Методическая статья

Получение одноклеточной суспензии эпителиальных клеток тимуса мыши и окрашивание внутриклеточных молекул для проточного цитометрического анализа

DOI:

10.3791/66945

⸱

26 июля 2024 г.

 ,  ,  ,  , 
1Thymus Biology Section, Experimental Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Flow Cytometry Facility, Experimental Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем протоколы приготовления одноклеточной суспензии эпителиальных клеток тимуса мыши и окрашивания внутриклеточных молекул для проточного цитометрического анализа.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эпителиальные клетки тимуса (TEC) играют важную роль в содействии развитию и отбору репертуара Т-клеток. Корковые ТЭК (цТЭК) в коре тимуса индуцируют раннее развитие Т-клеток и положительный отбор корковых тимоцитов. Напротив, медуллярные ТЭО (мТЭК) в мозговом веществе тимуса привлекают положительно отобранные тимоциты из коры головного мозга и обеспечивают самотолерантность в Т-клетках. Различные молекулы, в том числе DLL4 и beta5t, экспрессируемые в цТЭК, а также Aire и CCL21, экспрессируемые в мТЭК, способствуют функции тимуса, поддерживая развитие и отбор Т-клеток. Проточный цитометрический анализ функционально значимых молекул в цТЭО и мТЭЦ полезен для улучшения нашего понимания биологии ТЭО, даже несмотря на то, что современные методы получения суспензий одиночных клеток ТЭО могут получить только небольшую часть ТЭМ (примерно 1% для цТЭО и примерно 10% для мТЭЦ) из тимуса молодых взрослых мышей. Поскольку многие из этих функционально значимых молекул в ТЭО локализованы в клетках, мы описываем наши протоколы приготовления суспензии одиночных клеток мышиных ТЭО и окрашивания внутриклеточных молекул для проточного цитометрического анализа.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Тимус - это эпителиальный мезенхимальный орган, который способствует развитию и выбору репертуара Т-лимфоцитов. В корковом и медуллярном микроокружении в тимусе эпителиальные клетки тимуса (ТЭК) играют решающую роль в управлении развитием и отбором Т-клеток. Общепризнано, что корковые ТЭО (цТЭК) в коре тимуса в первую очередь способствуют индукции раннего развития Т-клеток и положительному отбору вновь сгенерированных тимоцитов, экспрессирующих антиген-рецептор Т-клеток (TCR). В противоположность этому, медуллярные ТЭК (mTEC) в мозговом веществе тимуса необходимы для привлечения положительно отобранных тимоцитов из коры головного мозга и установления центральной самотолерантности путем элиминации самореактивных Т-клеток и генерации регуляторных Т-клеток1,2. Эти функции ТЭК в поддержке развития и отбора Т-клеток опосредованы различными молекулами, экспрессируемыми в цТЭЦ и мТЭК.

К ним относятся дельта-подобный лиганд 4 (DLL4), важный для спецификации Т-клеточной линии лимфоидных предшественников)3,4, beta5t (также известный как Psmb11, важный для положительного отбора CD8 Т-клеток)5,6, и Prss16 (также известный как специфичная для тимуса сериновая протеаза, или TSSP, важная для положительного отбора CD4 Т-клеток)7,8 экспрессируется в cTECs, и аутоиммунный регулятор (Aire, важен для беспорядочной экспрессии собственных генов)9,10, семейство Fez цинковый палец 2 (Fezf2, важен для беспорядочной экспрессии Aire-независимых самогенов и генерации клеток тимуса)11,12,13,14и C-C мотив хемокинового лиганда 21 (CCL21, важный для медуллярной миграции и накопления положительно отобранных тимоцитов)14,15,16 экспрессируется в mTECs. Проточная цитометрия предоставляет средства для количественного обнаружения этих функционально значимых молекул в ПЭС, облегчая оценку как развития, так и функции цТЭО и мТЭК. Поскольку многие молекулы в ТЭО в основном экспрессируются внутри клеток, например, в цитоплазме (например, компонент протеасомы бета5т) и ядре (например, регулятор транскрипции Aire), предпочтительным является количественный анализ внутриклеточных молекул в цТЭО и мТЭЦ с использованием проточной цитометрии.

TECs редко встречаются в тимусе. Самка мыши в возрасте 5 недель имеет примерно 1 × 106 цТЭО и примерно 2,5 × 106 мТЭК, в то время как кора тимуса содержит примерно 3 × 108 CD4+CD8+ тимоцитов, а мозговое вещество тимуса содержит примерно 5 ×10 7 CD4+CD8- и CD4-CD8+ тимоцит<ов класса = "xref">17. Таким образом, подавляющее большинство (>99%) клеток тимуса являются кроветворными клетками, включая тимоциты, а не ТЭО у молодых взрослых мышей. Кроме того, ТЭО тесно связаны с соседними клетками (например, тимоцитами) и архитектурными внеклеточными компонентами (например, коллагеном) в пределах тимуса, поэтому высвобождение ТЭО в клеточную суспензию требует протеазного переваривания тимуса. Традиционные методы ферментативного сбраживания дают лишь небольшую долю ТЭО; примерно 1% (1 × 104) и 10% (2 × 105) для cTEC и mTEC, соответственно, от 5-недельной мыши thymus17,18,19. Низкая эффективность высвобождения ТЭО из тимуса, вероятно, связана с восприимчивостью ТЭК к протеолитическим ферментам и механическим воздействиям, а также с тесной ассоциацией ТЭО с соседними клетками, особенно между цТЭО и CD4+CD8+ тимоцитами20. В связи с этим результаты одноклеточного анализа мышиных ТЭК, включая проточный цитометрический анализ и анализ секвенирования РНК одиночных клеток, основанные на современных методах ферментативного ферментативного грануляторного препарирования клеток, являются репрезентативными лишь для небольшой части ТЭО и, следовательно, далеки от полноты. Тем не менее, несмотря на такие ограничения в ферментативном извлечении ТЭС, проточный цитометрический анализ ТЭО мышей в суспензии одиночных клеток по-прежнему полезен для количественного анализа функционально значимых молекул в цТЭО и мТЭС. В клеточной суспензии ТЭО были определены как клетки, положительные на эпителиальную поверхностную молекулу EpCAM (CD326) и отрицательные на поверхностную молекулу гемопоэтической клетки CD45. В пределах EpCAM+CD45-TECs уровни экспрессии на клеточной поверхности молекул Ly51 (также известных как BP-1 и CD249) и связывающей способности агглютинина I Ulex Europaeus (UEA1) (в первую очередь связывания с гликопротеинами и гликолипидами, содержащими α-связанную фукозу) были использованы для фенотипической маркировки цТЭИ (Ly51высокийуровень UEA1) и мТЭЦ (Ly51низкий уровеньUEA1высокий). В данной статье мы описываем наши экспериментальные протоколы традиционного приготовления одноклеточной суспензии мышиных ТЭО и окрашивания внутриклеточных молекул для проточного цитометрического анализа, уделяя особое внимание количественному анализу внутриклеточных молекул бета5т, CCL21 и Aire в свежеприготовленных мышиных ТЭС.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты на мышах проводились с одобрения Комитета по уходу за животными и их использованию Национального института рака (ASP21-431, ASP21-432 и EIB-076-3).

1. Приготовление суспензии клеток тимуса

ПРИМЕЧАНИЕ: Онтогенез мышей влияет на эффективность ферментативного высвобождения ТЭИ из тимуса. Ниже описаны три метода в зависимости от возраста мыши.

  1. Для постнатальных мышей старше 3 недель
    1. Соберите тимьян (две доли тимуса) с одной мыши. Поместите вилочковую железу в 5 мл RPMI1640 содержащей 10 мл HEPES в пластиковую посуду диаметром 60 мм на льду.
    2. Удалите кровь, ткани, не относящиеся к тимусу, и жир с помощью изогнутого пинцета с тонким концом под препарирующим микроскопом. Разрежьте вилочковую железу на небольшие кусочки (размером примерно 1-2 мм) ножницами для препарирования.
    3. Переложите кусочки тимуса в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 3 мл 1 мг/мл коллагеназы/диспазы и 1 ЕД/мл раствора ДНКазы в RPMI1640, содержащую 2% фетальную бычью сыворотку (FBS). Выдерживать на водяной бане или в термоблоке при температуре 37 °C в течение 20 минут.
    4. Аккуратно перемешайте с помощью пластиковой передаточной пипетки объемом 3 мл. Инкубируйте еще 20 минут в случае, если фрагменты тканей все еще видны.
    5. Аккуратно перемешайте с помощью пластиковой передаточной пипетки объемом 3 мл. Инкубируйте еще 10 минут в случае, если фрагменты ткани все еще видны.
    6. Аккуратно перемешайте с помощью пластиковой передаточной пипетки объемом 3 мл. Добавьте 5 мл 5 мМ ЭДТА в 1x HBSS, содержащий 1% FBS.
    7. Отфильтруйте клеточную суспензию через нейлоновую сетку толщиной 60 мкм в новую коническую пробирку объемом 50 мл. Центрифугирование клеточной суспензии при 350 × г при 4 °C в течение 5 мин.
    8. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 10 мл буфера FACS (1x HBSS, содержащий 1% бычьего сывороточного альбумина [BSA] и 0,1% NaN3).
    9. Храните клетки на льду и определяйте номера клеток с помощью счетчика клеток.
  2. Для новорожденных мышей в возрасте от 1 до 2 недель
    1. Выполните шаг 1.1.1.
    2. Удалите кровь и ткани, не относящиеся к тимусу, с помощью препарирующего пинцета под препарирующим микроскопом. Переложите тимус в пластиковую пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 200 мкл RPMI1640 с помощью 10 мМ HEPES и разрежьте тимус на небольшие кусочки (размером примерно 1-2 мм) с помощью ножниц.
    3. Дайте фрагментам тимуса осесть на дне пробирки, затем аккуратно удалите суспензию с помощью микропипетки объемом 200 мкл.
    4. Переложите кусочки тимуса в полипропиленовую пробирку с круглым дном объемом 5 мл, содержащую 2 мл 0,5 мг/мл коллагеназы/диспазы и 1 ед/мл раствор ДНКазы в RPMI1640, содержащем 2% FBS. Выдерживать на водяной бане или в термоблоке при температуре 37 °C в течение 10 минут.
    5. Аккуратно перемешайте с помощью пластиковой передаточной пипетки объемом 3 мл, а затем с помощью микропипетки объемом 1 мл с пластиковым наконечником для дальнейшей гомогенизации.
    6. Добавьте 2 мл 5 мМ ЭДТА в 1x HBSS, содержащий 1% FBS. Отфильтруйте клеточную суспензию через нейлоновую сетку толщиной 60 мкм в коническую пробирку объемом 50 мл. Добавьте 16 мл RPMI1640, содержащего 10 мМ HEPES.
    7. Центрифугировать клеточную суспензию 350 × г при 4 °C в течение 5 мин. Повторно суспендировать клеточную гранулу в 10 мл буфера FACS.
    8. Храните клетки на льду и определяйте номера клеток с помощью счетчика клеток.
  3. Для эмбриональных мышей и неонатальных мышей в возрасте до 1 недели
    1. Соберите тимьян (две доли тимуса) с одной мыши. Поместите тимус в пластиковую чашку диаметром 60 мм и удалите кровь, ткани, не относящиеся к тимусу, и жир с помощью изогнутого пинцета с тонким концом под препарирующим микроскопом.
    2. Поместите тимус в 0,2 мл RPMI1640, содержащего 10 мМ HEPES, в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Слейте жидкость с помощью микропипетки объемом 200 мкл.
    3. Добавьте 0,5 мл 0,5 мг/мл коллагеназы/диспазы и 1 ЕД/мл раствора ДНКазы в RPMI1640, содержащую 2% FBS. Выдерживать на водяной бане или в термоблоке при температуре 37 °C в течение 10 минут. Аккуратно перемешайте с помощью микропипетки объемом 1 мл с пластиковым наконечником.
    4. Добавьте 0,5 мл 5 мМ ЭДТА в 1x HBSS, содержащий 1% FBS. Отфильтруйте клеточную суспензию через нейлоновую сетку толщиной 60 мкм в новую коническую трубку объемом 15 мл. Добавьте 9 мл RPMI1640, содержащей 10 мМ HEPES.
    5. Центрифугируйте клеточную суспензию при 350 × г при 4 °C в течение 5 мин. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 1-3 мл буфера FACS.
    6. Храните клетки на льду и определяйте номера клеток с помощью счетчика клеток.
  4. Альтернативный метод: переваривание либеразы
    1. Выполните шаги 1.1.1 и 1.1.2.
    2. Дайте фрагментам тимуса осесть на дне пробирки, затем аккуратно удалите суспензию с помощью микропипетки объемом 200 мкл. Перенесите кусочки тимуса в 5 мл пробирки, содержащей 1 мл 0,5 ЕД/мл либеразы и 1 ЕД/мл ДНКазы в RPMI1640, содержащей 10 мМ HEPES. Выдерживать на водяной бане или в термоблоке при температуре 37 °C в течение 15 минут.
    3. Аккуратно перемешайте с помощью микропипетки объемом 1 мл с пластиковым наконечником. Инкубируйте еще 15 минут, если фрагменты ткани все еще видны.
    4. Аккуратно перемешайте с помощью микропипетки объемом 1 мл с пластиковым наконечником. Добавьте 1 мл 5 мМ ЭДТА в 1x HBSS, содержащий 1% FBS.
    5. Отфильтруйте клеточную суспензию через нейлоновую сетку толщиной 60 мкм в новую коническую пробирку объемом 50 мл. Добавьте 18 мл RPMI1640, содержащего 10 мМ HEPES.
    6. Центрифугируйте клеточную суспензию при 350 × г, 4 °C в течение 5 мин. Ресуспендируйте клетки в 10 мл буфера FACS (1x HBSS, содержащий 1% BSA и 0,1% NaN3).
    7. Храните клетки на льду и определяйте номера клеток с помощью счетчика клеток.

2. Окрашивание антителами клеток тимуса

  1. Поместите 16 × 106 клеток в полистирольную трубку с круглым дном объемом 5 мл. Центрифугируйте ячейки при 350 × г при 4 °C в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость.
  2. Добавьте 10 мкл рабочей концентрации моноклонального антитела к анти-Fc-рецептору (mAb, клон 2,4G2) в буфер FACS для блокирования неспецифического связывания окрашивающего IgG с Fc-рецептором клеточной поверхности. Выдерживать при температуре 4 °C в течение 5 минут.
  3. Добавьте по 40 мкл в каждую рабочую концентрацию анти-CD45 mAb (гемопоэтическая клеточно-специфичная; например, меченая BV421), анти-EpCAM mAb (эпителиально-клеточно-специфичная; например, меченая PE-Cy7), анти-Ly51 mAb (cTEC-детектирующая; например, меченая AF647) и агглютинин I Ulex europaeus (UEA-1) (детектирующая mTEC; например, меченая AF594) в буфер FACS. Параллельно подготовьте пробирки для одноцветных окрашенных клеток и неокрашенные клетки для настройки проточного цитометра.
  4. Инкубировать при 4 °C в течение 45 мин. Хорошо перемешивать каждые 10 мин. Добавить 2 мл буфера FACS.
  5. Центрифугируйте ячейки 350 × г при 4 °C в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость.
  6. Добавьте 1 мкл красителя Ghost Dye Violet 510 (для отличия жизнеспособных клеток от мертвых при проточном цитометрическом анализе неподвижных и проникнутых клеток). Используйте неразбавленный реагент Ghost Dye; Хорошо перемешайте. Инкубировать при 4 °C в течение 30 минут; Хорошо перемешивать каждые 10 минут.
  7. Добавьте 2 мл буфера FACS. Центрифужные ячейки 350 × г при 4 °C в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость.
  8. Закрепите клетки, добавив 1 мл 2% параформальдегида (PFA) в PBS и инкубируя при комнатной температуре в течение 10 минут.
  9. Добавьте 3,5 мл PBS в пробирку и центрифужные ячейки 700 × г при 4 °C в течение 8 мин. Выбросьте надосадочную жидкость.
  10. Проникните клетки, добавив 1 мл буфера для внутриклеточной фиксации/пермеабилизации, и инкубируйте при 4 °C в течение 20 минут.
  11. Центрифугируйте клетки 700 × г при 4 °C в течение 8 мин. Выбросьте надосадочную жидкость.
  12. Добавьте 1 мл 1x пермеабилизационного буфера. Центрифугируйте ячейки при 700 × г при 4 °C в течение 8 минут. Выбросьте надосадочную жидкость.
  13. Добавьте по 100 мкл каждой из рабочих концентраций антитела против бета5t или антитела против CCL21 или 40 мкл рабочих концентраций антитела против Aire (например, меченного AF488) в 1x пермеабилизационный буфер, хорошо перемешайте и инкубируйте в течение 60 мин при комнатной температуре.
  14. Добавьте 1 мл 1x пермеабилизационного буфера. Центрифугируйте ячейки при 700 × г при 4 °C в течение 8 минут. Выбросьте надосадочную жидкость.
  15. Повторите шаг 2.14.
  16. Добавьте 100 мкл рабочих концентраций антикроличьего IgG (например, меченного AF555) и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре.
  17. Добавьте 1 мл 1x пермеабилизационного буфера. Центрифугируйте ячейки при 700 × г при 4 °C в течение 8 минут. Выбросьте надосадочную жидкость.
  18. Ресуспендируйте элементы в 200 мкл буфера FACS и хорошо перемешайте.
  19. Хранить клетки в темноте при температуре 4 °C до проточного цитометрического анализа.
  20. Фильтруйте ячейки через нейлоновую сетку толщиной 60 мкм перед проточным цитометрическим анализом.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для анализа требуется проточный цитометр, который позволяет обнаруживать по крайней мере шесть флуоресцентных каналов (для CD45, EpCAM, Ly51, UEA1, Ghost Dye и beta5t, CCL21 и/или Aire), а также параметры прямого и бокового рассеяния. Репрезентативные профили проточных цитометрических профилей клеток тимуса, расщепленных коллагеназой/диспазой, от 0-дневных мышей и 2-недельных мышей показаны в Рисунок 1 и Рисунок 2, соответственно. На обоих рисунках точечная диаграмма на панели A показывает интенсивность прямого рассеяния (FSC) и интенсивность флуоресценции Ghost Dye Violet 510 для общих сигналов частиц. Более 90% сигналов частиц представляют собой жизнеспособные клетки, о чем можно судить по отрицательному окрашиванию реагентом Ghost Dye и прямому рассеянию, отражающему размер клетки. На панели B показаны сигналы флуоресценции клеточной поверхности жизнеспособных клеток тимуса для CD45, молекулы, экспрессируемой кроветворными клетками, и EpCAM, молекулы, экспрессируемой эпителиальными клетками. Небольшой, но отличительной популяцией клеток является CD45-EpCAM+, представляя собой ПЭТ.

figure-results-1
Рисунок 1: Репрезентативные проточные цитометрические профили клеток тимуса, расщепленных коллагеназой/диспазой, от 0-дневных мышей дикого типа C57BL/6-фон. (A) Интенсивность прямого рассеяния и интенсивность флуоресценции Ghost Dye Violet 510 от общего количества сигналов частиц. Красным прямоугольником обозначены сигналы жизнеспособных клеток. (B) Флуоресцентные сигналы жизнеспособных клеток (красная рамка на панели А) для CD45 и EpCAM. Красным прямоугольником обозначены CD45-EpCAM+ TEC. (C) Сигналы окрашивания клеточной поверхности Ly51 и UEA1 в ТЭО (красное поле на панели В) выделяют две основные популяции: клетки свысоким содержанием UEA1Ly51, обогащенные цТЭК, и клетки снизким уровнем UEA1 Ly51, обогащенные мТЭК. (Д-Ж) Обнаружение (D) beta5t, (E) CCL21 и (F) Aire в cTEC (верхние панели) и mTEC (нижние панели), как определено на панели C. Серые гистограммы показывают контрольные профили, окрашенные только вторичными антителами (D,E) и (F), окрашенные с использованием клеток мышей с дефицитом Aire. Сокращения: FSC = прямой разброс; ТЭО = эпителиальные клетки тимуса; cTECs = кортикальные TECs; mTECs = медуллярные TEC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Репрезентативные проточные цитометрические профили клеток тимуса, расщепленных коллагеназой/диспазой, от 2-недельных мышей дикого типа C57BL/6-background. (A) Интенсивность прямого рассеяния и интенсивность флуоресценции Ghost Dye Violet 510 общего количества сигналов частиц. Красным прямоугольником обозначены сигналы жизнеспособных клеток. (B) Флуоресцентные сигналы жизнеспособных клеток (красная рамка на панели А) для CD45 и EpCAM. Красным прямоугольником обозначены CD45-EpCAM+ TEC. (C) Сигналы окрашивания клеточной поверхности Ly51 и UEA1 в ТЭО (красное поле на панели В) выделяют две основные популяции: клетки свысоким содержанием UEA1Ly51, обогащенные цТЭК, и клетки снизким уровнем UEA1 Ly51, обогащенные мТЭК. (Д-Ж) Обнаружение (D) beta5t, (E) CCL21 и (F) Aire в cTEC (верхние панели) и mTEC (нижние панели), как определено на панели C. Серые гистограммы показывают контрольные профили, окрашенные только вторичным антителом (D,E) и окрашенные IgG, меченным изотипом (F). Сокращения: FSC = прямой разброс; ТЭО = эпителиальные клетки тимуса; cTECs = кортикальные TECs; mTECs = медуллярные TEC; FITC = флуоресцеин изотиоцианат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Ly51 и UEA1 сигналы окрашивания клеточной поверхности, как показано на панели C, выявляют две основные популяции в TEC: популяцию с относительно высоким содержанием Ly51 и низкой в UEA1, обогащенную cTECs, и другую относительно низкую в Ly51 и высокую в UEA1, обогащенную mTECs21,22,23,24,25. На эмбриональной и неонатальной стадиях, включая 0-суточный, частота цТЭО выше, чем у мТЭК. На постнатальных стадиях частота мТЭО доминирует, главным образом, потому, что эффективность высвобождения цТЭО из тимуса становится крайне низкой (примерно 1% цТЭО и 10% мТЭО могут быть восстановлены в одноклеточной суспензии)17.

Фиксация и проникновение клеток позволяют обнаруживать внутриклеточные молекулы внутри ТЭО. На панели D показана экспрессия бета5t, обнаруженная в большинстве cTEC, но не в mTEC; На панели E показано обнаружение CCL21 в части mTEC, но не в cTECs, а на панели F показана экспрессия Aire в субпопуляции mTEC.

Дополнительные профили проточной цитометрии внутриклеточных молекул в мышиных ТЭО можно найти в опубликованных статьях; для beta5t6,20, CCL2114,16,26, и Aire27,28, а также для дополнительных внутриклеточных молекул, включая кератин22,29 и Fezf211,30.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Коллагеназа, с диспазой или без нее, широко используется для переваривания тимуса мышей для получения ТЭО 4,5,9,18,21. Либераза, содержащая смесь протеаз, включая коллагеназу, также используется для переваривания тимуса для получения ТЭО17,22. Использование коллагеназы и либеразы дает по существу эквивалентные выходы и качество цТЭО и мТЭЦ из тимуса мыши, хотя могут возникать незначительные различия в зависимости от партии ферментов. Трипсин также используется для эффективного переваривания тимуса21,23, хотя было показано, что многие молекулы клеточной поверхности, включая EpCAM и CD80, экспрессируемые TECs, чувствительны к расщеплению трипсина21. Для ферментативного расщепления тимуса часто добавляют ДНКазу для снижения вязкости из-за высвобождения ДНК из поврежденных клеток17,21.

Ферментативное переваривание тимуса имеет важное значение для высвобождения ТЭО из тимуса. Тимус должен быть достаточно переварен до тех пор, пока фрагменты ткани не станут невидимыми, а клеточная суспензия не станет однородной. Тем не менее, пищеварение не следует оставлять слишком долго, потому что чрезмерное ферментативное лечение повреждает клетки и снижает их жизнеспособность. В каждом эксперименте важно уделять пристальное внимание инкубационному периоду и силе пипетирования во время переваривания тимуса. Также важно знать, что современная технология ферментативного сбраживания позволяет высвобождать лишь небольшую часть ТЭО, как подробно описано во Введении и как сообщалось ранее 17,18,19.

Поскольку ТЭО редко встречаются в суспензии клеток общего тимуса, проточный цитометрический анализ ТЭО с использованием суспензии клеток общего тимуса требует окрашивания многих клеток, обычно 8 × 106 до 16 × 106 клеток на измерение.

ТЭО, полученные из расщепленных ферментами клеток тимуса, могут быть обогащены с использованием анти-CD45 магнитных шариков22 и/или центрифугирования31 с градиентом плотности Перколла. Эти процедуры обогащения экономят время, особенно когда ТЭО впоследствии очищаются с помощью проточного цитометрического сортировщика клеток. Следует также отметить, что обогащение анти-CD45 приведет к удалению субпопуляции ТЭК, которые тесно связаны с CD45-экспрессирующими тимоцитами20 , а центрифугирование Перколла может удалить неожиданно плотную субпопуляцию ТЭК.

Что касается фиксации ПЭТ, то известно, что лечение ПФА уменьшает клетки и снижает интенсивность прямого рассеяния при проточном цитометрическом анализе. Щадящее пипетирование клеток сразу после добавления 2% PFA и последующего добавления PBS может помочь предотвратить чрезмерное уменьшение клеток.

Для проточного цитометрического анализа, учитывая нечастое появление ТЭО в тимусе, их разграничение требует особого подхода по сравнению с тимоцитами или спленоцитами. Первоначальная классификация основана на использовании CD45, гемопоэтического панмаркера, повсеместно присутствующего на тимоцитах и других кроветворных клетках, включая дендритные клетки и макрофаги. И наоборот, ПЭС, будучи некроветворными по происхождению, не имеют экспрессии CD45. Вместо этого ТЭО экспрессируют EpCAM на своей поверхности, что позволяет использовать прямую стратегию стробирования CD45-отрицательных и EpCAM-положительных для распознавания ТЭК. В нашем проточно-цитометрическом анализе мы начинаем с определения этой популяции и в дальнейшем обеспечиваем соответствующее масштабирование параметров прямого и бокового рассеяния, учитывая значительную расхождение в размерах между ТЭО и тимоцитами, а также учитывая большой размер и высокую автофлуоресценцию ТЭС.

В дальнейшем внимание уделяется оценке cTEC- и mTEC-маркеров в CD45-негативной EPCAM-положительной популяции. В связи с незначительной численностью этой популяции этот шаг становится необходимым для компенсации цТЭО и мТЭК. Исследование полностью окрашенной панели (например, cTEC-маркера Ly51 и mTEC-маркера UEA-1 вместе с CD45 и EpCAM, определяющими TEC) дополнительно обеспечивает адекватность масштабирования рассеяния. Во время настройки проточной цитометрии наша основная цель заключается в различении положительных и отрицательных популяций для каждого антитела.

При совместном окрашивании Aire, beta5t и CCL21 идентифицируются различные популяции в подмножествах TEC. Учитывая селективную экспрессию Эйра с помощью mTECs, мы сосредоточились на четырехцветном окрашивании CD45-отрицательных/EPCAM-положительных/UEA-1-положительных/Ly51-отрицательных клеток. В этом случае UEA-1-положительные клетки используются для установления отрицательного контроля над Aire, что способствует четкой идентификации Aire-положительных клеток. Аналогичный подход принят для CCL21, который выражается в mTEC. И наоборот, для бета5т, экспрессируемого исключительно цТЭК, применяется сопоставимая стратегия гейтирования с акцентом на Ly51-положительные клетки в четырехцветном окрашивании, чтобы установить фоновые уровни для бета5т. Последующий анализ образцов, окрашенных анти-бета5т, облегчает идентификацию положительной популяции.

Антитела против бета5т и антитела против CCL21 являются антителами кроликов, поэтому эти антитела не следует смешивать без предварительного флуоресцентного мечения. Рабочие концентрации антител должны быть заранее определены путем проведения проточного цитометрического анализа контрольных клеток (например, ТЭО от мышей дикого типа и нокаутов), окрашенных серийными разведениями антител.

При проточном цитометрическом анализе цТЭО и мТЭЦ часто определяются экспрессией на клеточной поверхности Ly51 или CD205 для цТЭЦ и UEA1 и CD80 для мТЭК. Однако следует иметь в виду, что цТЭО и мТЭО в конечном итоге должны определяться их микроанатомической локализацией в тимусе. В эмбриональном тимусе новые данные свидетельствуют о том, что экспрессия Ly51 и CD205 не ограничивается цТЭК, а распространяется на другие популяции ТЭК, включая cTEC/mTEC-бипотентных предшественников и незрелых мТЭО32,33. Кроме того, экспрессия Ly51 в цТЭО остается низкой во время эмбриогенеза и перинатального периода по сравнению с постнатальным периодом33, как также показано на рисунках 1 и 2.

В заключение следует отметить, что проточный цитометрический анализ ферментативно высвобождаемой одноклеточной суспензии ТЭО предлагает мощный метод количественного анализа ТЭО и их субпопуляций с разрешением для одиночных клеток, несмотря на ограниченную эффективность высвобождения ТЭС. В частности, проточный цитометрический анализ внутриклеточных молекул в суспензии одиночных клеток ТЭК полезен для изучения экспрессии различных молекул, важных для развития и функционирования ТЭО и их субпопуляций.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Благодарим доктора Идзуми Охигаси за прочтение рукописи. Эта работа была поддержана Программой внутренних исследований ZIA BC 011806 Национальных институтов здравоохранения, Национального института рака и Центра исследований рака.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Коллагеназа/диспаза Roche11097113001
Liberase TMRoche5401127001
Foxp3 / Буферный набор для окрашивания транскрипционного фактораeBioscience00-5523-00
Ghost Dye Violet 510 Tonbo13-0870-T500
BV421 против мыши CD45, Клон 30-F11BD Horizon563890
Моноклональное антитело Alexa Fluor 647 против мыши Ly51, Клон 6C3BioLegend108312
PE/Cy7 против мыши EpCAM/CD326 моноклональное антитело, Клон G8.8BioLegend118216
DyLight 594 Ulex Europaeus Agglutinin I (UEA1)Vector ЛабораторииDL-1067-1
Alexa Fluor 488 антимышиное моноклональное антитело Aire, клон 5H12eBioscience53-5934-82
Моноклональное антитело кролика против мыши Psmb11/beta5t, клон CPTC-PSMB11 (мышь)-1NIH NCICPTC-PSMB11 (мышь)-1https://proteomics.cancer.gov/antibody-portal
Антитело против мыши CCL21/exodus 2 кроличье поликлональное антителоBio-RadAAM27
Alexa Fluor 555 anti-rabbit IgG тяжелая цепь козье рекомбинантное антителоInvitrogenA27039
Anti-Mouse CD32/CD16 – Очищенный (антитело к блоку Fc)Leinco TechnologiesC247
Нейлоновая сетка 60 микронКомпонент ПоставкаW31436
Оборудование
ТермомиксерEppendorfТермоблок
Целометр Auto 2000 Счетчик жизнеспособности клетокNexcelomПодсчет
LSRFortessa Cell AnalyzerBD BiosciencesПроточный цитометрПять лазеров (355, 408, 488, 595 и 637 нм)
FACSDiva версия программного обеспечения 9.0.1BD BiosciencesПроточный цитометрический анализ
FlowJo 10.9.0BD BiosciencesПроточный цитометрический анализ
Скоростьразведения антител (рабочая концентрация)Буфер
Anti-Mouse CD32/CD16 – Очищенный (антитело Fc-блока)1:40FACS Buffer
BV421 против мыши CD45 моноклональное антитело1:25FACS Buffer
PE/Cy7 против мыши EpCAM/CD326 моноклональное антитело1:100FACS Buffer
Alexa Fluor 647 против мыши Ly51 моноклональное антитело1:100FACS Buffer
DyLight 594 Ulex Europaeus Agglutinin I (UEA1)1:400FACS Buffer
Anti-mouse CCL21/exodus 2 кроличье поликлональное антитело1:2001x Permeabilization Buffer
Anti-mouse Psmb11/beta5t кроличье моноклональное антитело, клон CPTC-PSMB11 (мышь)-11:10001x Пермеабилизационный буфер
Alexa Fluor 555 анти-кроличий IgG тяжелая цепь козье рекомбинантное антитело1:4001x Пермеабилизационный буфер
Назначение
RPMI1640, содержащий 10 мМ HEPES Для клеточного препарата
RPMI1640, содержащий 2% FBSДля клеточного препарата
буфер FACS (1x HBSS, содержащий 1% BSA  и 0,1% азид натрия)Для клеточного препарата и окрашивания
1 мг/мл коллагеназы/диспазы и 1 ЕД/мл раствора ДНКазы в RPMI1640, содержащей 2% FBSДля ферментного расщепления
2% PFA в PBSДля фиксации
/пермеабилизации Буфер (1 часть концентрата фиксации/пермеабилизации с 3 частями разбавителя фиксации/пермеабилизации)Для фиксации клеток
1x Пермеабилизационный буфер (1 часть 10X концентрата с 9 частями дистиллированной воды)Для окрашивания межклеточных антител 
Моноклональное антитело жизнеспособных клетокданныхразведенияантителклеток

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see). Nat Rev Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).
  2. Takahama, Y., Ohigashi, I., Baik, S., Anderson, G. Generation of diversity in thymic epithelial cells. Nat Rev Immunol. 17 (5), 295-305 (2017).
  3. Hozumi, K., et al. Delta-like 4 is indispensable in thymic environment specific for T cell development. J Exp Med. 205 (11), 2507-2513 (2008).
  4. Koch, U., et al. Delta-like 4 is the essential, nonredundant ligand for Notch1 during thymic T cell lineage commitment. J Exp Med. 205 (11), 2515-2523 (2008).
  5. Murata, S., et al. Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes. Science. 316 (5829), 1349-1353 (2007).
  6. Ripen, A. M., Nitta, T., Murata, S., Tanaka, K., Takahama, Y. Ontogeny of thymic cortical epithelial cells expressing the thymoproteasome subunit β5t. Eur J Immunol. 41 (5), 1278-1287 (2011).
  7. Gommeaux, J., et al. Thymus-specific serine protease regulates positive selection of a subset of CD4+ thymocytes. Eur J Immunol. 39 (4), 956-964 (2009).
  8. Viret, C., et al. Thymus-specific serine protease contributes to the diversification of the functional endogenous CD4 T cell receptor repertoire. J Exp Med. 208 (1), 3-11 (2011).
  9. Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).
  10. Mathis, D., Benoist, C. Aire. Annu Rev Immunol. 27, 287-312 (2009).
  11. Takaba, H., et al. Fezf2 orchestrates a thymic program of self-antigen expression for immune tolerance. Cell. 163 (4), 975-987 (2015).
  12. Takaba, H., Takayanagi, H. The mechanisms of T cell selection in the thymus. Trends Immunol. 38 (11), 805-816 (2017).
  13. Lammers, S., et al. Ehf and Fezf2 regulate late medullary thymic epithelial cell and thymic tuft cell development. Front Immunol. 14, 1277365(2024).
  14. Ushio, A., et al. Functionally diverse thymic medullary epithelial cells interplay to direct central tolerance. Cell Rep. 43 (4), 114072(2024).
  15. Kozai, M., et al. Essential role of CCL21 in establishment of central self-tolerance in T cells. J Exp Med. 214 (7), 1925-1935 (2017).
  16. Lkhagvasuren, E., Sakata, M., Ohigashi, I., Takahama, Y. Lymphotoxin β receptor regulates the development of CCL21-expressing subset of postnatal medullary thymic epithelial cells. J Immunol. 190 (10), 5110-5117 (2013).
  17. Sakata, M., Ohigashi, I., Takahama, Y. Cellularity of thymic epithelial cells in the postnatal mouse. J Immunol. 200 (4), 1382-1388 (2018).
  18. Hirakawa, M., et al. Fundamental parameters of the developing thymic epithelium in the mouse. Sci Rep. 8 (1), 11095(2018).
  19. Venables, T., Griffith, A. V., DeAraujo, A., Petrie, H. T. Dynamic changes in epithelial cell morphology control thymic organ size during atrophy and regeneration. Nat Commun. 10 (1), 4402(2019).
  20. Nakagawa, Y., et al. Thymic nurse cells provide microenvironment for secondary T cell receptor α rearrangement in cortical thymocytes. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (50), 20572-20577 (2012).
  21. Gray, D. H., Chidgey, A. P., Boyd, R. L. Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry. J Immunol Methods. 260 (1-2), 15-28 (2002).
  22. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).
  23. Jenkinson, E. J., Anderson, G., Owen, J. J. Studies on T cell maturation on defined thymic stromal cell populations in vitro. J Exp Med. 176 (3), 845-853 (1992).
  24. Adkins, B., Tidmarsh, G. F., Weissman, I. L. Normal thymic cortical epithelial cells developmentally regulate the expression of a B-lineage transformation-associated antigen. Immunogenetics. 27 (3), 180-186 (1988).
  25. Farr, A. G., Anderson, S. K. Epithelial heterogeneity in the murine thymus: fucose-specific lectins bind medullary epithelial cells. J Immunol. 134 (5), 2971-2977 (1985).
  26. Wells, K. L., et al. Combined transient ablation and single-cell RNA-sequencing reveals the development of medullary thymic epithelial cells. eLife. 9, e60188(2020).
  27. Hubert, F. X., et al. A specific anti-Aire antibody reveals aire expression is restricted to medullary thymic epithelial cells and not expressed in periphery. J Immunol. 180 (6), 3824-3832 (2008).
  28. Nishikawa, Y., et al. Temporal lineage tracing of Aire-expressing cells reveals a requirement for Aire in their maturation program. J Immunol. 192 (6), 2585-2592 (2014).
  29. Jenkinson, W. E., Rossi, S. W., Parnell, S. M., Jenkinson, E. J., Anderson, G. PDGFR alpha-expressing mesenchyme regulates thymus growth and the availability of intrathymic niches. Blood. 109 (3), 954-960 (2007).
  30. Cosway, E. J., et al. Redefining thymus medulla specialization for central tolerance. J Exp Med. 214 (11), 3183-3195 (2017).
  31. Farr, A. G., Eisenhardt, D. J., Anderson, S. K. Isolation of murine thymic epithelium and an improved method for its propagation in vitro. Anat Rec. 216 (1), 85-94 (1986).
  32. Baik, S., Jenkinson, E. J., Lane, P. J., Anderson, G., Jenkinson, W. E. Generation of both cortical and Aire+ medullary thymic epithelial compartments from CD205+ progenitors. Eur J Immunol. 43 (3), 589-594 (2013).
  33. Ohigashi, I., et al. Developmental conversion of thymocyte-attracting cells into self-antigen-displaying cells in embryonic thymus medulla epithelium. eLife. 12, RP92552(2024).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Beta5tCCL21

Похожие статьи