Методическая статья

Иммуноокрашивание по всему массиву и автоматический подсчет ганглиозных клеток сетчатки мыши

2.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66991

⸱

4 октября 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Sichuan Provincial Key Laboratory for Human Disease Gene Study, Sichuan Provincial People's Hospital, University of Electronic Science and Technology of China, 2School of Medicine, University of Electronic Science and Technology of China, 3Research Unit for Blindness Prevention of Chinese Academy of Medical Sciences (2019RU026), Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People's Hospital

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает процедуру выделения сетчатки мыши целиком и выполнения иммуноокрашивания для мечения всех ганглиозных клеток сетчатки (РГК). За этим процессом следует визуализация и автоматический подсчет RGC с помощью программного обеспечения на основе искусственного интеллекта, что обеспечивает простой, быстрый и точный метод количественного определения RGC во всей сетчатке мыши.

Аннотация

Глаукома является ведущей причиной слепоты во всем мире, характеризуясь сложным патогенным механизмом, который затрудняет восстановление зрения. Мыши служат ценными животными моделями для изучения патогенеза и лечения глаукомы благодаря их относительно однородному генетическому фону и ганглиозным клеткам сетчатки (РГК), которые структурно напоминают таковые у человека. Точная оценка повреждения РГК и результатов лечения в моделях глаукомы у мышей требует определения числа РГК по всей сетчатке. Этот протокол описывает комплексный метод, включающий изоляцию всей сетчатки, мечение РГК специфическими антителами и быстрый и точный автоматический подсчет РГК с помощью программы на основе искусственного интеллекта. Оптимизированный подход позволяет эффективно и точно количественно определять количество РГК в сетчатке мышей, облегчая оценку дегенерации РГК и потенциальных терапевтических вмешательств. Позволяя исследователям оценить степень повреждения РГК, этот протокол способствует более глубокому пониманию патогенеза глаукомы и помогает в разработке эффективных стратегий лечения для управления и предотвращения потери зрения.

Введение

Глаукома характеризуется прогрессирующей гибелью ганглиозных клеток, что представляет собой значительную проблему для восстановления зрения 1,2. Это заболевание находится в центре внимания офтальмологических исследований из-за его распространенности и влияния на зрение3. Модели мышей незаменимы при глаукоме
исследования в связи с их однородным генетическим фоном, высокой репродуктивной способностью и сходством свойств ганглиозных клеток с человеческими4. Основной целью этого метода является точное количественное определение ганглиозных клеток сетчатки (РГК) в мышиных моделях, что имеет важное значение для понимания патогенеза глаукомы и разработки соответствующих методов лечения.

Обоснование разработки этого метода проистекает из потребности в надежном и эффективном методе оценки дегенерации RGC в мышиных моделях. Традиционные методы, такие как мечение РГК в срезах сетчатки, часто дают ненадежные результаты из-за неравномерного распределения РГК в сетчатке5. Количественная оценка РГК по всей сетчатке лучше отражает изменения в их количестве и имеет решающее значение для оценки прогрессирования заболевания и терапевтических вмешательств.

Этот метод имеет ряд преимуществ по сравнению с альтернативными методами. Например, ручной подсчет ганглиозных клеток сетчатки (РГК) в нормальной сетчатке взрослой мыши, которая содержит от 40 000 до 60 000 ГСК, может занять много времени и подвержен ошибкам. Разработанное нами программное обеспечение для автоматического подсчета RGC позволяет проводить точный подсчет менее чем за 3 минуты, что потенциально экономит исследователям значительное количество времени. Кроме того, программное обеспечение на основе искусственного интеллекта, используемое для автоматического подсчета, сводит к минимуму смещение и улучшает воспроизводимость.

Кроме того, этот метод обеспечивает стандартизированный подход к оценке дегенерации РГК на различных моделях мышей и экспериментальных условиях, внося ценные данные в область исследований глаукомы. Этот метод согласуется с другими исследованиями, которые подчеркивают важность анализа всей сетчатки для понимания изменений сетчатки при заболеваниях9.

Чтобы помочь читателям определить, подходит ли этот метод для их применения, важно отметить, что этот метод особенно полезен для исследователей, изучающих дегенерацию ганглиозных клеток сетчатки (ГСК) у мышей с глаукомой или другими заболеваниями сетчатки. Метод адаптируется к различным экспериментальным установкам и обеспечивает высокую степень точности и эффективности подсчета RGC, что делает его идеальным как для небольших, так и для крупномасштабных исследований. Кроме того, простой дизайн протокола и наличие удобного программного обеспечения делают его доступным для исследователей с разным уровнем знаний в области анализа сетчатки.

Протокол

Процедура соответствовала рекомендациям Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии по использованию животных в исследованиях и была одобрена Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) Народной больницы провинции Сычуань. В данном исследовании использовались мыши-самцы C57Bl/6J (в возрасте 2 месяцев). На рисунке 1 показана общая процедура, описанная здесь. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Изоляция сетчатки целиком

  1. Жертвоприношение животных
    1. Принесите мышей в жертву с помощью вывиха шейки матки (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами) (рисунок 2A). До вывиха шейки матки,
      Обезболивайте мышей путем вдыхания изофлурана (3-5% кислорода) или внутрибрюшинной инъекции смеси кетамина/ксилазина.
  2. Энуклеация и обработка глазного яблока
    1. Отметьте синим маркером край роговицы на тыльной стороне глазного яблока, чтобы запомнить ориентацию при последующем рассечении.
    2. Удалите ножницами остаточные мышечные ткани, прикрепленные к глазному яблоку. Перенесите энуклеированное глазное яблоко в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл с круглым дном, наполненную 1x PBS, для кратковременного промывания (рис. 2C).
  3. Фиксация
    1. Перенесите глазное яблоко в другую микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл с круглым дном, содержащую свежеприготовленный 4% параформальдегид (PFA) для фиксации при 4 °C в течение 10 минут (рисунок 2D).
    2. Сделайте небольшой разрез (примерно 1-2 мм) на роговице с помощью тонких ножниц под препарирующим микроскопом.
    3. Поместите глазное яблоко обратно в фиксатор для дальнейшей фиксации при 4 °C в течение 3 ч, чтобы сохранить морфологию ткани (Рисунок 2D).
  4. Удаление роговицы и хрусталика 1,9
    1. Сделайте небольшой разрез примерно 1 мм вокруг роговичного лимба, границы между роговицей и склерой, с помощью тонких хирургических ножниц.
    2. Аккуратно разрежьте по окружности роговицы, иссекая ее полностью, чтобы обнажить нижележащие структуры.
    3. С помощью тонких щипцов аккуратно захватите и осторожно приподнимите хрусталик из окружающих тканей, чтобы предотвратить повреждение сетчатки. Поддерживайте структурную целостность сетчатки с помощью деликатных операций.
    4. Переложите наглазник в микроцентрифужную пробирку для дальнейшей обработки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Иссекайте роговицу и извлекайте хрусталик более эффективно, используя технику «перекрестной щели»10. Сделайте два перпендикулярных разреза поперек роговицы и с помощью щипцов извлеките хрусталик.
  5. Склеральный разрез
    1. Вырежьте точный разрез в склере тонкими офтальмологическими ножницами, чтобы облегчить последующие этапы рассечения (Рисунок 2J).
  6. Отделение сетчатки
    1. Вставьте щипцы зубами в разрез между склерой и сетчаткой. Аккуратно возьмитесь за край склеры, избегая чрезмерной силы, чтобы не допустить разрыва ткани.
    2. Постепенно увеличивайте разрез, перемещая щипцы вдоль границы между склерой и сетчаткой медленными, уверенными движениями рук. Используйте зубчатую часть щипцов, чтобы аккуратно отделить склеру от сетчатки, убедившись, что сетчатка не повреждена (Рисунок 2J).
  7. Резка сетчатки глаза
    1. Разделите сетчатку на четыре примерно одинаковых по размеру лоскута с помощью острых ножниц. Убедитесь, что разрезы находятся примерно на полпути к зрительному нерву и ориентированы под углом 90° друг к другу.
  8. Чистка сетчатки глаза
    1. Аккуратно разверните рассеченную сетчатку с помощью щетки с мягкой щетиной и тщательно удалите мусор с ее поверхности (Рисунок 2K).
  9. Окончательная фиксация
    1. Перенесите изолированную сетчатку в микроцентрифужную пробирку, содержащую свежий 4% ПФА, с помощью одноразовой пипетки Пастера. Оставьте фиксацию на льду еще на 5 часов или на ночь для сохранения тканей.

2. Иммуноокрашивание

  1. Стирка
    1. Промойте изолированную цельную сетчатку в 1x PBS с легким перемешиванием в течение 5 минут. Откажитесь от раствора PBS. Повторите этот процесс дважды, чтобы удалить остаточный фиксатор и мусор.
  2. Блокировка
    1. Погрузите отмытую сетчатку в блокирующий буферный раствор (1x PBS с 4% нормальной сывороткой крови осляка (NDS) и 0,2% Triton X-100) на 30 минут, чтобы предотвратить связывание неспецифических антител и усилить проникновение (рис. 3A).
  3. Первичная инкубация антител
    1. Замените блокирующий буфер первичным антителом BRN3A (разведенным в соотношении 1:200 в блокирующем буфере). Инкубируйте сетчатку в течение ночи при 4 °C, чтобы обеспечить связывание специфических антиген-антител (рис. 3B).
  4. Стирка
    1. Промойте сетчатку три раза 1x PBS в течение 5 минут каждый, чтобы удалить несвязанные первичные антитела и уменьшить фоновое окрашивание (Рисунок 3C).
  5. Вторичная инкубация антител
    1. Инкубируйте сетчатку с помощью Alexa594- или Alexa488-конъюгированного вторичного антитела против кролика (разбавленного 1:300) в течение 2 ч при комнатной температуре, чтобы визуализировать целевые антигены (рис. 3D).
  6. Стирка
    1. Выполните три последовательных промывки 1x PBS в течение 5 минут каждое, чтобы удалить избыток вторичных антител и свести к минимуму неспецифическое связывание.
  7. Установка
    1. Аккуратно перенесите окрашенную иммуновитамином сетчатку на предметное стекло микроскопа, осторожно сплющив ее, чтобы свести к минимуму складчатость или искажение.
    2. Нанесите небольшую каплю средства для защиты от выцветания в центр сетчатки, обеспечивая равномерное распределение по тканям.
    3. Осторожно расположите покровный стекло на установленной сетчатке, избегая попадания пузырьков воздуха (рис. 3E, F).

3. Обработка изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Импортируйте изображение в программу автоматического подсчета RGC и начните подсчет. Количество BRN3A-положительных клеток для всей сетчатки может быть получено за считанные минуты. Загрузите программное обеспечение AutoCount с GitHub (https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs). Следуйте приведенным ниже инструкциям по установке программного обеспечения:

  1. Скачайте код по ссылке GitHub . Вы получите файл с именем "Intelligent-quantifying-RGCs.zip". Распакуйте этот файл.
  2. Скачайте необходимые файлы с облачного диска (см. Таблицу материалов) и распакуйте их. Скачанный файл называется "yolov5_cpu". Распакуйте этот пакет в текущую папку, чтобы избежать непредвиденных проблем.
  3. Найдите файл конфигурации из шага 1 и измените его содержимое, указав на путь «yolov5_cpu».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если загруженный "yolov5_cpu" помещен в "D:\1me\yolov5_cpu_", измените файл "config.ini" на шаге 1 на "D:/1me/yolov5_cpu" (используйте / вместо \). (Рисунок 4А).
  4. Откройте графический интерфейс, нажав на userinterface.exe. Первоначальная загрузка может быть медленной (запуск от имени администратора) (рис. 4B).
  5. После открытия программного обеспечения проверьте, присутствует ли файл модели "pmse_plus.pt" в корневом каталоге диска C. Если его нет, скопируйте его в этот каталог.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Файл модели "pmse_plus.pt" находится в папке weights папки "yolov5", которая находится в извлеченной папке Intelligent-quantifying RGCs (Рисунок 4C).
  6. Подготовьте изображения, которые будут обнаружены.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение позволяет считывать только одну или пять картинок одновременно. Чтение большего количества приведет к ошибке.

4. Автоматический подсчет ячеек

  1. Откройте программу для подсчета (рисунок 5A).
  2. Нажмите кнопку ОТКРЫТЬ ИЗОБРАЖЕНИЕ , чтобы импортировать изображение (Рисунок 5B).
  3. Нажмите кнопку RUN , чтобы программное обеспечение автоматически подсчитало ячейки (Рисунок 5C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение отметит подсчитанные ячейки красным квадратным прямоугольником и отобразит количество ячеек в правом верхнем углу (Рисунок 5D).

Результаты

В этом протоколе подробно описана методология полного иммуноокрашивания сетчатки мышей, обеспечивающая тщательную подготовку тканей, точную инкубацию антител и надежный автоматический подсчет клеток. Эта процедура способствует надежной маркировке и количественному определению ганглиозных клеток сетчатки (РГК), что позволяет точно оценивать клеточные популяции в различных экспериментальных контекстах. Метод был использован для подсчета RGC у мышей дикого типа и мышей, смоделированных глаукомой, что дало стабильные результаты. Репрезентативный результат показывает, что количество РГК у нормальной взрослой мыши в возрасте 2 месяцев составляет примерно 45 000 (рис. 6).

Чтобы оценить, может ли программное обеспечение ИИ точно количественно определить меченые BRN3a RGC в нормальных моделях и моделях заболевания, мы создали мышиную модель глаукомы7, индуцированную N-метил-D-аспартатом (NMDA). Сетчатка с цельным креплением у этой модели была иммуноокрашена анти-BRN3A, а RGC были количественно определены с помощью программного обеспечения для автоматического подсчета. Результат показал относительно высокое окрашивание фона (рис. 7). Тем не менее, программное обеспечение смогло точно идентифицировать почти все RGC. В общей сложности 15 231 РГК был идентифицирован в этой сетчатке, по сравнению с примерно 45 000-50 000 РГК в нормальной сетчатке мыши, что указывает на тяжелую дегенерацию. Таким образом, программное обеспечение ИИ также может быть эффективно использовано для подсчета РГК в сетчатке с менее оптимальным качеством окрашивания.

figure-results-1
Рисунок 1: Принципиальная схема подготовки РГК. (A) Глазное яблоко удаляется и помещается в 1x PBS. (B) Глазное яблоко фиксируется в 4% PFA на льду в течение 3 ч. (C) Удаление роговицы. (D) Извлечение хрусталика. (E) Наглазник разделен на 4 клапана с помощью ножниц. (F) Склеры отслаиваются, и мусор аккуратно удаляется с поверхности сетчатки мягкой щеткой. (G) Сетчатка иммуномечена анти-BRN3A. (H) Флуоресцентные сигналы визуализируются с помощью конфокального микроскопа. (I) Автоматический подсчет RGC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Изоляция сетчатки мыши. (A) Мышь усыпляется из-за вывиха шейки матки. (B) Мышь помещается на плоскую поверхность. (В) Глазное яблоко осторожно удаляется ножницами. (D) Глазное яблоко аккуратно помещается в 1x PBS. (E) Глазное яблоко фиксируется щипцами на краю роговицы. (F) На краю роговицы делается небольшой разрез с помощью иглы. (G) Чашеобразная структура удаляется после удаления роговицы. (H) Хрусталик осторожно снимается с помощью щипцов. (I) Небольшой разрез делается по краю роговицы по направлению к зрительному нерву на склере, что позволяет избежать повреждения сетчатки. (J) Склера разрывается вдоль разреза с помощью щипцов. (K) Сетчатка разглаживается и очищается кистью. (L) Сетчатка уплощается и быстро фиксируется ледяным метанолом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Иммуноокрашивание сетчатки мыши целиком . (A) После промывки 1x PBS сетчатка блокируется блокирующим буфером. (B) Сетчатку инкубируют с первичным антителом при 4 °C в течение ночи. (C) Сетчатка промывается 1x PBS три раза. (D) Сетчатку инкубируют со вторичным антителом в течение 2 ч при комнатной температуре. (E) Сетчатка установлена на предметном стекле с РГК направленными вверх. (F) Изображения получают с помощью лазерного конфокального микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Установка программного обеспечения для автоматического подсчета. (A) Шаг 1 включает в себя обновление пути к файлу в каталог "yolov5_cpu". (B) Запущен графический интерфейс. (C) Проверка наличия файла модели в корневом каталоге диска C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-5
Рисунок 5: Работа автоматизированного программного обеспечения для подсчета RGC. (A) Программное обеспечение для подсчета открылось. (B) Нажмите кнопку ОТКРЫТЬ ИЗОБРАЖЕНИЕ , чтобы импортировать изображение. (C) Нажатие кнопки RUN для запуска автоматического подсчета. (D) Подсчитанные ячейки помечаются красным квадратным полем, а номер ячейки отображается в правом верхнем углу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-6
Рисунок 6: Автоматический подсчет RGC мыши. На верхней панели (слева) представлены репрезентативные результаты иммуноокрашивания сетчатки с плоским креплением анти-BRN3A; На верхней панели (справа) показан автоматический подсчет RGC с помощью ранее разработанного программного обеспечения. Масштабная линейка: 100 μм. Вставки с верхних панелей увеличены и показаны на нижней панели соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-7
Рисунок 7: Подсчет РГК в NMDA-индуцированной мышиной модели глаукомы. Левая панель: Обзор сетчатки радиатора целиком, показывающий RGC, распознаваемые программным обеспечением искусственного интеллекта. Правая панель: увеличенное изображение частичной области сетчатки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Этот протокол обеспечивает метод определения всех ганглиозных клеток сетчатки (РГК) в сетчатке мыши, который может быть использован для мониторинга прогрессирования дегенерации РГК на мышиных моделях для изучения глаукомы. Сетчатка мыши является нежнойнервной тканью, и выделение целой сетчатки от глаз мыши требует многократной практики. В ходе экспериментов было установлено, что время фиксации существенно влияет на морфологию сетчатки. Для мышей в возрасте около 2 недель достаточно времени фиксации в 20 минут для получения хороших результатов благодаря тонкой и слабой склере. Однако для взрослых мышей старше 2 месяцев 20 минут фиксации недостаточно. Время фиксации 3 ч является оптимальным для получения неповрежденной сетчатки цельного крепления.

В процессе изоляции сетчатки самым сложным этапом является отделение склеры от сетчатки10. Склеру можно относительно легко отклеить от сетчатки с помощью двух комплектов щипцов с зубчатыми наконечниками. С помощью двух наборов щипцов для захвата склеры и разъединения склера разрывается на мелкие кусочки и отделяется от сетчатки.

Высококачественное изображение ганглиозных клеток сетчатки (РГК) имеет решающее значение для точного подсчета. Поскольку сетчатка трехмерна, не все РГК находятся на одном уровне в плоской сетчатке8. Когда сетчатка закреплена на предметном стекле, она должна быть расправлена как можно плоско, чтобы облегчить последующую визуализацию. Во время визуализации изображения получаются на нескольких уровнях фокусировки, чтобы захватить все РГК в разных областях всей сетчатки.

Таким образом, этот протокол обеспечивает стандартизированную процедуру автоматического подсчета всех РГК в плоской сетчатке мыши. Этот метод позволяет ученым точно оценивать дегенерацию RGC в мышиных моделях, повышая эффективность и точность количественного определения RGC. Такая точность имеет решающее значение для понимания и лечения глаукомы и связанных с ней заболеваний.

Раскрытие информации

У авторов нет никаких противоречий для раскрытия.

Благодарности

Этот исследовательский проект был поддержан Национальным фондом естественных наук Китая (82371059 (H.Z.)), Департаментом науки и технологий провинции Сычуань, Китай (2023JDZH0002 (H.Z.)), Научно-техническим бюро Чэнду (2022-YF05-01984-SN (H.Z.)) и Народной больницей провинции Сычуань (30320230095 (J.Y.), 30420220062 (J.Y.)).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1&раз; PBSServicebioG4202
Alexa594-конъюгированный козий антикролик IgG  (Н+Л)ThermoFisherA-11012
Anti-BRN3A антитела [EPR23257-285]Abcamab245230
AutoCount программное обеспечениеhttps://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs
облачный дискGoogle дискссылка https://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6 
Облачный дискBaidulink Код извлечения: g44khttps://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg 
МаркерSharpie
Normal Donkey SerumBiosharp, лабгиновый25030081
параформальдегидMacklinP804536
ProClean 300BeyotimeST853
СахарозаBBI, сангонA610498
Triton X-100BioFroxx, neoFroxx1139ML100

Ссылки

  1. Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).
  2. Gallo Afflitto, G., Swaminathan, S. S. Racial-ethnic disparities in concurrent rates of peripapillary & macular OCT parameters among a large glaucomatous clinical population. Eye. , (2024).
  3. Atkinson, M. J., et al. A new measure of patient satisfaction with ocular hypotensive medications: the Treatment Satisfaction Survey for Intraocular Pressure (TSS-IOP). Health Qual Life Outcomes. 1, 67(2003).
  4. Guo, J., et al. A new mouse-fixation device for IOP measurement in awake mice. Vision Res. 219, 108397(2024).
  5. Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 31 (2), 152-181 (2012).
  6. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).
  7. Zhang, J., et al. Automatic counting of retinal ganglion cells in the entire mouse retina based on improved YOLOv5. Zool Res. 43 (5), 738-749 (2022).
  8. Al-Khindi, T., et al. The transcription factor Tbx5 regulates direction-selective retinal ganglion cell development and image stabilization. Curr Biol. 32 (19), 4286-4298 (2022).
  9. Claes, M., Moons, L. Retinal ganglion cells: Global number, density and vulnerability to glaucomatous injury in common laboratory mice. Cells. 11 (17), 2689(2022).
  10. Zhang, N., Wang, Z., Lin, P., Xing, Y., Yang, N. Methanol-based whole-mount preparation for the investigation of retinal ganglion cells. J Vis Exp. (194), e65222(2023).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

BRN3A

Похожие статьи