Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Доставка олигонуклеотидной полезной нагрузки наночастицами в животной модели мультиформной глиобластомы

2.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66986

⸱

27 сентября 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Precision Health Program, Michigan State University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Michigan State University, 3Department of Radiology, College of Human Medicine, Michigan State University, 4Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Michigan State University, 5Henry Ford Health, 6Transcode Therapeutics Inc.

В этой статье

Краткое содержание

Гематоэнцефалический барьер является серьезным препятствием в проведении терапии глиобластомы, заболевания, от которого нет лекарства. В этой статье мы сообщаем о терапевтической наноплатформе на основе оксида железа in vivo под визуальным контролем, которая может обходить этот физиологический барьер благодаря своему размеру и накапливаться в опухоли.

Аннотация

Мультиформная глиобластома (ГБМ) является наиболее распространенной и агрессивной формой первичного злокачественного новообразования головного мозга, от которого нет лечения. Гематоэнцефалический барьер является значительным препятствием в доставке терапии ГБМ. Здесь представлена наноплатформа терапевтической доставки на основе оксида железа под визуальным контролем, способная обходить этот физиологический барьер благодаря своему размеру и накапливаться в области опухоли, доставляя ее полезную нагрузку. Эта наноплатформа с длиной волны 25 нм состоит из наночастиц оксида железа, покрытых сшитым декстраном, помеченных флуоресцентным красителем Cy5.5 и содержащих антисмысловой олигонуклеотид в качестве полезной нагрузки. Магнитное ядро из оксида железа позволяет отслеживать наночастицы с помощью магнитно-резонансной томографии in vivo , в то время как краситель Cy5.5 позволяет отслеживать с помощью оптической визуализации. В этом отчете подробно описан мониторинг накопления этой платформы наночастиц (называемой MN-anti-miR10b) в ортотопически имплантированных опухолях глиобластомы после внутривенного введения. Кроме того, она дает представление о доставке РНК-олигонуклеотидов in vivo , проблеме, которая препятствует внедрению РНК-терапии в клинику.

Введение

Мультиформная глиобластома (ГБМ) является астроцитомой высшей степени, от которой практически не существует лечения. Ежегодно примерно у 15 000 человек диагностируется глиобластома, которая имеет удручающую среднюю выживаемость около 15 месяцев и 5-летнюю выживаемость 5%. В последние десятилетия наблюдалось незначительное улучшение прогноза, несмотря на многочисленные усилия по продвижению терапевтических вариантов. Текущий стандарт лечения ГБМ включает максимальную хирургическую резекцию, когда это возможно, с последующей лучевой терапией и химиотерапией. Темозоломид (TMZ), химиотерапия выбора, был последним методом лечения глиобластомы, который показал заметную клиническую эффективность; однако, по крайней мере, 50% опухолей GBM проявляют устойчивость к TMZ3. Несмотря на такой строгий терапевтический режим, все еще существует значительная клиническая потребность в улучшенной терапии глиобластомы.

Разработка терапевтических средств для лечения ГБМ и других заболеваний, связанных с мозгом, значительно затруднена избирательным характером гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). ГЭБ представляет собой физиологический барьер, состоящий из эндотелиальных клеток, перицитов и концов астроцитов, который создает полупроницаемую мембрану между кровеносной системой и мозгом, ограничивая свободное прохождение молекул и клетокв мозг. Будучи защитным в нормальной физиологии и критически важным для гомеостаза мозга, ГЭБ предотвращает попадание многих терапевтических средств в мозг, что усложняет лечение ГБМ. Усилия по улучшению доставки терапевтических средств к GBM привели к разработке средств доставки на основе наночастиц, улучшения доставки лекарств с помощью сфокусированного ультразвука и рецептор-опосредованной доставки лекарств 5,6.

Наночастицы стали многообещающей средой для разработки терапевтических средств для лечения множества заболеваний, включая рак. Применение наночастиц в визуализационных и терапевтических целях при ГБМ было предпринято с использованием различных конструкций наночастиц 7,8. С акцентом на доставку лекарств в GBM в сочетании с визуализацией in vivo доставки, в предлагаемом подходе используются магнитные наночастицы (MN), состоящие из ядра оксида железа и покрытые декстрана для стабильности. Магнитные свойства этих наночастиц позволяют обнаруживать их с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ), в то время как простая химия конъюгации с аминированным покрытием декстрана позволяет конъюгировать терапевтические фрагменты, такие как молекулы РНК, дополнительные целевые фрагменты или фрагменты визуализации (такие как оптический краситель ближнего инфракрасного диапазона Cy5.5)9,10. В дополнение к возможностям визуализации, наноплатформа способна продлить период полувыведения РНК-терапевтических препаратов, защищая олигонуклеотид от эндогенных нуклеаз, улучшая терапевтическую доставку. Здесь представлено применение этой наноплатформы для доставки in vivo терапевтических олигонуклеотидов (называемых MN-anti-miR10b) в GBM, контролируемых с помощью визуализации in vivo. Ранее способность этой наноплатформы к накоплению была продемонстрирована в клетках GBM in vitro, что приводит к значительной потере жизнеспособности опухолевых клеток11. Прежде чем проводить терапевтические исследования in vivo, необходимо продемонстрировать in vivo доставку этой наноплатформы к опухолям GBM на животных моделях. Для этого были изготовлены ортотопические животные модели GBM, а также проведено внутривенное введение конструкции с последующей визуализацией in vivo. Ниже приведены протоколы этих исследований, показывающие накопление в области опухоли, подтвержденное визуализацией in vivo и микроскопией ex vivo.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Мичиганского государственного университета. Самки беспородных обнаженных мышей были приобретены в Jackson Labs (штамм #007850) в возрасте 7 недель и им дали акклиматизироваться в течение 1 недели перед операцией по имплантации. На момент имплантации у мышей было примерно 21-25 г. Клетки U251, экспрессирующие люциферазу светлячков, были получены и предоставлены доктором Аной де Карвальо12.

1. Культивирование клеток и подготовка к имплантации

  1. Культивирование меченых люциферазой клеток глиобластомы человека, U251 в модифицированной среде Dulbecco Eagle Medium (DMEM), содержащей D-глюкозу, L-глутамин и пируват натрия и дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой и 1% пенициллином/стрептомицином при 37 °C с 5%CO2.
  2. Как только клетки достигнут 70% конфлюенции, трипсинизируйте 0,25% трипсина/ЭДТА в течение 1-2 минут при 37 °C. Используйте 2-4 мл для фляги Т-75 или 4-6 мл для фляги Т-175.
  3. После того, как клетки отделятся от колбы, погасите реакцию в соотношении 2:1 дополненного DMEM и осторожно перемешайте с помощью пипетирования, чтобы диссоциировать клетки в одноклеточную суспензию. Переложите клетки в коническую трубку и гранулируйте клетки центрифугированием при 300 x g в течение 5 минут.
  4. Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 1x фосфатно-солевой буфер (PBS). Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра с помощью окрашивания трипановым синим, чтобы исключить мертвые клетки и рассчитать общее количество живых клеток. Еще раз гранулируйте ячейки, как описано выше.
  5. Ресуспендируйте клеточную гранулу до концентрации 1 x 108 клеток/мл в PBS и храните клеточную суспензию на льду для внутричерепной имплантации.

2. Имплантация ортотопической опухоли от руки

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол адаптирован из Irtenkauf et al. (процедура доктора Аны де Карвальо; Генри Форд Хелс Гермелин Центр опухолей головного мозга)12. Все шаги должны выполняться в шкафу биобезопасности, чтобы обеспечить безопасность как для испытуемых, так и для исследователей. Метод имплантации свободной руки позволяет ускорить процедуру для достижения больших размеров выборки при сохранении качества внутричерепной имплантации. В качестве альтернативы можно использовать стереотаксическое устройство для имплантации опухоли в тех же координатах, описанных ниже.

  1. Взвесьте обнаженную мышь и введите обезболивающий раствор кетамина/ксилазина (100 мг/кг/10 мг/кг) путем внутрибрюшинной инъекции с помощью шприца 28G. Поместите мышь в клетку для восстановления поверх грелки, чтобы поддерживать температуру тела. Подтвердите обезболивание, проверив рефлекс педали.
  2. Нанесите офтальмологическую мазь для глаз, введите кетопрофен (5 мг/кг) подкожно с помощью шприца 28G и нанесите идентифицирующие ушные удары.
  3. Простерилизуйте операционное место в верхней части головы с помощью 70% этанола, затем нанесите скраб бетадином и повторите 3 раза. Затем сделайте разрез 5-7 мм маленькими хирургическими ножницами справа от средней линии головы и оттяните кожу тонкими щипцами, чтобы обнажить череп и шовные линии черепа.
  4. Потрите череп ватным тампоном, чтобы удалить надкостницу, обеспечив доступ к кости. Нанесите раствор 3% перекиси водорода с помощью нового ватного тампона, чтобы подсушить косточку С помощью новой ватной палочки сотрите излишки перекиси водорода и любую пену, которая может образоваться. Повторите этот шаг 3 раза, пока брегма не станет видимой на черепе и кость не станет достаточно сухой для сверления. Достаточно сухой череп будет иметь резко отбеленные линии швов и уменьшенное покраснение от первоначального вида.
  5. Относительно брегмы измерьте -2,5 мм медиально/латерально и -1 мм спереди/сзади с помощью линейки и отметьте место сверла маркером. Еще раз измерьте перед сверлением, чтобы убедиться, что метка находится в правильном положении.
  6. Возьмите электрическую микрохирургическую дрель (11 000 об/мин) с бором 0,5 мм и осторожно проделайте отверстие в черепе там, где оно было ранее помечено. Впитайте кровь или жидкость, которые могут скопиться в месте сверления, свежим ватным тампоном.
  7. Приготовьте шприц 33G микролитр, оснащенный игольчатой втулкой, к открытой игле длиной 3 мм. Наберите 5 мкл ранее приготовленной суспензии 1 x 108 клеток/мл после кратковременной суспензии с помощью пипетки и убедитесь, что в растворе для инъекций нет пузырьков. Тщательно сотрите излишки клеточной суспензии, оставшиеся на внешней стороне иглы и втулки иглы, салфеткой с содержанием 70% изопропанола.
  8. Вставьте иглу вертикально в место сверла до тех пор, пока втулка иглы не прекратит дальнейшее введение иглы. Осторожно отведите иглу примерно на 0,5 мм, чтобы освободить место для накопления введенных клеток.
  9. Медленно вводите клеточную суспензию в течение 1 минуты. После того, как будет введен полный объем, удерживайте иглу на глубине еще минуту, чтобы уменьшить отток раствора для инъекций. Затем осторожно втяните иглу.
  10. Чистым ватным тампоном сотрите всю жидкость, которая скапливается в месте инъекции, а затем нанесите костный воск, чтобы запечатать отверстие.
  11. Закройте разрез ветеринарным бондом и дайте ему высохнуть. С помощью чистого ватного тампона нанесите местный лидокаин в качестве обезболивающего.
  12. Следите за мышью до полного выздоровления и амбулаторного состояния. Вводите кетопрофен (5 мг/кг) подкожно в течение 2 дней после имплантации для обезболивания.

3. Синтез платформы наночастиц

  1. Синтезировать и конъюгировать наночастицы с Cy5.5 и олигонуклеотидом (анти-miR10b), как описано ранее11.

4. Введение MN-anti-miR10b

Примечание: В этом исследовании инъекции делались один раз в неделю в течение 6 недель, начиная с 7 дней после имплантации, но один и тот же протокол может быть использован для различных частот инъекций.

  1. Взвесьте мышь и рассчитайте объем MN-anti-miR10b для введения мыши. Дозы MN-anti-miR10b назначаются в концентрации 20 мг Fe/кг на мышиных моделях GBM. Например, мышь массой 20 г получает дозу 80 мкл 5 мг Fe/мл MN-anti-miR10b. Контрольные мыши получают равный объем PBS в соответствии с этой схемой дозирования.
  2. Приготовьте шприц 28G с дозой MN-anti-miR10b и убедитесь, что в растворе для инъекций нет пузырьков.
  3. Обезболивайте мышь в дозе 2%-4% изофлурана для индукции и 1,5%-2% для поддержания со скоростью потока 1,5 л/мин в индукционной коробке. Переместите мышь к носовому конусу и продолжайте вводить анестезию. Проверьте глубину анестезии и нанесите ветеринарную мазь.
  4. Простерилизуйте хвост салфеткой с 70% изопропанолом и дайте лишнему спирту высохнуть.
  5. Поверните хвост, чтобы расположить боковые хвостовые вены к верхней части хвоста. Затем, нацелившись на вену, введите иглу в хвост и установите вакуум, оттянув поршень назад.
  6. Вводите иглу до тех пор, пока кровь не поступит в шприц, что свидетельствует об успешном поступлении в вену.
  7. Медленно введите MN-anti-miR10b и втяните иглу после полного введения. Надавите на место инъекции марлей до тех пор, пока кровотечение не остановится.
  8. Снимите мышь с носового конуса. Следите за мышью до полного выздоровления и амбулаторного состояния.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Болюсное введение наночастиц может вызвать респираторный дистресс. Внимательно следите за мышью и немедленно накладывайте легкие компрессии в грудную клетку, если есть признаки респираторного дистресса.

5. Биолюминесцентная и флуоресцентная визуализация in vivo

ПРИМЕЧАНИЕ: Биолюминесценция и флуоресцентная визуализация in vivo проводятся в системе визуализации In vivo (IVIS) до и через 24 часа после введения наночастицы.

  1. Готовят стерильно фильтрованный D-люциферин в концентрации 30 мг/мл в PBS без Mg2+ и Ca2+.
  2. Откройте программное обеспечение для управления IVIS и начните инициализацию для подготовки аппарата. Во время инициализации системы выберите папку для сохранения изображений, выбрав «Получение» > «Автосохранение в», и определите папку для файлов для сохранения.
  3. В моментах визуализации взвесьте мышь и рассчитайте объем D-люциферина для введения в дозировке 150 мг/кг. Приготовьте шприц 28G с объемом, защищающим раствор от прямого света. Это исследование включало визуализацию через 2 дня после операции по имплантации для подтверждения посева, а еженедельная визуализация начиналась на 7-й день после имплантата, непосредственно перед еженедельным лечением.
  4. Обезболивайте мышь в дозе 2%-4% изофлурана для индукции и 1,5%-2% для поддержания со скоростью потока 1,5 л/мин в индукционной камере. После обезболивания аккуратно потрепайте мышь, чтобы избежать дальнейшего травмирования места операции, и введите дозу D-люциферина внутрибрюшинно. Дайте мыши восстановиться и подождите 10 минут перед получением изображения, чтобы сигнал биолюминесценции развился и стабилизировался.
  5. Пока развивается сигнал биолюминесценции, подготовьте сканер IVIS к биолюминесцентной визуализации. Положите черный коврик с низкой флуоресценцией на столик для визуализации и настройте матрицу носовых обтекателей на количество объектов, которые необходимо изобразить.
  6. В программе нажмите Мастер обработки изображений. Выберите Биолюминесцентная визуализация , а затем выберите Открыть фильтр. На следующем экране выберите «Объект изображения» и «Поле зрения». Теперь IVIS настроен на биолюминесцентную визуализацию.
  7. За 3 минуты до визуализации начните грунтовать индукционную коробку, дав смеси изофлурана и кислорода заполнить коробку. За 2 минуты до визуализации поместите мышей в индукционный бокс для анестезии.
  8. После обезболивания переместите мышей из индукционного бокса в IVIS для визуализации и уложите каждую из них в положение лежа. Обеспечьте поддерживающую анестезию с использованием 2% изофлурана во время визуализации.
  9. После того, как мыши будут помещены в сканер IVIS, нажмите «Получить последовательность». Сделайте снимок, используя настройки автоматической экспозиции с минимальным порогом сигнала 3 000 отсчетов. Биолюминесцентная визуализация визуализирует локализацию меченых люциферазой клеток глиобластомы U251. Функция автоматической экспозиции позволяет получить изображение с длительностью экспозиции, рассчитанной на основе самого яркого сигнала в поле зрения, но не более 5 минут, заданной пользователем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Типичная клетка с мышами требует одного изображения, так как посев обычно равномерный. В случаях с одной или несколькими яркими мышами мышей мыши могут быть удалены, и может быть предпринят повторный захват для лучшего улавливания сигналов от тусклых мышей.
  10. После биолюминесцентной визуализации измените настройки IVIS для подготовки эпифлуоресцентной визуализации и выполнения флуоресцентного сканирования.
    1. В мастере обработки изображений выберите Флуоресценция > Фильтрованная пара с эпиподсветкой. На следующем экране выберите зонды для изображения, например Cy5.5. Выберите объект изображения и поле зрения. Сканер IVIS теперь настроен на флуоресцентную визуализацию зондов, выбранных на предыдущем экране.
  11. Сделайте снимок, используя настройки автоматической экспозиции с минимальным порогом сигнала 6 000 отсчетов. Флуоресцентная визуализация Cy5.5 визуализирует локализацию MN-anti-miR10b. Функция автоматической экспозиции позволяет получить изображение с длительностью экспозиции, рассчитанной на основе самого яркого сигнала в поле зрения, но не более 5 минут, заданной пользователем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентная визуализация редко занимает более 1 минуты выдержки, даже у контрольных мышей, введенных PBS. Всегда достаточно одного изображения, так как отклонение сигнала между обработанными мышами невелико.
  12. Извлеките мышь из IVIS после визуализации. Наблюдайте до полного восстановления после анестезии и амбулатории.

6. Магнитно-резонансная томография in vivo

ПРИМЕЧАНИЕ: МРТ проводится до и через 24 часа после введения наночастиц и может быть выполнена у тех же животных, которым проводится оптическая и биолюминесцентная визуализация.

  1. Обезболивайте испытуемую мышь в индукционном боксе в дозе 2%-4% изофлурана для индукции и 1,5%-2% для поддержания со скоростью потока 1,5 л/мин. После обезболивания положите мышь лежа на кровать для МРТ поверх баллона для мониторинга дыхания. Плотно прилегайте носовой конус к морде для проведения анестезии во время визуализации и нанесите офтальмологическую глазную мазь.
  2. Обездвижьте и расположите голову для сканирования с помощью прикусочной планки и ушных ушей.
  3. Установите смазанный ректальный датчик температуры и убедитесь, что дыхание и мониторинг температуры работают. Расположите катушку для мозга мыши над головой, вставив колышки на подставке для мыши в отверстия на катушке, и закрепите катушку на месте, чтобы уменьшить движение во время сканирования.
  4. Положите на верхнюю часть мыши небольшую теплую циркуляционную подушечку для циркуляции воды, чтобы поддерживать температуру тела во время анестезии. Следите за тем, чтобы между катушкой и нагревательным одеялом оставалось некоторое расстояние, чтобы ограничить искажение изображения из-за помех от воды.
  5. Переместите мышь и стол для визуализации в положение для сканирования.
  6. Настройте и совместите катушки МРТ, запустив этап настройки Wobble в программном обеспечении для сбора данных. На сервисном конце МРТ используйте ручки настройки и согласования на катушке, чтобы убедиться, что кривая центрирована (настройка) и как можно глубже (согласована).
  7. Проведите сканирование локализатора в трех плоскостях и при необходимости отрегулируйте ложе визуализации так, чтобы мозг располагался в изоцентре магнита.
  8. Получите взвешенное сканирование 2D T2 для обнаружения введенного агента в опухоли со следующими параметрами: время повторения (TR) = 2500 мс, время эхо (TE) = 25 мс, поле зрения (FOV) 20 x 20 мм, 18 корональных срезов, разрыв между срезами 0,2 мм, разрешение в плоскости 150 x 150 мкм, толщина среза 0,5 мм.
  9. Получите B0-карту всего мозга для вычисления локализованной прокладки с помощью утилиты Mapshim. Затем используйте взвешенные изображения 3D T2 для визуализации наночастиц с TR = 30 мс, TE = 10 мс, FOV 20 x 15 x 12 мм, разрешением изотропно 100 мкм.
  10. Получите карту T2* для дальнейшей визуализации наночастиц с использованием взвешенного изображения 2D T2 в качестве ориентира для сканирования положения над опухолью. Используйте TR = 800 мс, TE = 3,5 мс. FOV 20 x 20 мм, 5 корональных срезов, без зазора между срезами. Разрешение в плоскости 100 мкм в плоскости. Получение 10 положительных эхо-изображений с интервалом эхо-сигнала 5 мс.
  11. Контролируйте дыхание и температуру тела на протяжении всей последовательности визуализации и при необходимости корректируйте изофлуран и температуру воды.
  12. После визуализации извлеките мышь из МРТ-сканера и поместите ее в отапливаемую клетку для восстановления. Наблюдайте за мышью до тех пор, пока она полностью не оправится от наркоза и не начнет амбулаторное лечение.

7. Биолюминесцентная и флуоресцентная визуализация ex vivo

  1. Выполняйте биолюминесцентную и флуоресцентную визуализацию ex vivo в IVIS, аналогичную визуализации in vivo . Выполните шаги по инициализации IVIS и настройке сканирования, как описано выше.
  2. В экспериментальной конечной точке взвесьте мышь и рассчитайте объем D-люциферина для введения в дозировке 150 мг/кг. Введите дозу D-люциферина и проведите визуализацию в реальном времени через 10 минут после инъекции, как описано ранее.
  3. После заключительной биолюминесценции in vivo и флуоресцентной визуализации быстро усыпьте мышь с вывихом шейки матки, еще находясь под анестезией, препарируйте мышь и соберите основные органы, включая мозг, на чашке Петри.
  4. Поместите чашку Петри с удаленными органами в сканер IVIS и визуализируйте органы с помощью биолюминесцентного и флуоресцентного методов, используя те же настройки захвата, что и при визуализации in vivo .
  5. Мгновенно заморозьте все органы, необходимые для дальнейшего анализа в ОКТ, медленно опуская криомолд с образцом в ОКТ в неглубокую лужу жидкого азота с помощью длинных щипцов до тех пор, пока ОКТ не станет полностью белой. Не допускайте контакта жидкого азота с жидким ОКТ или опускайте форму слишком быстро, так как это приведет к образованию пузырей ОКТ. Хранить замороженные образцы при температуре -80 °C.
  6. Храните мозг, содержащий опухоль, в ОКТ и мгновенной заморозке для криосекции. Хранить при температуре -80 °C до тех пор, пока не понадобится для анализа.

8. Флуоресцентная микроскопия

  1. Подготовьте криостат к криосекции. Установите температуру камеры и головки образца в диапазоне от -15 °C до -20 °C.
  2. Извлеките мгновенно замороженный мозг в ОКТ из хранилища при температуре -80 °C и поместите его в камеру криостата. Дайте образцам нагреться до температуры камеры (-20 °C) перед разделкой.
  3. С помощью бритвы с одним лезвием разрежьте мозг коронально в месте инъекции. Обычно это видно в виде ямочки на поверхности мозга. Установите образец на диск для образцов с помощью небольшого количества ОКТ, чтобы расположить разрезанную сторону мозга, на которую нужно сделать срез. Приложите достаточное давление охлажденного груза внутри камеры, чтобы обеспечить стабильную установку образца.
  4. Переместите установленный диск для образца и образца на головку образца для подготовки к разделке. Обрежьте ткань на желаемую глубину, взяв срезы по 20 мкм, регулируя угол образца так, чтобы срез ткани был как можно ближе к уровню ткани.
  5. Как только желаемая глубина ткани будет достигнута, отрегулируйте криостат так, чтобы он делал срезы образца размером 5 - 7 мкм. Закрепите срезы на стеклянных предметных стеклах, предварительно помеченных дескрипторами, такими как идентификатор мыши, срез ткани и номер предметного стекла, быстро опустив заряженную сторону предметного стекла микроскопа на срез.
  6. Внесите в свежий 4% параформальдегид (PFA). Погрузите предметное стекло с салфеткой в раствор PFA на 15 минут для фиксации ткани. Промойте предметное стекло с помощью DPBS 3x после фиксации.
  7. К теперь уже зафиксированному срезу ткани на предметном стекле добавьте каплю объемом 40 мкл монтажной среды, содержащей 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), который окрашивает ядра клеток. Осторожно поместите стеклянный покровный колпак размером 24 мм x 50 мм поверх монтажного материала и убедитесь, что вся ткань заключена в монтажный материал.
  8. Визуализируйте ткань с помощью флуоресцентной микроскопии DAPI (излучение (em) при 359 нм, возбуждение (ex) при 457 нм) и Cy5.5 (ex 683 нм, em 703 нм).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Синтезировали и охарактеризовали MN-anti-miR10b, как описано ранее11. Просвечивающая электронная микроскопия MN-anti-miR10b показывает морфологию и полидисперсность наноплатформы (рис. 1B). Эта наноплатформа имеет средний размер 25,12 ± 0,34 нм с дзета-потенциалом 13,18 ± 1,47 мВ (рис. 1C, D). В этих исследованиях голым мышам были ортотопически имплантированы клетки глиобластомы человека U251 в соответств...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Несколько критических шагов в различных методах валидации накопления наночастиц в ГЭБ могут иметь решающее значение для успеха протокола. Начиная с ортотопической имплантации клеток GBM, важно убедиться, что линии швов черепа видны после высыхания кости; Это способствует точному размещению опухолевых клеток. Для сверления отверстия через череп лучше всего оказать легкое давление на место сверления и начать сверление, чтобы сделать неглубокий отпечаток в кости. После того, как первоначаль...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

З.М. и А.М. являются соучредителями и акционерами TransCode Therapeutics Inc. Остальные авторы не имеют конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Финансирование этого исследования было частично предоставлено за счет гранта от Альянса медицинских наук Мичиганского государственного университета имени Генри Форда A.M. и A.dC. Мы благодарим доктора Даниэль Р. Фергюсон за руководство исследованиями на животных в Университете штата Мичиган и за одобрение этого видео.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Атимические обнаженные мыши "J:NU"Jackson LaboratoryRRID:IMSR_JAX:007850Модель мыши с ослабленным иммунитетом
0,25% ТрипсинGibco25200-056Реагент для клеточной культуры U251
1,7 мл микроцентрифужная пробиркаDOT ScientificRN1700-GMTДля коллекции тканей
10 &; L, Neuros Шприц, модель 1701 RN, 33 калибр, Point Style 4Hamilton65460-06Шприц для внутричерепной имплантации опухолевых клеток
3M Vetbond3M1469SBТканевый клей для закрытия хирургического участка
4% Параформальдегид Thermo ScientificJ199943-K2Тканевый фиксирующий раствор
70% изопропоилспиртовая салфеткаCardinalMW-APLМестная антисептическая салфетка для имплантации опухоли и инъекции в хвостовую вену
Aperio VersaLeicaДля сканирования окрашенного участка ткани слайды
Betadine Surgical ScrubPurdue6761815101Топический антисептик для имплантации опухоли
BioSpec 70/30BrukerМагнитно-резонансный томограф
Костный воскMedlineDYNJBW25Костный воск для герметизации места имплантации
Заусенцы для микросверлаF.S.T.19007-05Сверлильный заусенец для проделывания отверстия в черепе для имплантации опухоли
DAPI Fluoromount-GSouthernBiotech0100-20Тканевый монтажный материал, содержащий DAPI краситель
Dulbecco' s Модифицированная среда Eagle Medium (DMEM)Gibco11995-065Среда для клеточных культур для U251
Extra Fine Graefe NotebooksF.S.T.11150-10Сугикальный инструмент для имплантации опухолей
Фетальная бычья сывороткаCorning35-010-CVПищевая добавка для клеточных культур U251
Тонкие ножницы - Sharp 10,5cmF.S.T.14060-10Сугикальный инструмент для имплантации опухоли
Glydo (Lidocaine)Sagent673-76Местный анальгетик для хирургического вмешательства
Ideal Micro DrillCellPoint Scientific67-1200AСверло, используемое для проделывания отверстия в черепе для имплантации опухоли
Инсулиновый шприц 1CC 29G X 1/2"Becton, Dickinson324704Шприц для инъекции D-люциферина и инъекции в хвостовую вену наночастицы
ИзофлуранCovetrus11695067772Анетезия
Изофлуран ВапорайзерSOMNI ScientificVS6002Аппарат для анестезии
IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging SystemPerkinElmer/Revvity128201Биолюминесцентный и флуоресцентный сканер
IVISbrite D-Люциферин Калийная сольPerkinElmer/Revvity122799-100MGСубстрат для биолюминесцентной визуализации
Ketaset (Кетамин)Zoetis10004027Анестетик для хирургии имплантации опухолей
Кетофен (Кетопрофен)Zoetis10004031Анальгетик для хирургии имплантации опухолей
Leica CM1950LeicaCM1950Для криосекции ОКТ-внедренных образцов
PBSGibco14190-144Реагент клеточной культуры и раствор клеточной суспензии для имплантации U251
Пенициллин-стрептомицинGibco15140-122Антибиотик для сред клеточных культур для U251
Puralube vet мазьMWI Veterinary27505Офтальмологическая глазная мазь для защиты при имплантации опухоли
RulerF.S.T.18000-30Используется для измерения места сверления для планировки
Tissue-Tek Cryomold  Промежуточный 15 x 15 x 5 ммSakura4566Форма для сбора образцов тканей
Fabric-Tek O.C.T. CompoundSakura4583Замораживающий состав для сбора образцов тканей
U-251 MG клеточная линия человекаMillapore Sigma9063001клеточная линия глиобластомы человека
Xylazine Injectable Solution, 100 мг/млCovetrus1XYL006Паралитическое средство для операции по имплантации опухоли

Ссылки

  1. Tan, A. C., et al. Management of glioblastoma: State of the art and future directions. CA Cancer J Clin. 70 (4), 299-312 (2020).
  2. Cihoric, N., et al. Current status and perspectives of interventional clinical trials for glioblastoma - analysis of clinicaltrials.Gov. Radiat Oncol. 12 (1), 1(2017).
  3. Lee, S. Y. Temozolomide resistance in glioblastoma multiforme. Genes Dis. 3 (3), 198-210 (2016).
  4. Dong, X. Current strategies for brain drug delivery. Theranostics. 8 (6), 1481-1493 (2018).
  5. Teleanu, D. M., Chircov, C., Grumezescu, A. M., Volceanov, A., Teleanu, R. I. Blood-brain delivery methods using nanotechnology. Pharmaceutics. 10 (4), 268(2018).
  6. Ohta, S., et al. Investigating the optimum size of nanoparticles for their delivery into the brain assisted by focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Sci Rep. 10 (1), 18220(2020).
  7. Teplyuk, N. M., et al. Therapeutic potential of targeting microrna-10b in established intracranial glioblastoma: First steps toward the clinic. EMBO Mol Med. 8 (3), 268-287 (2016).
  8. Dube, T., Kumar, N., Bishnoi, M., Panda, J. J. Dual blood-brain barrier-glioma targeting peptide-poly(levodopamine) hybrid nanoplatforms as potential near infrared phototheranostic agents in glioblastoma. Bioconjug Chem. 32 (9), 2014-2031 (2021).
  9. Yoo, B., et al. Design of nanodrugs for mirna targeting in tumor cells. J Biomed Nanotechnol. 10 (6), 1114-1122 (2014).
  10. Medarova, Z., Pham, W., Farrar, C., Petkova, V., Moore, A. In vivo imaging of sirna delivery and silencing in tumors. Nature Medicine. 13 (3), 372-377 (2007).
  11. Chen, M., et al. Co-administration of temozolomide (tmz) and the experimental therapeutic targeting mir-10b, profoundly affects the tumorigenic phenotype of human glioblastoma cells. Front Mol Biosci. 10, 1179343(2023).
  12. Irtenkauf, S. M., et al. Optimization of glioblastoma mouse orthotopic xenograft models for translational research. Compar Med. 67 (4), 300-300 (2017).
  13. Moore, A., Marecos, E., Bogdanov, A., Weissleder, R. Tumoral distribution of iron oxide nanoparticles in a rodent model. Radiology. 214 (2), 568-574 (2000).
  14. Moore, A., Medarova, Z., Potthast, A., Dai, G. In vivo targeting of underglycosylated muc-1 tumor antigen using a multimodal imaging probe. Cancer Res. 64 (5), 1821-1827 (2004).
  15. Yoo, B., et al. Therapy targeted to the metastatic niche is effective in a model of stage iv breast cancer. Sci Rep. 7, 45060(2017).
  16. Dadfar, S. M., et al. Iron oxide nanoparticles: Diagnostic, therapeutic and theranostic applications. Adv Drug Deliv Rev. 138, 302-325 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Гематоэнцефалический барьернаночастицы оксида железамагнитно-резонансная томографияфлуоресцентная визуализациябиолюминесцентная визуализациянакопление в опухоли
Доставка олигонуклеотидной полезной нагрузки наночастицами в животной модели мультиформной глиобластомы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.