Гибридный ансамблевый и одномолекулярный анализ для визуализации движения полностью восстановленного КМГ

Краткое содержание

Мы сообщаем о гибридном ансамбле и анализе одной молекулы для непосредственного изображения и количественной оценки движения флуоресцентно меченных, полностью восстановленных геликаз Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) на линейных молекулах ДНК, удерживаемых на месте в оптической ловушке.

Аннотация

У эукариот есть одна репликативная геликаза, известная как CMG, которая централизованно организует и управляет репликосомой, а также лидирует в передней части репликационных вилок. Получение глубокого механистического понимания динамики КМГ имеет решающее значение для выяснения того, как клетки выполняют огромную задачу эффективного и точного воспроизведения всего своего генома один раз за клеточный цикл. Одномолекулярные методы уникально подходят для количественной оценки динамики КМГ благодаря их беспрецедентному временному и пространственному разрешению. Тем не менее, исследования движения КМГ на отдельных молекулах до сих пор основывались на предварительно сформированном КМГ, выделенном из клеток в виде комплекса, что исключает изучение этапов, ведущих к его активации. В данной работе мы описываем гибридный ансамбль и одномолекулярный анализ, который позволил визуализировать на уровне одной молекулы движение флуоресцентно меченного CMG после полного восстановления его сборки и активации из 36 различных очищенных полипептидов S. cerevisiae . Этот анализ основан на двойной функционализации концов линейного субстрата ДНК с двумя ортогональными фрагментами прикрепления и может быть адаптирован для изучения столь же сложных механизмов процессинга ДНК на уровне одной молекулы.

Введение

Репликация ДНК у эукариот осуществляется динамическим белковым комплексом, известным как реплисома¹. Ключевым компонентом этого комплекса является эукариотическая репликативная геликаза Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG), которая управляет и централизованно организует репликосому, лидируя в передней части репликационных вилок ^1,2. Таким образом, получение глубокого количественного понимания динамики КМГ имеет решающее значение для понимания динамики ответа. Такое понимание может быть достигнуто с помощью одномолекулярных методов, которые уникально подходят для изучения молекулярных моторов, таких как CMG, благодаря их непревзойденному пространственному и временному разрешению, и могут предоставить нам беспрецедентное количественное понимание их функции, стохастичности и динамики ^{2,3,4,5,6,7,8,9}.

In vivo CMG загружается и активируется с интервальным во времени образом, чтобы гарантировать, что репликация происходит только один раз за клеточный цикл ^1,10,11. Во-первых, в фазе G1 клеточного цикла набор белков, известных как факторы нагрузки, загружает первый компонент CMG, гексамерный комплекс Mcm2-7, на дцДНК 12,13,14,15,16 в форме двойных гексамеров с конфигурацией «голова к голове» ^15,17,18. В конкретном случае дрожжей этот начальный процесс происходит в определенных последовательностях ДНК, известных как истоки репликации¹. Несмотря на то, что Mcm2-7 является моторным ядром репликативной геликазы, сам по себе он не способен раскручивать ДНК¹⁹ без двух факторов, активирующих геликазы Cdc45 и GINS, которые должны быть рекрутированы в загруженный Mcm2-7 для образования полностью активного CMG 11,19,20,21. Процесс активации геликазы происходит в S-фазе клеточного цикла и начинается с селективного фосфорилирования двойных гексамеров Mcm2-7 регулируемой клеточным циклом киназой DDK 22,23,24. Эти события фосфорилирования облегчают рекрутирование Cdc45 и GINS в двойные гексамеры Mcm2-7 10,22,23,24,25,26 с помощью второго набора белков, известных как факторы возбуждения 10,11,26 . Связывание Cdc45 и GINS приводит к образованию двух сестринских хеликаз CMG, которые первоначально охватывают обе нити родительской ДНК и все еще расположены в конфигурации «голова к голове»^11,27. На заключительной стадии активации фактор возбуждения Mcm10 катализирует АТФ-зависимую гидролиз-зависимую экструзию одной нити ДНК из каждой сестринской CMG¹¹. После экструзии цепи сестринские геликады CMG обходят и отделяются друг от друга путем транслокации вдоль одноцепочечной ДНК АТФ-зависимым образом 11,20,21,28, раскручивая ДНК путем стерического исключения нетранслокационной цепи²⁹. Весь этот процесс был полностью восстановлен in vitro из минимального набора из 36 очищенных полипептидов S. cerevisiae ^10,11.

Несмотря на описанную выше изощренную регуляцию сборки и активации КМГ in vivo, исследования in vitro восстановленных одномолекулярных движений КМГ ^{2,30,31,32,33,34} до сих пор основывались на предварительно активированных КМГ, выделенных в виде комплекса из клеток ^20,21, пропуская все шаги, предшествующие его активации, и двунаправленный характер его движения. Этот предварительно активированный подход CMG стал золотым стандартом в области одномолекулярных соединений отчасти из-за биохимической сложности полностью восстановленной реакции сборки CMG ^10,11. Эту биохимическую реакцию было сложно перевести с объемного биохимического уровня на уровень одной молекулы по нескольким причинам. Во-первых, для максимизации эффективности реакции требуются коэффициенты загрузки и срабатывания, необходимые для сборки и активации CMG, в концентрациях в диапазоне 10-200 нМ^10,11,27. Эти диапазоны концентраций соответствуют верхнему пределу того, что может выдержать большинство одномолекулярных методов, особенно при^{использовании} флуоресцентно меченных компонентов. Наконец, CMG эволюционировала, чтобы путешествовать по тысячам пар оснований в ячейке 36,37,38,39. Следовательно, для изучения его движения в биологически значимом пространственном масштабе требуются длинные субстраты ДНК (обычно длиной порядка десятков килооснований)30,31,34,40,41,42. Использование таких длинных субстратов ДНК создает дополнительную проблему, заключающуюся в том, что чем длиннее субстрат ДНК, тем больше у него потенциальных неспецифических сайтов связывания белков и белковых агрегатов. В случае CMG последний момент особенно важен, поскольку некоторые факторы нагрузки и возбуждения, участвующие в сборке и активации CMG, содержат внутренне неупорядоченные области⁴³ и склонны к агрегации.

В данной работе мы сообщаем о гибридном ансамбле и одномолекулярном анализе, который позволил наблюдать и количественно оценить движение CMG после полного восстановления его сборки и активации из 36 очищенных полипептидов S. cerevisiae ²⁸. Этот анализ основан на двойной функционализации обоих концов субстрата ДНК с двумя ортогональными частями прикрепления: дестиобиотином и дигоксигенином² (рис. 1A). Первый фрагмент, дестиобиотин, используется для обратимого связывания субстрата ДНК с магнитными шариками⁴⁴ , покрытыми стрептавидином (рисунок 1B). После этого флуоресцентно меченый CMG собирают и активируют на связанной с шариками ДНК, а магнитный штатив используется для очистки и промывки образовавшихся комплексов ДНК:КМГ, связанных с магнитными шариками (рис. 1C). При этом удаляется избыток белка, который в противном случае агрегировался бы на субстрате ДНК; это обеспечивает практически неагрегационные комплексы ДНК:КМГ. Затем интактные комплексы элюируются из магнитных шариков путем добавления молярного избытка свободного биотина, который может вытеснить взаимодействие дестиобиотина и стрептавидина (рис. 1D). Затем отдельные комплексы ДНК:КМГ связываются между двумя оптически захваченными полистирольными шариками, покрытыми антителами против дигоксигенина (анти-Dig); На этом этапе используется вторая часть ДНК, дигоксигенин, которая может связываться с анти-Dig даже в буферном растворе, содержащем избыток свободного биотина (рис. 1E). После того, как комплекс ДНК:КМГ удерживается на месте в оптической ловушке, движение флуоресцентно меченного КМГ визуализируется с помощью конфокального сканирующего лазера (рис. 1F). Мы ожидаем, что этот анализ может быть легко адаптирован для исследования на уровне одной молекулы аналогично сложных взаимодействий ДНК и белка.

Протокол

1. Синтез дважды функционализированной линейной подложки ДНК и связывание с магнитными шариками

1. Двойная функционализация субстрата ДНК дестиобиотином и дигоксигениновыми фрагментами
   1. Линеаризовать 20 мкг 23,6 кб плазмиды pGL50-ARS1 (содержащей естественное происхождение репликации ARS1, клонированную на месте и доступную по запросу) 200 единицами фермента рестрикции AflII в течение 16 ч при 37 °C в конечном объеме 200 мкл 1x буфера (50 мМ ацетата калия, 20 мМ трис-ацетата, 10 мМ ацетата магния, 100 мкг/мл BSA, pH 7,9).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг можно сократить до 4 часов без снижения выхода, если это так удобно.
   2. Инактивировать AflII путем инкубации реакции при 65 °C в течение 20 минут. Притупляют образовавшиеся 4-нуклеотидные выступы TTAA, дополняя реакцию линеаризации 200 мкл 60 единицами полимеразы фрагмента Кленоу (от 3' до 5' экзо-), 17 мкл 10-кратного буфера (500 мМ NaCl, 100 мМ Tris-HCl, 100 мМ MgCl₂, 10 мМ DTT, pH 7,9), 33 мкМ D-дестиобиотин-7-дАТФ, 33 мкМ дигоксигенин-11-дУТП, 33 мкМ дСТФ, 33 мкМ дГТФ, и сверхчистой воды до конечного объема 370 мкМ. Инкубируйте реакцию при 37 °C в течение 30 мин.
      Примечание: На этом этапе фрагмент Кленоу притупляет выступы на обоих концах линеаризованной ДНК путем включения двух нуклеотидов D-дестиобиотин-7-dATP и двух нуклеотидов дигоксигенин-11-dUTP на каждом конце.
   3. Дополните реакцию 10 мМ ЭДТА и инактивируйте фрагмент Кленоу, инкубируя реакцию при 75 °C в течение 20 минут. Доведите объем реакции до 400 мкл с ультрачистой водой.
   4. Возьмите четыре спиновые колонки S-400, закрутите их в течение не менее 30 с, чтобы снова суспендировать смолу, а затем центрифугируйте их в течение 1 минуты при 735 x g , чтобы удалить буфер хранения. Переложите колонки в чистые пробирки объемом 1,5 мл.
   5. Немедленно добавьте по 100 мкл раствора ДНК в каждую колонку и центрифугируйте их в течение 2 мин при 735 x g. Теперь ДНК находится в проточном потоке, и колонки могут быть отброшены.
   6. Объедините проток четырех колонок, измерьте объем с помощью пипетки и измерьте концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра. Это будет использоваться для расчета количества ДНК, связанной с бусинами.
2. Связывание дважды функционализованной линейной ДНК с магнитными шариками, покрытыми стрептавидином
   1. Вихревые магнитные шарики М-280 покрыты стрептавидином в течение 30 с для их ресуспендирования.
   2. Перенесите 4 мг ресуспендированных магнитных шариков, покрытых стрептавидином M-280, в чистую пробирку объемом 1,5 мл. Поместите пробирку в магнитную решетку, подождите 1 минуту, пока шарики соберутся, и снимите буфер для хранения.
   3. Добавьте 1 мл 1x буфера A (5 мМ Tris-HCl pH 7,5, 0,5 мМ EDTA и 1 М NaCl) в гранулы и повторно суспендируйте путем вортексирования в течение 5 с. Выдержите бусины при комнатной температуре в течение 5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все буферы должны быть стерильно отфильтрованы. Заранее сделайте большой объем из 2x буфера A, 1x буфера B (см. ниже) и 1x буфера C (см. ниже) для экономии времени (рекомендуется). Эти буферы рекомендованы производителем магнитных шариков и могут храниться при температуре -20°C.
   4. Поместите пробирку в магнитный держатель, подождите 1 минуту, пока бусины соберутся, и удалите буфер А.
   5. Повторно суспендируйте шарики в 400 мкл 2x буфера A с помощью пипетирования, а затем добавьте 400 μL функционализированного раствора ДНК (обратите внимание, что это разбавляет 2x буфер A до конечной концентрации 1x, что является оптимальным для связывания ДНК с бусинами). Аккуратно перемешайте с помощью пипетки.
   6. Инкубируйте смесь шариков и ДНК в течение ночи при температуре 4 °C с вращением из конца в конец, чтобы функционализированная ДНК могла соединиться с шариками.
   7. Используйте магнитный штатив для удаления надосадочной жидкости (не выбрасывайте ее до измерения ее объема пипеткой и концентрации несвязанной ДНК спектрофотометром) и промойте шарики 2 раза 500 мкл буфера B (10 мМ HEPES-KOH pH 7,6, 1 мМ ЭДТА и 1 М KOAc) для удаления неспецифически связанной ДНК. Промойте шарики 2 раза 500 мкл буфера C (10 мМ HEPES-KOH pH 7,6 и 1 мМ ЭДТА), который является буфером для хранения, рекомендованным производителем.
      1. Рассчитайте общее количество ДНК, связанной с магнитными шариками, сравнив общее количество ДНК, добавленной к шарикам, с количеством ДНК, оставшимся в надосадочной жидкости. Выход должен быть в пределах 2,3-2,9 мг ДНК (~150-190 фмоль) на мг магнитных шариков. Если урожайность ниже, перед использованием убедитесь, что колонки S400 не пересохли. Постоянно контролируйте целостность ДНК с помощью гель-электрофореза, чтобы убедиться, что исходный субстрат плазмидной ДНК не разрушается.
   8. Суспендируйте шарики в 300 мкл буфера C и храните при температуре 4 °C. Чтобы предотвратить образование царапин, сделайте 4 одноразовых аликвоты по 1 мг магнитных шариков и не храните ДНК дольше 2 недель.

2. Гибридный ансамбль и одномолекулярный анализ для визуализации и количественной оценки движения полностью восстановленной КМГ с помощью коррелятивного двухлучевого оптического пинцета и конфокальной микроскопии

1. Сборка ансамбля и активация флуоресцентно меченого CMG на магнитной ДНК, связанной с бусинами (Рисунок 1С).
   Примечание: Реакции сборки и активации CMG проводились в два этапа: загрузка и фосфорилирование Mcm2-7, а также сборка и активация CMG. Если не указано иное, все этапы замены буфера проводились с помощью магнитного штатива, позволяющего магниту собирать шарики в течение 1 минуты и затем удаляя надосадочную жидкость. Все инкубации проводились в термоблоке с регулируемой температурой и крышкой для предотвращения фотообесцвечивания флуоресцентных белков. Если крышки нет, трубки следует накрыть оловянной фольгой. Очистка и флуоресцентное мечение всех белков, используемых в этом протоколе, были проведены в соответствии с предыдущими описаниями^10,11,28.
   1. Загрузка и фосфорилирование Mcm2-7
      1. Возьмите 1 мг магнитных шариков, покрытых стрептавидином, связанных с ДНК, и удалите буфер для хранения (буфер С).
      2. Промойте шарики 200 μL загрузочного буфера (25 мМ HEPES-KOH pH 7,6, 100 мМ K глутамата, 10 мМ MgOAc, 0,02% заменителя NP40, 10% глицерина, 2 мМ DTT, 100 мкг/мл BSA и 5 мМ АТФ).
      3. Снимите загрузочный буфер и снова суспендируйте шарики в 75 мкл загрузочного буфера. Аккуратно перемешайте с помощью пипетки.
      4. Добавьте ORC в конечной концентрации 37,5 нМ к связанной с гранулами ДНК и инкубируйте реакцию в течение 5 мин при 30 °C с перемешиванием 800 об/мин.
      5. Добавьте Cdc6 в конечной концентрации 50 нМ и инкубируйте реакцию в течение 5 мин при 30 °C с перемешиванием 800 об/мин.
      6. Добавьте Mcm2-7/Cdt1 (или флуоресцентно меченный Mcm2-7^{JF646-Halo-Mcm3}/Cdt1) в конечной концентрации 100 нМ и инкубируйте реакцию в течение 20 мин при 30 °C с перемешиванием 800 об/мин.
      7. Добавьте DDK в конечной концентрации 100 нМ и инкубируйте реакцию в течение 30 мин при 30 °C с перемешиванием 800 об/мин.
      8. Удалите надосадочную жидкость и промойте связанную с гранулами ДНК (которая теперь содержит фосфорилированные гексамеры Mcm2-7) 200 мкл буфера для промывки с высоким содержанием солей (HSW) (25 мМ HEPES-KOH pH 7,6, 300 мМ KCl, 10 мМ MgOAc, 0,02% заменителя NP40, 10% глицерина, 1 мМ DTT и 400 мкг/мл BSA). Перемешайте с помощью пипетки, убедившись, что шарики полностью суспендированы в буфере и не видны комки.
      9. Удалите буфер HSW и промойте шарики один раз 200 μL буфера CMG (25 мМ HEPES-KOH pH 7,6, 250 мМ K глутамата, 10 мМ MgOAc, 0,02% заменителя NP40, 10% глицерина, 1 мМ DTT и 400 мкг/мл BSA).
   2. Сборка и активация флуоресцентно меченых CMG
      1. Удалите буфер CMG и ресуспендируйте связанные с ДНК гранулы в 50 мкл буфера CMG с добавлением 5 мМ АТФ.
      2. Добавьте 50 нМ Dpb11, 200 нМ ГИНС, 30 нМ Polɛ, 20 нМ S-CDK, 50 нМ Cdc45^LD555, 30 нМ Sld3/7, 55 нМ Sld2 и 10 нМ Mcm10 к ДНК, связанной с шариками. Для этого шага смешайте все белки в одной пробирке непосредственно перед добавлением их в ДНК и поместите ее на лед. Добавьте ресуспендированную ДНК, связанную с бусинами, в белковую смесь. Инкубируйте реакцию в течение 15 минут при 30 °C с перемешиванием со скоростью 800 об/мин.
      3. Промойте шарики 3 раза 200 μл буфера HSW. Промойте шарики один раз 200 μл буфера CMG.
   3. Элюирование интактных комплексов ДНК:КМГ из магнитных шариков (Рисунок 1D)
      1. Удалите буфер CMG и элюирующие комплексы ДНК:КМГ из магнитных шариков путем ресуспендирования ЦМГ-содержащих ДНК-связанных магнитных шариков в 200 мкл элюирующего буфера (буфер КМГ с добавлением 10 мМ биотина). Инкубировать при комнатной температуре в течение 1 ч при перемешивании 800 об/мин.
      2. Поместите трубку в магнитную решетку и дайте набрать бусины в течение 5 минут. Осторожно соберите надосадочную жидкость (которая теперь содержит элюированные комплексы ДНК:КМГ), не нарушая осевшие шарики, и перенесите ее в новую пробирку.
      3. Чтобы убедиться, что в растворе не осталось гранул (так как магнитные шарики, оставшиеся в растворе, могут помешать оптической захватывающей части анализа), снова поместите собранную надосадочную жидкость в магнитный штатив и дайте собрать оставшиеся шарики еще 5 минут. Аккуратно соберите надосадочную жидкость и переложите ее в новую трубку.
      4. Добавьте 1400 мкл буфера CMG к 200 мкл надосадочной жидкости. Теперь образец готов к визуализации с помощью одной молекулы.
2. Одномолекулярная визуализация полностью восстановленной КМГ с помощью коррелятивного двухлучевого оптического пинцета и конфокальной микроскопии (Рисунок 1E-Г).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Одномолекулярная часть анализа проводится в коммерческой установке, которая сочетает в себе двухлучевой оптический пинцет с конфокальной микроскопией и микрофлюидикой^45,46 (Рисунок 1E-Г), но также может проводиться в домашних условиях. Используемая здесь коммерческая установка оснащена микрофлюидной проточной ячейкой с пятью входами (обозначаемыми каналами 1-5 соответственно) и одним выходом (Рисунок 1E). В приведенных ниже шагах все имена кнопок и/или панелей относятся к программному обеспечению, которое поставляется с этой коммерческой конфигурацией.
   1. Используйте пять входных отверстий в коммерческой установке следующим образом: Введите каналы 1-3 слева и используйте их для захвата шариков (канал 1), связывания ДНК-белкового комплекса (канал 2) и проверки на наличие CMG (канал 3). Используйте каналы 4 и 5 в качестве резервуаров белка и мест обмена буфером. Перед каждым экспериментом пассивируйте микрофлюидную проточную ячейку в течение не менее 30 минут 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, а затем 0,5% плуронового F-127, растворенного в ультрачистой воде.
      1. Убедитесь, что содержание каждого канала в каждом эксперименте соответствует описанию (рисунок 1E):
         Канал 1: полистирольные шарики, покрытые антидигоксигенином (диаметр 2,06 мкм), разведенные в соотношении 1:50 в PBS;
         Канал 2: комплексы ДНК:КМГ, элюированные из магнитных шариков;
         Канал 3: Imaging Buffer (буфер CMG с добавлением 2 мМ 1,3,5,7 циклооктатетраена, 2 мМ 4-нитробензилхохола и 2 мМ тролокса);
         Каналы 4 и 5: Буфер для визуализации, дополненный 25 нМ RPA, 10 нМ Mcm10 и либо 5 мМ АТФ, 5 мМ АТФγS или без нуклеотида.
   2. Перед экспериментом отрегулируйте мощность улавливающего лазера для достижения жесткости 0,3 пН/нм в обеих ловушках^33,46, нажав кнопку «Повторная калибровка» на панели управления мощностью программного обеспечения. Установите размер конфокального пикселя на 50 x 50 нм, размер изображения на 160 x 18 пикселей, время освещения на пиксель на 0,2 мс и частоту кадров на 5 с на панели сканирования изображения программного обеспечения. Установите регулятор температуры на 30 °C на панели «Температура».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, мы рекомендуем установить максимальную скорость предметного столика (используемую для перемещения между каналами) на уровне 0,2 мм/с, чтобы свести к минимуму диссоциацию CMG от ДНК под действием силы сопротивления.
   3. Подавайте все растворы в проточную ячейку при постоянном давлении 0,5 бар в порту впрыска (который можно настроить на панели Pressure Bar программного обеспечения). Затем выключите подачу в каналах 4 и 5. После первоначальной подачи всех растворов уменьшите давление до 0,2 бар.
   4. Перемещайте захватывающие лазеры в Канал 1 до тех пор, пока в каждую оптическую ловушку не попадет по одной бусине. Переместите захваченные бусины в канал 2, перемещая джойстик во время нажатия на спусковой крючок. Затем выловите комплекс ДНК:КМГ, перемещая правую бусину к левой бусине и от нее с помощью джойстика, не нажимая на спусковой крючок, до тех пор, пока не будет захвачен трос ДНК (что известно путем мониторинга кривой силы-удлинения захваченной ДНК⁴⁷ на панели FD Viewer программного обеспечения).
      1. Для привязки ДНК убедитесь, что вы ввели длину ДНК и правильное значение температуры на панели Reference Model, которая автоматически построит теоретическую расширяемую модель червеобразной цепи конструкции ДНК на панели FD Viewer. Если одна молекула ДНК зажата между двумя бусинами, поведение ДНК по силе-удлинению должно близко соответствовать построенной модели растягиваемой червеобразной цепи. Убедитесь в этом, отслеживая экспериментальную кривую силы-растяжения, которую программное обеспечение автоматически построит поверх теоретической.
         Отклонения от теоретической модели могут указывать на наличие нескольких молекул ДНК, связанных между бусинами, и/или на наличие белковых агрегатов, связанных с ДНК и уплотняющих ее. Чтобы предотвратить принудительно опосредованную диссоциацию белков от ДНК, не превышайте напряжение в 10 пН во время этого первоначального теста.
   5. Переместите бусины в Канал 3 и сразу остановите поток во всех каналах. Проведите однокадровое тестовое сканирование в канале 3, чтобы подтвердить наличие CMG, освещая его лазером с длиной волны 561 нм и мощностью 4 μВт, измеренной на объективе. Отрегулируйте мощность лазера визуализации на панели Возбуждение лазеров. Если КМГ присутствует, она будет выглядеть в виде двумерных пятен, ограниченных дифракцией, как показано на рисунках 1G и 2A.
      1. Если ДНК не может быть поймано, проверьте канал 2 на наличие пузырьков, которые могут замедлить поток в канале 2 (по сравнению с каналами 1 и 3). Если пузырьки присутствуют, увеличьте давление в канале от 2 до 1 бар, чтобы попытаться промыть пузырьки.
   6. Если CMG присутствует, переместите трос ДНК в канал 4 или 5 для визуализации; В противном случае, включите поток обратно, выбросьте бусины и вернитесь к шагу 2.2.4.
   7. В каналах 4 или 5 отрегулируйте расстояние между бусинами, чтобы достичь начального натяжения 2 пН в тросе ДНК. Для этого введите 2 pN на панели Force Spectroscopy и нажмите на кнопку Enable для запуска силового зажима. Как только начальное напряжение достигнет 2 пН, отключите силовой зажим перед получением изображения, нажав кнопку «Включить» на панели «Силовая спектроскопия».
   8. Изображение CMG^Cdc45-LD555 каждые 5 с с помощью лазера 561 нм при мощности 4 μВт, измеренной на объективе (рис. 1F). Для этого нажмите кнопку «Начать сканирование» на панели «Сканирование изображений». При таком сканировании CMG будет отображаться в виде двумерных пятен, ограниченных дифракцией, как показано на рисунке 1G.
      1. Если ЧМГ наблюдается, но кажется, что он не двигается до обесцвечивания, проверьте все белки, используемые для нуклеазной активности, так как зазубрины на ДНК приведут к диссоциации КМГ от ДНК⁴¹, что значительно снизит ее кажущуюся процессивность.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Мощность лазера 4 μВт должна дать стабильные результаты при использовании коммерческого микроскопа, используемого здесь. Если вы используете домашнюю установку, мы рекомендуем оценить оптимальную мощность лазера опытным путем. Оптимальная мощность лазера должна давать достаточный сигнал от флуорофора, чтобы локализовать его с желаемой точностью, и время жизни флуорофора, близкое к желаемому временному диапазону эксперимента.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что данная публикация посвящена анализу гибридного ансамбля и одной молекулы, ранее мы уже публиковали всестороннее описание анализа данных, полученных с помощью этого анализа⁴⁸.

Результаты

При правильном выполнении описанный здесь протокол должен дать практически свободные от агрегатов комплексы ДНК:КМГ. Реакция без агрегации не должна закупоривать ни один из каналов в микрофлюидной проточной ячейке, и должна быть возможность растягивать захваченные молекулы ДНК до конца конца в пределах 10% длины ее контура без разрыва ДНК. И наоборот, если в реакции присутствует агрегация, молекулы ДНК иногда могут сжиматься агрегатами, что часто приводит к разрыву ДНК при растяжении. Хороший способ распознать белковые агрегаты — посмотреть на 2D-сканирование ДНК. В реакции без агрегации КМГ проявляется в виде дискретных, симметричных дифракционно-ограниченных пятен, редко скученных по ДНК, таких как те, что на сканах, показанных на рисунке 2А. Напротив, агрегаты представляют собой менее дискретные, иногда асимметричные капли, занимающие большую длину ДНК, как на сканах, показанных на рисунке 2B. Кроме того, если анализ выполнен успешно и достигнута высокая чистота очищенных белков, будет наблюдаться движение КМГ на большие расстояния в присутствии АТФ, как это наблюдается на кимографе, показанном на рисунке 2С.

Рисунок 1: Графическое описание гибридного ансамбля и анализа одной молекулы для визуализации и количественной оценки движения полностью восстановленной CMG. (A) Линейная ДНК размером 23,6 кб, содержащая естественное начало репликации ARS1, дважды функционализирована с обоих концов дестиобиотином и дигоксигенином. (Б) Дважды функционализированная ДНК связывается с магнитными шариками, покрытыми стрептавидином, через свои дестиобиотиновые фрагменты. (C) CMG поэтапно собирают и активируют на магнитной ДНК, связанной с бусинами, с различными стадиями промывки для удаления избытка несвязанного белка и белковых агрегатов. (D) Интактные комплексы ДНК:КМГ затем элюируются из магнитных шариков путем добавления избытка свободного биотина, который превосходит взаимодействие дестиобиотина и стрептавидина. (E) Отдельные комплексы ДНК:CMG связываются между двумя покрытыми антидигоксигенином оптически захваченными полистирольными шариками с помощью микрофлюидной проточной ячейки. Обратите внимание, что взаимодействие Dig-anti-Dig ортогонально взаимодействию биотин-авидин, поэтому присутствие свободного биотина не влияет на него. (F) После удержания на месте оптическим пинцетом, комплексы ДНК:КМГ переносятся в различные буферные условия, где плоскость ДНК затем сканируется с помощью конфокального сканирующего лазера для отображения движения КМГ вдоль ДНК с течением времени. (G) На верхней панели показана схема комплекса ДНК:КМГ, удерживаемого на месте между двумя оптически захваченными полистирольными шариками с покрытием Anti-Dig, сканируемыми с помощью конфокального сканирующего лазера. На нижней панели показан пример 2D-сканирования CMG, связанного с ДНК, удерживаемой на месте с помощью оптической ловушки. В этих экспериментах ДНК не помечена, но ее можно рассматривать как горизонтальную линию, проходящую через середину изображения. Эта цифра была изменена с²⁸. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Примеры данных успешного и неудачного эксперимента. (A) Пример 2D-сканирования CMG-содержащей ДНК в образце без агрегации. В обоих сканированиях CMG показывает симметричные и дискретные дифракционно-ограниченные пятна, разрозненно распределенные вдоль ДНК. (B) Пример 2D-сканирования CMG-содержащей ДНК в образце, содержащем агрегаты. В обоих сканированиях CMG образует менее симметричные капли, скученные по ДНК. (C) Кимограф, показывающий положение на ДНК дифракционно-ограниченных КМГ пятен с течением времени в присутствии АТФ, показывающий дальнее движение комплексов КМГ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Критические шаги и важные проверки качества реагентов
Здесь освещаются важнейшие этапы и проверки качества биологических реагентов в анализе. Во-первых, важна чистота используемых белков, потому что деградация ДНК, вызванная даже небольшими нуклеазными загрязнителями в образцах белков, отрицательно повлияет на данные. Это связано с тем, что только неповрежденные (или частично поврежденные) молекулы ДНК могут быть пойманы в двухлучевой оптический пинцет. Что еще более важно, зазубрины на ДНК приведут к диссоциации^{CMG 41}, что усложнит наблюдение за дальним движением CMG. Мы настоятельно рекомендуем проверять каждый очищенный белок на нуклеазную активность, а также постоянно контролировать целостность субстрата исходной плазмиды, чтобы свести к минимуму образование трещин. Вторым важным этапом является тщательное удаление магнитных шариков после элюирования комплексов ДНК:КМГ. Удаление надосадочной жидкости на этом этапе следует проводить медленно, чтобы не нарушить собранные бусины. Если магнитные шарики останутся в образце, попавшем в оптический пинцет, они часто будут попадать на оптически захваченные полистирольные шарики, в результате чего они выйдут из оптической ловушки и усложнят сбор данных. Наконец, с комплексами ДНК:КМГ следует осторожно обращаться в оптическом пинцете. С этой целью мы рекомендуем не увеличивать напряжение ДНК выше 10 пН, так как применение силы может диссоциировать CMG от ДНК. Кроме того, перемещение между каналами в микрофлюидной проточной ячейке должно осуществляться как можно медленнее (~ 0,2 мм/с), чтобы предотвратить диссоциацию CMG от ДНК из-за возникающих сил сопротивления.

Модификации метода
Существует несколько этапов анализа, которые могут быть изменены. Например, мы показали, что время элюирования может быть сокращено с 60 минут до 30 минут без существенного влияния на выход элюирования. Кроме того, мы рекомендуем добавлять в элюирующий буфер низкую (ниже 1 мМ) концентрацию АТФ или АТФγS для предотвращения диффузии CMG с концов ДНК, а также для общей стабилизации CMG²⁸. Кроме того, несмотря на то, что буферные композиции и концентрации белков, о которых мы здесь сообщаем, основаны на тех, которые использовались в предшествующей биохимической и одномолекулярной работе^11,18, анализ, который мы описываем, полностью совместим с другими протоколами для сборки CMG^26,27. Таким образом, любое биохимическое усовершенствование, о котором сообщается для повышения эффективности сборки или активации CMG, может и должно быть реализовано в объемной части анализа для увеличения выхода. Наконец, увеличение времени между кадрами увеличивает общее время, за которое можно получить изображение КМГ, что облегчает наблюдение за движением КМГ на большие расстояния до обесцвечивания флуорофорами.

Ограничения метода
Гибридный метод, который мы описываем, ограничен тем, что можно получить изображение CMG только после его активации в массовом масштабе. Потребуется дальнейшая работа по наблюдению за активацией CMG в режиме реального времени. Еще одним важным ограничением является то, что, хотя мы ожидаем, что CMG будет собран в пары 17,26,27, общее количество комплексов CMG на ДНК, которое мы наблюдаем, в основном составляет один ²⁸, что позволяет предположить, что CMG или, по крайней мере, Cdc45 диссоциирует от ДНК во время обработки чувствительных комплексов ДНК:КМГ. Сокращение количества этапов обработки перед визуализацией отдельных молекул, а также разработка более эффективных стратегий пассивации пластиковых трубок и стекла микрофлюидной проточной ячейки могут увеличить этот выход.

Значение метода
В исследованиях движения одиночных молекул КМГ до сих пор использовался предварительно активированный КМГ, очищенный в виде комплекса из клеток. Несмотря на то, что этот подход относительно прост, он ограничен тем, что в нем отсутствуют все шаги, ведущие к активации CMG, а также двунаправленный характер CMG и ответного движения. С другой стороны, полное восстановление сборки и активации CMG имеет потенциал для изучения любых предварительных этапов активации, а также для изучения движения CMG в двух направлениях. Тем не менее, этот подход сложнее перевести с объемного биохимического уровня на уровень одной молекулы, поскольку он включает в себя гораздо больше очищенных белковых факторов и этапов. Анализ, который мы описываем здесь, помог преодолеть эти проблемы, позволив нам визуализировать движение полностью восстановленного CMG на уровне одной молекулы, что позволило нам получить доступ к некоторым ранее отсутствующим динамикам предварительной активации²⁸. Кроме того, хотя мы в основном видим один CMG на ДНК, мы смогли наблюдать несколько экземпляров двух комплексов CMG, движущихся в противоположных направлениях, и мы даже смогли зафиксировать первоначальное разделение сестринских CMG друг от^друга28, что дает некоторое представление об установлении двунаправленной репликации.

Еще одно преимущество этого анализа по сравнению с предыдущим движением CMG заключается в полностью двухцепочечной природе субстрата ДНК, который мы используем (рис. 1A). В предыдущих работах с предварительно активированным CMG наиболее распространенным способом связывания CMG с субстратом ДНК является 3'-лоскут одноцепочечной ДНК. В результате получается конструкция ДНК, которая не может быть легко ограничена на кручение и, таким образом, препятствует изучению роли суперспирали в прогрессии ответных ударов. С другой стороны, новый подход, который мы описываем здесь, может быть адаптирован для изучения роли крутящего момента в этом процессе, поскольку используемый субстрат ДНК полностью двухцепочечный.

Более широкое применение метода
Описанный гибридный анализ проложит путь к полному воссозданию полной эукариотической реплисомы, что позволит нам и другим наблюдать и количественно оценивать важную динамику, которая позволяет репсисоме успешно справляться со всеми ее различными задачами. Если оставить в стороне репликацию ДНК, анализ, о котором мы сообщаем, представляет собой важный шаг вперед в переводе сложной биохимической реакции с объемного биохимического уровня на уровень одной молекулы. Мы ожидаем, что этот анализ может быть легко модифицирован для изучения столь же сложных взаимодействий ДНК и белков, участвующих в различных механизмах процессинга ДНК.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
АфлII	NEB	R0520L
Полистирольные шарики с антидигоксигениновым покрытием	Spheroteck	DIGP-20-2
АТФ раствор	Thermo Fisher	R0441
ATPγ S	Roche	11162306001
BSA NEB		B9000S
C-Trap	Lumicks
CutSmart Buffer	NEB	B6004S	В комплекте с AflII
dCTP	Promega	U122B
D-desthiobiotin-7-dATP	Jena Bioscience	NU-835-Desthiobio
dGTP	Thermo Fisher	10218014
Digoxigenin-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-DIGXL
Dynabeads M-280 Стрептавидин магнитные шарики	Invitrogen	11205D
Klenow Fragment (3'→ 5' экзо-)	NEB	M0212L
Microspin S-400 HR вращающиеся колонны	GE Healthcare	GE27-5140-01
NEBuffer2	NEB	B7002S	В комплекте с Klenow Fragment
Nonidet  P 40 Заменитель	Sigma	74385
Pluronic F-127	Сигма	П2443