Упрощенный метод выделения и культивирования клеток пигментного эпителия сетчатки у взрослых мышей

Краткое содержание

Пигментный эпителий сетчатки (РПЭ) действует как важнейший барьер между сосудистой оболочкой и сетчаткой, способствуя здоровью и функции типов клеток сетчатки, таких как фоторецепторы. В данной работе мы описываем простой и эффективный протокол выделения и культивирования взрослых мышей RPE.

Аннотация

Пигментные эпителиальные клетки сетчатки (РПЭ) имеют решающее значение для правильного функционирования сетчатки. Дисфункция РПЭ участвует в патогенезе важных заболеваний сетчатки, таких как возрастная макулярная дегенерация, пигментный ретинит и диабетическая ретинопатия. Мы представляем оптимизированный подход к выделению РПЭ из глаз взрослых мышей. В отличие от ранее описанных методов, этот подход позволяет выделить и культивировать высокочистый РПЭ от взрослых мышей. Этот простой и быстрый метод не требует обширных технических навыков и достижим с помощью основных научных инструментов и реактивов. Первичные РПЭ выделяют у фоновых мышей C57BL/6 в возрасте от 3 до 14 недель путем энуклеации глаза с последующим удалением переднего сегмента. Ферментативная трипсинизация и центрифугирование используются для диссоциации и изоляции РПЭ от наглазника. В заключение следует отметить, что этот подход предлагает быстрый и эффективный протокол использования РПЭ в изучении функции и заболеваний сетчатки.

Введение

Пигментный эпителий сетчатки (РПЭ) представляет собой специализированный клеточный монослой, выстилающий мембрану Бруха, расположенный между фоторецепторами и сосудистой оболочкой¹. Клетки РПЭ играют решающую роль в правильном функционировании сетчатки. Клетки РПЭ транспортируют глюкозу и витамин А к фоторецепторам, улучшают зрение путем повторной изомеризации полностью транс-ретиналь в 11-цис-сетчатку и поддерживают внешние сегменты фоторецептора посредством фагоцитоза отторгнутых наружных сегментов, удаляют воду из субретинального пространства, формируют внешний гематематический барьер за счет наличия плотных соединений и секретируют нейротропные факторы роста (такие как производный фактор пигментного эпителия). и основной фактор роста фибробластов), которые поддерживают фоторецепторы². Дисфункция клеток РПЭ участвует в патогенезе различных ретинопатий, включая возрастную макулярную дегенерацию, пигментный ретинит и диабетическую ретинопатию ^3,4,5. Исследования in vitro с использованием клеток РПЭ имеют решающее значение для улучшения нашего понимания патогенеза этих заболеваний. Первичные клетки РПЭ являются гораздо более предпочтительными для этих исследований, поскольку клеточные линии РПЭ, хотя и легкодоступны, не имеют ключевых характеристик первичных клеток РПЭ.

В то время как различные виды использовались в качестве источников первичных клеток РПЭ, у мышей есть преимущество использования генетических модификаций для понимания патогенеза ретинопатий. Ранее описанные протоколы выделения клеток РПЭ от грызунов либо требуют использования неонатальных животных, либо являются длительными, требуют технических навыков, либо не подходят для культивирования 6,7,8,9,10,11,12. Мы описываем простой и быстрый метод выделения клеток RPE от взрослых мышей, которые дают высокочистые культуры этих клеток.

Протокол

Использование животных в этом исследовании было одобрено Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Кейс Вестерн Резерв.

1. Приготовление реагентов

1. Приготовьте промывочную буферную среду, добавив сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS), не содержащий кальция, магния, фенолового красного, с 10 мМ буферным раствором HEPES. Держите раствор при температуре 4 °C до использования.
2. Приготовьте среду RPE, добавив модифицированную среду Dulbecco's Modified Eagle's Medium с 4,5 г/л глюкозы, 1,25x GlutaMAX Supplement (исходная концентрация 100x или 200 мМ; конечная концентрация 2,5 мМ L-глутамина), с 10% фетальной бычьей сывороткой, 1% пенициллином/стрептомицином и 1x раствором заменимых аминокислот MEM (100x). Перед использованием предварительно подогрейте среду до 37 °C на водяной бане.

2. Извлечение глаз мыши

1. Усыпите мышь, предпочтительно в возрасте от 3 до 14 недель, с использованием метода эвтаназии, одобренного IACUC (вывих шейки матки под анестезией с использованием коктейля кетамина/ксилазина в концентрации 0,1 мл на 20 г мышей [87,5 мг/кг кетамина и 12,5 мг/кг ксилазина]).
   Глаза, собранные у более молодых мышей, будут способствовать увеличению выхода пигментных эпителиальных клеток сетчатки с течением времени и расширят способность к последовательному пассажу.
2. Положите мышь на бок так, чтобы глаз был направлен вверх.
3. Поместите указательный и большой пальцы выше и ниже глаза соответственно. Осторожно надавите на костную структуру, окружающую глаз, чтобы вызвать выпячивание глазного яблока.
4. Вставьте кончик слегка приоткрытых ножниц под глаз и осторожно поверните запястье от глаза на 90°, пока глаз не отсоединится от глазницы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не закрывайте ножницы, чтобы разрезать глаз или зрительный нерв, так как это затруднит рассечение наглазника.
5. Немедленно поместите и обваляйте глаз в 70% этаноле не более чем на 5 секунд, прежде чем переложить его в промывочный буферный сред, хранящийся на льду.
6. Под препарирующим микроскопом перенесите по одному глазу в чашку Петри, заполненную буфером для промывки и полосками пропитанной марли.
7. Стабилизируйте глаз, удерживая зрительный нерв пинцетом. Аккуратно сделайте надрез на уровне ora serrata хирургическим ножом диаметром 3,00 мм 45° или лезвием бритвы 0,009 дюйма.
8. С помощью ножниц Vannas аккуратно введите ножницы в разрез и разрежьте по окружности ora пильчатой мышцы, пока передний сегмент и стекловидное тело не будут удалены и отброшены.
9. Аккуратно отклейте сетчатку от наглазника с помощью привязанных щипцов, стараясь не повредить слой RPE.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сетчатку было легче удалить, наполните трансферную пипетку промывочной буферной средой и осторожно приложите ее к краям наглазника, чтобы аккуратно приподнять сетчатку.
10. Наконец, удалите зрительный нерв и излишки соединительной ткани из наглазника с помощью ножниц. Будьте осторожны, чтобы не проколоть наглазник.

3. Изоляция первичного СИЗД

1. Перенесите наглазник в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 1 мл 0,25% трипсина + 0,02% ЭДТА.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Две наглазницы могут быть добавлены к одной аликвоте Trypsin-EDTA для увеличения выхода культивируемого RPE.
2. Поместите микроцентрифужные пробирки на водяную баню, установленную при температуре 37 °C, и инкубируйте в течение 10 минут. Каждые 2 минуты вынимайте трубки из водяной бани и 40 раз сильно постучите по дну трубки по столешнице.
3. Через 10 минут осторожно механически нарушьте работу наглазника с помощью серологической пипетки P1000 или 2 мл, делая пипетирование вверх и вниз не более 3 раз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фрагментация листов СИЗД имеет важное значение, так как большие листы не будут прилипать должным образом.
4. Немедленно нейтрализуйте трипсин, нанеся слой отделенных листов РПЭ, но не наглазник, на 0,5 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) в конической пробирке объемом 15 мл.
5. Кроме того, разбавьте трипсин, нанеся 3 мл среды RPE по каплям на слои листов FBS и RPE.
6. Центрифугируйте РПЭ при 340 x g в течение 3 минут.
7. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в подходящем количестве среды RPE для 24-луночного планшета (1,9^см2/лунка) или 48-луночного планшета (0,75^см2/лунка).
   ПРИМЕЧАНИЕ: РПЭ можно наносить на лунные планшеты, покрытые белками внеклеточного матрикса, в частности ламинином, коллагеном IV или фибронектином, для повышения адгезии¹¹. RPE также может быть ресуспендирован в 1 мл среды RPE и нанесен слой на градиент разделения 40% плотности для дальнейшей изоляции чистых клеток RPE. Кроме того, вращение планшета при 340 x g в течение 3-5 минут может увеличить адгезию клеток¹³.
8. Инкубировать при 37 °C при 5%_CO2.

4. Культивирование СИЗОД

1. Не нарушайте работу изолированного СИЗД в течение как минимум 3 дней. Через 72 часа аккуратно удалите старую среду и замените ее свежей, предварительно подогретой средой.
2. Меняйте среду каждые 48 ч после первых 3 дней.
3. Как только клетки достигнут слияния, пропустите клетки с использованием 0,25% трипсина + 0,02% ЭДТА и уменьшите FBS в средах RPE до 2%.
   Примечание: Ранее сообщалось, что первичные РПЭ начинают дедифференцироваться после 5-7 пассажей и начинают терять свою гексагональную форму и^{пигментацию.}

Результаты

Описанный протокол был использован на фоновых мышах C57BL/6. Пол, по-видимому, не изменяет способность культивировать РПЭ. Мыши в возрасте до 6 недель дают ограниченное количество листов РПЭ по сравнению со старыми мышами, и для достижения оптимальной конфлюенции может потребоваться больше глаз. После выделения клеткам RPE требуется примерно 3 дня, чтобы стабилизироваться и прикрепиться к клеточной культуральной пластине. Примерно через 24 ч после выделения круглые, пигментированные клетки, которые кажутся ануклеатными, начали оседать, но не полностью прилипли к пластине (рис. 1А). В течение следующих 48-72 ч клетки начинают прикрепляться и распространяться, сохраняя свою темную пигментацию и прозрачное ядро (рис. 1B, C). Через 5 дней РПЭ увеличили конфлюенцию и начали образовывать межклеточные контакты, напоминающие поляризованный монослой с гексагональной формой (рис. 1D).

Изолированные РПЭ оценивали на чистоту и целостность герметичных соединений после 6 дней в культуре. Сначала РПЭ оценивали на наличие ретиноидизомергидролазы или белка пигментного эпителия сетчатки 65 кДа (РПЭ65), маркера, специфичного для РПЭ (Рисунок 2, зеленый). Кроме того, для того, чтобы РПЭ образовал один слой пигментированных клеток гексагональной формы, межклеточные соединения должны оставаться неповрежденными. Белки плотного соединения-1 или zonula occludens-1 (ZO-1) являются белками-каркасами, жизненно важными для поддержания и целостности плотных соединений между отдельными клетками RPE¹⁴. Конфлюентно изолированные культуры RPE сохраняли свои белки межклеточного соединения, о чем свидетельствует окрашивание ZO-1, обнаруженного на периферии клетки (рис. 2, красный). Как только эти клетки достигают слияния в больших листах, они поддерживают межклеточные контакты, не разрастаясь до 2 недель. Предыдущие исследования показали, что ZO-1 высоко экспрессируется в течение 9 дней в культуре¹⁵. Дополнительные маркеры, используемые в культурах первичных РПЭ, включают коллаген IV, CRALBP и OTX2¹¹.

Рисунок 1. Морфология первичного РПЭ мыши, культивируемого на стандартном полистирольном 24-луночном планшете. (A) Первичный РПЭ выделен из обоих глаз мыши C57BL/6 и культивирован в одной лунке 24-луночного полистирольного планшета для культуры тканей без покрытия сразу после выделения. (В,В) Через 48 ч и 72 ч первичные РПЭ начинают прилипать к пластине и образуют пигментированные двуядерные клетки. (D) Через 5 дней светлопольная микроскопия показывает, что гиперпигментированные клетки гексагональной формы увеличивают слияние и начинают образовывать межклеточные контакты. Масштабная линейка: 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2. RPE-специфичный маркер RPE-65 и маркер межклеточного соединения ZO-1 консервативны в изолированных первичных мышиных RPE. Первичные РПЭ от трех мышей C57BL/6 культивировали в течение 6 дней до фиксации 4% параформальдегидом. Клетки проникали 0,1% Triton-X в PBS в течение 5 мин, блокировали 5% нормальной козьей сыворотки и инкубировали с антителами против RPE-65 (зеленый) или ZO-1 (красный). Масштабная линейка: 50 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3. Упрощенное схематическое изображение протокола выделения пигментного эпителия сетчатки. После извлечения глазного яблока из мыши простерилизуйте глаз, кратковременно окунув его в 70% этанол перед перемещением в буфер для промывки. В буфере для промывки разрежьте вдоль ora пильчатый и удалите передний сегмент. Удалите сетчатку и поместите наглазник в пробирку с трипсином/ЭДТА. Осторожно постучитывайте пробиркой по столешнице каждые 2 минуты в течение 10 минут, переложите надосадочную жидкость в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте гранулу СИЗОД. Ресуспендируйте элементы и планшет на 24- или 48-луночный планшет. Графика сгенерирована с помощью BioRender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

В этой статье мы изложили упрощенный протокол выделения и бактериологического исследования пигментного эпителия сетчатки мыши. Клетки RPE, выделенные из глаз взрослых мышей, экспрессировали RPE-специфичный маркер RPE65 и маркер межклеточного соединения ZO-1. Кроме того, культивируемые клетки развились в пигментированные шестиугольные листы в культуре.

Ранее было опубликовано несколько методов выделения РПЭ у грызунов 6,7,8,9,10,11,12. Многие протоколы отслаивают слои РПЭ от мембраны Бруха, что требует технических навыков и увеличивает риск повреждения РПЭ или гибели клеток 6,7,9,11,12,16. Таким образом, в этом протоколе используется ферментативная отслойка слоя РПЭ, а не механическая диссоциация, чтобы способствовать выживанию и поддержанию целостности листов РПЭ в культуре. Этот метод позволяет получить РПЭ мыши в культуре, которая поддерживает морфологию РПЭ с высокопигментированными клетками гексагональной формы, сохраняющими экспрессию белков плотных соединений. Кроме того, в этом протоколе отсутствуют сложные реагенты или материалы, используемые в других протоколах, такие как проницаемые мембранные вставки, дополнительные белки покрытия внеклеточного матрикса или специализированные реагенты для диссоциации тканей. Вместо этого в этом протоколе используется простое ферментативное расщепление с использованием 0,25% трипсина-ЭДТА в сочетании с перемешиванием тканей для диссоциации слоя RPE от мембраны Бруха. Этот протокол был успешно выполнен на мышах в возрасте от 3 до 14 недель; Тем не менее, может потребоваться больше глаз для успешного получения сливающейся культуры у молодых мышей.

Во время выполнения этого протокола может возникнуть несколько проблем. Требуются технические навыки, чтобы точно вырезать вокруг ora serrata и аккуратно удалить сетчатку, не нарушая слой RPE. Сетчатка может быть нарушена при разрезании окружности склеры, что может изменить жизнеспособность РПЭ. Совершенствование этой техники может быть достигнуто только путем повторяющейся, непрерывной практики. Кроме того, листы СИЗОД могут оставаться прикрепленными к слою сетчатки после удаления. Чтобы избежать чрезмерной потери СИЗОД, стимулируйте отслойку сетчатки с помощью шприца или пересадочной пипетки, наполненной промывочной буферной средой, чтобы аккуратно приподнять края сетчатки от наглазника. Инкубация гиалуронидазы также может способствовать отслойке¹⁶. В том случае, если РПЭ не отделяются должным образом от мембраны Бруха и сосудистой оболочки, увеличьте время инкубации трипсином на водяной бане. Кроме того, заморозьте аликвоты свежего трипсина при температуре -20 °C и разморозьте непосредственно перед использованием для поддержания оптимальной ферментативной активности. Неспособность RPE прикрепиться к луночной пластине после изоляции может возникнуть, если клетки засеяны со слишком низкой плотностью или если RPE были повреждены в процессе изоляции. Кроме того, наш протокол не требует покрытия белков внеклеточного матрикса (ВКМ) для культивирования. Тем не менее, было показано, что белки ВКМ, такие как фибронектин, коллаген IV, ламинин или коллаген I, увеличивают прикрепление клеток, и их следует рассматривать при плохой приверженности¹¹.

Для увеличения выхода монослоек, культивируемых с помощью RPE, объедините не менее 2-3 глаз мышей соответствующего возраста с одинаковым генетическим фоном; Клетки могут со временем потерять свою гексагональную форму и пигмент, если их не засеять в достаточно высокой плотности. Для мышей в возрасте старше 8 недель 2 глаз на 24-луночный планшет должно быть достаточно для оптимального слияния. Если мыши в возрасте до 8 недель, 3-4 глаза приведут к лучшему привержению и слиянию. Со временем клетки могут быть восприимчивы к эпителиально-мезенхимальному переходу (ЭМП) с потерей пигментации и приобретением удлиненной формы. Добавление ингибиторов Rho-киназы и TGFβR-1/ALK5, таких как Y27632 и Repsox, соответственно, может предотвратить ЭМП культивируемых клеток RPE¹². В то время как протокол изоляции является кратким и требует всего 1 час для выделения 2-4 глаз, первичной культуре может потребоваться до 7-10 дней для достижения полного слияния. Кроме того, пассирование РПЭ ограничено, с повышенным риском ЭМП при каждом последующем прохождении.

Клетки пигментного эпителия сетчатки являются критически важными клетками для поддержания гомеостаза в глазу. РПЭ действуют как фагоциты, помогая поддерживать фоторецепторы, предотвращая повреждение нервных слоев светом и действуя как плотный эпителиальный барьер для регуляции транспорта¹⁷. Заболевания, непосредственно влияющие на РПЭ, такие как возрастная макулярная дегенерация, пигментный ретинит и диабетическая ретинопатия, могут усугублять воспаление, усиливать апоптоз и нарушать клеточные соединения, что приводит к повышению вероятности дегенерации сетчатки и^{слепоты.} Культивирование первичного РПЭ облегчает изучение патогенеза глазных заболеваний, поражающих РПЭ. В заключение следует отметить, что наш протокол сокращает продолжительность выделения и упрощает необходимые методы и реагенты, сохраняя при этом культуру клеток высокой чистоты.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,009 RD Однолезвийные лезвия	Personna	941202
модифицированной средой Dulbecco's Eagle's Medium (DMEM)	Corning	10-013-CV	с 4,5 г/л глюкозы, L-глютамина, пирувата натрия
Фетальная бычья сыворотка	Corning	35010CV
GlutaMAX, 100x	Gibco	35050061
сбалансированный раствор соли Хэнка	Gibco	14175095	без кальция, без магния, без фенола красного
HEPES Буферный раствор (1M)	Gibco	15630106
MEM Заменимые аминокислоты, 100x	Gibco	11140050
микроунитомный нож	BVI Beaver	377546
раствор пенициллина-стрептомицина, 100x	Corning	30-002-CI
Микропластины из полистирола	Falcon	08-772-1	24-луночный или 48-луночный
обычный фетальный бычий сыворот	Corning	35-010-CV
Трипсин-ЭДТА (0,25%)	Gibco	25200056	с фенолом
красными ножницами Vannas	Fine Science Tools	10091-12