Методическая статья

Исследование ангиогенеза на функциональном и молекулярном уровнях с использованием анализа миграции царапин и анализа прорастания сфероидов

2.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66954

⸱

31 мая 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Eye Center, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Department of Medicine I, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 3Institute of Pharmaceutical Sciences, Faculty of Chemistry and Pharmacy, University of Freiburg, 4Pharmacy, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 5Ophtha-Lab, Department of Ophthalmology, St. Franziskus Hospital Muenster

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данном исследовании представлены двумерный (2D) анализ миграции царапин раны и трехмерный (3D) анализ прорастания сфероидов, а также соответствующие методы анализа, включая экстракцию РНК и иммуноцитохимию, в качестве подходящих анализов для изучения ангиогенеза in vitro.

Аннотация

Ангиогенез играет решающую роль как в физиологических, так и в патологических процессах в организме, включая рост опухоли или неоваскулярные заболевания глаз. Детальное понимание основных молекулярных механизмов и надежные модели скрининга имеют важное значение для эффективного нацеливания на заболевания и разработки новых терапевтических вариантов. Для моделирования ангиогенеза было разработано несколько тестов in vitro , использующих возможности контролируемой среды для выяснения ангиогенных факторов на молекулярном уровне и скрининга терапевтических мишеней.

В этом исследовании представлены рабочие процессы изучения ангиогенеза in vitro с использованием эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVECs). Мы подробно описываем анализ миграции царапин раны с использованием системы визуализации живых клеток, измеряющую миграцию эндотелиальных клеток в 2D-условиях, и анализ сфероидального прорастания, оценивающий прорастание эндотелиальных клеток в 3D-условиях, обеспечиваемых коллагеновой матрицей. Кроме того, мы описываем стратегии подготовки образцов для проведения дальнейших молекулярных анализов, таких как транскриптомика, особенно в условиях 3D, включая экстракцию РНК и иммуноцитохимию. В целом, эта система предлагает ученым надежный и универсальный набор инструментов для проведения научных исследований в области анализов ангиогенеза in vitro .

Введение

Ангиогенез, который относится к образованию новых кровеносных сосудов из уже существующих1, является важнейшим процессом во время физиологического развития и патологических состояний. Он незаменим для обеспечения энергией высокометаболически активных тканей, таких как сетчатка2 или развивающаяся центральная нервная система3, а также во время заживления поврежденных тканей4. Аномальный ангиогенез, с другой стороны, является основой для многочисленных заболеваний. Солидные опухоли, такие как колоректальный рак или немелкоклеточный рак легких, способствуют их росту и необходимому снабжению энергией, способствуя ангиогенезу. Помимо рака, неоваскулярные заболевания глаз, такие как диабетическая ретинопатия или возрастная макулярная дегенерация, которые являются основными причинами слепоты в развитых странах, являются результатом аберрантного роста сосудов 6,7. Детальное понимание основного патомеханизма имеет решающее значение для понимания того, как физиологический ангиогенез может быть усилен, например, при заживлении ран при лучшем контроле патологических состояний, таких как вазопролиферативные заболевания глаз.

На клеточном уровне клетки эндотелия сосудов активируются различными сигнальными молекулами в ангиогенезе, инициируя пролиферацию и миграцию клеток8. Впоследствии клетки организуются в иерархию, при этом непролиферирующие верхние клетки образуют филоподии на переднем крае развивающейся ветвисосуда 8. Наряду с этим быстро пролиферирующие стебельчатые клетки следуют за клетками верхушки, способствуя формированию формирующегося сосуда. Впоследствии другие типы клеток, такие как перициты или гладкомышечные клетки, рекрутируются для дальнейшей стабилизации зарождающейся ветви9.

Для изучения молекулярных процессов на уровне эндотелиальных клеток сосудов были разработаны инедавно пересмотрены многочисленные протоколы in vitro. Эти анализы обычно делятся на две категории: более простые, но масштабируемые 2D-подходы и более сложные 3D-протоколы. В недавнем проекте мы провели всесторонний сравнительный анализ между 2D-анализом миграции царапин и 3D-анализом прорастания сфероидов11, чтобы оценить степень их различий и их способность моделировать различные аспекты ангиогенеза12.

Несмотря на то, что оба метода обладают преимуществами надежности и простоты реализации, на молекулярном уровне 3D-анализ прорастания сфероидов оказался благоприятным для решения ключевых аспектов ангиогенеза по сравнению с данными in vivo, такими как метаболические переключатели или взаимодействия между клеткой и матриксом. Поскольку анализы ангиогенеза in vitro используются для оценки ангиомодулирующего потенциала сигнальных путей13 и для скрининга терапевтических агентов, существенное значение имеет переносимость результатов in vitro в условия in vivo. Кроме того, возможность проведения основанного на омиксе анализа уровней РНК и белков для характеристики молекулярных изменений в ответ на целевую модуляцию ангиогенных процессов в контролируемых условиях остается важным преимуществом по сравнению с условиями in vivo 14,15.

В этой публикации мы представляем ключевые анализы для изучения вопросов, связанных с ангиогенезом, с помощью анализа визуализации миграции живых клеток и анализа прорастания сфероидов, включая последующие молекулярные анализы, такие как секвенирование РНК для транскриптомного анализа и иммуногистохимия на уровне белка.

Протокол

1. Культура клеток HUVEC

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все следующие шаги в стерильных условиях труда (на стерильном рабочем столе).

