Методическая статья

Идентификация редких антиген-специфических Т-клеток из легких мышей с помощью пептид:Тетрамеры основного комплекса гистосовместимости

DOI:

10.3791/66939

⸱

19 июля 2024 г.

 ,  , 
1Center for Immunology and Inflammatory Diseases, Division of Rheumatology, Allergy, and Immunology, Massachusetts General Hospital, 2Division of Immunology, Boston Children's Hospital, 3Harvard Medical School, 4Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Massachusetts General Hospital

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы предоставляем подробный протокол для выделения и идентификации популяций редких антиген-специфических Т-клеток в легких мышей с помощью обогащения Т-клеток на основе магнитных гранул и тетрамеров комплекса пептида:главного комплекса гистосовместимости (MHC).

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Идентификация и характеристика антиген-специфических Т-клеток в период здоровья и болезни остается ключом к улучшению нашего понимания иммунной патофизиологии. Технические проблемы отслеживания антиген-специфических популяций Т-клеток в эндогенном репертуаре Т-клеток значительно усложнились благодаря разработке реагентов пептида: тетрамера MHC. Эти флуоресцентно меченные растворимые мультимеры молекул MHC класса I или II, комплексованных с антигенными пептидными эпитопами, связываются непосредственно с Т-клетками с соответствующей специфичностью рецептора Т-клеток (TCR) и, следовательно, могут идентифицировать антиген-специфические популяции Т-клеток в их нативном состоянии без необходимости функционального ответа, индуцированного ex vivo стимуляция. Для чрезвычайно редких популяций Т-клетки, связанные с тетрамером, могут быть обогащены магнитами для повышения чувствительности и надежности обнаружения.

По мере углубления исследований тканевого резидентного Т-клеточного иммунитета существует насущная потребность в идентификации антиген-специфических Т-клеток, которые перемещаются и находятся в нелимфоидных тканях. В этом протоколе мы представляем подробный набор инструкций по выделению и характеристике антиген-специфических Т-клеток, присутствующих в легких мыши. Это включает в себя выделение Т-клеток из переваренной легочной ткани с последующим этапом общего магнитного обогащения Т-клеток и окрашивание тетрамерами для анализа и сортировки проточной цитометрии. Этапы, описанные в этом протоколе, используют общие методы и легкодоступные реагенты, что делает его доступным практически для любого исследователя, занимающегося иммунологией Т-клеток мышей, и хорошо адаптируется для различных последующих анализов любой популяции низкочастотных антиген-специфических Т-клеток, находящихся в легких.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В основе адаптивной иммунной системы лежит способность Т-клеток распознавать и реагировать на определенный антиген. Когда и где Т-клетка реагирует на родственный ей антиген, определяет баланс инфекции и аутоиммунитета, гомеостаза и рака, здоровья и болезни1. Из этого следует, что изучение Т-клеток в конкретном контексте иммунитета должно быть сосредоточено на клетках, специфичных к соответствующему антигену, представляющему интерес. К числу технологических достижений, которые значительно расширили возможности по освидетельствованию антиген-специфических популяций Т-клеток, относятся флуоресцентно меченые растворимые мультимеры (обычно тетрамеры) молекул основного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I или класса II, интегрированные в антигенные пептидные эпитопы, более известные как «пептид: тетрамеры MHC»2,3,4,5 . Представляя собой естественные лиганды Т-клеточных антигенных рецепторов (TCR), тетрамеры пептида:MHC класса I и класса II обеспечивают средства для прямой идентификации антиген-специфических CD8+ и CD4+ Т-клеток соответственно в эндогенном репертуаре Т-клеток в иммунной системе без необходимости ответа на стимуляцию антигена в анализе. Тетрамеры представляют собой более элегантный подход к изучению антиген-специфичных Т-клеток, чем модели адаптивного переноса трансгенных Т-клеток TCR6, и все чаще используются для идентификации чужеродных и собственных антиген-специфических популяций Т-клеток как в экспериментальных моделях мышей, так и в моделях заболеваний человека 4,5.

В то время как тетрамеры могут легко идентифицировать высокочастотные популяции Т-клеток, которые разрослись в ответ на стимуляцию антигена, их использование для наивных, самоантиген-специфичных Т-клеток или Т-клеток памяти ограничено очень низкими частотами этихпопуляций. Наша группа и другие разработали и популяризировали стратегии магнитного обогащения на основе тетрамеров, которые увеличивают чувствительность обнаружения, что позволяет изучать эти клеточные популяции в лимфоидных тканях мышей 8,9,10,11.

Появление тканевых резидентных Т-клеток в этой области поставило повышенный акцент на разработку новых способов исследования Т-клеток в нелимфоидном пространстве. Как и многие другие поверхности слизистых оболочек, Т-клетки в легких сталкиваются с рядом собственных и чужеродных антигенов, полученных из эпителия хозяина, комменсальных и инфекционных микробов, а также объектов окружающей среды, включая аллергены. Транскрипционный анализ Т-клеток, полученных из нелимфоидной ткани (НЛТ), демонстрирует фенотип, подобный памяти, который несет уникальную тканеспецифическую судьбу и функцию, часто направленную на транспортировку и тканевый гомеостаз12. Более того, тканевые резидентные Т-клетки памяти (Trms), как правило, более клонально ограничены, чем те, которые находятсяв циркуляции. Определение того, как и почему антигены стимулируют проживание Т-клеток в NLT, имеет решающее значение для понимания того, как иммунная система защищает от инфекции, поддерживает гомеостаз тканей и, иногда, переходит в аутоиммунную систему. Тем не менее, по-видимому, наблюдается больший истирание среди тканевых резидентных Т-клеток легких по сравнению с другими NLT14. Соответственно, возможность идентификации и характеристики эндогенных Т-клеток легкого с заданной антиген-специфичностью ограничена присущей им редкостью.

Комбинируя использование методов обогащения клеток на основе магнитных шариков и окрашивание пептидом:тетрамером MHC, нам удалось обнаружить расширенные, но редкие аутоантиген-специфические Т-клетки в легких мышей15,16. В этой статье мы представляем подробное описание протокола, который мы оптимизировали для надежной изоляции и характеристики любой популяции редких антиген-специфических Т-клеток, присутствующих в легких мышей (Рисунок 1). Этот протокол включает в себя стадию окрашивания антителами in vivo для отличия резидентных в ткани Т-клеток от сосудистых Т-клеток17, за которыми следуют два различных метода обработки легочной ткани для учета имеющихся ресурсов. Затем следует этап общего магнитного обогащения Т-клеток, окрашивание тетрамером и анализ с помощью проточной цитометрии. Жизнеспособность клеток и окрашивание тетрамерами дополнительно усиливаются в этом протоколе за счет добавления аминогуанидина, который блокирует индуцируемый апоптоз Т-клеток, индуцируемый активацией оксида азота (iNOS)18, и дазатиниба, который ограничивает подавление TCR19. Этапы, описанные в этом протоколе, используют общие методы и легкодоступные реагенты, что делает его доступным практически для любого исследователя, занимающегося иммунологией Т-клеток мышей, и легко адаптируется для различных последующих анализов. Несмотря на то, что наивные Т-клетки вряд ли будут обнаружены в легких, мы считаем, что этот протокол будет особенно полезен для изучения собственных антиген-специфических Т-клеток и Trm в легких.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Обзор рабочего процесса протокола. Легкие собирают у мышей и диссоциируют на отдельные клетки. Образцы затем обогащают для Т-клеток перед окрашиванием тетрамисами пептида:МНС и флуоресцентно меченными антителами для проточного цитометрического анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Процедуры, описанные в этом протоколе, одобрены и разработаны в соответствии с руководящими принципами, изложенными Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) Массачусетской больницы общего профиля, программой по содержанию животных, аккредитованной Американской ассоциацией по аккредитации ухода за лабораторными животными (AAALAC). Эксперименты проводились на 8-12-недельных самцах и самках мышей с генетическим фоном C57BL/6, выращенных и содержащихся в животноводческом хозяйстве MGH в специфических условиях, свободных от патогенов.

1. Приготовление исходных растворов

  1. Приготовьте буфер HEPES, растворив 10 мМ HEPES, 5 мМ KCl, 1,8 мМ CaCl2, 150 мМ NaCl и 1 мМ MgCl2, и доведите до pH 7,4.
  2. Приготовьте 10-кратный стоковый раствор либеразы, растворив 700 мкг/мл термолизиновой среды (ТМ) либеразы (см. Таблицу материалов) в сбалансированном солевом растворе Хэнка с Ca++ и Mg++ (см. Таблицу материалов).
  3. Приготовьте 10-кратный стоковый раствор аминогуанидина, растворив 100 мМ соли аминогуанидина гемисульфата (см. Таблицу материалов) в сбалансированном солевом растворе Хэнка с Ca++ и Mg++ (см. Таблицу материалов).
  4. Приготовьте полную среду Eagle's Ham's Aminoacids (EHAA), смешав среду EHAA (см. Таблицу материалов) с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 100 Ед/мл пенициллина/стрептомицина, 50 мкг/мл гентамицина, 2 мМ L-глутамина и 55 мкМ 2-меркаптоэтанола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно использовать другие распространенные среды для Т-клеток, такие как RPMI или DMEM.
  5. Приготовьте буфер для сортировщика, смешав 1x PBS с 2% FBS и 0,05% азидом натрия.
  6. Приготовьте Fc-блок, разбавив очищенное антитело против мыши CD16/32 (см. Таблицу материалов) при 1:100 v/v в буфере сортировщика.
  7. Приготовьте раствор для разложения Либераза ТМ/ДНКаза путем добавления 100 мкг/мл Либеразы ТМ и 50 мкг/мл ДНКазы I (см. Таблицу материалов) в среду RPMI 1640 без L-глютамина (см. Таблицу материалов).
  8. Приготовьте смесь кетамина/ксилазина, добавив 10 мг/мл кетамина (см. Таблицу материалов) и 1 мг/мл ксилазина (см. Таблицу материалов) в обычный физиологический раствор (0,9% NaCl) (см. Таблицу материалов).

2. Генерация суспензии одиночных клеток из легочной ткани с помощью автоматического диссоциатора тканей

  1. Для каждой мыши приготовьте 4 мл ледяного буфера HEPES в специализированной пробирке для диссоциации тканей (см. Таблицу материалов) и держите его на льду.
  2. Обезболивание мышей путем внутрибрюшинного введения 150-200 мкл смеси кетамина/ксилазина. Введите 1-3 мкг флуорофор-конъюгированного антитела против мыши CD45 (см. Таблицу материалов), разведенного в 100 мкл физиологического раствора, внутривенно каждой мыши, находящейся под наркозом. Усыпить мышь через 3 минуты после введения антител с внутрибрюшинным введением 500-600 мкл смеси кетамина/ксилазина.
  3. Резецируйте легкие и поместите их в соответствующие тканевые диссоциаторные трубки, охлажденные на льду. Поместите трубки на автоматический тканевый диссоциатор (см. Таблицу материалов) и запустите первую программу (предустановленную программу) для легочной ткани.
  4. Добавьте 500 мкл стокового раствора либеразы и 500 мкл стокового раствора аминогуанидина в каждую пробирку, содержащую диссоциированную легочную ткань. Выдерживать на смесителе в течение 30 минут при температуре 37 °C.
  5. Поместите трубки обратно на диссоциатор и запустите вторую программу (предустановленную программу) для легочной ткани.
  6. Вылейте одноклеточную суспензию из пробирки для диссоциатора тканей через клеточный фильтр 100 мкм (см. Таблицу материалов) в коническую пробирку объемом 50 мл. Промойте пробирку для диссоциатора тканей 5 мл полной EHAA (или любой эквивалентной Т-клеточной среды) и пропустите через ситечко в пробирку объемом 50 мл.
  7. Снимите ситечко и увеличьте объем клеточной суспензии до 50 мл с помощью полного EHAA. Центрифугируйте клеточную суспензию при 400 x g в течение 5 мин при 4 °C. Осторожно отсасывайте надосадочную жидкость, оставляя после себя примерно 100 мкл надосадочной жидкости и клеточной гранулы.
  8. Добавьте примерно 100 μL раствора Fc Block, чтобы довести общий объем до 200 μL и энергично завихрите, чтобы повторно суспендировать гранулу.

3. Альтернативный протокол: получение суспензии одиночных клеток из легочной ткани путем ручной диссоциации

  1. Для каждой мыши приготовьте 1 мл полной EHAA в микрофуге объемом 1,5 мл и держите на льду.
  2. Обезболивание мышей путем внутрибрюшинного введения 150-200 мкл смеси кетамина/ксилазина. Введите 1-3 мкг флуорофор-конъюгированного антитела против мыши CD45, разведенного в 100 мкл нормального физиологического раствора, внутривенно каждой мыши, находящейся под наркозом. Усыпить мышь через 3 минуты после введения антител с внутрибрюшинным введением 500-600 мкл смеси кетамина/ксилазина.
  3. Резецируйте легкие и поместите их в соответствующую микрофужную пробирку объемом 1,5 мл, охлажденную на льду.
  4. После того, как все легкие будут собраны, перенесите каждое легкое в свежую микрофугальную пробирку без какой-либо клеточной среды.
  5. Разрежьте легкие на мелкие фрагменты (кусочки ~2-3 мм) с помощью ножниц внутри микрофуговой пробирки.
  6. Добавьте в каждую тюбик по 1 мл коктейля для пищеварения Liberase TM/DNase I.
  7. Выдерживать 30 минут при температуре 37 °C на водяной бане. После этого верните образцы на лед, чтобы предотвратить переваривание.
  8. Налейте образец через сетчатое фильтр размером 100 мкм, помещенное поверх конической пробирки объемом 50 мл. Разомните ткань о сетку резиновым концом поршня из стерильного шприца объемом 1 мл.
  9. Промойте сетчатое фильтр с помощью буфера холодного сортировщика, собрав итоговый объем 7 мл в пробирке. Центрифугируйте клеточную суспензию при 400 x g в течение 5 мин при 4 °C. Осторожно отсасывайте надосадочную жидкость, оставляя примерно 100 мкл надосадочной жидкости и клеточной гранулы.
  10. Добавьте 100 μL раствора Fc Block, чтобы довести общий объем до 200 μL и энергично завихрите, чтобы ресуспендировать гранулу.

4. Обогащение образца легких на Т-клетки с помощью магнитных шариков

  1. Добавьте 50 мкл микрогранул CD90.2, противомышиных (см. Таблицу материалов). Вдохните и инкубируйте в течение 10 минут при 4 °C.
    Примечание: CD90.2 соответствует аллелю, экспрессируемому Т-клетками у мышей C57BL/6. Проверьте аллельный генотип, если используются другие линии мышей.
  2. Тем временем поместите парамагнитную разделительную колонку (см. Таблицу материалов) на одно- или четырехпозиционный разделительный магнит (см. Таблицу материалов). Поместите открытую коническую трубку объемом 15 мл под каждую колонну, чтобы улавливать поток. Заправьте колонну 3 мл буфера для холодной сортировки, чтобы колонна могла стекать под действием силы тяжести в коническую трубу внизу.
  3. После того, как клетки инкубируются с микрогранулами в течение 10 минут, добавьте холодный сортировочный буфер объемом 1 мл и пропустите через клеточное сетчатое фильтр размером 100 мкм, расположенное на вершине колонки. Соберите поток из колонны в свежую коническую трубку объемом 15 мл, расположенную ниже колонны.
  4. После того, как клеточная суспензия полностью прососалась через колонну под действием силы тяжести, промойте колонку, промыв исходную пробирку дополнительными 3 мл холодного буфера сортировщика и нанеся его на колонну через сетку, тем самым промыв сетчатое фильтр. Снимите ситечко.
  5. Когда образец снова полностью стекает в колонку и больше не будет протекать из колонки, снимите колонку с магнита и поместите ее на свежую коническую пробирку объемом 15 мл.
  6. Добавьте в колонку 5 мл буфера холодного сортировщика.
  7. Немедленно элюируйте ячейки, связанные с колонной, одним непрерывным движением вдавливая поршень колонны в верхнюю часть и выталкивая буфер сортировщика из нижней части колонны в новую трубку.
  8. Центрифугируйте элюированные образцы при давлении 400 x g в течение 5 мин при 4 °C. Осторожно отсасывайте надосадочную жидкость, оставляя после себя примерно 100 мкл надосадочной жидкости и клеточной гранулы.
  9. Добавьте 100 μL буфера для холодной сортировки, чтобы довести общий объем до 200 μL и энергично завихрите, чтобы повторно суспендировать гранулу.
  10. При необходимости проанализируйте проточный образец, содержащий несвязанную фракцию клетки.

5. Окрашивание антиген-специфических Т-клеток тетрамерами пептид:МНС

  1. Добавьте 1 мкл 10 мкМ дазатиниба (см. Таблицу материалов) в каждый образец, вихрь и инкубируйте в течение 5 мин при RT.
  2. Добавьте PE- или APC-конъюгированный пептид:тетрамер MHC до конечной концентрации 10 нМ (или эмпирически оптимизированной концентрации для данного тетрамера).
  3. Сделайте вихрь и инкубируйте в темноте в течение 1 ч при RT (или эмпирически оптимизированном времени и температуре).

6. Анализ меченных тетрамером Т-клеток с помощью проточной цитометрии

  1. В то время как образец окрашивается тетрамеров пептида:МНС, готовят мастер-смесь антител для окрашивания поверхностных маркеров клеток (табл. 1).
    Примечание: Избегайте флуорофонов, которые конфликтуют с внутривенно вводимыми антителами к CD45 или тетрамерами.
  2. За 15 минут до окончания инкубационного периода для окрашивания тетрамером добавьте поверхностную смесь антител в соотношении 1:100 (или эмпирически оптимизированной концентрации) к каждому образцу.
  3. Продолжайте инкубацию в темноте в RT в течение оставшейся части 1-часового инкубационного периода.
  4. Добавьте 50 000 шариков проточной цитометрии (см. Таблицу материалов) и добавьте буфер холодного сортировщика до конечного объема около 5 мл. Центрифугируйте окрашенный образец при 400 x g в течение 5 минут при 4 °C. Осторожно отсасывайте надосадочную жидкость, оставляя после себя около 100 μл надосадочной жидкости и клеточных/гранулированных гранул.
  5. Повторно суспендируйте образец с помощью дополнительного буфера для сортировки объемом 200 мкл и перенесите образец в пробирку для сортировки флуоресцентных активированных клеток (FACS) объемом 5 мл.
  6. Проанализируйте образец на проточном цитометре. Соберите как можно больше ячеек, максимум до 2 500 000 событий. Убедитесь, что собрано не менее 20 000 событий с количеством бусин. Поддерживайте скорость привлечения на уровне 5 000 событий в секунду или ниже.
  7. Сохраните все данные в виде файлов FCS.

  

ФлуорохромАнтитело
БУВ395КД90.2
Тихоокеанский синийCD45 (добавлен ранее при внутривенном введении)
Тихоокеанский апельсинСД8
Бриллиантовый фиолетовый 785СД4
ФИТКCD3
ПерХП-Cy5.5Дамп (B220, CD11b, CD11c, F4/80)
ПЭТетрамер pMHC или фенотипический маркер
ПЭ-CY7Фенотипический маркер (например, CD44, PD-1, CD69 и т.д.)
БТРТетрамер pMHC или фенотипический маркер
АлексаФлюор 700Фенотипический маркер (например, CD44, PD-1, CD69 и т.д.)
БТР-CY7Живое/мертвое пятно

Таблица 1: Образец матрицы окрашивания. Типичная панель антител флуорофор-конъюгированной проточной цитометрии, используемая для идентификации и характеристики антиген-специфических Т-клеток.

7. Анализ данных

  1. Проанализируйте файлы данных FCS с помощью соответствующего программного обеспечения для проточной цитометрии.
    1. Установите последовательность последовательных ворот включения, чтобы идентифицировать 1) лимфоцитоподобные, 2) одиночные, 3) живые, 4) экстраваскулярные, 5) дамп-отрицательные и 6) CD90.2-положительные события, которые являются либо CD4, либо CD8-положительными (рис. 2).
    2. Определите тетрамер-положительные Т-клетки в этих популяциях.
  2. Определите абсолютное количество тетрамеров-положительных клеток, рассчитав отношение добавленных гранул (50 000) к количеству гранул, собранных во время выборки, и умножив это значение на общее количество собранных тетрамеров-положительных клеток.
    figure-protocol-1

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 2 показана репрезентативная стратегия гейтирования, используемая при идентификации редких антиген-специфичных CD4+ Т-клеток в легких с тетрамеров класса II пептид:МНС. Тот же процесс может быть применен к антиген-специфичным CD8+ Т-клеткам с тетрамеров класса I пептид:МНС (данные не показаны).

Из-за большого количества нелимфоидных клеток в легких, надежное обнаружение редких антиген-специфичных Т-клеток тетрамером требует некоторой формы предварительного обогащения интересующих Т-клеток для улучшения соотношения сигнал/шум. На рисунке 3 показана эффективность магнитного обогащения общего количества Т-клеток из легочной ткани на основе антител CD90.2, которое мы описали в этом протоколе. В среднем, мы извлекаем более 99% всех CD90.2+ Т-клеток из легких с чистотой более 90% с помощью этого процесса обогащения. На рисунке 4 показано улучшенное обнаружение редких тетрамеров-положительных CD4+ Т-клеток в результате этого обогащения по сравнению с отсутствием обогащения или прямой стратегией обогащения клеток на основе тетрамеров.

На рисунке 5 показано улучшенное мечение тетрамером антиген-специфических Т-клеток, обработанных дазатинибом, особенно в редких популяциях.

figure-results-1
Рисунок 2: Стратегия стробирования для анализа проточной цитометрии. Последовательные ворота включения и исключения используются для идентификации редких собственных антиген-специфичных CD4+ Т-клеток, которые накапливаются в легких после острого повреждения тканей. Счетные бусины могут быть идентифицированы непосредственно на основе их флуоресценции вдоль канала FITC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 3: Магнитное обогащение общего количества Т-клеток в легких на основе антител CD90.2. Показаны репрезентативные графики проточной цитометрии для несвязанной (слева) и связанной (справа) фракций образца легкого после обогащения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 4: Сравнение стратегий обогащения клеток для обнаружения редких антиген-специфических Т-клеток в легких. Три мыши, экспрессирующие модельный собственный антиген в эпителии легких, были иммунизированы подкожно пептидным эпитопом из собственного антигена, эмульгированного в Complete Freund's Adjuvant (CFA). Через 7 дней легкие мышей собирали, объединяли и разделяли на три равных образца для окрашивания тетрамером после отказа от обогащения клеток (слева), обогащения клеток на основе антител CD90.2 (в центре) или обогащения клеток на основе тетрамера (справа). Образцы анализировали методом проточной цитометрии на предмет не более 1 500 000 событий (показаны CD4+ гейтированные события). Количество тетрамеров-положительных событий отмечено черным цветом, в то время как вычисленное общее количество антиген-специфических Т-клеток в образцах легких обозначено красным цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 5: Лечение дазатинибом усиливает окрашивание тетрамерами. Мышам дикого типа (слева) или мышам, экспрессирующим модельный собственный антиген в эпителии легких (справа), подкожно иммунизировали пептидным эпитопом из собственного антигена, эмульгированного в ЦФА. Селезенку и лимфоидные органы мышей собирали, объединяли и разделяли на два равных образца для мечения пептидом:тетрами MHC класса II с предварительной обработкой дазатинибом или без нее. Гистограммы окрашивания тетрамером накладывают друг на друга, сравнивая образцы, обработанные (красным) и без (синий) дазатинибом. Указывается медиана интенсивности флуоресценции каждого образца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Предыдущая характеристика антиген-специфических Т-клеток из легких выиграла от значительного количества антиген-специфических Т-клеток, которые расширяются после острого прайминг-события, такого как интраназальная иммунизация или инфекция 20,21,22. Тем не менее, более редкие популяции Т-клеток в легких, такие как собственные антиген-специфические Т-клетки или тканевые резидентные Т-клетки памяти, трудно обнаружить без некоторой формы обогащения образцов для интересующих Т-клеток 15,16,23. Мы достигли этой цели, объединив ранее описанные методы диссоциации легочной ткани для получения высокого процента жизнеспособных лимфоцитов24,25 со стратегией дифференциации внутрисосудистых Т-клеток от паренхиматозных и общим процессом обогащения Т-клеток с последующим окрашиванием тетрамером17. Используя этот протокол, мы продемонстрировали возможность идентификации и характеристики редких Т-клеток, специфичных к собственным антигенам в легких, возникающим в ответ на прямую иммунизацию экзогенным пептидом или непрямую активацию от высвобождения антигена во время повреждения тканей15,16. При разработке этого протокола был учтен ряд соображений.

Мы описали два различных протокола обработки легочной ткани, которые хорошо зарекомендовали себя. Один из них включает в себя использование автоматизированного инструмента для диссоциации тканей, в то время как другой основан на ручном процессе. Важно отметить, что в обоих методах используется Liberase TM, смесь коллагеназы I и II, которая также содержит термолизин металлопротеазы. Было продемонстрировано, что эта смесь ферментов повышает пищеварительную активность по сравнению с одним коктейлем коллагеназы и хорошо работает с восстановлением лейкоцитов из легочной ткани26.

Автоматизированный протокол диссоциации тканей требует больших первоначальных затрат на аппарат и специализированные трубки для диссоциации тканей, но пробирки можно мыть и повторно использовать вместе с клеточными фильтрами, которые также, как правило, можно использовать повторно. Протокол ручной диссоциации не влечет за собой первоначальных затрат на специализированное оборудование, но является трудоемким и продлевает сбор урожая, так как каждый образец измельчается индивидуально. Существуют и другие различия между протоколами, касающимися использования аминогуанидина или ДНКазы I для ограничения гибели клеток и их сливания, но мы не проводили тщательного сравнения влияния этих добавок. Решение об использовании того или иного протокола должно зависеть от личного опыта в проводимом типе исследования, а также от наличия автоматизированного инструмента для диссоциации тканей, который будет представлять собой самый большой фактор стоимости. Действительно, элементы двух протоколов могут быть смешаны и сопоставлены для обеспечения наилучшей производительности в соответствии с конкретными потребностями исследования.

Упомянутый выше протокол в значительной степени исключает использование градиента плотности для выделения лимфоцитов из одноклеточной суспензии, полученной в результате диссоциации тканей. Мы обнаружили, что этап магнитного обогащения Т-клеток, необходимый для идентификации редких антиген-специфических Т-клеток, устраняет этот этап. Тем не менее, в случаях, когда частоты антиген-специфичных Т-клеток достаточно высоки, чтобы полностью исключить необходимость в этапе обогащения Т-клеток, рекомендуется использовать градиент плотности, поскольку он обеспечит значительное обогащение клеток-мишеней за счет удаления большого количества нелимфоидных клеток. Кроме того, если препараты одноклеточных клеток легких особенно велики и/или беспорядочны, перед магнитным обогащением можно использовать этап градиента плотности для удаления избыточного клеточного мусора, который впоследствии может закупорить колонки (этапы 4.4-4.7).

Мы выбрали общее обогащение всех Т-клеток на основе маркера Т-клеток CD90 (CD90.2 для аллеля, экспрессируемого у мышей C57BL/6), а не более прямую стратегию обогащения клеток на основе тетрамеров. Это дает ряд преимуществ. (1) Обогащение на основе CD90 приводит к большему числу антиген-специфических событий, обнаруживаемых при проточной цитометрии, чем при обогащении образцов без обогащения или на основе тетрамеров (рис. 4). Это способствует более точным оценкам частот редких антиген-специфических Т-клеток без необходимости сбора чрезмерного количества общих событий (>2 500 000), что продлевает время сбора образцов и ухудшает разрешение сигнал/шум. (2) В отличие от обогащения на основе тетрамеров, обогащение на основе CD90 позволяет оценить весь компартмент Т-клеток легкого, включая CD4+ и CD8+ Т-клетки, внутрисосудистые и внесосудистые Т-клетки, антиген-специфические и антиген-неспецифические, все в одном образце (рис. 2). (3) Поскольку стадия обогащения на основе CD90 происходит до окрашивания тетрамером, она сводит к минимуму время до того, как меченные тетрамером клетки будут проанализированы на проточном цитометре, тем самым ограничивая потенциальную потерю сигнала от отслойки тетрамера.

Процесс обогащения Т-клеток в этом протоколе основан на положительном отборе с помощью магнитных гранул CD90.2, но аналогичные результаты могут быть достигнуты с помощью стратегий негативного отбора, обеспечиваемых наборами для выделения CD4, CD8 или pan T-клеток. Мы описываем использование микрошариков, колонок и магнитов определенной марки, но должны работать и другие системы магнитного обогащения. Опять же, решения должны основываться на результатах конкретного проводимого исследования, а также на общих затратах, которые могут быть существенными. По нашему опыту работы с протоколами обогащения, существует общий компромисс между выходом клеток-мишеней и их чистотой, и для целей обнаружения крайне ограниченного числа антиген-специфичных Т-клеток выход имеет приоритет.

В то время как репрезентативные результаты показывают эксперименты с участием CD4+ Т-клеток и тетрамеров пептида:МНС класса II, этот протокол столь же эффективен для CD8+ Т-клеток и тетрамеров пептида:МНС класса I. В таких случаях следует учитывать потенциально иные условия, требуемые для окрашивания тетрамером класса I (концентрация, время, температура). Более того, мы не видим причин, препятствующих его использованию для антиген-специфических исследований В-клеток с соответствующими реагентами В-клеток, меченными флуорохромом27.

Наконец, описанный здесь протокол включает добавление ингибитора протеинкиназы дазатиниба в образец перед окрашиванием тетрамером. Дазатиниб блокирует передачу сигналов TCR и интернализацию, что улучшает мечение Т-клеток тетрамером, а также потенциальноснижает индуцированную тетрамером гибель Т-клеток. Мы обнаружили пользу лечения дазатинибом наиболее заметной в выявлении более редкой популяции собственных антигенов. Вероятно, это связано с тем, что собственные антиген-специфические Т-клетки экспрессируют более низкое сродство TCR из-за эффектов отрицательного отбора во время центральной толерантности 28,29,30,31.

Используемый здесь протокол был успешно объединен с протоколами внутриклеточного окрашивания для анализа транскрипционного фактора и экспрессии цитокинов в редких Т-клетках, резидентных в легких. Мы также успешно отсортировали эти редкие популяции для последующего анализа, включая транскриптомику одиночных клеток и секвенирование TCR. Дальнейшее использование и развитие этого протокола должно принести большую пользу исследованиям адаптивного иммунитета в патофизиологии легких.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет никаких противоречий для раскрытия.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Л. Куна за техническую помощь в обработке тканей и производстве тетрамеров. Эта работа финансировалась Национальными институтами здравоохранения (R01 AI107020 и P01 AI165072 к J.J.M., T32 AI007512 к D.S.S.), Массачусетским консорциумом по готовности к патогенам (J.J.M) и Исполнительным комитетом по исследованиям Массачусетской больницы общего профиля (J.J.M.).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
100 мм ячеистый фильтрFisher Scientific22-363-549
10x PBS без Ca++ или Mg++Corning46-013-CM
1x PBS без Ca++ или Mg++Corning21-031-CV
AccuCheck Счетные бусиныInvitrogenPCB100
Аминогуанидин Гемисульфат СольSigma-AldrichA7009
CD90.2 микрогранулы, мышьMiltenyi130-121-278
Магнит для разделения клеток (Сепаратор MidiMACS)Miltenyi130-042-302Удерживает одну колонку LS
Магнит для разделения клеток (QuadroMACS Separator)Miltenyi130-090-976Удерживает 4 колонки LS
ДазатинибSigma-AldrichCDS023389
DNase iRoche10104159001
Eagle' s Ham' s Аминокислотная средаSigma-AldrichC5572
gentleMACSMiltenyi130-093-235Автоматический диссоциатор тканей
gentleMACS C TubesMiltenyi130-093-237Автоматический диссоциатор тканей
Hank's Balanced Salt Solution with Ca++ или Mg++Corning21-020-CM
HEPESGibco15630080
КетаминVedcoNDC 50989-996-06
Liberase TMRoche5401119001
Антитело против мыши CD45 Pacific Blue (клон: 30-F11)Biolegend103126
Парамагнитные колонки для разделения клеток (LS Columns)Miltenyi130-042-401Поставляется с поршенем
Очищенный против мыши Антитело к CD16/32 (клон: 93)Среда Biolegend101302
RPMI 1640 без L-глутаминаCorning15-040-CM
Sodium Chloride 0,9% (нормальный физиологический раствор)CytivaZ1376
XylazinePivetalNDC 466066-750-02

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).
  2. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  3. Crawford, F., Kozono, H., White, J., Marrack, P., Kappler, J. Detection of antigen-specific T cells with multivalent soluble class II MHC covalent peptide complexes. Immunity. 8 (6), 675-682 (1998).
  4. Nepom, G. T., et al. HLA class II tetramers: tools for direct analysis of antigen-specific CD4+ T cells. Arthritis Rheum. 46 (1), 5-12 (2002).
  5. Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
  6. Moon, J. J., et al. Tracking epitope-specific T cells. Nat Protoc. 4 (4), 565-581 (2009).
  7. Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. J Immunol. 188 (9), 4135-4140 (2012).
  8. Moon, J. J., et al. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).
  9. Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection. Immunity. 28 (6), 859-869 (2008).
  10. Kotturi, M. F., et al. Naive precursor frequencies and MHC binding rather than the degree of epitope diversity shape CD8+ T cell immunodominance. J Immunol. 181 (3), 2124-2133 (2008).
  11. Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells. J Vis Exp. (68), e4420(2012).
  12. Szabo, P. A., Miron, M., Farber, D. L. Location, location, location: Tissue resident memory T cells in mice and humans. Sci Immunol. 4 (34), 9673(2019).
  13. Poon, M. M. L., et al. Tissue adaptation and clonal segregation of human memory T cells in barrier sites. Nat Immunol. 24 (2), 309-319 (2023).
  14. Zheng, M. Z. M., Wakim, L. M. Tissue resident memory T cells in the respiratory tract. Mucosal Immunol. 15 (3), 379-388 (2022).
  15. Legoux, F. P., et al. CD4+ T cell tolerance to tissue-restricted self antigens is mediated by antigen-specific regulatory T Cells rather than deletion. Immunity. 43 (5), 896-908 (2015).
  16. Shin, D. S., et al. Lung injury induces a polarized immune response by self-antigen-specific CD4(+) Foxp3(+) regulatory T cells. Cell Rep. 42 (8), 112839(2023).
  17. Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nat Protoc. 9 (1), 209-222 (2014).
  18. Vig, M., et al. Inducible nitric oxide synthase in T cells regulates T cell death and immune memory. J Clin Invest. 113 (12), 1734-1742 (2004).
  19. Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
  20. Hogan, R. J., et al. Protection from respiratory virus infections can be mediated by antigen-specific CD4(+) T cells that persist in the lungs. J Exp Med. 193 (8), 981-986 (2001).
  21. Hogan, R. J., et al. Activated antigen-specific CD8+ T cells persist in the lungs following recovery from respiratory virus infections. J Immunol. 166 (3), 1813-1822 (2001).
  22. Zhao, J., et al. Airway memory CD4(+) T cells mediate protective immunity against emerging respiratory coronaviruses. Immunity. 44 (6), 1379-1391 (2016).
  23. Hondowicz, B. D., et al. Interleukin-2-dependent allergen-specific tissue-resident memory cells drive asthma. Immunity. 44 (1), 155-166 (2016).
  24. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. J Vis Exp. (29), e1266(2009).
  25. Faustino, L. D., et al. Interleukin-33 activates regulatory T cells to suppress innate gammadelta T cell responses in the lung. Nat Immunol. 21 (11), 1371-1383 (2020).
  26. Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies. Methods Mol Biol. 1784, 69-76 (2018).
  27. Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
  28. Naeher, D., et al. A constant affinity threshold for T cell tolerance. J Exp Med. 204 (11), 2553-2559 (2007).
  29. Moon, J. J., et al. Quantitative impact of thymic selection on Foxp3+ and Foxp3- subsets of self-peptide/MHC class II-specific CD4+ T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (35), 14602-14607 (2011).
  30. Koehli, S., Naeher, D., Galati-Fournier, V., Zehn, D., Palmer, E. Optimal T-cell receptor affinity for inducing autoimmunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (48), 17248-17253 (2014).
  31. Zhang, Z., Legoux, F. P., Vaughan, S. W., Moon, J. J. Opposing peripheral fates of tissue-restricted self antigen-specific conventional and regulatory CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 50 (1), 63-72 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи