Соберите сыворотку (верхний слой разделения) и храните при температуре -20 °C до использования.
  4. Жидкостная хроматография S-equol с тандемной масс-спектрометрией (LC/MS/MS) анализ
    1. Обратитесь к файлу Table of Materials для получения информации о химических веществах и реагентах, использованных в этом эксперименте.
    2. Калибровочные стандарты и контроль качества: Готовьте исходные растворы S-эквола и внутреннего стандарта (рацемический эквол-d4) в ДМСО в концентрации 1 мг/мл и храните при -20 °C.
    3. Стандартные растворы месторождения разбавить ацетонитрилом:водой (50:50) до получения смешанного рабочего раствора с различной концентрацией. Приготовьте внутренний стандарт в этилацетате в виде экстракционного раствора в концентрации 100 нг/мл. Храните исходные и рабочие растворы при температуре 4 °C и используйте ежедневно, в разбавленном виде или сразу.
    4. Отбор проб
      1. Образец готовят с помощью осаждения белка экстракционным раствором (этилацетат плюс внутренний стандарт, см. раздел 5.4.3) с последующим центрифугированием и выпариванием надосадочной жидкости под сухим азотом (50 °C).
      2. Восстановите образец в 100 мкл 50% ацетонитрила и перенесите в флаконы автосамплера для анализа ЖХ/МС/МС.
    5. Разделение проб
      1. Добейтесь разделения с помощью колонки C18, 2,1x50 мм, 1,7 мкм. Используйте 0,1% муравьиной кислоты в качестве подвижной фазы А и 0,1% муравьиной кислоты в подвижной фазе ацетонитрила В.
      2. Используйте градиент и удерживайте подвижную фазу B на уровне 40% с расходом 0,3 мл/мин в течение 0,5 мин. Затем увеличьте скорость потока до 100% в течение 1 минуты, подержите там 2 минуты, а затем вернитесь к 40% B на 1 минуту.
      3. Контролируйте сток колонны с помощью масс-спектрометрического детектора с использованием электрораспылительной ионизации, которая работает в отрицательном режиме. Запрограммируйте спектрометр на мониторинг следующих переходов мониторинга множественных реакций (MRM): 241 → 119,1 для S-equol и 245 → 123 для внутреннего стандарта equol-d4.
      4. Вычислите калибровочную кривую для S-эквола с использованием отношения пика площади анализа к внутреннему стандарту с помощью квадратного уравнения с функцией взвешивания 1/x2 с использованием калибровочных диапазонов 5-500 нг/мл.

6. Измерение влияния лечения MDA на основную микробиоту кишечника

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается использование количественной ПЦР для измерения уровня основной микробиоты кишечника после лечения MDA.

  1. Выполните сбор образцов кала и экстракцию ДНК, как описано в шагах 4.5.1 и 4.6.1.
  2. Определение концентрации ДНК с помощью флуориметра ДНК для высокочувствительного обнаружения. Нормализовать образцы ДНК до 10 нг/мкл и хранить при температуре -20 °C до использования.
  3. Используйте кПЦР для изучения численности представителей кишечной микробиоты: (i) Akkermansia muciniphila, (ii) Bifidobacterium spp., (iii) Streptococcus salivarius, (iv) Lactobacillus spp. и (v) общего количества бактерий с использованием праймеров, разработанных против гипервариабельной области V6 гена бактериальной 16S рРНК, как описано ранее 20,21,22.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Условия количественной ПЦР и используемые праймеры перечислены в таблице 2.

Результаты

MDA может быть использован при пероральной доставке бактериальных штаммов на мышиных моделях. Мышей C57BL/6J обрабатывали антибиотиками (цефокситин в питьевой воде) в течение 2 дней для очистки комменсальных микробных сообществ перед началом тренинга MDA. Подслащенный раствор сгущенного молока/воды вводили один раз в сутки последовательно в течение 3 дней до начала лечения. Мышей кратковременно удерживали мягким загривком во время введения МДА. На 4-й день мышей однократно обрабатывали PBS (отрицательный контроль, n = 4) или анаэробной культурой C. scindens (бактерии desA+, n = 4), которую предварительно ресуспендировали в подслащенном растворе сгущенного молока/воды. Все мыши, как правило, принимали лечение в течение нескольких секунд и выпивали всю дозу (100 мкл). Чтобы подтвердить доставку и присутствие анаэробных бактерий, мы сравнили образцы кала, собранные после лечения антибиотиками, с образцами кала, собранными через 24 часа после лечения PBS или C. scindens (рис. 1). Фекальную ДНК выделяли, количественно определяли и нормализовали до 10 нг/мкл для проведения количественной ПЦР с использованием ген-специфичных праймеров C. scindens ATCC 35704 desA (табл. 1). Мы заметили, что у мышей, получавших антибиотики, бактерии desA+ были минимальны или отсутствовали вообще. Как и ожидалось, мы наблюдали значительно большее количество бактерий desA+ у мышей, получавших C. scindens, которое значительно отличалось от таковых в контрольной группе PBS (p = 0,0286, рис. 1).

Доставка экспериментального соединения (S-эквола) методом MDA. Мышей NSG (n = 15) и FVB/NJ (n = 18) проводили обучение с подслащенным раствором сгущенного молока/воды за два дня до начала лечения. Мышам NSG проводили лечение антибиотиками (цефокситин в питьевой воде) для уничтожения кишечных бактерий, продуцирующих эквол, и, следовательно, выработки эндогенного эквола. Мышей FVB/NJ кормили диетой без сои, чтобы исключить выработку эндогенного эквола. Все мыши были кратковременно ограничены мягким загривком для проведения лечения. Контрольная группа получала подслащенный раствор сгущенного молока/воды в сочетании с кукурузным маслом, группа ДМСО (контрольная группа для S-эквола) получала подслащенный раствор сгущенного молока/воды и ДМСО в кукурузном масле, а группа эквола получала подслащенный раствор сгущенного молока/воды и эквол в кукурузном масле. Мышей лечили пять дней в неделю с помощью метода MDA в общей сложности 43 дня. Мыши, как правило, принимали лечение в течение нескольких секунд и выпивали всю дозу (100 мкл). В целом, все мыши потребляли по крайней мере половину дозы в определенный день (частичная доза в определенный день, но полная доза либо за день до этого, либо на следующий день). Ни одна из мышей не отказалась от лечения полностью на протяжении всего исследования. Мы заметили, что после загривки размещение мышей на спине улучшило время потребления лечения и гарантировало, что животное приняло всю дозу.

Циркулирующие уровни эквола демонстрируют эффективную доставку лекарственного препарата MDA. Образцы крови были взяты у мышей NSG после эвтаназии в конце исследования, чтобы подтвердить, что доставка эквола MDA привела к циркуляционным уровням эквола у исследуемых животных. Мы не смогли собрать достаточное количество крови у одной из мышей, получавших эквол, чтобы провести анализ LC/MS/MS. Уровни эквола в сыворотке крови были измерены с помощью LC/MS/MS в Общем ресурсе аналитической фармакологии Медицинской школы Университета Джона Хопкинса. Мы не наблюдали циркулирующего эквола в контрольной группе и группе ДМСО (носитель эквола), в то время как у мышей, получавших эквол, был обнаружен циркулирующий эквол (рис. 2). Важно отметить, что мы ожидаем некоторого изменения в уровнях циркулирующего эквола у мышей, получавших эквол, из-за разных дат и времени жертвоприношения животных в этом эксперименте.

Микробные сообщества кишечника остаются неизменными после лечения MDA. Влияние молочного раствора MDA (с экволом и без него) на микробиоту кишечника оценивали на мышах FVB/NJ. Мы количественно оценили микробный состав образцов, взятых на исходном уровне (без лечения/без MDA) и образцов, взятых через 7 дней после начала лечения (через 9 дней после начала MDA, включая дни обучения). Мы не наблюдали существенных изменений общей бактериальной нагрузки или общего микробного состава основной микробиоты кишечника (Akkermansia muciniphila, Bifidobacterium spp., Streptococcus salivarius, Lactobacillus spp.) при оценке с помощью видоспецифичного анализа количественной ПЦР (рис. 3), как описано ранее21,22. В одной клетке наблюдалась значительная разница в уровне лактобактерий между исходным уровнем и после лечения МДА; однако этот вывод наблюдался при контроле транспортного средства DMSO и не был согласован во всех клетках.

figure-results-1
Рисунок 1: MDA доставляет анаэробные бактерии в кишечник мыши, которые могут быть количественно определены с помощью количественной ПЦР с калом. Мышей C57BL/6J лечили антибиотиками в течение двух дней подряд в питьевой воде. Затем мышей лечили анаэробной бактерией C. scindens с использованием метода MDA. Бактериальную нагрузку кала C. scindens (desA+) измеряли с помощью количественной ПЦР для гена desA как после лечения антибиотиками, так и через 24 ч после лечения MDA (PBS или C. scindens). (A) Количественная оценка генов desA, специфичных для C. scindens, показана между мышами, получавшими PBS и C. scindens, после лечения антибиотиками и через 24 часа после лечения MDA. (B) Те же данные, которые показаны в течение 24 часов после MDA в пункте (A), показаны в виде столбчатого графика. Статистическую значимость определяли с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. (*) p = 0,0286, погрешности = SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Анализ циркулирующих уровней эквола у мышей NSG, получавших эквол с помощью метода MDA. Уровни эквола в сыворотке крови количественно определяли с помощью ЖХ/МС/МС у мышей, обработанных контролем (n = 5), ДМСО (носитель, n = 5) и экволом (n = 4). У одной из мышей, получавших эквол, не было получено достаточного количества крови для проведения ЖХ/МС/МС. Эти процедуры проводились с использованием метода MDA. Сывороточный эквол был обнаружен только в группе, получавшей эквол. Предел количественного определения < 5 нг/мл. Статистическую значимость определяли с помощью непараметрического одностороннего ANOVA с множественными сравнениями (поправка Данна). (**) p = 0,0053, погрешность = SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Основные кишечные бактерии и общий уровень бактериальной нагрузки не изменились у мышей FVB/NJ после лечения MDA. Существенных изменений значений Cq кПЦР для целевых микробных сообществ до и после проведения лечения методом MDA не наблюдалось. Lactobacillus показал достоверную разницу (*, p = 0,0321) только в клетке 3 между исходным уровнем и лечением MDA. Этот вывод не согласуется между клетками. Номера клеток обозначаются как C1-C4. Статистическую значимость определяли с помощью одностороннего ANOVA с множественными сравнениями (поправка Тьюки). Погрешности = SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Название грунтовкиПоследовательности праймеровУсловия ПЦР
DesA_CS_F5'-GGACAGGGTGTCGGCTTTATG-3'93°C 3 мин, 34 цикла (95 °C 30 с, 54 °C 30 с)
DesA_CS_R5'-TTACTTCACCTTCGCCAGTTTCTG-3'

Таблица 1: Праймеры и условия количественной ПЦР для бактерий desA+ (C. scindens).

Название грунтовкиПоследовательности праймеровУсловия ПЦР
V6_F
V6_R		5'-CAACGCGWRGAACCTTACC-3'
5'-CRACACGAGCTGACGAC-3'		95 °C, 3 мин
36 циклов
95 °C, 30 с
53 °C, 30 с
A.muc_F
A.muc_R		5'-CAGCACGTGAAGGTGGGGAC-3'
5'-CCTTGCGGTTGGCTCTCAGAT-3'		50 °C, 5 мин
95 °C, 10 мин
40 циклов
95 °C, 15 с
60 °C, 1 мин
Bifido_F
Bifido_R		5'-CGGGTGAGTGAGTAATGCGTGACC-3'
5'-ГАТАГГАГГЦGАККККА-3'		95 °C, 3 мин
36 циклов
95 °C, 30 с
53 °C, 30 с
С. salivarius_F
С. salivarius_R		5'-CACGCCATGCTGGAAGTG-3'
5'-GCGATGAGCCAAGCTGAAG-3'		95 °C, 10 мин
44 цикла
95 °C, 15 с
60 °C, 1 мин
Lacto_F
Lacto_R		5'-TGGAAACAGRTGCTAATACCG-3'
5'-GTCCATTGTGGAAGATTCCC-3'		50 °C, 2 мин
95 °C, 10 мин
40 циклов
95 °C, 15 с
62 °C, 1 мин