  1. Расширение HUVEC
    1. Для обоих анализов ангиогенеза используйте объединенные эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVECs) или микрососудистые эндотелиальные клетки человека (HMVECs).
    2. Перед выполнением расщепления культивируйте клетки до тех пор, пока они не достигнут 90% конфлюенции, в колбе T75 без покрытия со средой для роста эндотелиальных клеток (EGM). Выполняйте смену среды 3 раза в неделю.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы ускорить рост, среду можно менять ежедневно. Не используйте HUVEC после шестого прохода. Исследование получило наиболее последовательные результаты во всех экспериментах с HUVEC одного и того же пассажа.
  2. Разделение HUVEC
    1. Когда HUVEC достигнут желаемого слияния в колбе T75, промойте их один раз 5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS), после чего инкубируйте клетки с 0,5% трипсином в течение 2 минут в инкубаторе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное воздействие трипсина может повредить функцию HUVEC.
    2. Аккуратно отсоедините ячейки, постучав по колбе. Подтвердите успешную отслойку под инвертированным фазово-контрастным микроскопом.
    3. Добавьте 8 мл EGM, переложите раствор в пробирку и гранулируйте клетки центрифугированием при 250 x g в течение 3 минут.
    4. Если необходим подсчет клеток, повторно суспендируйте клетки в 5 мл EGM и используйте камеру Нейбауэра. В противном случае добавьте 40 мл EGM и распределите его по 4 свежим колбам для клеточных культур T75.

2. Анализ миграции царапин на рану

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ миграции царапин на рану требует продолжительности 3 дня для завершения (Рисунок 1). Выполняйте все следующие действия в стерильных условиях труда (стерильный рабочий стол).

  1. Гальванизация и голодание клеток (день 1)
    1. Используя специализированный 96-луночный планшет для визуализации живых клеток, засейте 20 000 HUVEC в 100 мкл EGM на лунку. Дайте клеткам отстояться в течение 6 ч в инкубаторе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется оптимизировать количество клеток с учетом различной скорости роста эндотелиальных клеток сосудов между поставщиками и лабораториями. Цель состоит в том, чтобы получить идеальный монослой на следующий день перед началом царапины. Перенаселенные лунки могут изменять поведение эндотелиальных клеток, например, путем контактного ингибирования16, в то время как неполный монослой резко затрудняет анализ.
    2. Заморочьте все лунки на ночь 100 μл EBM на лунку с добавлением 2% FBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не повредить монослой клеток, особенно при использовании многоканальной пипетки.
  2. Приготовление растворов для стимуляции (день 2)
    1. Разбавляйте желаемые вещества и контрольные вещества в базальной среде роста эндотелиальных клеток (EBM) с добавлением 2% FBS. На каждую лунку используйте 100 мкл раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: EBM с добавлением 2% FBS служит в качестве отрицательного контроля, в то время как рекомбинантный фактор роста эндотелия сосудов человека (VEGF) в концентрации 25 нг/мл может быть использован в качестве положительного контроля. При использовании 96-луночных планшетов рекомендуется планировать эксперименты с минимальным количеством технических повторений (4 лунки с идентичными условиями), хотя для достижения оптимальных результатов рекомендуется использовать 8. Стремитесь свести к минимуму потенциальные эффекты краев или углов при планировании макета.
  3. Создание скретча (день 2)
    1. Проверьте клетки под микроскопом, чтобы убедиться в слиянии монослоя клеток и жизнеспособности клеток. Поместите 96-луночный планшет в 96-луночный инструмент для создания ран и создайте царапину, нажав на рычаг устройства. Осторожно снимите крышку инструмента для создания ран, прежде чем отпустить рычаг, чтобы предотвратить двойную царапину.
    2. Промойте все лунки дважды, используя 200 μL EBM на лунку с добавлением 2% FBS. Подтвердите под микроскопом, что мусор был успешно удален.
  4. Клеточная стимуляция (день 2)
    1. Добавьте 100 μл приготовленных растворов для интенсификации или контроля на лунку.
  5. Визуализация (день 2-3)
    1. Получайте изображения один раз в час в течение 24 часов с помощью автоматического расписания, предоставляемого микроскопом для визуализации живых клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения хорошего качества изображения сканируйте каждую лунку сразу после ее переноса в инкубатор, в котором находится система визуализации живых клеток. 30-минутное время акклиматизации в инкубаторе помогает получить лучшее качество изображения. Программное обеспечение микроскопа запрограммировано на получение одного изображения в час для каждой лунки в средней линии определенной царапины.
  6. Если у вас нет инструмента для создания ран и тепловизора живых клеток, выполните описанные ниже действия.
    1. Используйте наконечник для дозатора в 24-луночном планшете, чтобы вызвать царапину. Делайте снимки с помощью классического микроскопа для клеточных культур через определенные промежутки времени. Для этой цели используйте моторизованный микроскоп, оснащенный функциями точного отслеживания по осям X и Y. Это обеспечивает автоматическое позиционирование, обеспечивая равномерную съемку изображений в заранее определенных местах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Когда необходима ручная визуализация, целесообразно получить изображение только T0, а также одну временную точку «x» часов после лечения. В описанном протоколе с использованием HUVEC временная точка T12 (через 12 ч после стимуляции) представляла собой привлекательную временную точку с четким разделением между негативным и VEGF-стимулированным положительным контролем. Тем не менее, рекомендуется проводить начальные эксперименты с визуализацией каждые 2 часа или 1 час, чтобы определить оптимальную временную точку для конкретных экспериментальных условий в каждой лаборатории.
  7. Анализ (день 3)
    1. Программное обеспечение для микроскопа для визуализации живых клеток может обеспечить прямой анализ полученных изображений. Определите маски, обозначающие клеточную лужайку, начальную царапину и области относительной плотности раны. Определение границ клеток на основе различий в контрасте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов, проводимых с HUVEC, использовались корректировка сегментации 1,6, размер отверстия 500мкм2, скорректированный размер 1 пиксель, площадь >500 мкм и эксцентриситет >0,6. Тщательная визуальная проверка параметров обнаружения клеток относительно фактических изображений имеет важное значение. Благодаря оптимизированным конфигурациям программное обеспечение автоматически рассчитывает относительную плотность ран (RWD) с течением времени и генерирует соответствующие временные графики со стандартным отклонением (SD) технических реплик. Эти данные затем могут быть использованы для статистического анализа.

3. Экстракция РНК с помощью 2D культивируемых клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все следующие шаги до шага 3.3 в стерильных условиях труда (стерильный рабочий стол).

