Пигментный эпителий сетчатки (РПЭ) действует как важнейший барьер между сосудистой оболочкой и сетчаткой, способствуя здоровью и функции типов клеток сетчатки, таких как фоторецепторы. В данной работе мы описываем простой и эффективный протокол выделения и культивирования взрослых мышей RPE.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Упрощенный метод выделения и культивирования клеток пигментного эпителия сетчатки у взрослых мышей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Пигментные эпителиальные клетки сетчатки (РПЭ) имеют решающее значение для правильного функционирования сетчатки. Дисфункция РПЭ участвует в патогенезе важных заболеваний сетчатки, таких как возрастная макулярная дегенерация, пигментный ретинит и диабетическая ретинопатия. Мы представляем оптимизированный подход к выделению РПЭ из глаз взрослых мышей. В отличие от ранее описанных методов, этот подход позволяет выделить и культивировать высокочистый РПЭ от взрослых мышей. Этот простой и быстрый метод не требует обширных технических навыков и достижим с помощью основных научных инструментов и реактивов. Первичные РПЭ выделяют у фоновых мышей C57BL/6 в возрасте от 3 до 14 недель путем энуклеации глаза с последующим удалением переднего сегмента. Ферментативная трипсинизация и центрифугирование используются для диссоциации и изоляции РПЭ от наглазника. В заключение следует отметить, что этот подход предлагает быстрый и эффективный протокол использования РПЭ в изучении функции и заболеваний сетчатки.
Введение
Пигментный эпителий сетчатки (РПЭ) представляет собой специализированный клеточный монослой, выстилающий мембрану Бруха, расположенный между фоторецепторами и сосудистой оболочкой1. Клетки РПЭ играют решающую роль в правильном функционировании сетчатки. Клетки РПЭ транспортируют глюкозу и витамин А к фоторецепторам, улучшают зрение путем повторной изомеризации полностью транс-ретиналь в 11-цис-сетчатку и поддерживают внешние сегменты фоторецептора посредством фагоцитоза отторгнутых наружных сегментов, удаляют воду из субретинального пространства, формируют внешний гематематический барьер за счет наличия плотных соединений и секретируют нейротропные факторы роста (такие как производный фактор пигментного эпителия). и основной фактор роста фибробластов), которые поддерживают фоторецепторы2. Дисфункция клеток РПЭ участвует в патогенезе различных ретинопатий, включая возрастную макулярную дегенерацию, пигментный ретинит и диабетическую ретинопатию 3,4,5. Исследования in vitro с использованием клеток РПЭ имеют решающее значение для улучшения нашего понимания патогенеза этих заболеваний. Первичные клетки РПЭ являются гораздо более предпочтительными для этих исследований, поскольку клеточные линии РПЭ, хотя и легкодоступны, не имеют ключевых характеристик первичных клеток РПЭ.
В то время как различные виды использовались в качестве источников первичных клеток РПЭ, у мышей есть преимущество использования генетических модификаций для понимания патогенеза ретинопатий. Ранее описанные протоколы выделения клеток РПЭ от грызунов либо требуют использования неонатальных животных, либо являются длительными, требуют технических навыков, либо не подходят для культивирования 6,7,8,9,10,11,12. Мы описываем простой и быстрый метод выделения клеток RPE от взрослых мышей, которые дают высокочистые культуры этих клеток.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Использование животных в этом исследовании было одобрено Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Кейс Вестерн Резерв.
1. Приготовление реагентов
- Приготовьте промывочную буферную среду, добавив сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS), не содержащий кальция, магния, фенолового красного, с 10 мМ буферным раствором HEPES. Держите раствор при температуре 4 °C до использования.
- Приготовьте среду RPE, добавив модифицированную среду Dulbecco's Modified Eagle's Medium с 4,5 г/л глюкозы, 1,25x GlutaMAX Supplement (исходная концентрация 100x или 200 мМ; конечная концентрация 2,5 мМ L-глутамина), с 10% фетальной бычьей сывороткой, 1% пенициллином/стрептомицином и 1x раствором заменимых аминокислот MEM (100x). Перед использованием предварительно подогрейте среду до 37 °C на водяной бане.
2. Извлечение глаз мыши
- Усыпите мышь, предпочтительно в возрасте от 3 до 14 недель, с использованием метода эвтаназии, одобренного IACUC (вывих шейки матки под анестезией с использованием коктейля кетамина/ксилазина в концентрации 0,1 мл на 20 г мышей [87,5 мг/кг кетамина и 12,5 мг/кг ксилазина]).
Глаза, собранные у более молодых мышей, будут способствовать увеличению выхода пигментных эпителиальных клеток сетчатки с течением времени и расширят способность к последовательному пассажу. - Положите мышь на бок так, чтобы глаз был направлен вверх.
- Поместите указательный и большой пальцы выше и ниже глаза соответственно. Осторожно надавите на костную структуру, окружающую глаз, чтобы вызвать выпячивание глазного яблока.
- Вставьте кончик слегка приоткрытых ножниц под глаз и осторожно поверните запястье от глаза на 90°, пока глаз не отсоединится от глазницы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не закрывайте ножницы, чтобы разрезать глаз или зрительный нерв, так как это затруднит рассечение наглазника. - Немедленно поместите и обваляйте глаз в 70% этаноле не более чем на 5 секунд, прежде чем переложить его в промывочный буферный сред, хранящийся на льду.
- Под препарирующим микроскопом перенесите по одному глазу в чашку Петри, заполненную буфером для промывки и полосками пропитанной марли.
- Стабилизируйте глаз, удерживая зрительный нерв пинцетом. Аккуратно сделайте надрез на уровне ora serrata хирургическим ножом диаметром 3,00 мм 45° или лезвием бритвы 0,009 дюйма.
- С помощью ножниц Vannas аккуратно введите ножницы в разрез и разрежьте по окружности ora пильчатой мышцы, пока передний сегмент и стекловидное тело не будут удалены и отброшены.
- Аккуратно отклейте сетчатку от наглазника с помощью привязанных щипцов, стараясь не повредить слой RPE.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сетчатку было легче удалить, наполните трансферную пипетку промывочной буферной средой и осторожно приложите ее к краям наглазника, чтобы аккуратно приподнять сетчатку. - Наконец, удалите зрительный нерв и излишки соединительной ткани из наглазника с помощью ножниц. Будьте осторожны, чтобы не проколоть наглазник.
3. Изоляция первичного СИЗД
- Перенесите наглазник в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 1 мл 0,25% трипсина + 0,02% ЭДТА.
ПРИМЕЧАНИЕ: Две наглазницы могут быть добавлены к одной аликвоте Trypsin-EDTA для увеличения выхода культивируемого RPE. - Поместите микроцентрифужные пробирки на водяную баню, установленную при температуре 37 °C, и инкубируйте в течение 10 минут. Каждые 2 минуты вынимайте трубки из водяной бани и 40 раз сильно постучите по дну трубки по столешнице.
- Через 10 минут осторожно механически нарушьте работу наглазника с помощью серологической пипетки P1000 или 2 мл, делая пипетирование вверх и вниз не более 3 раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фрагментация листов СИЗД имеет важное значение, так как большие листы не будут прилипать должным образом. - Немедленно нейтрализуйте трипсин, нанеся слой отделенных листов РПЭ, но не наглазник, на 0,5 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) в конической пробирке объемом 15 мл.
- Кроме того, разбавьте трипсин, нанеся 3 мл среды RPE по каплям на слои листов FBS и RPE.
- Центрифугируйте РПЭ при 340 x g в течение 3 минут.
- Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в подходящем количестве среды RPE для 24-луночного планшета (1,9см2/лунка) или 48-луночного планшета (0,75см2/лунка).
ПРИМЕЧАНИЕ: РПЭ можно наносить на лунные планшеты, покрытые белками внеклеточного матрикса, в частности ламинином, коллагеном IV или фибронектином, для повышения адгезии11. RPE также может быть ресуспендирован в 1 мл среды RPE и нанесен слой на градиент разделения 40% плотности для дальнейшей изоляции чистых клеток RPE. Кроме того, вращение планшета при 340 x g в течение 3-5 минут может увеличить адгезию клеток13. - Инкубировать при 37 °C при 5%CO2.
4. Культивирование СИЗОД
- Не нарушайте работу изолированного СИЗД в течение как минимум 3 дней. Через 72 часа аккуратно удалите старую среду и замените ее свежей, предварительно подогретой средой.
- Меняйте среду каждые 48 ч после первых 3 дней.
- Как только клетки достигнут слияния, пропустите клетки с использованием 0,25% трипсина + 0,02% ЭДТА и уменьшите FBS в средах RPE до 2%.
Примечание: Ранее сообщалось, что первичные РПЭ начинают дедифференцироваться после 5-7 пассажей и начинают терять свою гексагональную форму ипигментацию.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Описанный протокол был использован на фоновых мышах C57BL/6. Пол, по-видимому, не изменяет способность культивировать РПЭ. Мыши в возрасте до 6 недель дают ограниченное количество листов РПЭ по сравнению со старыми мышами, и для достижения оптимальной конфлюенции может потребоваться больше глаз. После выделения клеткам RPE требуется примерно 3 дня, чтобы стабилизироваться и прикрепиться к клеточной культуральной пластине. Примерно через 24 ч после выделения круглые, пигментированные клетки, которые кажутся ануклеатными, ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этой статье мы изложили упрощенный протокол выделения и бактериологического исследования пигментного эпителия сетчатки мыши. Клетки RPE, выделенные из глаз взрослых мышей, экспрессировали RPE-специфичный маркер RPE65 и маркер межклеточного соединения ZO-1. Кроме того, культивируемые клетки развились в пигментированные шестиугольные листы в культуре.
Ранее было опубликовано несколько методов выделения РПЭ у грызунов 6,7,8,9,10,11,12.<...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Соответствующая финансовая или нефинансовая информация не раскрывается.
Благодарности
Исследования, представленные в этой публикации, были поддержаны NIH Grants R01EY018341 and R01EY019250 (C.S.S.), NIH Grant F31EY035156 (A.H.) и P30 EY011373. Финансирующая организация не играла никакой роли в планировании или проведении этого исследования.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,009 RD Однолезвийные лезвия | Personna | 941202 | |
| модифицированной средой Dulbecco's Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | с 4,5 г/л глюкозы, L-глютамина, пирувата натрия |
| Фетальная бычья сыворотка | Corning | 35010CV | |
| GlutaMAX, 100x | Gibco | 35050061 | |
| сбалансированный раствор соли Хэнка | Gibco | 14175095 | без кальция, без магния, без фенола красного |
| HEPES Буферный раствор (1M) | Gibco | 15630106 | |
| MEM Заменимые аминокислоты, 100x | Gibco | 11140050 | |
| микроунитомный нож | BVI Beaver | 377546 | |
| раствор пенициллина-стрептомицина, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Микропластины из полистирола | Falcon | 08-772-1 | 24-луночный или 48-луночный |
| обычный фетальный бычий сыворот | Corning | 35-010-CV | |
| Трипсин-ЭДТА (0,25%) | Gibco | 25200056 | с фенолом |
| красными ножницами Vannas | Fine Science Tools | 10091-12 |
Ссылки
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
- Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Prog Retin Eye Res. 100846, (2020).
- Lambros, M. L., Plafker, S. M. Oxidative stress and the Nrf2 anti-oxidant transcription factor in age-related macular degeneration. Adv Exp Med Biol. 854, 67-72 (2016).
- Ferrari, S., et al. Retinitis pigmentosa: genes and disease mechanisms. Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).
- Xia, T., Rizzolo, L. J. Effects of diabetic retinopathy on the barrier functions of the retinal pigment epithelium. Vision Res. 139, 72-81 (2017).
- Edwards, R. B. Culture of rat retinal pigment epithelium. In Vitro. 13 (5), 301-304 (1977).
- Mayerson, P. L., Hall, M. O., Clark, V., Abrams, T. An improved method for isolation and culture of rat retinal pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 26 (11), 1599-1609 (1985).
- Chang, C. W., Roque, R. S., Defoe, D. M., Caldwell, R. B. An improved method for isolation and culture of pigment epithelial cells from rat retina. Curr Eye Res. 10 (11), 1081-1086 (1991).
- Wang, N., Koutz, C. A., Anderson, R. E. A method for the isolation of retinal pigment epithelial cells from adult rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (1), 101-107 (1993).
- Sakagami, K., et al. A rapid method for isolation of retinal pigment epithelial cells from rat eyeballs. Ophthalmic Res. 27 (5), 262-267 (1995).
- Heller, J. P., Kwok, J. C., Vecino, E., Martin, K. R., Fawcett, J. W. A method for the isolation and culture of adult rat retinal pigment epithelial (RPE) cells to study retinal diseases. Front Cell Neurosci. 9, 449(2015).
- Shen, J., He, J., Wang, F. Isolation and culture of primary mouse retinal pigment epithelial (RPE) cells with Rho-Kinase and TGFbetaR-1/ALK5 inhibitor. Med Sci Monit. 23, 6132-6136 (2017).
- Hood, E. M. S., Curcio, C., Lipinski, D. Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts. STAR Protoc. 3 (4), 101758(2022).
- Naylor, A., Hopkins, A., Hudson, N., Campbell, M. Tight Junctions of the outer blood retina barrier. Int J Mol Sci. 21 (1), 211(2019).
- Ban, B., Rizzolo, L. J. A culture model of development reveals multiple properties of RPE tight junctions. Mol Vis. 3, 18(1997).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nat Protoc. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Yang, S., Zhou, J., Dengwen, L. Functions and diseases of the retinal pigment epithelium. Front Pharmacol. 12, 727870(2021).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
