Профилирование рН люминала в трехмерных органоидах желудочно-кишечного тракта с помощью микроэлектродов

Краткое содержание

В настоящем протоколе описаны измерения рН в органоидах желудка человека, полученных из тканей человека, с использованием микроэлектродов для пространственно-временной характеристики внутрипросветной физиологии.

Аннотация

Оптимизация и детальная характеристика моделей органоидов желудочно-кишечного тракта требуют передовых методов анализа их люминального окружения. В данной работе представлен высоковоспроизводимый метод точного измерения рН в просвете 3D-органоидов желудка человека с помощью микроэлектродов, управляемых микроманипуляторами. Микроэлектроды pH коммерчески доступны и состоят из скошенных стеклянных наконечников диаметром 25 мкм. Для измерений pH-микроэлектрод продвигается в просвет органоида (>200 мкм), взвешенного в Matrigel, в то время как электрод сравнения погружается в окружающую среду в культуральной пластине.

Используя такие микроэлектроды для профилирования органоидов, полученных из желудочного тела человека, мы демонстрируем, что рН люминала относительно постоянен в каждой культуральной лунке на уровне ~7,7 ± 0,037 и что непрерывные измерения могут быть получены в течение как минимум 15 минут. В некоторых крупных органоидах измерения выявили градиент pH между поверхностью эпителия и просветом, что позволяет предположить, что измерения pH в органоидах могут быть достигнуты с высоким пространственным разрешением. В предыдущем исследовании микроэлектроды были успешно использованы для измерения концентрации кислорода в органоидах в люминате, что продемонстрировало универсальность этого метода для анализа органоидов. Таким образом, этот протокол описывает важный инструмент для функциональной характеристики сложного просветного пространства внутри 3D-органоидов.

Введение

Органоиды — миниатюрные многоклеточные структуры, полученные из стволовых клеток, — произвели революцию в изучении физиологии человека и начинают заменять животные модели, даже^{в условиях регулирования}. С момента первоначального описания кишечных органоидов Сато и др. в 2009 году, технология органоидов стала чрезвычайно популярной^. Большое количество исследований очень подробно охарактеризовало клеточный состав и функции органоидных моделей 3,4,5,6. Тем не менее, световое пространство этих трехмерных многоклеточных структур остается в значительной степени неопределенным ^7,8. Просвет представляет собой центральную полость органоидов, полученных из тканей слизистой оболочки, которая окружена апикальными частями поляризованных эпителиальных клеток. Поскольку клеточная секреция и абсорбция происходят преимущественно на апикальной поверхности эпителия, микроокружение просвета органоидов контролируется этими важными физиологическими процессами. Используемые в настоящее время органоидные модели демонстрируют вариации в клеточных сигнальных паттернах, общей стволовости, градиентах концентрации метаболитов и условиях окружающей среды⁹. Таким образом, понимание физиологии органоидного просвета необходимо для точного моделирования функции органов и патологии. К сожалению, относительная недоступность просвета значительно затрудняет функциональный анализ физиологии люминов в 3D-органоидах¹⁰.

Способность исследовать профили pH особенно важна для желудка, который печально известен тем, что имеет самый крутой протонный градиент в организме, варьирующийся от примерно 1-3 в просвете до почти нейтрального в эпителии 11,12,13. Остается значительный пробел в нашем понимании микромасштабного поддержания градиента pH желудка и актуальности органоидных моделей для повторения этой динамической среды в слое желудочной слизи. Традиционные подходы к анализу рН органоидов предполагают использование рН-чувствительных красителей, которые могут быть флуоресцентными или колориметрическими индикаторами. McCracken et al. использовали люминальную инъекцию SNARF-5F-ратиометрического индикатора pH в органоиды для анализа падения люминального pH в ответ на лечение гистамином. Такие красители могут быть включены в питательные среды, что позволяет проводить неинвазивный мониторинг pH в режиме реального времени. Мало того, что pH-чувствительные красители требуют сложных этапов калибровки, которые способствуют низкой надежности и точности измерений, но такие красители также имеют тенденцию работать в определенных диапазонах обнаружения, которые могут не отражать полный диапазон pH в пределах интересующей микросреды^14,15. Тем не менее, можно считать целесообразным использовать индикаторные красители для подтверждающих экспериментов. Также были разработаны оптические наносенсоры, использующие флуоресцентные оптоды и pH-чувствительные подходы; Тем не менее, такие методы зондирования требуют микроскопической визуализации и также подвержены фотообесцвечиванию, фототоксичности, а также систематической ошибке изображения^16,17. Кроме того, Брукс и др. имеют напечатанные на 3D-принтере многолуночные планшеты, содержащие микроэлектроды, поверх которых могут быть нанесены органоиды^. Такой подход, однако, не позволяет проводить измерения непосредственно внутри органоидного просвета.

Измерения pH на основе электродов позволяют достичь более высокой точности по сравнению с другими методами, а также обеспечить мониторинг pH в режиме реального времени. Кроме того, pH-электроды, установленные на микроманипуляторах, обеспечивают превосходное пространственное разрешение измерений pH, поскольку точное расположение наконечника электрода можно точно контролировать. Это обеспечивает максимально возможную гибкость и воспроизводимость при анализе моделей органоидов. Используемые здесь электроды представляют собой миниатюрные pH-микроэлектроды, которые работают на основе диффузии протонов через селективное pH-стекло, окружающее тонкую платиновую проволоку. Микроэлектрод подключается к внешнему электроду сравнения Ag-AgCl, а затем подключается к высокоомному милливольтметру. Электрический потенциал между двумя кончиками электродов при погружении в один и тот же раствор будет отражать pH раствора¹⁹. Такие системы микропрофилирования были использованы при метаболическом анализе биопленок^20,21, планктонных водорослей²², образцов мокроты человека²³ и даже сфероидов мезенхимальных стволовых клеток²⁴. Как наша лаборатория, так и Murphy et al. ранее использовали микроэлектроды_O2, управляемые микроманипулятором, для оценки концентрации кислорода в просветных пространствах органоидов. Murphy et al. объединили этот метод с математическим моделированием, чтобы выявить градиент кислорода в своих сфероидах. Наша группа смогла обнаружить снижение уровня кислорода в люминальном спектре в тканевых органоидах желудка по сравнению с окружающим внеклеточным матриксом²⁵.

Здесь мы подробно описываем метод ручного микроэлектродного профилирования рН просвета в сферических органоидах желудочно-кишечного тракта, который позволит лучше понять их сложное микроокружение просвета. Мы ожидаем, что этот метод добавит новое измерение в исследование физиологии органоидов с помощью измерений уровня pH в микромасштабе в режиме реального времени с высоким разрешением. Кроме того, следующий протокол может быть легко адаптирован для анализа O₂, N₂O, H₂, NO, H₂S, окислительно-восстановительного потенциала и температуры в различных типах органоидных моделей. Физиологическое профилирование служит ценным инструментом для оптимизации условий культивирования органоидов для лучшей имитации сред in vivo , тем самым повышая актуальность и полезность органоидных моделей в биомедицинских исследованиях.

Протокол

Для этого протокола требуются 3D-органоиды диаметром не менее 200 мкм, которые имеют отчетливый просвет и встраиваются в искусственный внеклеточный матрикс (ВКМ, например, Матригель). Ткани желудка человека для получения органоидов были получены с одобрения Институционального наблюдательного совета Университета штата Монтана и информированного согласия пациентов, проходящих эндоскопию верхних отделов кишечника в Bozeman Health (протокол # 2023-48-FCR, к D.B.) или в качестве исключенных образцов для цельного желудка или рукавной гастрэктомии из Национального центра исследований заболеваний (протокол #DB062615-EX). Информация об органоидных линиях и номерах пассажей, использованных для данного исследования, представлена в таблице 1, а состав среды указан в таблице 2. Обратитесь к ранее опубликованным протоколам по получению и поддержанию линий органоидов желудочно-кишечного тракта ^6,26,27.

1. Подготовка желудочных органоидов человека к профилированию pH

1. Инициируйте и поддерживайте культуру органоидов желудка с использованием стандартных протоколов. Поддерживайте органоиды на 24-луночных планшетах в концентрации 500 мкл расширительной среды на лунку (табл. 2). Проход устанавливали органоидные линии каждые 5-7 дней, перенося в чашку со стеклянным дном диаметром 35 мм для подготовки к экспериментам по профилированию pH.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Органоидные культуры для наших экспериментов получают из препаратов желудочных желез, которые получают из тканей взрослого человека, как описано выше. Мы используем метод расщепления тканей коллагеназой для выделения этих желез до того, как они будут суспензированы в ВКМ, как описано ранее 25,28,29.
2. Из активно выращиваемых органоидных культур в проходах 1-15 выберите лунки, содержащие не менее 100 органоидов (примерно 2 млн клеток) диаметром от 200 до 700 мкм для переноса и расширения на чашках Петри 3,5 мм.
3. При подготовке органоидов к осаждению (шаги 1.4-1.8) дайте аликвоте (аликвотам) внеклеточного матрикса (ВКМ) оттаять на льду в течение не менее 45 минут. Поддерживайте ECM на льду на протяжении всего этого протокола, чтобы предотвратить гелеобразование. Предварительно разогрейте планшеты для клеточных культур, поместив их в инкубатор с температурой 37 °C и 5%_CO2 .
4. Удалите среду из лунок и соберите органоидные культуры желудка, нанеся ледяной PBS на каждую каплю ECM и поцарапав гель кончиком пипетки P1000. Пипетируйте PBS с фрагментами ECM, содержащими органоиды, в коническую пробирку объемом 15 мл.
5. Центрифугируйте пробирку при 200 × г при 4 °C в течение 5 мин. Фрагменты ЭКМ, содержащие органоиды, будут видны в виде слоя на дне пробирки. Осторожно отасуньте надосадочную жидкость и пипетку 350 мкл 0,25% трипсина-ЭДТА в каждую пробирку, осторожно перемешивая пипетированием вверх и вниз. Инкубируйте пробирки на водяной бане при температуре 37 °C в течение 2-5 минут.
6. После инкубации с трипсином-ЭДТА добавьте 600 мкл ледяного DMEM с пенициллином/стрептомицином в каждую пробирку и энергично пипетируйте вверх и вниз не менее 40 раз. Центрифуга при 200 × г при 4 °C в течение 5 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость. Чтобы подготовить культуры для измерения pH, суспендируйте клеточную гранулу в ледяном жидком ECM с соотношением 1:4 В/В органоидной гранулы к ECM для гальванического покрытия.
7. Для каждого образца наберите 40 мкл жидкого ECM, содержащего органоиды/фрагменты органоидов в тонкой горизонтальной линии по диаметру чашки со стеклянным дном диаметром 35 мм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесение геля на планшет в линию, а не в виде круглой капли, облегчает доступ к отдельным органоидам за счет разжижения культуры.
8. Дайте гелю полимеризоваться в течение 15-30 минут; затем осторожно добавьте 2 мл органоидной расширительной среды в планшет пипетированием по краю лунки, чтобы не нарушить гель.
9. Заменяйте носители через день. Подождите 4-8 дней, чтобы минимум 10 органоидов выросли до минимального диаметра 400 мкм.
10. Чтобы приступить к эксперименту по профилированию pH, убедитесь, что каждая культура содержит не менее 10 органоидов, которые соответствуют следующим критериям: диаметр >200 мкм, здоровый внешний вид (в органоидах практически не видно темного материала, наблюдаемого с помощью светлопольного микроскопа) и не перегруженность другими органоидами.

2. Распаковка и калибровка микроэлектродов

ПРИМЕЧАНИЕ: Для проведения микромасштабных измерений в дополнение к микроэлектроду датчика pH используется отдельный электрод сравнения, а не интегрированная (и, следовательно, более громоздкая) конструкция. Микроэлектрод pH и электрод сравнения должны храниться влажными. Не допускайте контакта с воздухом более 10 минут за один раз. Определите подходящий размер наконечника для конкретного приложения. Здесь мы использовали потенциометрический pH-микроэлектрод со скошенным диаметром наконечника 25 мкм.

1. Пока микроэлектрод все еще находится в защитной трубке, визуально осмотрите наконечник на наличие повреждений.
2. Подключите электрод сравнения к кабелю pH-электрода через разъем. Затем подключите микроэлектрод к усилителю, а усилитель — к заземленному ПК с программным обеспечением через USB-кабель (рис. 1A).
3. Заполните две конические пробирки объемом 50 мл 2/3 70% этанолом и деионизированным H₂O (diH₂O). Поместите микроэлектрод и электрод сравнения в трубку diH₂O, следя за тем, чтобы оба кончика оказались погруженными в жидкость на глубине не менее 1 см.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого и подобных этапов также можно использовать высокие стаканы.
4. Дайте электродам уравновеситься в течение ~10 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура также может быть приостановлена на этом этапе и возобновлена позже, так как электроды могут храниться в diH₂O.
5. Пока электроды находятся в равновесии, откройте программное обеспечение (красный значок) на рабочей станции компьютера. На вкладке «Настройки» убедитесь, что рядом с микроэлектродом установлен флажок, указывающий на то, что он правильно подключен и распознан программным обеспечением. Нажмите «Начать эксперимент » в левом верхнем углу окна и введите желаемое имя файла и место назначения. В окне Настройки калибровки датчика и эксперимента нажмите Очистить все точки , чтобы подготовить программное обеспечение к новой калибровке.
6. Заполните две конические пробирки объемом 50 мл 2/3 калибровочными буферами с pH 4,01 и pH 9,21. Аккуратно промокните защитную трубку и электрод сравнения насухо деликатной лабораторной салфеткой.
7. Начиная с электродов в буфере pH 4,01, введите 4,01 в качестве известного значения pH. Как только показания мВ стабилизируются, выберите точку добавления. Убедитесь, что сигнал стабилен на уровне ~380 мВ. После того, как точка будет добавлена, поместите оба электрода обратно в diH₂O для промывки, затем снова промокните насухо.
8. Повторите предыдущий шаг с буфером 9.21 и нажмите кнопку Добавить точку , когда сигнал стабилизируется (~83 мВ). Убедитесь, что микроэлектроды реагируют линейно в диапазоне pH от 4,01 до 9,21; Следовательно, необходима только двухточечная калибровочная кривая. Убедитесь, что результирующая линия между этими точками имеет отрицательный наклон 50-70 мВ/pH-единицу. Нажмите «Сохранить и использовать калибровку».
   ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь вы готовы начать запись измерений³⁰.

3. Профилирование рН органоидов желудка человека

ПРИМЕЧАНИЕ: Для праворукого пользователя описан следующий протокол. ВНИМАНИЕ: Отключите все параметры энергосбережения на вашем ПК, так как текущие измерения будут прерваны, если ПК перейдет в спящий режим.

1. Соберите кольцевую подставку с зажимом на левой стороне стереомикроскопа для удержания электрода сравнения. Расположите микроманипулятор, прикрепленный к тяжелой лабораторной стойке с правой стороны микроскопа (рисунок 1A).
2. Осторожно извлеките микроэлектрод из защитного корпуса, положив его на скамью и быстро и быстро сняв корпус.
   ВНИМАНИЕ: Микроэлектроды невероятно хрупкие, и следует следить за тем, чтобы наконечник не соприкасался с жестким, твердым материалом. Для достижения наилучших результатов выполняйте измерения на прочном столе без оборудования, которое может вызвать вибрацию стола или нежелательное перемещение электродов.
3. Установите микроэлектрод на микроманипулятор и расположите стереоскоп и микроманипулятор таким образом, чтобы микроэлектрод мог продвигаться к чашке с культурой, не задевая объектив или другие части микроскопа.
4. Расположите чашку для культивирования, содержащую органоиды, чтобы обеспечить адекватную визуализацию первого органоида, который должен быть профилирован (рисунок 1B).
5. Слегка закрепите электрод сравнения на зажиме на кольцевой подставке слева от стереоскопа. Расположите электрод сравнения так, чтобы он находился в среде, окружающей ЭБУ. Следите за тем, чтобы он не нарушил работу органоидов при перемещении предметного столика между измерениями.
6. Глядя непосредственно на культуральную пластину (не в микроскоп), продвигайте кончик микроэлектрода вперед до тех пор, пока он не будет достаточно погружен в среду. На вкладке «Регистратор данных» в программном обеспечении нажмите кнопку «Пуск» (один треугольник, указывающий вправо), чтобы начать запись. Убедитесь, что в правой части экрана установлен флажок Откалибровано.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подождите ~10 секунд для стабилизации каждого показания перед переходом к следующей области.
7. Перед вводом в ЭКМ убедитесь, что наконечник электрода виден под микроскопом и что он расположен таким образом, чтобы продвигаться линейно к первому интересующему органоиду. Медленно продвигайте электрод в гель, не контактируя ни с какими органоидами. Запишите не менее трех показаний pH и рассчитайте среднее значение.
8. Расположите микроэлектрод таким образом, чтобы он был готов к продвижению к первому интересующему органоиду вдоль оси, перпендикулярной поверхности. Позвольте электроду сделать небольшое углубление на поверхности эпителия, не проникая (рисунок 1C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг также даст представление о том, останется ли органоид на месте или он может более свободно перемещаться в ЭХМ.
9. Одним быстрым движением продвигайте микроэлектрод в органоид. Если органоид движется вокруг микроэлектрода или удаляется, попробуйте немного изменить угол или приложите его к другому органоиду или пластиковому ободку, окружающему дно покровного стекла чашки. Измерьте рН света (три раза) 10 различных органоидов для каждого экспериментального условия. Когда закончите запись измерений, нажмите квадратную кнопку «Стоп».
   ВНИМАНИЕ: Оцените диаметр органоида, чтобы решить, насколько далеко продвигать электрод в просвет органоида, стараясь не прокалывать его насквозь. Для повышения точности измерьте диаметр с помощью программного обеспечения камеры микроскопа, если оно доступно. ПРИМЕЧАНИЕ: Если после одного или нескольких измерений кончик микроэлектрода заметно покрывается мусором, промойте микроэлектрод в растворе для диссоциации клеток, PBS, EtOH, а затем diH₂O, прежде чем продолжить.

4. Моторизованное профилирование (опционально)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой опции требуется микроманипулятор, установленный на механическом двигателе, который в конечном итоге управляется компьютерным программным обеспечением через контроллер двигателя³¹.

1. Откройте программу «Профилирование» (значок коричневого цвета) и начните новый эксперимент на вкладке « Профилирование ».
2. Настройки оси Z автоматически распознают мотор при правильном подключении моторного аппарата.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При этой настройке движение в направлениях x и y по-прежнему контролируется вручную.
3. Перейдите на вкладку Взаимодействие с профилем³⁰. Прежде чем нажать кнопку «Пуск», убедитесь, что есть возможность быстро перейти к взгляду на окуляр микроскопа, чтобы обеспечить вход органоида на нужное расстояние. Перейдите в Настройки профиля и выполните следующие действия:
   1. Укажите, что начальное расстояние равно 0 μм.
      ВНИМАНИЕ: Если эпителиальная оболочка особенно жесткая на данном органоиде, органоид может быть оттолкнут или деформирован, а не проникнут. Если это так, продолжайте продвигаться по электроду, но обратите внимание на точку, в которой происходит ввод, так как программное обеспечение не может записать это автоматически.
   2. Оценивая размер профилируемого органоида, укажите конечное расстояние , которое не более чем на 3/4 от расчетного диаметра органоида.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот конкретный шаг предназначен для предотвращения повреждения наконечника электрода.
   3. Укажите желаемый размер шага — 100 мкм, как показано на рисунке 2Е. Убедитесь, что минимальный размер шага соответствует размеру наконечника электрода (например, 25 мкм для наконечника электрода pH-25 мкм 25 мкм).
   4. Укажите безопасное положение, в которое мотор будет возвращать наконечник электрода между профилями.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это должна быть комфортная высота над образцом (за пределами органоида), где датчик можно безопасно перемещать в сторону в направлениях x и y с помощью ручного микроманипулятора. Оставьте угол датчика на значении по умолчанию.
   5. Чтобы обеспечить равновесие электрода, укажите не менее 3 с в поле Ожидание перед измерением.
   6. Установите для параметра Период (периоды) измерения значение не менее 1 с. Измерения за этот период будут усреднены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При выполнении измерений в среде с высоким уровнем электрического шума может быть полезно указать более длительный период.
   7. Установите Задержку между(ями) не менее 1 с.
   8. Задайте предпочтительное количество повторов для измерения на каждой глубине.
   9. Начните запись измерений, нажав кнопку « Старт ».

5. Чистка электродов

1. Поместите очищаемый электрод обратно в защитную трубку.
2. Промойте электроды с помощью diH₂O после измерений.
3. Промойте электроды 70% этанолом в течение пары минут.
4. Промойте электроды буфером pH 4,01.
5. Прежде чем приступить к измерениям, еще раз промойте электроды с помощью diH₂O.

6. Хранение электродов

ПРИМЕЧАНИЕ: Оба электрода должны храниться при комнатной температуре в месте с низкой активностью, защищенном от случайных повреждений.

1. После использования pH-микроэлектрода осторожно переместите его горизонтально обратно в защитную трубку (скользя вдоль лабораторного стола для горизонтальной поддержки).
2. Держа микроэлектрод вертикально (кончик направлен вверх), аккуратно наполните защитную трубку стерильной водой. Заглушите защитную трубку с помощью пробки, в комплекте с которой идет электрод. Убедитесь, что все отверстия в защитной трубке заклеены изолентой. Хранить в небьющейся коробке до следующего использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать оригинальную коробку, в которой поставлялись электроды, так как она будет содержать защитные вставки, предназначенные для удержания электродов на месте при хранении.
3. Храните электрод сравнения в стакане или градуированном цилиндре, заполненном раствором 3М KCl. Накройте стакан/градуированный цилиндр парапленкой, чтобы предотвратить испарение раствора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании градуированного цилиндра рекомендуется закрепить его на лабораторном столе с помощью ленты, чтобы предотвратить случайное перемещение.

7. Инъекция метилового красного (по желанию)

ПРИМЕЧАНИЕ: Метиловый красный является колориметрическим индикаторным красителем, который можно использовать для валидации измерений микроэлектродов.

1. Стеклянный капилляр объемом 2 мкл наполнить стерильным минеральным маслом, загрузить его на автоинъектор nL, управляемый микроманипулятором, а затем заполнить раствором, содержащим 0,02% метилового красного и 150 мМ HCl.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор должен казаться красным/розовым при нахождении в капилляре из-за кислотности HCl.
2. Введите органоиды диаметром не менее 300 мкм с 9,2 мкл раствора²⁵.
3. Захват изображений или видео с помощью камеры, адаптированной к стереомикроскопу (рис. 2G).

Результаты

Секреция кислоты является важнейшей функцией желудка человека. Однако вопрос о том, в какой степени секреция кислоты может быть смоделирована в органоидах, до сих пор остается предметом споров 6,32,33,34. Поэтому мы разработали протокол, подробно описанный выше, для точного измерения выработки кислоты в органоидах желудочного сока. Примечательно, что мы использовали нестимулированные органоиды, полученные из взрослых стволовых клеток, культивируемые в стандартных условиях экспансии, которые были пассированы несколько раз, что привело^{к потере} париетальных клеток. Таким образом, наличие кислотосекретящих париетальных клеток и высвобождение активных кислот в нашей модельной системе не ожидалось.

Для наших экспериментов мы использовали органоиды диаметром от 200 мкм до 1000 мкм, засеянные на чашки со стеклянным дном. Во-первых, мы протестировали два различных размера наконечников для микроэлектродов — pH-25 с диаметром наконечника 25 мкм и pH-50 с диаметром наконечника 50 мкм. Как показано на рисунке 2А, существенной разницы между измерениями, полученными с меньшими и большими наконечниками, не было. Интересно, что исходный pH в органоидах имел тенденцию быть слегка щелочным при ~pH 8. Используя наконечник pH-25 с длиной 25 мкм, мы затем оценили изменение рН просвета в различных десяти органоидах, содержащихся на одном и том же культуральном планшете, с помощью трех измерений, полученных от каждого органоида (рис. 2B). В пределах одной пластины рН просвета отдельных органоидов показал лишь незначительные, незначительные изменения (8,16 ± 0,12; p ≥0,0445-0,99) (рис. 2B). Мы также сравнили внутрипросветные измерения pH в пяти различных органоидных линиях с проходами от 3 до 16 (рис. 2C). Опять же, мы обнаружили последовательные измерения pH в каждой культуре, но значительную вариабельность между линиями органоидов. Тем не менее, рН просвета в целом оставался между рН 7,3 и рН 8,2 в пределах одного порядка, и не было очевидной тенденции к среднему pH при сравнении числа ранних и поздних пассажей (Рисунок 2C). Затем мы задались вопросом, связан ли pH просвета органоида напрямую с pH среды расширения органоидов и внеклеточного матрикса (ECM). Сравнение между средами, ВКМ, окружающей органоиды, и просветом органоида выявило значительные различия в рН, при этом рН просвета органоидов ниже, чем у ВКМ, а рН ВКМ ниже, чем у окружающих органоидных сред расширения (рис. 2D), что позволяет предположить, что рН просвета органоидов является физиологически значимым, а не напрямую определяется средой культивирования. В шести независимых экспериментах мы измерили средний рН просвета, который был близок к нейтральному и составлял 7,13 ± 0,09.

Для измерения pH органоидного просвета с большим пространственным разрешением был использован моторизованный микроманипулятор. Этот подход актуален, если необходимо регистрировать pH или другие градиенты в пределах заполненного слизью органоидного просвета²⁹ . На рисунке 2E показаны две репрезентативные серии измерений pH в крупных органоидах (диаметром >1000 мкм), демонстрирующие точку входа в каждый органоид и заканчивающиеся на глубине ~800 мкм. Поскольку два профилированных органоида не имели одинакового диаметра, измерения не сразу сопоставимы. Несмотря на это, мы демонстрируем доказательства небольшого градиента pH Δ0,6 между поверхностью эпителия и более глубоким просветом органоида (рис. 2E). Чтобы определить возможность проведения измерений pH в органоидах с течением времени, что позволило бы измерять реакцию на лечение в режиме реального времени, мы регистрировали внутрипросветное pH внутри репрезентативного органоида в течение примерно 20 минут и обнаружили, что показания оставались очень стабильными после начального периода адаптации (рисунок 2F).). Для валидации измерений рН просвета независимым методом мы использовали pH-чувствительный колориметрический краситель (метиловый красный), который мы вводили в просвет органоида с помощью нанолитрового автоинъектора, установленного на микроманипуляторе (рис. 2G). Желтая окраска красителя подтвердила, что просвет органоида имеет pH >6,2, что согласуется с измерениями микроэлектродов, которые показали почти нейтральный pH. В целом, эти репрезентативные результаты иллюстрируют осуществимость и воспроизводимость измерений pH на основе микроэлектродов в органоидных культурах.

Рисунок 1: Обзор метода. (А) Принципиальная схема настройки профилирования. Микроэлектрод на рисунке 1A был взят с веб-сайта Unisense. ³⁶ (B) Репрезентативное изображение органоидной культуры, готовой к профилированию, окружающей ЭВМ и окружающей среды (масштабная линейка = 5 мм). (C) Пример правильного позиционирования микроэлектродов при подготовке к зондированию органоидов (масштабная линейка = 500 мкм). Аббревиатура: ECM = внеклеточный матрикс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Иллюстрация 2: Валидация профилирования микросенсоров в органоидах желудка человека. (A) Сравнение измерений рН среднего просвета с использованием наконечников микроэлектродов длиной 25 мкм (рН-25) и 50 мкм (рН-50). Данные от 10 отдельных органоидов, каждый из которых был получен в одном репрезентативном эксперименте. (B) Были получены три повторных измерения pH для 10 отдельных органоидов. Односторонний ANOVA с множественными сравнениями (p = 0,1229). (C) измерения pH, полученные с помощью электрода pH-25, согласуются в пределах каждой из пяти анализируемых органоидных линий с различными номерами проходов; 4-10 органоидов измеряется на линию в зависимости от размера и доступности. Односторонняя ANOVA с множественными сравнениями (p < 0,0001). (D) Измерения pH в органоидах желудка и окружающих его матригелях и средах (n = 6 независимых экспериментов). Измерения получены путем проникновения в эпителиальные органоиды желудка с pH-25. Каждая точка данных представляет собой среднее арифметическое 10 отдельных измерений pH в пределах одного органоида. Односторонняя ANOVA (p < 0,0001). (E) Профили pH от эпителия до просвета двух репрезентативных органоидов с использованием моторизованного микроманипулятора. (F) Стабильность рН с течением времени (~19,8 мин) в одном репрезентативном органоиде. (G) Микроинъекция метилового красного индикаторного красителя pH и HCl в просвет органоида желудка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

			Донор
Цифра	Линия	Проход	Секс	Возраст	Этнос
2А	35	6	F	40	B
2В	7	15	F	26	B
	7	4	F	26	B
	1	16	F	45	C
	34	3	F	44	Неизвестный
	35	6	F	40	B
2С	7	15	F	26	B
2D	36	1	Неизвестный
	7	5	F	26	B
	37	1	Неизвестный
	31	3	F	45	H
	7	9	F	26	B
	7	4	F	26	B
2Э	10	15	F	43	Неизвестный
2Ф	34	3	F	33	C
2G	7	5	F	26	B

Таблица 1.

Расширяющая среда для органоидов желудка человека (L-WRN)
Кондиционированная среда L-WRN	50%
Усовершенствованный DMEM/F12	37%
Фетальная бычья сыворотка	10%
Пенициллин/стрептомицин	1%
L-глютамин	1%
Гентамицин	0.10%
Амфотерицин В	0.10%
Буфер HEPES	0.40%
У-27632	0.10%
СБ-431542	0.10%

Таблица 2.

Дополнительный рисунок S1: Экспрессия ионного транспортера в органоидах желудка человека. Относительное число копий нормализовано до 18S рРНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S2: Органоид желудка человека с деформированной архитектурой после прокола с помощью зонда pH-микродатчика. Масштабная линейка = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительное видео S1: Неудачная попытка профилирования в культуре органоидов желудка. Микроэлектрод с pH 25 мкм вручную продвигается к исследуемому органоиду. После неудачной попытки из-за неправильного определения угла была предпринята попытка использовать другой угол, и выясняется, что органоиду не хватает структурной целостности для профилирования (сферическая структура не прочна и деформируется при проникновении электродом). Затем пользователь перенаправляет его на попытку создания другого органоида. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Ограниченный доступ к просветному пространству органоидов сильно ограничил наше понимание физиологической динамики этого микроокружения. Надежный инструмент для функционального анализа люминальной физиологии расширит наши возможности по использованию органоидов в качестве моделей in vitro для физиологии, фармакологии и исследований заболеваний. Органоиды являются высоконастраиваемыми, физиологически значимыми моделями с дополнительным потенциалом для репликации генетической изменчивости в человеческой популяции. В существующих методах измерения pH внутри просвета органоида используются pH-чувствительные красители или наночастицы, методы, которые часто должны сочетаться с флуоресцентной микроскопией или спектроскопией 16,17,37. Описанный метод профилирования на основе микросенсоров обеспечивает новый путь измерения внутрипросветного pH органоидов желудочно-кишечного тракта с новой пространственной точностью. Наш метод демонстрирует последовательное и надежное измерение рН просвета органоида желудочно-кишечного тракта, а также свидетельствует о градиенте pH. В неопубликованных экспериментах мы подтвердили экспрессию генов семейства SLC SLC4A2 и 26A7, которые, как известно, отвечают за секрецию бикарбонатов, а также SLC9A3, 9A4 и 9A8, которые отвечают за протонный обмен (дополнительный рисунок S1)38,39,40,41. Наши исследования свидетельствуют о преобладании секреции бикарбоната и недостатке париетальных клеток в наших органоидах, что может объяснить щелочность.

Важно убедиться, что используемые микроэлектроды хорошо подходят для органоидного микропрофилирования – это включает в себя выбор правильного диаметра наконечника. Мы попробовали наконечники размером 25 мкм и 50 мкм и получили аналогичные результаты (рис. 2A), но решили продолжить работу с меньшим размером наконечника в соответствии с рекомендациями производителя, поскольку ожидалось, что он будет менее инвазивным и обеспечит более высокое пространственное разрешение, поскольку измерения усредняются по площади скошенного наконечника. Однако в качестве недостатка меньшие кончики более хрупкие. Размер органоида должен учитываться при определении желаемого пространственного разрешения.

Важнейшим этапом в разработке протокола было обеспечение возможности различать внутрипросветный рН органоида от рН в ЭВМ, а затем и в окружающей питательной среде. Можно было бы ожидать разумного количества потока метаболитов внутрь и из органоидов⁴². Мы ожидаем, что pH органоида зависит от окружающей среды, и обнаружили, что органоиды были последовательно менее щелочными, чем окружающая среда, в шести независимых экспериментах (рис. Кроме того, стабильность так же важна при профилировании, как и при калибровке датчика.

Ожидается, что органоиды, полученные из тканей, будут демонстрировать определенную степень вариабельности от донора к донору, поэтому важно профилировать любую органоидную линию на исходном уровне, прежде чем применять какие-либо экспериментальные вмешательства, такие^{как медикаментозное} лечение. Мы предполагаем, что колебания рН в пределах любой органоидной культуры могут быть обусловлены локальными ионными градиентами на микроуровне и неоднородным распределением просветной слизи, определяемым иммунофлуоресценцией и иммуногистохимическим окрашиванием (неопубликованные данные). Наблюдаемые различия рН между отдельными органоидными линиями и пассажами могут быть обусловлены индивидуальными различиями в клеточном составе и секреторной активности органоидов. Мы также обнаружили, что некоторые органоидные линии по своей природе труднее проникнуть, чем другие. Аналогичным образом, некоторые из них могут потерять свою структурную целостность и разрушиться при введении электрода (дополнительный рисунок S2 и дополнительное видео S1). Это, по-видимому, не связано с пассажем органоидов, но чаще всего наблюдается у органоидов более ~1,5 мм в диаметре. В предыдущем исследовании мы показали, что слизь внутри органоидов была распределена неоднородно^. Из-за этой гетерогенности становится трудно определить, повлияло ли распределение слизи на измерение.

Микросенсоры являются минимально инвазивными инструментами, которые могут профилировать органоидную внутрипросветную физиологию с высокой скоростью и высоким пространственным разрешением. Такие датчики также не нарушают химических градиентов и минимально чувствительны к турбулентности в интересующей микросреде. Компактная конструкция стала возможной благодаря отделению электрода датчика от электрода сравнения — стандартные лабораторные датчики pH объединяют эти два электрода, что приводит к увеличению размера. Оптические наносенсоры pH и_O2 для внутриклеточных измерений были разработаны группой Кэша в Колорадской горной школе и успешно показали себя при измерении метаболитов как на мышиных, так и на биопленочных моделях. Однако из-за неоднородности органоидного просвета такие сенсоры могут приводить к неинтерпретируемым^{результатам}. McCracken et al. проанализировали рН просвета в органоидах желудка, полученных из эмбриональных стволовых клеток, путем введения SNARF-5F и визуализации pH-чувствительного красителя с помощью конфокальной микроскопии в реальном времени³⁷. Примечательно, что измерения, о которых сообщил Маккракен, были очень похожи на значения pH, полученные в нашем текущем исследовании (рис. 2B, C). Наш метод, возможно, может быть применен в монослойной архитектуре, с более вертикальной установкой, как при биопленочном профилировании, хотя это может представлять риск повреждения электродов⁴⁴. Будущие исследования также могут включать последовательные измерения pH в течение нескольких дней для оценки изменений, связанных с развитием клеток. Поскольку органоиды среднего размера обычно восстанавливаются и заживают после зондирования, один органоид теоретически может быть исследован в несколько раз дольше, чем можно поддерживать стерильность культур. По мере того, как мы совершенствуем наше понимание динамики pH в моделях органоидов, пространственное разрешение должно быть приоритетом для точного картографирования сложной и исторически недоступной трехмерной микросреды внутри.

Таким образом, этот протокол представляет собой подробный метод точных измерений pH с высоким пространственно-временным разрешением с использованием pH-микроэлектродов, установленных на микроманипуляторе и стереомикроскопе. Этот метод был валидирован на органоидах, полученных из стволовых клеток взрослого человека, и подходит для эпителиальных органоидов диаметром не менее 200 мкм, которые имеют отчетливый просвет. Мы предполагаем, что при выборе альтернативных микроэлектродов этот метод может быть легко адаптирован к другим типам органоидов и измерению альтернативных соединений, таких как NO или_O2.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
3 м KCl	Unisense
5 мл Колеблющийся серологический пипет, индивидуально упакованный, бумага/пластик, пакет, стерильный	CellTreat	229091B
10 мл неколобляющийся серологический пипет, индивидуально упакованный, бумага/пластик, пакет, стерильный	CellTreat	229092B
15 мл центрифужная пробирка - штатив для пены, стерильный	CellTreat	229412
Планшет для культивирования тканей 24 лунки, стерильный	CellTreat	229124
25 мл серологического пипета, индивидуально упакованный, бумага/пластик, пакет, стерильный	CellTreat	229093B
35 мм чашка | No 1.5 Покровное покрытие | Диаметр стекла 20 мм |	MatTek	P35G-1.5-20-C
50 мл без покрытия - штатив для пенопласта, стерильный	CellTreat	229422
70% этанол	BP82031GAL	BP82031GAL
70 мкм; m Ситечко для клеток, в индивидуальной упаковке, стерильное	CellTreat	229483
1,000 & микро; L Наконечники для пипеток увеличенной длины с низким удержанием, стеллажные, стерильные	CellTreat	229037
раствор амфотерицина B (фунгизона)	HyClone Laboratories, Inc	SV30078.01
Шкаф биобезопасности	Nuaire	NU-425-600	Класс II Тип A/B3
Бычья сыворотка Альбумин	Биореагенты Фишера	BP1605-100
Раствор для восстановления клеток	Corning	354253	Раствор для диссоциации клеток
DMEM/F-12 (Advanced DMEM)	Gibco	12-491-015
Модификация Дульбекко Eagles Medium (DMEM)	Fisher Scientific	15017CV
Фетальная бычья сыворотка	HyClone Laboratories, Inc	SH30088
G418 Сульфат	Corning	30-234-CR
Гентамицин сульфат	IBI Scientific	IB02030
HEPES, свободная кислота	Цитива	SH30237,01
HP Павильон 2-в-1 14" Ноутбук Intel Core i3	HP	M03840-001
Соляная кислота	Fisher Scientific	A144C-212
Инкубатор	Fisher Scientific	11676604
iPhone 12 камера	Apple
L-глютамин	Cytiva	SH3003401
большой Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Деликатные салфетки, 1-слойный	Fisher Scientific	34133
M 205 FA стереомикроскоп	Leica
Matrigel Membrane Matrix 354234	Corning	CB-40234
MC-1 UniMotor Controller	Unisense
Метилкрасный
MM33 Микроманипулятор	Marzhauser Wetzlar	61-42-113-0000	Правша
MS-15 Моторизованный столик	Unisense
Nanoject-II	Drummond	3-000-204	нанолитровый автоинъектор
Пенициллин/Стрептомицин (10,000 Ед/мл)	Gibco	15-140-148
pH Микроэлектроды	Unisense	50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160	Программное обеспечение SensorTrace не совместимо с компьютерами Apple
Электрод сравнения	Unisense	REF-RM-001652	Программное обеспечение SensorTrace не совместимо с Apple
Computers SB 431542	Tocris Bioscience	16-141-0
Адаптер для камеры смартфона	Gosky
Технические характеристики Лабораторный стенд LS	Unisense	LS-009238
Трипсин-ЭДТА 0,025%, фенол красный	Gibco	25-200-056
UniAmp	Unisense	11632
United Biosystems Inc  МИНИ КЛЕТОЧНЫЕ СКРЕБКИ 200/PK	Fisher	MCS-200
Y-27632 дигидрохлорид	Tocris Bioscience	12-541-0
&микро; Набор для калибровки	датчиков Unisense/ Mettler Toledo	51-305-070, 51-302-069	pH 4.01 и 9.21, пакеты 20 мл