  1. Гальванические ячейки (день 1)
    1. Отсоедините HUVEC на шаге 1.2 протокола культивирования клеток HUVEC.
    2. Засейте 50 000 клеток в лунку в 12-луночный планшет с 2 мл EGM на лунку.
    3. Через 6 ч смените среду на EBM, содержащую 2% FBS (среда для голодания) для ночного голодания.
  2. Лечение клеток (день 2)
    1. Разбавляйте интересующие агенты в EBM с добавлением 2% FBS. Замените голодающие среды приготовленным разведением и инкубируйте клетки в течение нужного времени в инкубаторе.
  3. Экстракция РНК (2-3 день)
    1. Лизируйте клетки 750 мкл тризола на лунку и инкубируйте в течение 10 мин на орбитальном шейкере.
    2. Повторно суспендируйте образцы с помощью пипетки объемом 1000 мкл несколько раз, а затем храните их в определенных пробирках с низкой связываемостью РНК (объем 1,5 мл). Хранить при температуре -80 °C.

4. Иммуноцитохимия с 2D культивируемыми клетками

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все следующие шаги до шага 4.4 в стерильных условиях труда (стерильный рабочий стол).

  1. Подготовка чехлов
    1. Инкубировать 100 покровных стекол диаметром 12 мм в 5% гидроксиде калия в метаноле в пробирке объемом 50 мл в течение 30 мин, встряхивая нанесенный раствор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это очень важный этап в депротонировании поверхности покровных стеклопакетов и улучшении условий для нанесения покрытий и культуры. На этом этапе настоятельно рекомендуется убедиться, что покровные стекла хорошо распределены в среде и не высыхают и не склеиваются.
    2. Промойте покровные стекла в течение 30 мин 4 раза деминерализованной водой.
    3. После промывки переложите их в 70% изопропиловый раствор для хранения.
  2. Нанесение покрытия на покровные стекла
    1. Прислоните покровные стекла по отдельности к стенке квадратной чашки Петри, чтобы обеспечить испарение изопропилового спирта.
    2. Через 5 минут переложите покровные стекла в 24-луночный планшет (по одному покровному листу на лунку). Нанесите 1 мл раствора 10 мг/мл коллагена I в PBS в каждую лунку и инкубируйте в течение 60 мин при 37 °C.
    3. Затем промойте покровные стекла 4-5 раз в течение 5 минут с PBS.
  3. Культивирование клеток
    1. Отсоедините HUVEC в соответствии с процедурами, описанными в шаге 1.2 протокола культивирования клеток HUVEC.
    2. Засейте 50 000 клеток в лунку в 24-луночный планшет с 2 мл EGM на лунку.
    3. Через 6 ч смените среду на EBM, содержащую 2% FBS, чтобы позволить клеткам прикрепиться к лунке и заморить их голодом в течение ночи.
    4. На следующий день разбавляющие агенты, представляющие интерес в EBM, дополненные 2% FBS. Замените голодающий раствор в лунках на приготовленный разведенный и инкубируйте клетки в течение нужного времени в инкубаторе.
  4. Фиксация и блокировка
    1. Культивируйте клетки в течение желаемого времени, затем промойте клетки PBS в течение 5 минут.
    2. Зафиксируйте клетки 2% параформальдегидом (PFA) в PBS на 20 минут при комнатной температуре (RT).
    3. Умыться с PBS 3-4 раза в течение 5 минут.
    4. Инкубируют образцы с блокирующим буфером, содержащим 5% нормальной сыворотки крови коз (NGS), 0,1% Triton-X-100 в PBS в течение 1 ч в режиме ЛТ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе важно промыть образцы, чтобы гарантировать полное удаление ПФА. Выбирайте вид сыворотки в зависимости от происхождения вторичного антитела.
  5. Окрашивание
    1. Инкубируйте образцы в течение ночи при 4 °C в блокирующем буфере с первичным антителом.
    2. На следующий день, чтобы удалить все несвязанные первичные антитела, промойте образцы 3-4 раза PBS в течение 5 минут каждый.
    3. Затем образцы инкубируют в течение 1 ч в ЛТ с соответствующими вторичными антителами и фаллоидином-FITC, разведенными вместе в блокирующем буфере.
    4. Постирайте дополнительно 3-4 раза.
    5. Переверните покровные стекла на предметные стекла с помощью небольшой капли монтажного материала, содержащего DAPI, дайте высохнуть в темноте и заклейте лаком для ногтей. Храните образцы в темноте при температуре 4 °C.

5. Сфероидный анализ на проращивание

ПРИМЕЧАНИЕ: Для завершения анализа на прорастание сфероидов требуется 3 дня (Рисунок 2). Выполните все следующие шаги до шага 5.7 в стерильных условиях труда (стерильный рабочий стол).

  1. Генерация сфероидов в висячих каплях (день 1)
    1. Отсоедините HUVEC в соответствии с процедурами, описанными в шаге 1.2 протокола культивирования клеток HUVEC.
    2. Объедините 200 000 клеток с 8 мл EGM и 2 мл стокового раствора метоцела, обеспечивая тщательное перемешивание. Пожалуйста, обратитесь к Дополнительному файлу 1 для получения инструкций по приготовлению исходного раствора метоцела.
    3. Нанесите капли раствора объемом 25 мкл на перевернутую внутреннюю поверхность большой квадратной чашки Петри. Осторожно поверните крышку на 180° и расположите ее на дне сосуда для клеточной культуры так, чтобы капли свисали. Поместите сосуд в инкубатор для клеточных культур на ночь.
  2. Приготовьте коллагеновый гель (день 2)
    1. Тщательно перемешайте 2,3 мл коллагена типа I типа крысиного хвоста с 0,280 мл 10x Medium 199 до тех пор, пока смесь не приобретет стабильно ровный желтый оттенок. Держите эту смесь на льду на протяжении всего процесса.
  3. Титруйте коллагеновый гель (день 2)
    1. Титруйте смесь до достижения физиологического pH, обозначенного оранжевым цветом, с использованием NaOH (2 N).
    2. Добавьте 50 μл буфера HEPES в конечный продукт.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить оптимальный динамический диапазон для анализа, крайне важно максимально приблизиться к физиологическому pH. Для различных партий коллагена может потребоваться разное количество NaOH. Держите смесь строго на льду на протяжении всего процесса и все время равномерно перемешивайте.
  4. Заготовка фероидов (день 2)
    1. Промойте висячие капли с крышек клеточных культур 20 мл PBS.
    2. Центрифугируйте раствор в течение 7 мин при 250 x g. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте сфероиды в 0,1 мл FBS и 0,4 мл EGM, осторожно постукивая по трубке.
    3. Добавьте 2 мл стокового раствора метоцела и тщательно перемешайте. Используйте пипетку с минимальной емкостью 5 мл, чтобы не повредить сфероиды.
  5. Добавление сфероидов в 3D коллагеновый матрикс (день 2)
    1. Добавьте 2 мл приготовленной коллагеновой смеси к ресуспензионным сфероидам и тщательно перемешайте.
    2. Дозируйте 0,5 мл полученной смеси в лунки 24-луночного планшета и инкубируйте в клеточном инкубаторе в течение 30 мин.
  6. Стимуляция сфероидов в 3D коллагеновой матрице (день 2)
    1. Приготовьте разведение нужных веществ в EBM. На каждую лунку используйте 100 мкл раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: EBM служит в качестве отрицательного контроля, в то время как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) в концентрации 25 нг/мл (конечная концентрация в 500 мкл коллагенового матрикса и 100 мкл слоя EBM) может быть использован в качестве положительного контроля.
    2. Высиживайте в течение нужного времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В стандартном анализе рекомендуется 18-24 часа, но время должно быть тщательно оптимизировано в каждой лаборатории.
  7. Визуализация сфероидов (день 3)
    1. Используйте инвертированный микроскоп и платформу визуализации для получения изображений всех сфероидов, которые не соприкасаются с краем лунки, друг с другом или имеют признаки повреждения. Поддерживайте постоянные настройки и уровни масштабирования в любых условиях.
  8. Анализ (день 3)
    1. Используйте измерительный инструмент в ImageJ Fiji, чтобы определить длину всех ростков от каждого сфероида на каждом изображении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте плагин, предоставленный в Дополнительном файле 2, который делает анализ более эффективным и генерирует файл выходного .txt.
    2. Импортируйте данные в электронную таблицу, R или любое другое предпочитаемое программное обеспечение и используйте среднюю совокупную длину всех ростков на сфероид в качестве считывания для каждого условия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты использования различных гелей не могут быть объединены в виде абсолютной длины проращивания. Данные из каждой группы обработки должны быть нормализованы до контрольной группы EBM или VEGF (относительная длина проращивания), прежде чем данные могут быть объединены.

6. Экстракция РНК с помощью 3D культивируемых клеток

  1. Сфероидальный анализ на проращивание
    1. Проведите анализ на прорастание сфероидов, как описано в разделе 5.
  2. Лизис коллагенового геля
    1. Сфероидные гели смыть теплым PBS в течение 5 минут.
    2. Разрежьте сфероидные гели на четвертинки и переложите все 4 четверти в пробирку объемом 50 мл. Используйте скальпель для механического рассечения гелей.
    3. Обработайте образцы геля раствором лизиса (содержащим 2 мг/мл коллагеназы D в PBS) и инкубируйте в течение 45 минут при 37 °C на шейкере.
    4. Аккуратно промойте гели PBS с добавлением 2 mM EDTA, чтобы остановить реакцию буфера для лизиса.
  3. Экстракция РНК
    1. Суспендируйте лизированные гели в 750 мкл тризола и инкубируйте в течение 10 минут, чтобы гарантировать достаточную экстракцию РНК, как описано на шаге 3.3.
    2. Повторно суспендируйте образцы с помощью пипетки объемом 1000 мкл несколько раз и перенесите образцы в определенные пробирки с низкой связывающей РНК (объем 1,5 мл). Хранить образцы при температуре -80 °C.

7. Иммуноцитохимия сфероидов в 3D коллагеновой матрице

  1. Сфероидальный анализ на проращивание
    1. Проведите анализ на прорастание сфероидов, как описано в разделе 5.
  2. Фиксация и блокировка
    1. Закрепите гели с 4% PFA в PBS на 1 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить хорошую фиксацию клеток в геле, гели необходимо аккуратно отсоединить по бокам лунок с помощью скальпеля и пинцета после промывания PBS.
    2. Аккуратно промойте гели 3-4 раза PBS, а затем полностью отделите их от поверхности лунок и переложите в новые 24-луночные планшеты.
    3. Инкубируйте гели в течение 1 ч при РТ с блокирующим раствором (содержащим 5% NGS и 0,1% Triton-X-100 в PBS) на орбитальном шейкере.
  3. Окрашивание
    1. Инкубируйте образцы в течение ночи при 4 °C на орбитальном шейкере, при этом первичное антитело разведено в блокирующем буфере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Переворачивание гелей во время этой инкубации не улучшило качество окрашивания.
    2. На следующий день аккуратно промойте гели 4-5 раз PBS по 5 минут каждый.
    3. Инкубируют соответствующее вторичное антитело, разведенное с фаллоидином-FITC в блокирующем буфере в течение ночи при 4 °C на орбитальном шейкере.
    4. Проведите 4-5 дополнительных этапов промывки с помощью PBS.
    5. Перенесите гели на предметные стекла микроскопа и закрепите их двумя каплями DAPI-содержащей монтажной среды на покровном стекле, надеваемом на каждый гель. Дайте образцам высохнуть перед запечатыванием лаком для ногтей и храните их в темноте при температуре 4 °C.
  4. Микроскопия
    1. Визуализируйте все образцы на конфокальном микроскопе. Используйте объектив 20x и сфокусируйтесь на области интереса. Получайте изображения в виде Z-стеков, а также изображения в отдельной фокальной плоскости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Получение изображений Z-стека и фокальной плоскости на нескольких срезах по всему 3D-образцу имеет важное значение для получения полного представления, особенно для толстых 3D-образцов.

8. Микрососудистые эндотелиальные клетки сетчатки человека (HRMVECs)

ПРИМЕЧАНИЕ: Все описанные шаги также могут быть выполнены с микрососудистыми эндотелиальными клетками, например, микрососудистыми эндотелиальными клетками сетчатки человека (HRMVECs). В этом случае среду необходимо переключить на определенную среду микрососудистых эндотелиальных клеток, содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) для культивирования, а также для выполнения определенных этапов в каждом анализе. Специфические для HRMVEC отличия от протоколов анализа описаны ниже:

  1. Анализ царапины на рану
    1. Культивируйте клетки в среде микрососудистых эндотелиальных клеток FBS с 10% содержанием вместо ЭГМ.
    2. Засейте 20 000 клеток в лунку.
    3. Не морите камеры голодом на ночь.
    4. После выполнения царапины замените среду на среду базальных эндотелиальных клеток, содержащую 5% FBS, вместо EBM с 2% FBS.
  2. Иммуноцитохимия 2D культивируемых HRMVEC
    1. Культивируйте клетки в 10% микрососудистой эндотелиальной клеточной среде вместо ЭГМ.
    2. Не морите камеры голодом на ночь.
    3. Непосредственно перед лечением смените среду на EBM + 5% FBS вместо EBM+2% FBS.
  3. Сфероидальный анализ на проращивание
    1. Засейте клетки в виде висячих капель микрососудистой эндотелиальной клеточной средой, содержащей 10% FBS вместо EGM.
  4. Иммуноцитохимия сфероидов в 3D коллагеновой матрице
    1. Засейте клетки в виде висячих капель микрососудистой эндотелиальной клеточной средой, содержащей 10% FBS вместо EGM.

Результаты

Для анализа миграции крайне важно тщательно изучить изображения, полученные в момент t = 0 ч, чтобы убедиться, что наличие полностью сформированного монослоя клетки точно обнаруживается системой (рис. 1B). Кроме того, следует подтвердить четкость и прямолинейность границы царапины (рисунок 1B). Зона, свободная от клеток, должна быть в значительной степени свободна от мусора. В конце анализа группа, получавшая стимуляцию, например, 25 нг/мл VEGF в качестве положительного контроля, должна показать успешную миграцию в исходной поцарапанной области (рис. 1B). Технические проблемы могут проявляться в виде неравномерного роста клеток, двойного царапания или волнистости границ царапин (рисунок 1C). Кроме того, важно установить существенный динамический диапазон между отрицательным контролем (EBM-стимулированные образцы) и положительным контролем (образцы VEGF) (рис. 1D). В нашей экспериментальной установке мы рассматриваем увеличение RWD на 25% после 12 ч как оптимальный диапазон (рис. 1D). В технически проблемном анализе положительный и отрицательный контроль не разделяются правильно, что указывает на низкий динамический диапазон (рисунок 1E).

Иммуноцитохимическое окрашивание HUVEC на покровных стеклах, визуализированное под флуоресцентным микроскопом для подтверждения успешного окрашивания (рис. 1F). Важно обследовать большинство клеток и определить характерную область предметного стекла. Специфичность окрашивания оценивают с помощью контрольного предметного стекла, обработанного только вторичным антителом, чтобы исключить неспецифическое связывание (рис. 1F). Специфические сигналы окрашивания должны быть критически изучены в соответствии с известной субклеточной локализацией белка-мишени. В качестве показателей успешного протокола иммуноокрашивания мы используем паттерны субклеточной локализации наряду с отсутствием сигнала в контрольной пробе.

Аналогичным образом, для получения высококачественных анализов на проращивание сфероидов необходимо учитывать определенные аспекты. В этом случае качество должно быть оценено в конце анализа, например, при t = 24 ч. Коллагеновая матрица, наблюдаемая под микроскопом, должна проявлять однородность и не должна казаться рыхлой или шероховатой (рис. 2В). Сфероиды, стимулированные только базальной средой в качестве отрицательного контроля и 25 нг/мл VEGF в положительном контроле, должны быть четко различимы (рис. 2B). Кроме того, сфероиды должны плавать в геле и не падать на землю, где они рассеиваются, что указывает на низкое качество (рисунок 2C). Эта проблема часто возникает из-за недостаточного охлаждения коллагена во время титрования смеси или из-за чрезмерного или недостаточного титрования pH (Рисунок 2C). Минимум 10 сфероидов на лунку должны быть визуализируемыми для каждой лунки. Отрицательный контроль (EBM-стимулированные образцы) должен демонстрировать умеренную исходную скорость прорастания, в то время как VEGF, выступающий в качестве положительного контроля, в идеале удваивает или, предпочтительно, утраивает RSL по сравнению с контролем (рис. 2D, левый график). Количество ростков также должно показывать аналогичный динамический диапазон (Рисунок 2D, правый график). Технический неоптимальный анализ не покажет этот динамический диапазон между контрольными группами и, следовательно, может привести к ложной интерпретации данных (рисунок 2E).

Аналог 2D окрашивания, изучение предметных стекол под флуоресцентным микроскопом и критическая оценка окрашенных структур имеют большое значение для успешного окрашивания (рис. 2F). Если ячеистая локализация структур и интенсивность сигнала по сравнению с контролем понятны, можно предположить, что окрашивание прошло успешно.

figure-results-1
Рисунок 1: Анализ миграции царапин на рану с помощью визуализации живых клеток. (A) Схема анализа миграции царапин на рану. (B) Изображения, демонстрирующие высококачественную техническую реплику при t = 0 ч и t = 12 ч. Клетки стимулировали VEGF в концентрации 25 нг/мл в качестве положительного контроля. (В) Примеры двух некачественных технических повторов при t = 0 ч из-за неправильной царапины или двойного царапины. (D) Результаты успешного анализа миграции царапин на рану. Правильное разделение положительного контроля, стимулированного VEGF 25 нг/мл, и отрицательного контроля, только обработанного базальной средой, было дополнительно визуализировано с помощью графика Скрипки при t = 12 ч. Данные включают 7-8 технических повторов на группу. (E) Примерные результаты, свидетельствующие о неудачном анализе миграции царапин на рану. Субоптимальное разделение положительного контроля, стимулированного VEGF 25 нг/мл, и отрицательного контроля, только обработанного базальной средой, визуализировали с помощью графика Скрипки при t = 12 ч. Данные включают 7-8 технических повторов на группу. (F) Примеры изображений HUVEC, нанесенных на покровные листы и окрашенных на DAPI, фаллоидин и VEGF-R2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Анализ прорастания сфероида. (А) Схема анализа прорастания сфероида. (B) Изображения, демонстрирующие отрицательный контроль (базальные стимулированные средой сфероиды) и положительный контроль (VEGF 25 нг/мл стимулированных сфероидов) идеального технического анализа в конце при t = 24 ч. (C) Примеры двух сфероидов низкого качества при t = 24 ч. На изображениях слева виден поврежденный сфероид, который упал на дно пластины, что приводит к ослаблению корпуса сфероида и аномально увеличенной скорости прорастания. Правильное изображение визуализирует коллаген с заметными цветовыми пятнами, создавая крайне неоднородную среду, которая значительно ухудшает качество анализа. (D) Анализ RSL (левый график) и количества ростков (правый график) успешного анализа с хорошим динамическим диапазоном между отрицательным и положительным контролем. Данные визуализируются с помощью графика скрипки и включают в себя 10-25 сфероидов на группу. (E) Анализ RSL (левый график) и количества ростков (правый график) технического проблемного анализа с неоптимальным динамическим диапазоном между отрицательным и положительным контролем. Данные визуализируются с помощью графика скрипки и включают в себя 10-25 сфероидов на группу. (F) Примеры изображений HUVEC из анализа прорастания сфероидов, окрашенных на DAPI, фаллоидин и VEGF-R2.c

Дополнительный файл 1: Инструкция по приготовлению исходного раствора методического метода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Плагин SpheroidCount.ijm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

В этом отчете мы представили спектр методов с функциональными и молекулярными показаниями для изучения ангиогенеза in vitro.

Миграционный анализ представляет собой хорошо зарекомендовавший себя метод, используемый во всех областях влажной лабораторной работы. Мы выбрали коммерчески доступный подход к визуализации живых клеток, чтобы воспользоваться преимуществами 96-луночного формата, подходящего для скрининга и экспериментов «доза-реакция», стандартизированного и воспроизводимого размера раны, созданного с помощью инструмента WoundMaker, возможности наблюдать кинетическую миграцию с помощью покадровой визуализации в течение 24 часов, а также программного обеспечения для автоматического количественного определения изображений. Тем не менее, необходимо наличие системы визуализации клеток жизни, оснащенной программным обеспечением для анализа ангиогенеза в лаборатории или на базовом объекте. Было создано множество альтернативных экспериментальных установок, которые не требуют специальных микроскопов для визуализации живых клеток или другогоспециального оборудования.

Исходя из нашего опыта, крайне важно оптимизировать настройки анализатора, так как HUVEC и другие типы эндотелиальных клеток сосудов могут иметь тенденцию к низкому контрасту, тем самым препятствуя автоматическому считыванию данных программным обеспечением микроскопа. Чтобы решить эту проблему, можно ввести дополнительный этап флуоресцентного окрашивания (например, окрашивание живыми клетками). Системы визуализации живых клеток поддерживают такое окрашивание и даже многоцветное окрашивание для отслеживания интересующего белка. Одним из основных ограничений анализа является то, что дифференциация между миграцией и пролиферацией клеток не всегда является прямой, и что результаты анализа представляют собой комбинацию обоих процессов. Решение для визуализации живых клеток, используемое в этом исследовании, пытается решить эту проблему путем введения относительной плотности ран (RWD). В отличие от традиционно используемого слияния в области царапины, RWD оценивает слияние в пределах поцарапанной области относительно внешней области царапины. Миграция в поцарапанной области повышает RWD за счет увеличения слияния внутри нее и одновременного уменьшения слияния за пределами поцарапанной области из-за миграции клеток. И наоборот, пролиферация клеток также увеличивает слияние за пределами поцарапанной области, тем самым уменьшая RWD. Важно признать, что этот подход основан на стратегическом анализе, позволяющем лишь уменьшить влияние распространения на окончательные данные. Для решения этой проблемы могут потребоваться дополнительные анализы пролиферации. В качестве альтернативы в анализ могут быть добавлены ингибиторы клеточного цикла, такие как митомицин С, для блокирования пролиферации. Реализация протоколов с этими ингибиторами должна быть тщательно оптимизирована в каждой лаборатории для достижения желаемого эффекта без сужения динамического диапазона анализа. Кроме того, увеличивая частоту сканирования каждой скважины, эта установка предлагает легко реализуемую возможность точного отслеживания движущихся ячеек на индивидуальном уровне, если такое подробное отслеживание представляет особый интерес.

В то время как анализ миграции живых клеток демонстрирует преимущество масштабируемости и автоматизированного, непредвзятого анализа, наше предыдущее исследование подчеркнуло способность анализа прорастания сфероидов захватывать более сложные детали ангиогенеза. Это включает в себя такие фундаментальные аспекты, как образование клеток на кончике и стебле, взаимодействие между клеткой и матриксом и гликолитический переключатель12. Чтобы гарантировать воспроизводимость анализа, исследователь должен иметь опыт подготовки коллагеновой матрицы, так как изменения pH и температуры во время этого процесса могут повлиять на результаты. Кроме того, анализ проводится вручную. Таким образом, анализ изображений занимает много времени и сопряжен с риском систематической ошибки. Правильная маскировка условий во время анализа имеет важное значение для предотвращения возникновения систематической ошибки. Чтобы решить эту проблему, мы недавно предложили основанный на нейронных сетях подход к выявлению и смягчению потенциальной систематической ошибки при анализе анализов прорастания, который может быть легко реализован17. В заключение следует отметить, что лучшим подходом к проверке результатов является объединение обоих анализов. Тем не менее, важно признать, что различия могут возникать из-за различного характера настроек 2D и 3D12.

Поскольку существует широкий выбор 2D и 3D анализов ангиогенеза in vitro , важно учитывать преимущества и недостатки представленных анализов по сравнению с другими методами. Например, анализ царапин на ранах фокусируется на 2D-горизонтальной миграции на пластиковой чашке, в то время как анализ камеры Бойдена характеризует вертикальную миграцию через сетчатую вставку с хемоаттрактантом в «внешней камере». Основанный на простой настройке и считывании, анализ царапин раны позволяет проводить высокопроизводительные эксперименты, особенно в формате 96 лунок, обеспечивая высокую воспроизводимость, а также возможность визуализации эксперимента и проведения покадровой съемки. К сожалению, недостатками анализа царапин являются сложность дифференциации пролиферации и миграции, потребность в адгезивных клетках и, при отсутствии инструмента для создания раны, более высокая вариабельность из-за неодинаковых царапин. Преимущество показаний анализа камеры Бойдена заключается в измерении хемотаксического действия растворимых веществ на подвижные клетки18 и выявлении как инвазии, так и миграции. К сожалению, недостатками являются плохая воспроизводимость и высокая дисперсия анализа, невозможность визуализации движения клеток, большое количество мигрирующих клеток, необходимых для получения сигнала, довольно длительная и сложная настройка и считывание, а также отсутствие возможности настройки таймлапса19.

Анализ проращивания сфероидов количественно определяет прорастание эндотелиальных клеток в 3D-гелевую матрицу, в то время как анализ формирования трубок характеризует образование клеточных трубок на поверхности гелевой матрицы20. Преимущество анализа прорастания состоит в том, что он характеризует вторжение клеток в матрикс, а также пролиферацию и миграцию. Недостатками являются более высокая вариативность титруемого коллагенового геля и, исходя из этого, качество сфероидов. Преимуществом анализа на формирование трубок является формирование сосудистых трубок через определенное время (в зависимости от цитокина) и простой подход. Недостатками являются отсутствие инвазии клеток и влияние самого Матригеля на образование трубок21.

Все представленные эксперименты проводились с использованием HUVEC. Хорошо известно, что существуют значительные различия в поведении эндотелиальных клеток сосудов различного происхождения (например, макрососудистых и микрососудистых)22,23. Таким образом, может возникнуть необходимость в проверке экспериментальных результатов с другими линиями сосудистых эндотелиальных клеток. Экспериментальные условия были переносимы на микрососудистый эндотелий сетчатки человека (HRMVECS), за исключением того факта, что HRMVEC требуют более высоких концентраций FBS. С другой стороны, обычно используемая линия эндотелиальных клеток аорты крупного рогатого скота (BAECs) не может быть использована в анализе сфероидального прорастания из-за чрезмерной скорости базального прорастания.

Оба представленных анализа имеют общее ограничение, заключающееся в том, что они ограничены одним типом клеток. Учитывая, что ангиогенез in vivo является сложным многоклеточным процессом, этот важнейший аспект не точно отражен ни в одном из анализов. Для обоих анализов были разработаны варианты совместного культивирования, с особым акцентом на анализ прорастания сфероидов, и недавно обсуждались10,24. В качестве альтернативы, проверка данных непосредственно в соответствующих моделях ангиогенеза in vivo представляет собой жизнеспособный вариант. Для этой цели были проведены такие исследования, как мышиная модель кислород-индуцированной ретинопатии (OIR)25, лазерно-индуцированная хориоидальная неоваскуляризация (Laser-CNV) модель26 и пробковый анализ27.

В целом, как 2D-анализ миграции живых клеток, так и 3D-анализ прорастания сфероидов, в сочетании с представленными инструментами молекулярного анализа, предлагают надежную платформу для исследований ангиогенеза и широко признаны в сообществе ангиогенеза. Сочетание этих анализов с последующими анализами in vivo для подтверждения полученных результатов обеспечивает прочную основу для изучения конкретных вопросов, связанных с ангиогенезом.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в данном проекте.

Благодарности

Авторы благодарят Софи Крюгер и Габриэль Принц за их отличную техническую поддержку. Мы благодарим Себастьяна Майера за разработку плагина ImageJ для количественного определения ростков сфероидов и Lighthouse Core Facility, Zentrum für Translationale Zellforschung (ZTZ), отделение медицины I, университетскую клинику Фрайбурга за использование системы IncuCyte. Графика создана с использованием biorender.com. Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft [Bu3135/3-1 + Bu3135/3-2 to F.B.], Medizinische Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg [Berta-Ottenstein-Program for Clinician Scholars to F.B.], Else Kröner-Fresenius-Stiftung [2021_EKEA.80 to F.B.], Немецким онкологическим консорциумом [CORTEX fellowship for Clinician Scholars to J.R.] и Volker Homann Stiftung [to J.N.+F.B.] и "Freunde der Universitäts-Augenklinik Freiburg" e.V." [.Л.]

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10x Средний 199Sigma-AldrichM0650
Alexa Fluor 647-конъюгированный AffiniPure F(ab)' 2-фрагментныйДжексон IR 115-606-072
Axio Vert. A1Zeiss
CapturePro 2.10.0.1JENOTIK Оптические системы
Коллаген Тип 1 крысиный хвостCorning354236
Коллагеназа DRoche 
Среда базальных эндотелиальных клетокLonzaCC-3156EBM
Среда для роста эндотелиальных клеток LonzaCC-3162EGM
этилендиаминтетрауксусная кислота Serva11290.02EDTA
Фетальная бычья сывороткаBio& SELLS 0615FBS
Эндотелиальные клетки пупочной вены человека, объединенныеLonzaC2519AHUVEC
IncuCyte ImageLock 96-луночные планшеты Sartorius4379
Incucyte S3 Система анализа живых клетокSartorius
MethocelSigmam-0512
Микрососудистая эндотелиальная клеточная среда с 10% FBSPB-MH-100-4090-GFPPELOBiotech
NaOHCarl RothP031.2
Фаллоидин-флуоресцеин изотиоцианат меченый (0,5 мг/мл метанола)Sigma-AldrichP5282-.1MGPhalloidin-FITC
фосфатно-солевой буферный растворThermo Fisher Scientfic14190-094
PBS Первичные микрососудистые эндотелиальные эндотелиальные клетки сетчатки человекаКлеточные системыACBRI 181
ProLong Glass Antifade Mountant with NucBlueInvitrogen от ThermoFisher Scientific2260939
QIAzol Lysis ReagentQIAGEN79306
рекомбинантный фактор роста эндотелия сосудов человекаPeproTech100-20VEGF
Квадратная чашка ПетриГрейнер688102
ТризолQiagen79306
ТрипсинPAN-BiotecP10-024100
VEGF-R2 (моноклональный)ThermoFisher Scientific Inc.B.309.4
РанмейкерСарториус4493
11088858001

Ссылки

  1. Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
  2. Gariano, R. F., Gardner, T. W. Retinal angiogenesis in development and disease. Nature. 438 (7070), 960-966 (2005).
  3. Mancuso, M. R., Kuhnert, F., Kuo, C. J. Developmental angiogenesis of the central nervous system. Lymphat Res Biol. 6 (3-4), 173-180 (2008).
  4. Tonnesen, M. G., Feng, X., Clark, R. A. Angiogenesis in wound healing. J Investig Dermatol Symp Proc. 5 (1), 40-46 (2000).
  5. Folkman, J. Role of angiogenesis in tumor growth and metastasis. Semin Oncol. 29, 6 Suppl 16 15-18 (2002).
  6. Crawford, T. N., Alfaro, D. V., Kerrison, J. B., Jablon, E. P. Diabetic retinopathy and angiogenesis. Curr Diabetes Rev. 5 (1), 8-13 (2009).
  7. Ng, E. W., Adamis, A. P. Targeting angiogenesis, the underlying disorder in neovascular age-related macular degeneration. Can J Ophthalmol. 40 (3), 352-368 (2005).
  8. Blanco, R., Gerhardt, H. Vegf and notch in tip and stalk cell selection. Cold Spring Harb Perspect Med. 3 (1), 006569(2013).
  9. Hellström, M., Kalén, M., Lindahl, P., Abramsson, A., Betsholtz, C. Role of PDGF-B and PDGFR-β in recruitment of vascular smooth muscle cells and pericytes during embryonic blood vessel formation in the mouse. Development. 126 (14), 3047-3055 (1999).
  10. Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
  11. Korff, T., Augustin, H. G. Tensional forces in fibrillar extracellular matrices control directional capillary sprouting. J Cell Sci. 112, Pt 19 3249-3258 (1999).
  12. Rapp, J., et al. 2D and 3D in vitro angiogenesis assays highlight different aspects of angiogenesis. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1870 (3), 167028(2024).
  13. Rapp, J., et al. STAT3 signaling induced by the IL-6 family of cytokines modulates angiogenesis. J Cell Sci. 136 (1), 260182(2023).
  14. Heiss, M., et al. Endothelial cell spheroids as a versatile tool to study angiogenesis in vitro. FASEB J. 29 (7), 3076-3084 (2015).
  15. Rapp, J., et al. Oncostatin m reduces pathological neovascularization in the retina through müller cell activation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (1), 22(2024).
  16. Fagotto, F., Gumbiner, B. M. Cell contact-dependent signaling. Dev Biol. 180 (2), 445-454 (1996).
  17. Rapp, J., et al. Addressing bias in manual segmentation of spheroid sprouting assays with U-Net. Mol Vis. 29, 197-205 (2023).
  18. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115 (3), 453-466 (1962).
  19. Guy, J. B., et al. Evaluation of the cell invasion and migration process: A comparison of the video microscope-based scratch wound assay and the Boyden chamber assay. J Vis Exp. (129), e56337(2017).
  20. Decicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. J Vis Exp. (91), e51312(2014).
  21. Vernon, R. B., Angello, J. C., Iruela-Arispe, M. L., Lane, T. F., Sage, E. H. Reorganization of basement membrane matrices by cellular traction promotes the formation of cellular networks in vitro. Lab Invest. 66 (5), 536-547 (1992).
  22. Craig, L. E., Spelman, J. P., Strandberg, J. D., Zink, M. C. Endothelial cells from diverse tissues exhibit differences in growth and morphology. Microvasc Res. 55 (1), 65-76 (1998).
  23. Müller, A. M., Hermanns, M. I., Cronen, C., Kirkpatrick, C. J. Comparative study of adhesion molecule expression in cultured human macro-and microvascular endothelial cells. Exp Mol Pathol. 73 (3), 171-180 (2002).
  24. Chiew, G. G. Y., Wei, N., Sultania, S., Lim, S., Luo, K. Q. Bioengineered three-dimensional co-culture of cancer cells and endothelial cells: A model system for dual analysis of tumor growth and angiogenesis. Biotechnol Bioeng. 114 (8), 1865-1877 (2017).
  25. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. 35 (1), 101-111 (1994).
  26. Lambert, V., et al. Laser-induced choroidal neovascularization model to study age-related macular degeneration in mice. Nat Protoc. 8 (11), 2197-2211 (2013).
  27. Kastana, P., et al. Matrigel plug assay for in vivo evaluation of angiogenesis. Methods Mol Biol. 1952, 219-232 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи