Этот протокол представляет собой быстрый и нелетальный метод получения паращитовидных желез у свиней. Процедура состоит из трех основных этапов: подготовка свиньи с анестезией, одностороннее извлечение тимуса и ex vivo идентификация и экстракция внутритимической паращитовидной железы.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Забор паращитовидных желез у живых свиней-доноров и идентификация ex vivo
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Гипопаратиреоз, часто возникающий в результате хирургических осложнений, серьезно нарушает гомеостаз кальция, что приводит к инвалидизирующим симптомам. Современные методы лечения приносят ограниченное облегчение, что подчеркивает необходимость альтернативных методов лечения, таких как трансплантация паращитовидных желез. В этом исследовании представлен простой метод получения паращитовидных желез от живых доноров от свиней с потенциальными применениями в исследованиях в области трансплантации, особенно в области ксенотрансплантации. Процедура включает в себя три ключевых этапа: подготовка свиньи с анестезией, одностороннее извлечение тимуса, а также идентификация ex vivo и извлечение интратимической паращитовидной железы. В протоколе используются свиньи породы Ландрас, а процедуры обеспечивают этичное лечение и восстановление после операции. Мы успешно извлекли паращитовидные железы, подтвердив их жизнеспособность и целостность путем последующего анализа. Уровни ПТГ в тканевой надосадочной жидкости превышали 1000 пг/мл, а иммунофлуоресцентное окрашивание отличало паращитовидные железы от ткани тимуса, подтверждая надежность процедуры. Этот протокол предлагает быстрый, нелетальный и этически обоснованный метод забора паращитовидных желез у свиней, устраняя анатомические различия между свиньями и людьми. Он предлагает устойчивый подход со значительными последствиями для исследований гипопаратиреоза и ксенотрансплантации.
Введение
Этот протокол представляет собой быстрый и нелетальный метод забора паращитовидных желез у свиней. Гипопаратиреоз, характеризующийся недостаточной секрецией паратгормона, критически нарушает гомеостаз кальция1. Это состояние, преимущественно хирургическое осложнение после паратиреоидэктомии или тиреоидэктомии, проявляется такими симптомами, как астения, хроническая боль, тахикардия, судороги и даже терминальная стадия почечной недостаточности. Иногда он возникает из-за редких аутоиммунных или генетических нарушений. Современные методы лечения, в основном кальций и витамин D в виде пероральных добавок или рекомбинантного паратгормона, обеспечивают лишь частичное облегчение системных симптомов, таких как усталость и депрессия. Растущая потребность в аллотрансплантации паращитовидных желез как потенциальном средстве лечения тяжелого гипопаратиреоза подчеркивает необходимость создания единых протоколов трансплантации 5,6,7,8,9. Тем не менее, доклинические исследования трансплантации паращитовидных желез остаются ограниченными, и существует нехватка стандартизированных моделей на животных. Кроме того, недавний всплеск в области ксенотрансплантации10,11 повышает интерес к клиническому применению ксенотрансплантации, особенно в области эндокринной клеточной терапии12,13. Тем не менее, модели ксенотрансплантации паращитовидных желез у свиней являются сложными из-за сложности идентификации ткани паращитовидных желез у свиней. Таким образом, существует необходимость в обеспечении воспроизводимого, устойчивого и этичного метода извлечения паращитовидных желез у свиней для дальнейшего развития ксенотрансплантации паращитовидных желез.
В отличие от людей, которые обычно имеют четыре паращитовидные железы, расположенные за щитовидной железой, свиньи имеют в большинстве случаев две паращитовидные железы, каждая из которых расположена в черепной части тимуса. Предыдущие исследования, направленные на обнаружение паращитовидных желез у свиней, основывались либо на летальных методах идентификации ex vivo, либо на методах на основе флуорофора, которые могут быть трудно реализовать при ксенотрансплантации. Здесь мы предлагаем простую и нелетальную технику, подходящую для ксенотрансплантации, основанную на двух ключевых этапах: извлечение тимуса свиньи и экстра живоевыделение паращитовидной железы с помощью трансиллюминации. Этот метод может быть полезен для исследований в области физиологии паращитовидных желез, а также для трансплантации.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все исследования на животных были одобрены комитетом по этике животных Университета Лилля (ссылка #20491-20190219161313).
1. Анестезия свиней
- Ввести бупренорфин (0,015 мг/кг, внутримышечно) за 30 минут до первого разреза для обеспечения предоперационной анальгезии.
- Выполните внутримышечную инъекцию кетамина (50 мг/кг) и ксилазина (3 мг/кг) для индуцирования седативного эффекта. Вводите 5% изофлуран ингаляционно в течение 3-5 минут для углубления анестезии.
- Оцените глубину анестезии, проверив рефлекс закрытия век и рефлекс глотания. Интубируйте свинью и положите ее лежа на операционный стол. Снизьте концентрацию изофлурана до 2% с помощью ингаляций для поддержания анестезии.
- Непрерывно контролируйте частоту сердечных сокращений и насыщение кислородом с помощью портативного многопараметрического ветеринарного монитора, чтобы обеспечить оптимальную глубину анестезии и физиологическую стабильность на протяжении всей процедуры.
2. Экспозиция интересующей территории
- Брейте и тщательно очищайте шейный отдел, простирающийся от подчелюстной области до грудины.
- Нанесите антисептическое мыло, а затем хлоргексидин, чтобы обеспечить стерильное поле. Тщательно просушите весь участок.
- Расположите стерильные простыни, чтобы изолировать переднюю шейную область для хирургического вмешательства.
3. Воздействие свиного тимуса
- Выполните вертикальный разрез 10 см по белой шейной линии с помощью скальпеля. Осторожно рассеките эту область ножницами Метценбаума, чтобы отделить предщитовидные мышцы, создав чистое операционное поле.
- Поместите самоудерживающийся ретрактор между омогиоидной мышцей и щитовидным хрящом, чтобы облегчить рассечение соединительной ткани и обнажить тимус.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте чрезмерного давления на трахею, чтобы предотвратить травму. - Постепенно обнажайте черепную часть тимуса и осторожно отделите ее от сонной артерии, в которой находятся блуждающий нерв, внутренняя яремная вена и общая сонная артерия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения травм используйте электрокоагуляцию для достижения гемостаза.
4. Извлечение свиного тимьяна
- После высвобождения извлеките черепную часть тимуса, которая обычно имеет размер 5-8 см.
- Промойте извлеченный тимус в изотоническом солевом растворе, чтобы облегчить идентификацию паращитовидной железы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение для улучшения визуализации и дифференцировки отчетливой текстуры паращитовидной железы
5. Идентификация внутритимической паращитовидной железы ex vivo
- Аккуратно разгладьте ткань тимуса, чтобы облегчить идентификацию паращитовидных желез.
ПРИМЕЧАНИЕ: Паращитовидная железа имеет характерную текстуру, особенно по сравнению с окружающими тканями. Фиброзная капсула паращитовидной железы более твердая и по размеру похожа на горошину. - Используйте источник света для определения паращитовидной железы с помощью трансиллюминации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сосудистая сеть, окружающая паращитовидную железу, должна быть хорошо видна, что способствует ее дифференцировке. - Тщательно иссекаем капсулу и извлекаем всю паращитовидную железу. Использование щипцов Debakey для деликатного обращения и ножниц Метценбаума для точного рассечения. Изолируйте железу от окружающей ткани тимуса.
- Поместите изолированную паращитовидную железу в раствор для хранения в холоде и поддерживайте его при температуре 4 °C, чтобы сохранить ее жизнеспособность для последующих процедур.
- Погрузите ткань в парафин для дальнейшей обработки.
6. Хирургическое закрытие и пробуждение
- После извлечения паращитовидной железы закройте операционное место слоями. Сшить мышцы и подкожные ткани с помощью рассасывающихся швов. Закройте кожу нерассасывающимися швами.
- Постепенно отучайте свинью от наркоза. Придя в сознание, наблюдайте за свиньей на предмет непосредственных послеоперационных осложнений.
- Применять анальгетики и антибиотики в соответствии с послеоперационным протоколом (бупренорфин 0,03 à 0,05 мг/кг и кламоксил 15 мг/кг в течение 48 ч). Верните свиней в помещение для выздоровления под ветеринарным наблюдением.
7. Протокол иммуноокрашивания
- Проводят депарафинизацию и дегидратацию из залитых парафином образцов: ксилола в течение 5 мин, ксилола в течение 10 мин, 100% этанола в течение 5 мин, 90% этанола в течение 7 мин 30, 70% этанола в течение 7 мин 30, 50% этанола в течение 5 мин, дистиллированной воды в течение 5 мин и фосфатно-буферного раствора (PBS) в течение 5 мин.
- Выполните извлечение антигенов путем разогрева образцов в микромикроволновой печи в цитратном буфере pH 6 при 650 Вт в течение 9 минут. Дайте образцам остыть в буфере в течение 20 минут. Промойте три раза PBS по 5 минут каждый.
- Инкубируйте образцы, окруженные ручкой Dako-pen, при комнатной температуре в течение 20 минут с раствором белкового блока, чтобы блокировать неспецифическое связывание.
- Образцы инкубируют в течение ночи при 4°C с первичным антителом (антитело к ПТГ (H-7), мышиный IgG-α-человек, sc-398856, 1:100) разведенным в 1% бычьем сывороточном альбумине (BSA). Дважды промыть PBS по 5 мин.
- Инкубировать в течение 1 ч 30 мин при комнатной температуре с вторичным антителом (Alexa Fluor 488, goat-α-Mouse, A11001, 1:500), разведенным в 1% бычьем сывороточном альбумине. Дважды промыть PBS и один раз дважды дистиллированной водой в течение 5 минут.
- Установите слайды с помощью раствора DAPI и храните слайды при температуре 4 °C.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Основные результаты этого исследования включают успешное извлечение паращитовидных желез у свиней породы Ландрас и последующий анализ для подтверждения их жизнеспособности и целостности. Результаты обобщены следующим образом. Идентификация ткани паращитовидных желез была подтверждена интраоперационно с помощью трансиллюминации (рис. 1A). После экстракции были собраны два небольших образца ткани (примерно по 10% каждый). Один образец измельчали в тарелке в 1 мл питательной среды DMEM...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол представляет собой быстрый и нелетальный метод получения паращитовидных желез у свиней. Ключевым этапом в рамках протокола является локализация тимуса свиньи для обеспечения полного извлечения для дальнейшего исследования ex vivo . После извлечения тимуса паращитовидная железа может быть легко идентифицирована с помощью трансиллюминации.
Одной из основных проблем этого метода является необходимость избежать зависимости от хирургических п...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Выражаем признательность Французскому обществу диабета и Фонду медицинских исследований за поддержку и финансирование исследований.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| 22G Короткий периферический катетер | Smiths Medical | 5060 | |
| Basic set II, креп | Hartmann | 9389253 | |
| Bupaq (bupré norphine) | Virbac | ||
| Favorita II | Aesculap Schermaschinen | GT104 | |
| Одноразовые скальпели | Swann-Morton | 0510 | |
| Электродный шпатель | Erbe | 21191-002 | |
| Электрохирургический генератор BE VIO 200p | Erbe | 10140-400 | |
| Euroklav 23 VS+ | MELAG | 10056 | |
| Гравитационный инфузионный 3-х ходовой клапан с подвижным наконечником Luer Lock | Care Fusion | A64-3V | |
| Ручка с двумя кнопками для электродов Slim-Line | Erbe | 20190-065 | |
| Изофлуран Воронкообразный испаритель | Супера Инновации в области анестезии | VAP3000 | |
| Изоран (изофлуран) | Axience | ||
| Кетамидор (ké tamine) | Axience | ||
| Light Ceiling Double | RIMSA | PENTA81+30E | |
| Medisorb Абсорбент углекислого газа | Vyaire | 8570043 | |
| Mersutures 0 | Ethicon | F2520 | |
| Microtome | LEICA RM2255 | ||
| Miller Blade | Opticlar | 600.020 | |
| Кислородный концентратор | DeVilbiss | 525KS | |
| Paxman (ксилазин) | Портативный | ||
| Многоразовый ларингоскоп | Mindray | ||
| Аппарат искусственной вентиляции легких для анестезии мелких животных | Midmark | 91806001 | |
| Хирургические инструменты | Kohler medizintechnik | ||
| Хирургический стол | Vetinox | TA700005 | |
| трахеальная трубка | Smiths Medical | 100/179/070 | |
| Vicryl 2-0 | Ethicon | JV453 | |
| VMS | Midmark | 91800003 | |
| Материалы и реагенты | |||
| DMEM F-12 средний | ThermoFischer | 11320033 | |
| антитела к паратгормону | SantaCruz | sc-398856 | |
| Быстрый интраоперационный анализ ПТГ | Beckman Coulter | A16972 |
Ссылки
- Gafni, R. I., Collins, M. T. Hypoparathyroidism. N. Engl. J. Med. 380, 1738-1747 (2019).
- Gosmanova, E. O., Houillier, P., Rejnmark, L., Marelli, C., Bilezikian, J. P. Renal complications in patients with chronic hypoparathyroidism on conventional therapy: a systematic literature review: Renal disease in chronic hypoparathyroidism. Rev. Endocr. Metab. Disord. 22, 297-316 (2021).
- Frey, S., et al. Impact of permanent post-thyroidectomy hypoparathyroidism on self-evaluation of quality of life and voice: results from the national qol-hypopara study. Ann. Surg. 274, 851-858 (2021).
- Büttner, M., Krogh, D., Siggelkow, H., Singer, S. What are predictors of impaired quality of life in patients with hypoparathyroidism. Clin. Endocrinol. (Oxf). 97, 268-275 (2022).
- Gadelha, D. D., Filho, W. A., Brandão, M. A. J., Montenegro, R. M. Is parathyroid allotransplantation a viable option in the treatment of permanent hypoparathyroidism? A review of the literature. Endocrine. 80 (2), 253-265 (2022).
- Sakane, E. N., Vieira, M. C. C., Vieira, G. M. M., Maeda, S. S. Treatment options in hypoparathyroidism. Arch. Endocrinol. Metab. 66, 651-657 (2022).
- Zhang, J. L. H., Appelman-Dijkstra, N. M., Schepers, A. Parathyroid allotransplantation: A systematic review. Med. Sci. 10, 19(2022).
- Goncu, B., et al. Graft survival effect of HLA-A allele matching parathyroid allotransplantation. J. Investig. Med. Off. Publ. Am. Fed. Clin. Res. 69, 785-788 (2021).
- Barczyński, M., Gołkowski, F., Nawrot, I. Parathyroid transplantation in thyroid surgery. Gland Surg. 6, 530-536 (2017).
- Montgomery, R. A., et al. Results of two cases of pig-to-human kidney xenotransplantation. N. Engl. J. Med. 386, 1889-1898 (2022).
- Loupy, A., et al. Immune response after pig-to-human kidney xenotransplantation: a multimodal phenotyping study. The Lancet. 402, 1158-1169 (2023).
- Goncu, B., et al. Xenotransplantation of microencapsulated parathyroid cells as a potential treatment for autoimmune-related hypoparathyroidism. Exp. Clin. Transplant. Off. J. Middle East Soc. Organ Transplant. 21, 901-912 (2023).
- Hasse, C., et al. Parathyroid xenotransplantation without immunosuppression in experimental hypoparathyroidism: long-term in vivo function following microencapsulation with a clinically suitable alginate. World J. Surg. 24, 1361-1366 (2000).
- Oster, M., et al. Fast and reliable dissection of porcine parathyroid glands - A protocol for molecular and histological analyses. Ann. Anat. - Anat. Anz. 219, 76-81 (2018).
- Hyun, H., et al. Structure-inherent targeting of near-infrared fluorophores for parathyroid and thyroid gland imaging. Nat. Med. 21, 192-197 (2015).
- Klute, K. Contribution to the topography and histology of porcine parathyroid glands. , Justus Liebig University of Giessen. Beitrag zur Topographie und Histologie der Epithelkörperchen des Schweines. Ph.D. thesis. Justus Liebig-Universität zu Giessen (1959).
- Arndt, H. On the topography of epithelial cells in pigs with special consideration of the suitability of pigs for the production of organo-therapeutic epithelial cell preparations. Z. Anat. 81, (Zur Topographie der Epithelkörperchen beim Schwein mitbesonderer Berücksichtigung der Eignung des Schweines für die Gewinnungorgano-therapeutischer Epithelkörperchenpräparate) 191-197 (1926).
- Butylina, M., Föger-Samwald, U., Gelles, K., Pietschmann, P., Sipos, W. Challenges in establishing animal models for studying osteoimmunology of hypoparathyroidism. Front. Vet. Sci. 10, 1163903(2023).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