Таблица 2: Праймеры и условия количественной ПЦР, используемые для измерения влияния MDA на основную микробиоту кишечника.

Обсуждение

ОГ может быть значительным источником стресса у исследовательских животных, что может создавать искажающую переменную, как ранее оценивалось в нескольких исследованиях 7,9,11,12,13,14,15,23. Из-за инвазивности ОГ были использованы альтернативные методы, чтобы свести к минимуму проблемы, связанные с ОГ 9,10,12,13,14,15. Введение лекарственных препаратов под контролем микропипеток (MDA) является новым методом, который позволяет доставлять лекарственные препараты менее инвазивным способом с использованием одноканальной пипетки и смеси интересующего препарата с подслащенным раствором сгущенного молока7. Важным этапом для этой методики является тренировочная сессия (минимум 2 дня), которая позволяет животному лучше ознакомиться с наконечником пипетки и вкусом сгущенного молока с сахаром, а также в целом сокращает время работы и стресс. Эта тренировка также позволяет мышам легко потреблять препараты, включенные в раствор сгущенного молока с сахаром, гораздо быстрее, чем при других методах, и с точной дозировкой.

В наших исследованиях внимательно следили за приготовлением и подачей подслащенного раствора сгущенного молока/воды, представленного в работе Scarborough et al.7. В течение всего исследования мышей не лишали воды или пищи до приема препарата. Они содержались в соответствующих клетках, а время обработки составляло менее 1 минуты. Одно из ключевых отличий в наших исследованиях заключалось в том, что, возможно, из-за возможности ухудшения зрения у линий мышей-альбиносов, которые мы использовали, и возможности легкого отвращения к вкусу при медикаментозном лечении, все мыши нуждались в кратковременном сдерживании с помощью легкого поглаживания в рамках протокола обучения и лечения. Эта модификация лечения MDA рекомендована Vanhecke et al.16. Нежный загривок, наряду с размещением мышей на спине, побуждал мышей жадно потреблять молочный раствор. Мы пришли к выводу, что необходимость в мягком поглаживании в рамках этапов обучения и лечения является необязательной и будет зависеть от исследования. Лечение (с поправкой на массу тела животного, если применимо) проводилось в стандартизированном объеме, и у мышей не наблюдалось изменений в поведении. Другие незначительные изменения по сравнению с первоначальным исследованием7 включали уменьшение количества тренировочных сессий и объемов, вводимых на каждой сессии. Некоторые из ограничений, с которыми мы столкнулись в этом исследовании, включают резистентность некоторых мышей к употреблению всей дозы (100 мкл) молочного раствора в первый день тренировки и в определенные моменты во время исследования. Это было преодолено путем размещения мышей на спине во время удержания. В этом исследовании не оценивали взаимодействие препарата с подслащенным раствором сгущенного молока, различия в потреблении между полами мышей (хотя ранее было показано, что MDA также эффективен у самок мышей 7,17) или повышение маркеров стресса, таких как уровни кортикостерона 7,11,14, связанные с ОГ.

В этом исследовании мы сосредоточились на способности метода MDA доставлять точную дозу экспериментального лечения, а затем оценили фекальные и/или циркулирующие уровни интересующих нас методов лечения у исследуемых животных. Мы также оценили, изменяет ли лечение MDA микробиоту кишечника, и наблюдали минимальные изменения или отсутствие изменений в основной фекальной микробиоте или общей фекальной бактериальной нагрузке исследуемых животных. Мы также не наблюдали травм у животных в результате лечения MDA. В заключение следует отметить, что MDA может служить альтернативным методом краткосрочного и долгосрочного лечения на моделях грызунов. В целом, MDA оказывает положительное влияние на благополучие животных, снижая риск травм, связанных с OG. MDA преодолевает некоторые ограничения других методов, и мы предполагаем, что он может быть широко использован в трансляционных исследованиях на многихразличных моделях грызунов.

Благодарности

Мы хотели бы выразить признательность за поддержку исследований со стороны Программы исследований рака предстательной железы Министерства обороны США W81XWH-20-1-0274 и Премии Фонда рака предстательной железы 16CHAL13. Мы хотели бы поблагодарить и выразить признательность доктору Мишель Рудек, доктору Нушин Расткари, доктору Николь Андерс и Линпин Сюй из Общего ресурса аналитической фармакологии в Университете Джона Хопкинса за помощь с equol LC/MS/MS.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
200 &микро; L наконечники для пипетокMettler Toledo17005860
AB SCIEX Triple QTRAP 5500 масс-спектрометрический детекторSciexN/A
Akkermansia muciniphila штамм muc геномная ДНКАмериканский тип культурыКоллекция BAA-835D-5
Аммония ацетатSigma– Aldrich5.43834
C57BL/6J мышиJackson LaboratoriesШтамм # 000664
C. scindens штамм 35704American Type Culture Collection35704
CefoxitinSagent NDC25021-109-10
Кукурузное маслоMedChemExpressHY-Y1888
DMSOSigma-AldrichD2650
этанолFisher ScientificAC611050040
Муравьиная кислотаSigma– Aldrich5.33002
FVB/NJ мышиJackson LaboratoriesШтамм# 001800
ГлицеринSigma– ОлдричG5516
ГексанFisher Scientific02-002-996
LC-MS класс водыFisher Scientific14-650-357
МетанолFisher Scientific02-003-340
Микротайнер Сепаратор сыворотки ТрубкаBecton Dickinson02-675-185
Молекулярная биология вода классаCorning46-000-CI
NSG мышиJacksonLaboratories Штамм # 005557
PBSCorning21-031-CV
Qubit DNA HS kitInvitrogenQ32851
Racemic; equol-d4Santa Cruz Biotechnologysc-219827
Армированный клостридиальный агарАнаэробные системыAS-6061
Армированный клостридиальный бульонАнаэробные системыAS-606
S-equolMedChemExpressHY-100583
S-эквол стандарт для LC-MSCayman Chemical10010173
одиночный канальная пипеткаRainin17008652
Streptococcus salivarius геномная ДНКАмериканская коллекция типовых культурBAA-1024D-5
Сгущенное молоко с сахаромCalifornia FarmsB09TGQ7WV8
VSL#3VSL#3B07WX1LVHL
&бета;-глюкуронидаза из Helix pomatiaSigma– ОлдричG7017

Ссылки

  1. Vandenberg, L. N., Welshons, W. V., Vom Saal, F. S., Toutain, P. -L., Myers, J. P. Should oral gavage be abandoned in toxicity testing of endocrine disruptors. Environ Health. 13 (1), 46(2014).
  2. Craig, M. A., Elliott, J. F. Mice fed radiolabeled protein by gavage show sporadic passage of large quantities of intact material into the blood, an artifact not associated with voluntary feeding. Contemp Top Lab Anim Sci. 38 (5), 18-23 (1999).
  3. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
  4. Gulin, J. E. N., Bisio, M., García-Bournissen, F. Refining drug administration in a murine model of acute infection with Trypanosoma cruzi. Lab Anim Res. 36, 37(2020).
  5. Bonnichsen, M., Dragsted, N., Hansen, A. K. The welfare impact of gavaging laboratory rats. Anim Welf. 14 (3), 223-227 (2005).
  6. Brown, A. P., Dinger, N., Levine, B. S. Stress produced by gavage administration in the rat. Contemp Top Lab Anim Sci. 39 (1), 17-21 (2000).
  7. Scarborough, J., et al. Preclinical validation of the micropipette-guided drug administration (MDA) method in the maternal immune activation model of neurodevelopmental disorders. Brain Behav Immun. 88, 461-470 (2020).
  8. Germann, P. G., Ockert, D. Granulomatous inflammation of the oropharyngeal cavity as a possible cause for unexpected high mortality in a Fischer 344 rat carcinogenicity study. Lab Anim Sci. 44 (4), 338-343 (1994).
  9. Martins, T., et al. Comparison of gelatin flavors for oral dosing of C57BL/6J and FVB/N mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 61 (1), 89-95 (2022).
  10. Huynh, N., Arabian, N., Lieu, D., Asatryan, L., Davies, D. L. Utilizing an orally dissolving strip for pharmacological and toxicological studies: A simple and humane alternative to oral gavage for animals. J Vis Exp. (109), e53770(2016).
  11. Hoggatt, A. F., Hoggatt, J., Honerlaw, M., Pelus, L. M. A spoonful of sugar helps the medicine go down: a novel technique to improve oral gavage in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 49 (3), 329-334 (2010).
  12. Neto, T., Faustino-Rocha, A. I., Gilda Costa, R. M., Medeiros, R., Oliveira, P. A. A quick and low-intensity method for oral administration to large numbers of mice: A possible alternative to oral gavage. Lab Anim. 56 (2), 185-190 (2022).
  13. Küster, T., et al. Voluntary ingestion of antiparasitic drugs emulsified in honey represents an alternative to gavage in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (2), 219-223 (2012).
  14. Gonzales, C., et al. Alternative method of oral administration by peanut butter pellet formulation results in target engagement of BACE1 and attenuation of gavage-induced stress responses in mice. Pharmacol Biochem Behav. 126, 28-35 (2014).
  15. Teixeira-Santos, L., Albino-Teixeira, A., Pinho, D. An alternative method for oral drug administration by voluntary intake in male and female mice. Lab Anim. 55 (1), 76-80 (2021).
  16. Schalbetter, S. M., et al. Oral application of clozapine-N-oxide using the micropipette-guided drug administration (MDA) method in mouse DREADD systems. Lab Anim (NY). 50 (3), 69-75 (2021).
  17. Vanhecke, D., Bugada, V., Buch, T. Refined tamoxifen administration in mice by encouraging voluntary consumption of palatable formulations). bioRxiv. , (2023).
  18. Heraudeau, M., et al. Micropipette-guided drug administration (MDA) as a non-invasive chronic oral administration method in male rats. J Neurosci Methods. 398, 109951(2023).
  19. Sfanos, K. S., et al. Compositional differences in gastrointestinal microbiota in prostate cancer patients treated with androgen axis-targeted therapies. Prostate Cancer Prostatic Dis. 21 (4), 539-548 (2018).
  20. Shrestha, E., et al. Profiling the urinary microbiome in men with positive versus negative biopsies for prostate cancer. J Urol. 199 (1), 161-171 (2018).
  21. Peiffer, L. B., et al. Composition of gastrointestinal microbiota in association with treatment response in individuals with metastatic castrate resistant prostate cancer progressing on enzalutamide and initiating treatment with anti-PD-1 (pembrolizumab). Neoplasia. 32, 100822(2022).
  22. Jones, C. B., Peiffer, L. B., Davis, C. M., Sfanos, K. S. Examining the effects of 4He exposure on the gut-brain axis. Radiat Res. 197 (3), 242-252 (2022).
  23. Walker, M. K., et al. A less stressful alternative to oral gavage for pharmacological and toxicological studies in mice. Toxicol Appl Pharmacol. 260 (1), 65-69 (2012).
  24. Miguelena Chamorro, B., Swaminathan, G., Mundt, E., Paul, S. Towards more translatable research: Exploring alternatives to gavage as the oral administration route of vaccines in rodents for improved animal welfare and human relevance. Lab Anim (NY). 52 (9), 195-197 (2023).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи