Исследовательская статья

Улучшение результатов студентов с помощью адаптируемого исследовательского опыта бакалавриата на основе курса молекулярного клонирования

DOI:

10.3791/67067

⸱

15 ноября 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University, 2Center for Applications in Biotechnology, California Polytechnic State University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Адаптируемый модуль молекулярного клонирования Gibson Assembly был использован в формате студенческого исследовательского опыта (CURE) на основе курса для студентов лабораторных курсов молекулярной биологии. Оценка результатов обучения учащихся показала улучшение понимания и уверенности в молекулярном клонировании после завершения CURE, и новые плазмиды были клонированы для исследований биосинтеза природных продуктов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Непрерывное развитие методов молекулярной биологии требует, чтобы учебные программы по молекулярной биологии регулярно совершенствовались для эффективной подготовки студентов к выходу на рынок труда с современными компетенциями. В частности, появление Gibson Assembly, гибкого и адаптивного метода молекулярного клонирования, продвинуло ландшафт молекулярного клонирования в многочисленных исследовательских средах. Таким образом, мы создали модуль клонирования Gibson Assembly для использования в лабораторном курсе молекулярной биологии в Калифорнийском политехническом государственном университете в Сан-Луис-Обиспо и оценили результаты обучения студентов с помощью этого модуля. В течение трех итераций курса студенты участвовали в независимом экспериментальном проекте, который включал клонирование трех уникальных библиотек плазмид для поддержки исследовательских проектов в области биосинтеза натуральных продуктов. Студентам были предоставлены анкеты до и после обучения, чтобы оценить их понимание молекулярного клонирования и их уверенность в терминах и методах молекулярной биологии. Ответы студентов показали значительное увеличение как в изучении концепций молекулярного клонирования, так и в самооценке уверенности в терминах и методах молекулярного клонирования. Эта модульная структура может быть обобщена для обучения Gibson Assembly различным приложениям, предоставляя инструкторам набор инструментов для обучения адаптируемой и новой технологии клонирования при продвижении их исследовательских проектов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обучение студентов фундаментальным концепциям молекулярной биологии и лабораторным методам имеет решающее значение для их научного и профессионального развития, поскольку эти методологии широко распространены в различных исследовательских средах, включая академические круги и промышленность. Таким образом, студенты специальностей «Биология» (специализация «Молекулярная и клеточная биология») и «Биохимия» в Калифорнийском политехническом государственном университете в Сан-Луис-Обиспо (Cal Poly) должны пройти лабораторный курс молекулярной биологии высшего дивизиона, чтобы изучить и применить эти темы (CHEM/BIO 475). Ранее была разработана базовая учебная программа для этого курса, в которой студенты выполняют клонирование на основе топоизомеразы (ТОПО) для сборки актинсодержащей плазмиды, которая получена из матрицы комплементарной ДНК (кДНК) дрожжей1. Учащиеся разрабатывают эксперименты на основе вопросов, которые имитируют подлинные исследовательские гипотезы, расширяя их знакомство с лабораторными практиками и обучением, основанным на исследованиях. Непрерывное развитие в области молекулярной биологии требует, чтобы соответствующие учебные программы были адаптированы для подготовки студентов с современными компетенциями для работы. В частности, использование Gibson Assembly стало более распространенным в научном сообществе; Несмотря нато, что метод был первоначально разработан для синтеза искусственных хромосом2, более 5000 публикаций на момент написания этого отчета ссылались на оригинальную работу Gibson et al. Сборка Gibson уникальна по сравнению с традиционными методологиями клонирования: она обладает широкими возможностями настройки и может легко лигировать несколько линейных фрагментов ДНК без необходимости использования сайтов рестрикции для создания соединений. Таким образом, мы увидели возможность пересмотреть учебную программу CHEM/BIO 475, включив в нее современные методы молекулярного клонирования и улучшив модель курса, основанную на исследованиях.

Былоустановлено, что студенческий исследовательский опыт способствует повышению концептуального понимания, развитию навыков и настойчивости в науке3, однако не все студенты бакалавриата имеют возможность непосредственно участвовать в исследовательской лаборатории. Для решения проблемы ограниченного вместимости студентов в исследовательских лабораториях были разработаны и использованы исследовательские программы бакалавриата на основе курсов (CURE) для повышения доступности науки за счет подлинных исследований в классе. Несмотря на то, что CURE различаются по своей реализации, были установлены общие практики, которые учитывают пять принципов научных исследований. В хорошо разработанном CURE студенты будут 1) использовать научные практики, 2) сотрудничать в исследовательском проекте, 3) пытаться сделать новые открытия, 4) вносить свой вклад в работу, актуальную за пределами аудитории, и 5) пересматривать и пересматривать гипотезы и методы вслучае неудачи эксперимента. Подобно традиционному исследовательскому опыту учащихся в лаборатории, было доказано, что CURE укрепляют уверенность учащихся в науке, научные навыки, ответственность за проект и настойчивость в науке, технологиях, инженерии и математике (STEM)5. В то время как ранее сообщалось о CURE, включающих молекулярное клонирование6,7,8,9,10,11,12,13, мы не знаем ни одного из них, которые подчеркивают способность Gibson Assembly создавать библиотеку подлинных исследовательских плазмид.

В этой статье мы сообщаем о расширении текущей учебной программы CHEM/BIO 475 в Калифорнийском политехническом государственном университете в Сан-Луис-Обиспо с двумя основными улучшениями: практическим опытом использования Gibson Assembly и участием студентов в CURE, которое предоставило оригинальные плазмидные конструкции для исследовательских проектов, финансируемых Национальным научным фондом (NSF-1708919 и NSF-2300890). В ходе трех реализаций этой учебной программы студенты внесли свой вклад в два отдельных исследовательских проекта, направленных на биосинтез биоактивных продуктов биоактивных молекул, производимых Actinomycetota. Натуральные продукты часто содержат фармакофоры с антибиотической, противогрибковой и/или противоопухолевой активностью, что придает этим малым молекулам важность в усилиях по разработке лекарств и потенциал для клинической значимости. Это исследование требует создания библиотек плазмид для изучения как функции, так и инженерного потенциала бактериальных биосинтетических ферментов. В рамках этого исследования студенты разработали и провели эксперименты по сборке Гибсона для клонирования уникальных плазмидных библиотек, относящихся к этим исследовательским проектам (рис. 1). Кроме того, формат и дизайн модуля отличаются тем, что он легко адаптируется для генерации любых плазмид, представляющих интерес для других исследовательских проектов.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Обзор роли Gibson Assembly в нашей исследовательской лаборатории. Actinomycetota продуцируют низкомолекулярные натуральные продукты с клинически значимой биологической активностью, используя кластеры генов, кодирующие биосинтетические ферменты. В нашем исследовании плазмиды, содержащие ген биосинтеза, собираются с помощью Gibson Assembly для последующих исследований функции закодированного фермента. Иконы науки от Biorender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обзор лаборатории

Лаборатория молекулярной биологии - это курс высшего дивизиона, обязательный для специальностей биохимии и специальностей биологии со специализацией в молекулярной и клеточной биологии. Другие студенты, отвечающие предварительным требованиям, могут пройти курс в качестве факультатива для старших классов. Курс является совместным курсом факультета химии и биохимии и факультета биологии Калифорнийского политехнического университета. Преподаватели обоих факультетов по очереди преподают этот курс каждый семестр (две четверти биологии, одна четверть химии и биохимии).

Класс собирается в лаборатории два раза в неделю по 170 минут и один раз в неделю на 50-минутную лекцию. Лабораторные секции вмещают максимум 16 студентов, и каждый квартал предлагается 2–3 лабораторные секции. Курс длится 10 недель, а заключительный экзамен проводится во время последней встречи на 10-й неделе. Лекционное время посвящается обсуждению теории, лежащей в основе многих экспериментальных методов, проводимых в лаборатории, а также актуальных тем молекулярной биологии, которые не освещаются в лаборатории. Основная учебная программа лаборатории включает в себя процесс клонирования гена актина из дрожжей1, который занимает около 7 недель (13–14 лабораторных заседаний). Методы включают микропипетирование, выделение РНК дрожжей, амплификацию гена дрожжей с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), клонирование ТОПО, сине-белый скрининг, выделение плазмид и верификацию вкладыша с помощью рестрикционного расщепления и ПЦР, анализ клонов in silico и анализ последовательности ДНК. Учебный план на последние 3 недели курса остается на усмотрение преподавателя, но включает в себя выполнение студентами «самостоятельного проекта» с неопределенными результатами.

Обзор эксперимента

Одним из направлений нашей исследовательской группы являются пути биосинтеза у Actinomycetota. При разработке независимого проекта мы предполагали, что студенты будут создавать плазмиды с помощью Gibson Assembly для использования в наших исследовательских проектах по биосинтезу натуральных продуктов. В то время как итерации модуля курса, которые оцениваются здесь, были специфичны для плазмид, которые позволяют манипулировать биосинтетическими путями, рабочий процесс сборки Гибсона чрезвычайно легко адаптируется для других проектов молекулярного клонирования (рис. 2). Рабочий процесс был разделен на три различных эксперимента (А, В и В), которые были завершены в течение двух лекционных периодов и шести лабораторных периодов (всего 3 недели) (см. Дополнительный файл 1 и Дополнительный файл 2). Экспериментам предшествовали рабочие листы для поддержки подготовки учащихся и оценки их понимания (Дополнительный файл 3, Дополнительный файл 4 и Дополнительный файл 5). Рабочий процесс представлен в формате, который гибко соответствует потребностям и интересам преподавателя.

figure-introduction-2
Рисунок 2: Рабочий процесс модуля Gibson Assembly. День 1 и день 4 — это лекции, на которых студенты выполняют анализ последовательностей in silico и планирование эксперимента. Дни 2–3 и 5–8 – это лабораторные совещания, на которых проводятся этапы клонирования новых плазмид с помощью Gibson Assembly, за которыми следует изоляция и скрининг. Графическая блок-схема сгруппирована по трем экспериментам, которые выполняют учащиеся (A, B и C). Более подробные инструкции и протоколы можно найти в руководствах для инструктора и студента, предоставленных в виде Дополнительного файла 1 и Дополнительного файла 2 соответственно. Иконы науки от Biorender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Модуль независимого проекта Gibson Assembly был впервые опробован в весеннем квартале 2019 года в CHEM/BIO 475. В 2020 и 2021 годах курс преподавался онлайн из-за пандемии SARS-CoV-2. Когда весной 2022 и 2023 годов очное обучение возобновилось, студентам курса было предложено принять участие в исследовании, оценивающем результаты обучения в рамках независимого проекта Gibson Assembly, в рамках которого будут клонированы оригинальные, имеющие отношение к исследованиям плазмиды. В 2019 году студенты создали библиотеку плазмид, состоящую из генных кассет из генома Micromonospora echinospora ATCC 15837, которые были клонированы в pKC1132 (рис. 3). Эта библиотека плазмид используется в нашей исследовательской лаборатории для инактивации генов, представляющих интерес в предполагаемом биосинтетическом кластере генов для природного продукта TLN-0522015. В дополнение к нашим исследованиям по инактивации генов студенты в 2022 году клонировали небольшую библиотеку генов из предполагаемого кластера генов TLN-05220 в pUC19 (Figure 3); Наша исследовательская группа использовала эти плазмиды для субклонирования генов в экспрессирующие векторы, включая pET28b, для сверхэкспрессии и очистки белков. Студенты когорты 2023 года внесли свой вклад в текущую работу над проектом биосинтетической инженерии на эпоксомицинсинтетазе16. В группах из 3–4 человек студенты клонировали сконструированные домены модулей нерибосомной пептидсинтетазы17 в различные векторы экспрессии белков для оптимизации сверхэкспрессии и очистки этих ферментов в нашей исследовательской лаборатории (рис. 3). Избыточность была встроена в план клонирования для каждой когорты. Например, когорта 2019 года состояла из 44 студентов, и 15 плазмид были распределены по классу для клонирования. Таким образом, клонирование каждой плазмиды было предпринято два или три раза.

figure-introduction-3
Рисунок 3: Краткая информация о клонировании плазмид и студентах-участниках в ходе независимых итераций проектов в 2019, 2022 и 2023 годах. Проект Gibson Assembly был развернут три раза. В каждом предложении студенты-участники клонировали различную библиотеку плазмид для использования в исследовательских проектах по изучению путей биосинтеза. Проекты в 2019 и 2022 годах поддержали нашу текущую работу над природным продуктом TLN-0522015 с двумя реакциями сборки Гибсона с двумя фрагментами (одна генная кассета или ген и вектор). Проект 2023 года включал в себя замену доменов в модулях 1 и 2 фермента нерибосомальной пептидсинтетазы (NRPS), который участвует в биосинтезе эпоксомицина16. Заштрихованные фрагменты представляют двух разных мутантов поменянного домена, а сплошные цвета представляют домены, которые не были поменяны местами. В общей сложности было получено восемь различных фрагментов генов (четыре для модуля 1 и четыре для модуля 2) с выступами, совместимыми для сборки Gibson. Для каждого модуля были собраны две различные комбинации трех фрагментов гена с одним из двух различных векторов (pBAD33 и pET28, всего четыре фрагмента на сборку) для создания восьми сконструированных NRPS-плазмид. Иконы науки от Biorender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обзор оценки

По крайней мере за 1 неделю до начала независимого проекта Gibson Assembly студентам из когорт 2022 и 2023 годов было предложено принять участие в исследовании результатов обучения, разработанном аналогично исследованию, проведенному в рамках обзора лабораторного курса биохимии в Cal Poly18. Студенты-участники заполнили предварительную анкету с несколькими вариантами ответов на лабораторной встрече до начала независимого проекта и последующую анкету с несколькими вариантами ответов во время заключительной лабораторной встречи (т.е. после того, как они завершили модуль Gibson Assembly). Анкеты до и после опроса состояли из 28 идентичных вопросов с двумя дополнительными вопросами в постанкете (всего 30). Десять вопросов по содержанию были написаны для оценки знаний студентов о ферментах и механизмах, участвующих в молекулярном клонировании (например, полимеразная цепная реакция [ПЦР], сборка Гибсона, трансформация, сине-белый скрининг). В следующих семи вопросах студентам было предложено самостоятельно оценить свое знакомство с терминами молекулярного клонирования (например, ДНК-полимераза, экзонуклеаза, лигаза). Следующие 10 вопросов позволили студентам самостоятельно оценить свои способности к выполнению методов молекулярного клонирования (например, анализ последовательности ДНК, реакции рестрикционного переваривания, электрофорез в агарозном геле). Студенты также сообщили, будет ли им комфортно продолжать карьеру в области молекулярной биологии, основываясь на своих знаниях о методах молекулярного клонирования. В постанкету были включены два дополнительных вопроса, чтобы студенты могли самостоятельно оценить свою приверженность обучению на курсе и то, был ли курс ценным опытом обучения (Дополнительный файл 6 и Дополнительный файл 7). Все данные ответов студентов на анкеты до и после опроса 2022 и 2023 годов были объединены для анализа и доступны в дополнительной таблице S1.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования с участием людей были рассмотрены и одобрены людьми в Исследовательском институциональном наблюдательном совете Cal Poly (2022-113-CP (IRB)). Участники предоставили письменное информированное согласие на участие в данном исследовании.

В приведенном ниже протоколе описывается подготовка преподавателя (шаги 1.1–1.3), действия студентов в рамках учебного модуля из трех экспериментов, включающего ПЦР для получения линейных фрагментов (шаги 2.1–2.7), сборку, преобразование и отбор клонов Гибсона (шаги 3.1–3.5), выделение плазмид и скрининг (этапы 4.1–4.4) и оценку результатов обучения (5.1–5.2). Подготовка инструктора описывает один из типичных примеров дизайна праймера и подготовки желаемой плазмидной карты in silico. Все разделы протокола могут быть адаптированы для других желаемых плазмид. Каждый студенческий эксперимент разделен на две 3-часовые лабораторные встречи.

1. Подготовка инструктора

  1. Проектирование грунтовки Gibson Assembly с помощью мастера сборки Benchling
    1. Определите источник матрицы ДНК для генных вставок, таких как геномная ДНК, плазмида и синтетическая ДНК.
      ЗАМЕТКА: Для генов, которые будут амплифицированы из сложных геномных матриц ДНК, рекомендуется сначала определить уникальные сайты связывания праймеров в матрице геномной ДНК, специфичные для интересующего гена (генов), используя инструмент поиска базового локального выравнивания (BLAST) Национального центра биотехнологической информации (NCBI)21, как подробно описано в Дополнительном файле 1. Для простых шаблонов, таких как плазмиды или синтетическая ДНК, перейдите к следующему шагу.
    2. Извлечение последовательностей ДНК генной вставки (вставок) и вектора (например, см. последовательность гена поликетидгидроксилазы и последовательность pUC19, предоставленную в виде файлов GenBank в Дополнительном файле 8). Импортируйте требуемые последовательности вставки и требуемую векторную последовательность в Benchling, каждую в виде нового файла последовательности ДНК. Откройте каждую импортированную последовательность, которая будет включена в реакцию сборки Гибсона.
      ЗАМЕТКА: Файлы последовательностей ДНК можно импортировать в нескольких форматах, включая GenBank и FASTA. Можно также импортировать последовательность непосредственно из базы данных с номером доступа или вставить нуклеотидную последовательность, скопированную из другого файла или просмотрщика.
    3. В нижней части экрана найдите инструмент «Мастер сборки ». Нажмите «Мастер сборок», затем выберите «Создать новую сборку». Из предложенных вариантов выберите Gibson и нажмите кнопку «Пуск », чтобы начать сборку.
    4. В окне векторной последовательности выберите все основания, которые должны быть включены в сборку, из векторной основы. Начните отбор с нуклеотидной позиции на 3'- конце генной вставки (например, в позиции 657 pUC19) и выберите все оставшиеся нуклеотиды для включения (например, через позицию 656 для включения всей последовательности pUC19). После выбора перейдите на вкладку «Магистраль » в нижней части экрана| «Установить фрагмент».
      ЗАМЕТКА: Переключайтесь между видами карты последовательности и плазмиды вектора, чтобы выбрать все нужные основания круглого шаблона. В качестве альтернативы, если вы планируете получить фрагмент вектора с помощью рестрикционного дайджеста (вместо ПЦР) для сборки Gibson, линеаризуйте последовательность основного скелета с помощью сайта среза фермента рестрикции (например, XbaI). Для этого щелкните место разреза, удерживайте клавишу Shift и щелкните место выреза еще раз. Затем нажмите Set Fragment , чтобы задать основу. Имейте в виду, что векторно-специфичные праймеры не будут генерироваться методом Benchling, если основная цепь линеаризована ферментом рестрикции в Assembly Wizard.
    5. В окне последовательности вставок выберите все основания вставки, которые должны быть включены в сборку. После выбора нажмите на вкладку «Вставка » в нижней части экрана | Набор фрагментов.
    6. В случае нескольких генных вставок нажмите кнопку + в правой части мастера сборки. В окне последовательности вставок выберите все основания вставки, которые должны быть включены в сборку. После выбора нажмите на вкладку «Вставка » в нижней части экрана | Набор фрагментов.
    7. После того, как все фрагменты будут установлены, переименуйте сборку в нужное имя плазмида и нажмите кнопку Собрать справа от мастера сборки. Выберите нужное расположение папки для папки Sequence Folder и Primer Folder. Нажмите кнопку Создать , чтобы собрать рекомбинантную плазмидную последовательность.
    8. Откройте собранный плазмид и нажмите кнопку История сборки , чтобы просмотреть базовую карту плазмиды и обзор последовательностей, из которых она была получена. Убедитесь, что положения нуклеотидов для каждого фрагмента соответствуют желаемой конструкции.
    9. На вкладке "Параметры сборки " просмотрите названия грунтовок, предназначенных для сборки. Обратите внимание, что для каждой вставки будет разработано по два праймера (прямой и обратный), а названия праймеров будут производиться из названий файлов последовательностей ДНК. Также убедитесь, что температуры плавления грунтовки и рекомендуемые температуры отжига совместимы в этом окне (см . Дополнительный файл 8, Репрезентативные грунтовки).
      1. Если температуры плавления праймера или температуры отжига не идеальны, вручную отрегулируйте последовательности праймера (например, удаляя нуклеотиды для снижения температуры плавления) в файлах последовательностей праймера. В качестве альтернативы нажмите « Открыть повторно » и отрегулируйте параметры праймера, нажав кнопку «Настройки фермента/праймера» рядом с кнопкой «Собрать » в мастере сборки. Затем повторите шаг сборки и повторно изучите последовательности грунтовок.
      2. Если библиотека плазмид должна быть клонирована с большим количеством различных генов, клонированных в одну и ту же векторную основу,
      3. В каждом случае используйте одну и ту же пару праймеров для вектора. Для этого вручную удалите все нуклеотиды из векторных праймеров, которые установят выступы, характерные для вставки. Эти нуклеотиды будут обнаружены на 5'- конце праймера. После снятия убедитесь, что температуры плавления грунтовки и температуры отжига совместимы (см . Дополнительный файл 8, Репрезентативные грунтовки).
      4. Убедитесь, что все пары капсюлей пластин имеют очень схожие температуры плавления и отжига.
        ЗАМЕТКА: Это снизит потребность в оптимизации температуры отжига для каждой пары и позволит одновременно повторять все студенческие ПЦР-реакции с использованием одной и той же программы термоамплификатора.
    10. После того, как проектирование грунтовки для желаемых плазмид будет завершено, нажмите кнопку «Завершить » в мастере сборки. Закажите праймеры в компании, занимающейся синтезом ДНК, и получите образцы матриц ДНК для вставок и векторов.
    11. Протестируйте вставные и векторно-специфичные пары праймеров для достижения оптимальных температур отжига с помощью эксперимента градиентной ПЦР с матричками ДНК. Первоначально испытайте рекомендованные Benchling температуры отжига ± 3 °C.
    12. После определения температур отжига создать аликвоты растворов праймеров, матрицы ДНК и необходимые реагенты для ПЦР-реакций для студентов.
  2. Перед началом экспериментов раздайте учащимся рабочие листы для поддержки подготовки и оценки понимания (Дополнительный файл 4, Дополнительный файл 5 и Дополнительный раздел 6).
  3. Сбор данных о результатах обучения
    ЗАМЕТКА: Если вы заинтересованы в сборе данных о результатах обучения из модуля Gibson Assembly и публикации результатов, получите одобрение на проведение исследований с участием людей в соответствии с политикой учреждения.
    1. Предложите учащимся принять участие в исследовании результатов обучения не менее чем за 1 неделю до начала независимого проекта Gibson Assembly.
    2. Попросите студентов-участников заполнить анкету с несколькими вариантами ответов (Дополнительный файл 6) на лабораторной встрече до начала самостоятельного проекта.

2. Студенческий эксперимент А: ПЦР для получения линейных фрагментов

  1. Получите праймеры и шаблонные растворы ДНК для ПЦР у инструктора.
  2. Пипетка 25 мкл реакции, включающие ДНК-полимеразу MasterMix, ДНК-матрицу, прямые и обратные праймеры и безнуклеазную воду в соответствии с инструкциями в руководстве для учащихся (см. Дополнительный файл 2).
  3. Проведите реакцию в термоамплификаторе в соответствии с руководством для учащихся в Дополнительном файле 2. Убедитесь, что температура отжига реакции соответствует длине грунтовки, а время продления соответствует длине желаемой ампликона. Подробные инструкции см. в Дополнительном файле 2 и Дополнительном файле 3 .
  4. Храните ПЦР-реакции при температуре 4 °C или −20 °C до следующего лабораторного периода.
  5. Проанализируйте 5 мкл каждой реакции с помощью электрофореза в агарозном геле. Пока гель работает, добавьте 1 мкл фермента рестрикции DpnI в каждую реакцию, в которой в качестве матрицы использовалась плазмидная ДНК. Выдерживайте эту смесь в течение 1 часа при температуре 37 °C.
    ЗАМЕТКА: DpnI разрушает любую оставшуюся кольцевую матрицу плазмидной ДНК, что снижает вероятность получения ложноположительных результатов на этапе трансформации.
  6. Визуализируйте гель, чтобы подтвердить, что ПЦР прошла успешно и была достигнута правильная амплификация. Очистите любые успешные ПЦР-реакции с помощью коммерчески доступного набора для очистки ПЦР. Измерьте концентрацию (нг/л) очищенного продукта ПЦР с помощью микрообъемного спектрофотометра для использования в последующих сборочных расчетах Gibson.
  7. Перед следующим занятием разработайте рецепт реакции для сборки Gibson (см. Дополнительный файл 2 и Дополнительный файл 4).

3. Студенческий эксперимент Б: Сборка Гибсона, трансформация и отбор клонов

  1. Пипеткой проведите реакцию сборки Гибсона в соответствии с разработанным рецептом. Инкубировать реакцию при 50 °C в течение 15 минут. Пока реакции инкубируются, подготовьтесь к трансформации путем размораживания химически компетентных клеток кишечной палочки на льду.
  2. Преобразуйте 2 мкл сборки Гибсона в химически компетентные ячейки с помощью теплового шока. Пипеткой нанесите 100 мкл трансформированных клеток на две селекционные пластины и распределите стерилизованными шариками. Приготовьте 10-4, 10-5 и 10-6 разведений оставшихся клеток на агаре Лурия-Бертани (LB). Планшет 100 мкл каждого серийного разведения на LB (без отбора) и намазать стерилизованными шариками.
    ЗАМЕТКА: На этом шаге можно рассчитать эффективность преобразования.
  3. Инкубируйте пластины в течение ночи при температуре 37 °C. Храните пластины при температуре 4 °C до следующего урока.
  4. Подсчитайте колонии на всех пластинах и рассчитайте эффективность преобразования в соответствии с инструкциями в Дополнительном файле 2. Повторно сгруппируйте одну селективную пластину с четырьмя колониями с каждой селективной пластины и инкубируйте эту пластину при температуре 37 °C в течение ночи.
    ЗАМЕТКА: Это служит резервной культурой ваших позитивных клонов.
  5. С помощью маркера выделите, обведите и обозначьте четыре отдельные колонии на выборочной пластине инициалами учащегося и номером (например, ABC1). Возьмите новую пластину с LB-агаром, содержащую антибиотик для выбора, используйте маркер, чтобы разделить пластину на квадранты (т.е. четверти), а затем используйте ~1/2 каждой колонии, чтобы повторно нанести полосу на соответственно помеченный квадрант, и другую 1/2, чтобы инокулировать 5 мл жидкой культуры LB для каждой из четырех выбранных колоний. Обязательно пометьте пробирки соответствующей колонией (например, ABC1) и добавьте правильную концентрацию антибиотика для выбора. Инкубировать жидкие культуры в встряхивающем инкубаторе при 37 °С в течение ночи и в агаровой тарелке в статическом инкубаторе при 37 °С; хранить жидкие культуры и планшеты при температуре 4 °C до следующего периода занятий.

4. Студенческий эксперимент В: Выделение плазмид и скрининг

  1. Выделите плазмидную ДНК из жидких культур из эксперимента B с помощью набора miniprep. Измерьте концентрацию выделенной плазмиды (в нг/мкл).
  2. Разработайте дайджест рестрикции или ПЦР-скрининг для анализа выделенных плазмид (см. подробные инструкции в Дополнительном файле 2 и сообщите об ожиданиях в Дополнительном файле 5).
  3. Пипетка для рестрикции переваривания или реакции в соответствии с разработанными рецептами и инкубация при температурах и продолжительности, рассчитанных ранее.
  4. Анализируйте результаты с помощью электрофореза в агарозном геле.

5. Оценка

  1. Предложите студентам-участникам заполнить анкету с несколькими вариантами ответов (Дополнительный файл 7) на лабораторной встрече после завершения модуля Gibson Assembly.
  2. Объедините все данные из ответов до и после анкеты для анализа.
    1. Изучите статистическую значимость увеличения среднего балла по каждому отдельному содержательному вопросу между анкетами с использованием двухстороннего парного t-критерия и величины d-эффекта Коэна.
    2. Оцените повышение уверенности учащихся для каждого отдельного семестра и методики, чтобы определить степень изменения и его статистическую значимость.
    3. Определите влияние студенческого происхождения и академических факторов на обучение учащихся с помощью нормализованного прироста знаний (NLG) и непарных t-критериев.
    4. Оцените отношение учащихся к проектному опыту и карьере в области молекулярной биологии, оценивая средние баллы.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Успехи учащихся в клонировании
В каждой итерации модуля Gibson Assembly (2019, 2022 и 2023 гг.) студентам предлагалось подготовить отчет, обобщающий их выводы. В 2019 году 36 из 44 студентов (81,8%) сообщили, что они успешно клонировали свои плазмиды на основе результатов скрининга, который они разработали для эксперимента C. В общей сложности 14 из 20 студентов (70,0%) сообщили об успехе в клонировании назначенных им конструкций в 2022 году, в то время как в командном проекте в 2023 году 12 из 27 студентов (44,4% или 4 из 8 групп) сообщили об успехе на основе своих скрининговых анализов. Выводы, содержащиеся в студенческих отчетах, рассматривались преподавателем или студентами-исследователями; Интерпретации студентов корректировались, если обнаруживалось, что результаты скрининга не подтверждают их утверждения. Один образец каждой отдельной плазмиды был проанализирован с помощью секвенирования по Сэнгеру, подтвердив последовательности плазмидных вставок для всех 15 желаемых плазмид в 2019 году и всех 12 плазмид в 2022 году. В 2023 году для анализа всех 8 плазмид было использовано цельноплазмидное оксфордское нанопоровое секвенирование; Однако только 1 из 8 плазмид соответствовала желаемой последовательности.

Содержательная оценка концепций молекулярной биологии
Содержательный раздел анкеты состоял из 10 вопросов с несколькими вариантами ответов, которые проверяли понимание студентами молекулярной биологии и концепций молекулярного клонирования. Сравнение средних баллов до и после опроса по всем 10 содержательным вопросам показало значительное увеличение с 63,7% до 80,4% (p < 0,05, двусторонний парный t-критерий; Рисунок 4), что говорит о том, что независимый проект Gibson Assembly улучшил понимание студентами молекулярной биологии и концепций клонирования. Тест Коэна d определил, что это значительное увеличение соответствует большому размеру эффекта (d = 0,891), что подтверждает сильную разницу между ответами студентов до и после ответов на вопросы по содержанию.

figure-results-1
Рисунок 4: Улучшение понимания студентами молекулярной биологии и молекулярного клонирования после самостоятельного проекта. Диаграмма «коробка» и «усы» ответов учащихся на вопросы, проверяющие содержание по молекулярной биологии и молекулярному клонированию до и после завершения самостоятельного проекта (размер выборки, n, из 46; Предварительные и последующие анкеты Gibson Assembly в Дополнительном файле 6 и Дополнительном файле 7 соответственно). Средние баллы до и после были проанализированы с помощью двухстороннего парного t-критерия, который указывает на значительное увеличение правильных ответов учащихся (p < 0,5). Квадраты представляют средние 50% баллов (т.е. с25-го по75-й процентили), а усы представляют минимальный и максимальный баллы (%). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Затем мы изучили, было ли увеличение среднего балла по каждому отдельному вопросу по содержанию статистически значимым между анкетами до и после опросников. Анализ с использованием двухсторонних парных t-тестов показал, что ответы студентов на вопросы о реакциях ПЦР, дайджестах рестрикции DpnI, ферментах Gibson Assembly, вставках и векторных последовательностях Gibson Assembly значительно увеличились (p < 0,05) после завершения самостоятельного проекта. Эти вопросы, основанные на содержании, имели относительно низкие баллы перед анкетированием по сравнению со средним показателем по содержанию в 63,7%, с самыми низкими баллами по вопросам о дифраждах DpnI и ферментах Gibson Assembly (34,8% и 47,8% соответственно). Постпроектный средний показатель по указанным вопросам увеличился до 71,7% и 89,1% соответственно, что ближе к среднему показателю по общему содержанию в 80,4%. Эти данные показывают, что к концу проекта понимание студентами как DpnI, так и ферментов Gibson Assembly улучшилось с большим эффектом, чем общий раздел содержания анкеты (d = 0,982).

Оценка отношения к терминам молекулярной биологии и лабораторным методам
Вопросы об отношении были разделены на два раздела анкеты студента. В первом разделе учащиеся должны были самостоятельно оценить свои знания семи терминов молекулярной биологии по шкале от 1 до 4 (от 1 = «Я понятия не имею, что означает этот термин» до 4 = «Я знаю, что означает этот термин, и могу легко объяснить это кому-то другому»). Средняя достоверность термина достоверно увеличилась с 3,52 до 3,87 при большой величине эффекта (p = 5,32 × 10-15 и d = 1,40 соответственно; Рисунок 5А). Во втором разделе об отношении студентов спрашивали, согласны ли они с утверждением «Мне комфортно выступать...» одиннадцать различных лабораторных методов молекулярной биологии по шкале от 1 до 5 (от 1 = «Категорически не согласен» до 5 = «Полностью согласен»). Средняя уверенность студентов в этих одиннадцати методах значительно увеличилась с 3,82 до 4,33 при большой величине эффекта (p = 2,08 × 10-11 и d = 1,09; Рисунок 5В).

figure-results-2
Рисунок 5: Повышение уверенности студентов в понимании терминов и методов молекулярной биологии и клонирования после самостоятельного проекта. Диаграммы «ящие» и «усовые» диаграммы уверенности студентов в терминах молекулярной биологии (А) и (В) в анкетах до и после (Пре- и постанкеты Гибсона в Дополнительном файле 6 и Дополнительном файле 7 соответственно). Для уверенности в термине (панель А) студенты выбирали уверенность по шкале из 4 частей (от 1 – «Я понятия не имею, что означает этот термин» до 4 – «Я знаю, что означает этот термин, и могу легко объяснить это кому-то другому»; размер выборки n – 45). Уверенность в лабораторной технике (панель B) оценивалась по 5-балльной шкале (от 1 до 5 баллов «Полностью согласен»; размер выборки n 42). Средние баллы до и после были проанализированы с помощью двухсторонних парных t-тестов, что указывает на значительное повышение уверенности студентов как в термине, так и в наборе данных техники (p < 0,5). В поле показаны средние 50% (т.е. с25-го по75-й процентили) ответов, а усы показывают минимальный и максимальный субъективный рейтинги доверия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Мы оценили повышение доверия студентов для каждого отдельного термина и методики и определили, что каждый термин, кроме ДНК-полимеразы и трансформации, показал статистически значимое увеличение (p < 0,05, двусторонний парный t-критерий; Таблица 1). Каждый студент, за исключением одного, отметил «Я знаю, что означает этот термин и могу легко объяснить это кому-то другому» для термина «ДНК-полимераза» как в предварительном, так и в последующем опросниках, поэтому в этом термине не было возможности для улучшения (Таблица 1). Для семестра трансформации 73,91% студентов выбрали самый высокий уровень доверия (номер 4 по шкале) в предварительном опросе по сравнению с 80,4% в пост-опросе. Девять из одиннадцати оцененных лабораторных методов показали значительное повышение уверенности студентов; это исключило расчеты молярности и гель-электрофорез (Таблица 1). В среднем, студенты сообщили о высоких баллах перед анкетированием по обоим этим методам (4,71 и 4,57 соответственно по сравнению со средним показателем по методике 3,81), что указывает на то, что студенты уже были уверены в этих терминах до проекта Gibson Assembly. Вопросы, которые оценивали уверенность учащихся в вопросах общей биологии (например, ДНК-полимераза, гель-электрофорез, расчеты молярности), в целом не показали статистически значимых изменений (Таблица 1). Тем не менее, все специализированные вопросы по сборке Гибсона показали значительное увеличение с наибольшим размером эффекта (d > 1,6), при этом метод «Сборка Гибсона» показал наибольшее изменение доверия студентов (Таблица 1 и Рисунок 6).

Тип контентаТермин/техникаAvg Questionnare ОтветСтатистическая значимостьРазмер эффекта (d)
ПредПоместитьЗначение P Да/Нет
Общая биохимияТермин ДНК-полимераза3.983.98неопределенныйНет0
Методика расчета молярности4.714.774.45Э-01Нет0.130
Техника гель-электрофореза4.574.681.68Э-01Нет0.254
Молекулярное клонированиеТехника проектирования грунтовок3.053.577.23Э-04Да0.536
Техника клонирования in silico3.614.075.75Э-04Да0.533
Сине-белый отсев Термин3.594.344.10Э-06Да0.655
Термин ПЦР-скрининга3.784.311.02Э-06Да0.936
Срок сборки Gibson2.873.787.41Э-13Да1.69
Техника сборки Gibson2.594.201.14Э-15Да1.61

Таблица 1: Значительное увеличение числа вопросов, касающихся молекулярного клонирования, но не общей биохимии. Среднее значение по анкетам до и после опросника (Анкеты Gibson Assembly Pre- и Post-Questionnaires в Дополнительном файле 6 и Дополнительном файле 7 соответственно) для выбранных вопросов термина и техники. Для оценки значимости использовали двухсторонний парный t-критерий (если p < 0,05 — да; если p ≥ 0,05 — нет). Для термина «ДНК-полимераза» ответы студентов были идентичными между до- и пост-анкетой, таким образом, p не определено. Величина эффекта сравнения ответов учащихся на каждый вопрос до и после был определен с использованием значений d Коэна (d ≥ 0,8 считается большим эффектом). Чем больше размер эффекта, тем выше вероятность того, что ответы до и после будут различаться в выборке. Размер выборки n составляет 45 и 42 для вопросов по терминам и техникам соответственно. Сокращение: AVG = средний.

figure-results-3
Рисунок 6: Увеличение количества вопросов, связанных с отношением к Gibson Assembly. Количество ответов, в которых учащиеся сообщили о доверии к семестру Ассамблеи Гибсона (А) и (В) методу в анкетах до и после опросников. Ответы на вопросы о достоверности термина были по шкале из 4 частей («Я понятия не имею, что означает этот термин» до 4-«Я знаю, что означает этот термин, и могу легко объяснить это кому-то другому»). Ответы на вопросы об уверенности в лабораторной технике варьировались от 1 «Категорически не согласен» до 5 «Полностью согласен». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Затем мы оценили, влияют ли факторы происхождения учащегося на то, насколько он узнал из независимого проекта. Было показано, что разрывы в восприятии достижений19 и успеваемости20 сохраняются в курсах бакалавриата STEM из-за пола; таким образом, мы использовали нормализованный прирост в обучении (NLG) и непарные t-критерии, чтобы определить, наблюдался ли подобный гендерный разрыв в этих независимых проектах. Основываясь на этих статистических тестах, мы не обнаружили, что пол учащихся оказывает влияние на результаты обучения учащихся. Мы также проверили, имеют ли академические факторы, такие как специальность, средний балл, оценки за предыдущую курсовую работу и итоговая оценка по BIO/CHEM 475, значительную связь с результатами обучения студентов в независимом проекте. В то время как студенты, специализирующиеся на биохимии (Дополнительная таблица S1 и Дополнительная таблица S2), имели более высокие средние баллы и оценки за итоговый курс, и каждый из них по отдельности показал более высокий средний NLG, непарные t-критерии не показали статистической значимости между этими индивидуальными фоновыми факторами и результатами обучения. Непарные t-критерии также использовались для оценки различий в NLG между когортами 2022 и 2023 годов. Было обнаружено, что когорта 2023 года показала значительно более высокий прирост знаний, чем когорта 2022 года по содержательным вопросам (Дополнительная таблица S3). Это указывает на то, что, несмотря на более низкий уровень успешности клонирования в когорте 2023 года, они получили большее понимание молекулярной биологии и концепций молекулярного клонирования, чем когорта 2022 года. Хотя причины такой разницы неясны, эти данные показывают, что успешное клонирование не обязательно для эффективного обучения с помощью этого модуля.

В дополнение к оценке владения студентами лабораторными методами, мы оценили их отношение к проектному опыту и карьере в области молекулярной биологии. Один из вопросов, включенный в оценку как до, так и после проекта, измерял их уровень комфорта при выборе карьеры, связанной с методами молекулярной биологии. Результаты показывают, что проект значительно повысил комфорт студентов в карьере в области молекулярной биологии (p = 8,46 × 10-5), при этом средний балл увеличился с 3,60 до 4,09 по нашей шкале от 1 до 5. Кроме того, постпроектная анкета включала вопросы о стремлении студентов максимизировать свой учебный опыт и их оценке ценности проекта. Респонденты оценили свою приверженность в среднем на 4,48 балла и сочли проект очень ценной возможностью для обучения, со средним баллом 4,73. В совокупности эти результаты подчеркивают ценность независимого проекта для академического роста студентов, а также энтузиазм и уверенность в начинаниях в области молекулярной биологии.

Дополнительная таблица S1: Обезличенные исходные данные. Все ответы студентов и основные специальности из анкет до и после опросников, которые были собраны в ходе итераций модуля Gibson Assembly CURE в 2022 и 2023 годах. Обратитесь к Дополнительному файлу 6 и Дополнительному файлу 7 , чтобы увидеть соответствующие вопросы до и после соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительная таблица S2: Различия в нормализованном приросте обучения по специальностям для каждого раздела анкеты. Непарные t-критерии показали, что ни один из типов вопросов не показал существенных различий в нормализованном приросте обучения (NLG) по основным направлениям (p < 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительная таблица S3: Разница в нормализованной успеваемости по когортам для каждого раздела анкеты. Непарные t-тесты показали, что когорта 2023 года имеет значительно более высокий нормализованный прирост обучения (NLG) по содержательным вопросам по сравнению с когортой 2022 года (p < 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительный файл 1: Руководство инструктора по модулю Gibson Assembly CURE. Руководство для инструкторов по реализации модуля Gibson Assembly CURE. Пошаговые инструкции предоставляются инструкторам для подготовки к курсу путем разработки и проверки грунтов Gibson Assembly на основе интересующего их шаблона. В общих чертах излагаются темы и упражнения, которые инструкторы должны охватить во время каждой лекции и лабораторных работ для экспериментов А–С. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 2: Руководство для студента по модулю Gibson Assembly CURE. Руководство для учащихся, включающее соответствующую справочную информацию о сборке Gibson и пошаговые протоколы для каждого эксперимента (A–C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 3: Рабочие листы планирования эксперимента А (индивидуальные и групповые). Индивидуальные и командные рабочие листы для понимания учащимися и подготовки к амплификации ПЦР для фрагментов сборки Gibson. Только один из этих рабочих листов должен быть назначен преподавателем на основе структуры самостоятельного проекта (индивидуального или командного). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 4: Рабочий лист планирования эксперимента B. Рабочий лист учащегося, помогающий в расчетах, необходимых для настройки реакции сборки Гибсона. Количество фрагментов на листе может быть скорректировано в зависимости от схемы клонирования для интересующих плазмид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 5: Лист планирования эксперимента C. Студенческий рабочий лист, помогающий в разработке дайджеста рестрикций или ПЦР-эксперимента для скрининга интересующей плазмиды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 6: Предварительная анкета Gibson Assembly. Анкета из двадцати восьми вопросов, раздаваемая студентам перед началом модуля Gibson Assembly CURE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 7: Пост-анкета Gibson Assembly. Анкета из тридцати вопросов, выдаваемая студентам после прохождения модуля Gibson Assembly CURE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 8: Zip-папка, содержащая файлы последовательностей GenBank (.gb) гена поликетидгидроксилазы, вектора pUC19 и плазмиды, собранной Гибсоном, а также таблицу репрезентативных праймеров. Обратитесь к этим файлам для примерного проектирования грунтовки в мастере сборки Benchling и заполнения рабочих листов планирования экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы предлагаем корректируемый лабораторный проект в классе для студентов, который обучает студентов молекулярному клонированию с помощью Gibson Assembly в исследовательской среде, основанной на курсе. В общей сложности 28 новых плазмид были клонированы студентами бакалавриата в аудиторных условиях. Успешность, о которой сообщали отдельные студенты, варьировалась от 44,4% до 81,8% в трех когортах, а общая успешность клонирования составила 80% (28 из 35 назначенных плазмид были успешно клонированы). Более низкий успех клонирования в 2023 году, вероятно, был связан с двумя сложными факторами. Во-первых, пробирки с образцами матричной ДНК были помечены очень близкими именами; не исключено, что имели место перепутанные матрицы ДНК, подготовленные студентами-исследователями, что привело к объединению несовместимых линейных фрагментов во время реакции сборки Гибсона, выполненной студентами в учебной лаборатории. В будущих итерациях этого проекта шаблонная ДНК должна быть сначала секвенирована или проверена с помощью дайджеста ограничений, чтобы подтвердить правильную идентичность, прежде чем она будет предоставлена студентам. Во-вторых, итерация этого проекта в 2023 году состояла из сборок с четырьмя фрагментами (один вектор и три вставки), в отличие от сборок с двумя фрагментами в предыдущие годы (один вектор и одна вставка). Это также могло снизить успешность клонирования в данном проекте, поскольку большее количество фрагментов в сборке Гибсона может снизить эффективность реакции22. В будущих итерациях этого проекта может быть обеспечена дополнительная избыточность, если большее количество групп клонирует одну и ту же плазмиду или группы настраивают несколько реакций сборки Гибсона при различных соотношении вставки к вектору, чтобы увеличить вероятность успешного лигирования и трансформации плазмид. Кроме того, включение более длинных перекрытий между фрагментами и увеличение времени инкубации реакции сборки Гибсона может увеличить успех сборок с 4–6 фрагментами23.

В дополнение к клонированию новых плазмид, результаты опроса до и после проекта показывают, что студенты улучшили свое понимание молекулярной биологии и концепций молекулярного клонирования, при этом наибольший эффект был достигнут в вопросах, связанных с клонированием сборки Гибсона. Кроме того, уверенность студентов в терминах молекулярной биологии и лабораторных методах значительно улучшилась после завершения проекта для большинства из оцениваемых. Сборка Gibson является важным и универсальным методом молекулярного клонирования, используемым в академических исследованиях и в биотехнологической промышленности2. Обучая этим концепциям и практическим навыкам на лабораторных курсах, все студенты бакалавриата имеют равные возможности получить диплом с исследовательской компетенцией и навыками, которые можно было бы нанять, при поступлении на работу или продолжении образования.

Описанная учебная программа Gibson Assembly включает в себя пять компонентов успешного CURE4. Студенты использовали научные практики, разрабатывая свои собственные протоколы, включая цели и ожидания, основанные на размерах ампликонов ПЦР и сокращениях рестрикционного дайджеста (Supplemental File 3, Supplemental File 4 и Supplemental File 5). Независимый проект способствует сотрудничеству студентов путем разделения подготовки каждого необходимого фрагмента между членами группы и в конечном итоге использования фрагментов от каждого члена группы в одной реакции лигирования (Experiment A Planning Sheet (Team-Based) in Supplemental File 3). Плазмиды, на клонирование которых были направлены эти независимые проекты, являются плазмидами с новой экспрессией, имеющими отношение к исследовательским проектам за пределами классной комнаты, потенциально предоставляя данные для исследований, пригодных для публикации. Как и в более традиционном исследовательском опыте, вероятность успеха клонирования в курсе CURE не была 100%. Студентам было предложено оценить переменные, которые могли привести к отрицательным результатам, и предложить гипотезы, объясняющие, почему плазмида не была успешно клонирована, что послужило подлинным учебным опытом для студентов в отношении результатов исследований.

В этой итерации Gibson Assembly CURE студенты клонировали плазмиды, имеющие отношение к исследованию природных продуктов Actinomycetota; Тем не менее, рабочий процесс был разработан таким образом, чтобы его можно было легко адаптировать и к другим проектам. Представленные здесь протоколы являются обобщенными, что позволяет студентам клонировать плазмиды, которые могут быть использованы для множества исследовательских целей, в течение шести лабораторных встреч и двух лекций. Эта структура позволяет студентам клонировать новые плазмиды по отдельности или совместно клонировать одну плазмиду из >2 линейных фрагментов в рамках командного подхода. В целом, этот подход может быть адаптирован для широкого круга исследовательских проектов, которые могут потребовать различного использования Gibson Assembly.

В этом исследовании оценивались успехи учащихся в обучении с помощью подхода к обучению Gibson Assembly, основанного на CURE, но дополнительное понимание можно было получить за счет расширения исследования. Несмотря на то, что формат анкетирования до и после опроса позволил оценить результаты обучения благодаря независимому проекту, сравнение с преподаванием Gibson Assembly на основе лекций не проводилось. Сравнение CURE на основе эксперимента с лекционным или более традиционным лабораторным занятием, где экспериментальные результаты уже разработаны для студентов, дало бы больше информации, если бы улучшенные результаты обучения Gibson Assembly специфичны для модели курса CURE. Наконец, в то время как некоторые вопросы по содержанию, относящиеся к Gibson Assembly, показали значительное улучшение понимания, другие – нет. Вопросы, касающиеся гомологичных перекрытий, используемых в сборке Gibson, как они устанавливаются и как они рекомбинируются в реакции клонирования Gibson Assembly, не улучшились. Это говорит о том, что дальнейшее объяснение или дополнительная оценка знаний по этим темам может улучшить понимание учащимися будущих реализаций этой учебной программы.

В Cal Poly продолжается реализация независимой проектной структуры Gibson Assembly. В будущих итерациях курса этот проект будет изменен для обеспечения большей самостоятельности студентов, генерации гипотез и планирования экспериментов. Предстоящее изменение учебной программы в Калифорнийском политехническом университете дает возможность расширить независимый проект, включив в него разработку праймеров под руководством студентов, выбор векторной основы, анализ последовательностей и/или последующее тестирование плазмид, например, на экспрессию белков. Кроме того, независимый проект может быть адаптирован для обучения другим соответствующим методам молекулярной биологии, таким как сайт-направленный мутагенез или редактирование генов, в зависимости от потребностей текущих исследовательских проектов. Изменение методов, используемых студентами в независимом проекте, может обеспечить большую проницательность в отношении того, какие темы подходят для формата CURE, а какие оказываются сложными для реализации.

В совокупности этот отчет подробно описывает адаптируемый учебный модуль Gibson Assembly, который реализует CURE как для улучшения понимания студентами новой методологии клонирования, так и для повышения компетентности в научном процессе. Независимый проект улучшил результаты обучения студентов и повысил уверенность в большинстве оцениваемых терминов и методов молекулярной биологии. Мы поощряем использование и адаптацию этого модуля не только для создания новых исследовательских плазмид, но и для повышения доступности и доверия студентов к методам исследований, лучше готовя студентов к будущей карьере в области STEM. В идеале эта работа должна вдохновить на совершенствование учебных программ по молекулярной биологии и способствовать адаптивности курсов STEM по мере дальнейшего развития методологий научных исследований.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов или других конфликтов интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы выражают благодарность Андреа Лаубшер за техническую поддержку, а также Майклу Блэку, Сэнди Клементу и Джавину Озе за полезные дискуссии о внедрении учебной лаборатории и оценке результатов обучения. Авторы выражают признательность всем студентам, принимавшим участие в исследовании результатов обучения в когортах 2019, 2022 и 2023 годов, а также студентам-исследователям Натану Куну и Ааюши Адеттивару, которые помогали в подготовке реагентов к внедрению учебной лаборатории. Авторы также выражают признательность за финансовую поддержку со стороны Фонда Уильяма и Линды Фрост, гранта Центра приложений в биотехнологии Chevron Biotechnology Applied Research Endowment Grant и Национального научного фонда (NSF-1708919 и NSF-2300890).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Дезоксирибонуклеотидтрифосфат (dNTPs, 10  mM)Компонент MasterMix от Fisher ScientificFERR0191Homemade
Dithiothreitol (DTT)Компонент MasterMix от Fisher ScientificFERR0861Homemade
DpnI New England BiolabsR0176S1000 единиц
Микробиологический инкубатор Fisherbrand IsotempFisher Scientific15-103-0513
FisherBrand Isotemp Водная баняFisherScientific S28124
GelRed Гель для нуклеиновых кислот ОкрашиваниебиотиумаNC959471910 000X
GeneJET Гелевая экстракция и очистка ДНКМикронабор Thermo ScientificFERK0831100 Preps
GeneRuler 1 kb ДНК-лестницаFisher ScientificFERSM0314100 применений
LB Бульон, MillerFisher BioReagentsBP9723-500500 г
Магния хлорид гексагидратFisher ScientificBP214-500Домашний компонент MasterMix
Mastercycler nexus X2 Градиентный термоамплификаторEppendorf6337000027
Центрифуга Microfuge 16Beckman CoulterA46474
Micromonospora echinospora бактерииАмериканская коллекция культур типаATCC 15837
Микроволновая печьGeneral Electric 
Молекулярная биология Класс АгарозаФишер БиореактивыBP160-100100 г
Nanodrop Один микрообъемный спектрофотометрThermo Scientific13-400-518
NEB 5-альфа Компетентная кишечная палочкаНовая Англия BiolabsC2987H20 x 0,05 мл
NEBuilder HiFi ДНК сборка мастер-миксНовая Англия BiolabsE2621S10 реакций
Настольный орбитальный шейкер New Brunswick Innova 40New BrunswickM1299-0090
Биореагенты Fisherбез нуклеазыBP24845050 мл
PEG-8000 Fisher ScientificBP233-100Домашний компонент MasterMix
Phusion DNA PolymeraseNew England BiolabsM0530Домашний компонент MasterMix
Портативные весыOhausSKX123
pUC19 векторNew England BiolabsN3041S
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix New England BiolabsM0492S100 реакций
T5 ExonucleaseEpicenterT5E4111KHomemade' MasterMix компонент
Taq DNA LigaseNew England BiolabsM0208Homemade' MasterMix компонент
Tris-HClFisher ScientificAAA1137918Homemade' MasterMix компонент
TriTrack DNA Gel Loading Dye (6x)Thermo ScientificFERR11615 x 1 мл
Zyppy Plasmid Miniprep KitZymo ResearchD4019100 Preps
β-никотинамидадениндинуклеотид (NAD+)New England BiolabsB9007SHomemade' MasterMix компонент
2440640

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Black, M. W., Tuan, A., Jonasson, E. Cloning yeast actin cDNA leads to an investigative approach for the molecular biology laboratory. Biochem Mol Biol Educ. 36 (3), 217-224 (2008).
  2. Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  3. Bell, J. K., et al. CUREs in biochemistry—where we are and where we should go. Biochem Mol Biol Educ. 45 (1), 7-12 (2017).
  4. Auchincloss, L. C., et al. Assessment of course-based undergraduate research experiences: A meeting report. CBE Life Sci Educ. 13 (1), 29-40 (2014).
  5. Buchanan, A. J., Fisher, G. R. Current status and implementation of science practices in Course-based Undergraduate Research Experiences (CUREs): A systematic literature review. CBE Life Sci Educ. 21 (4), ar83 (2022).
  6. Verity, N., Ulm, B., Pham, K., Evangelista, B., Borgon, R. Demonstrating core molecular biology principles using GST-GFP in a semester-long laboratory course. Biochem Mol Biol Educ. 50 (1), 55-64 (2022).
  7. Li, G., et al. CUR(E)ating a new approach to study fungal effectors and enhance undergraduate education through authentic research. Biochem Mol Biol Educ. 52 (1), 6-14 (2024).
  8. Roecklein-Canfield, J. A., Lopilato, J. Tagging and purifying proteins to teach molecular biology and advanced biochemistry. Biochem Mol Biol Educ. 32 (6), 373-377 (2004).
  9. Li, C., et al. Directed evolution of glyphosate oxidase and a chemiluminescence system for glyphosate detection: A comprehensive practical laboratory experiment on biotechnology. Biochem Mol Biol Educ. 51 (3), 302-311 (2023).
  10. Wang, J. T. H., Schembri, M. A., Ramakrishna, M., Sagulenko, E., Fuerst, J. A. Immersing undergraduate students in the research experience: A practical laboratory module on molecular cloning of microbial genes. Biochem Mol Biol Educ. 40 (1), 37-45 (2012).
  11. Dean, D. M., Wilder, J. A. The “Frankenplasmid” lab: An investigative exercise for teaching recombinant DNA methods. Biochem Mol Biol Educ. 39 (5), 376-383 (2011).
  12. Bornhorst, J. A., Deibel, M. A., Mulnix, A. B. Gene amplification by PCR and subcloning into a GFP-fusion plasmid expression vector as a molecular biology laboratory course. Biochem Mol Biol Educ. 32 (3), 173-182 (2004).
  13. Roberts, L. A., Shell, S. S. A research program-linked, course-based undergraduate research experience that allows undergraduates to participate in current research on mycobacterial gene regulation. Front Microbiol. 13, 1025250(2023).
  14. Jose, P. A., Maharshi, A., Jha, B. Actinobacteria in natural products research: Progress and prospects. Microbiol Res. 246, 126708(2021).
  15. Banskota, A. H., et al. TLN-05220, TLN-05223, new Echinosporamicin-type antibiotics, and proposed revision of the structure of bravomicins. J Antibiot. 62 (10), 565-570 (2009).
  16. Schorn, M., et al. Genetic basis for the biosynthesis of the pharmaceutically important class of epoxyketone proteasome inhibitors. ACS Chem Biol. 9 (1), 301-309 (2014).
  17. Smith, H. G., Beech, M. J., Lewandowski, J. R., Challis, G. L., Jenner, M. Docking domain-mediated subunit interactions in natural product megasynth(et)ases. J Ind Microbiol Biotechnol. 48 (3-4), kuab018(2021).
  18. Williams, L. C., et al. The genetic code kit: An open-source cell-free platform for biochemical and biotechnology education. Front Bioeng Biotechnol. 8, 941(2020).
  19. Bloodhart, B., Balgopal, M. M., Casper, A. M. A., Sample McMeeking, L. B., Fischer, E. V. Outperforming yet undervalued: Undergraduate women in STEM. PLoS One. 15 (6), e0234685(2020).
  20. Farrar, V. S., Aguayo, B. -Y. C., Caporale, N. Gendered performance gaps in an upper-division biology course: Academic, demographic, environmental, and affective factors. CBE Life Sci Educ. 22 (4), ar55(2023).
  21. Camacho, C., et al. BLAST+: Architecture and applications. BMC Bioinf. 10 (1), 421(2009).
  22. Optimization Tips for NEBuilder® HiFi DNA Assembly and NEB® Gibson Assembly. , New England BioLabs Inc. https://www.neb.com/en-us/tools-and-resources/usage-guidelines/optimization-tips-for-nebuilder-hifi-dna-assembly-and-neb-gibson-assembly (2024).
  23. Instruction Manual: Gibson Assembly® Master Mix / Gibson Assembly® Cloning Kit. , New England BioLabs Inc. https://www.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale2611.pdf?rev=9db62577a41b4cfda071e21864a6763e (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи