Здесь мы представляем протокол антителозависимого, клеточно-опосредованного анализа цитотоксичности (ADCC) с использованием набора для биотестирования ADCC. Этот метод является ценным инструментом для выяснения механизма ADCC и оценки терапевтического потенциала антител в иммунотерапии рака.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Оценка антителозависимой, клеточно-опосредованной цитотоксичности в раковых клетках с помощью антителозависимого клеточно-опосредованного репортерного биоанализа
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Метод антителозависимой, клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) представляет собой важный инструмент для оценки эффективности терапевтических антител в иммунотерапии рака. Оценка активности ADCC в раковых клетках имеет важное значение для разработки и оптимизации методов лечения на основе антител. В данной работе мы предлагаем методологический подход к использованию набора для биотестирования ADCC для количественной оценки реакции ADCC с использованием клеток рака щитовидной железы в качестве эффекторных клеток. Протокол предполагает совместное культивирование эффекторных клеток с раковыми клетками-мишенями в различных соотношениях в присутствии терапевтического антитела. Набор для биотестирования ADCC, использованный в этом эксперименте, включает в себя генетически модифицированные эффекторные клетки, экспрессирующие репортерный ген люциферазы под контролем элементов ответа ядерного фактора активированных Т-клеток (NFAT). При связывании поверхностного антигена на клетках-мишенях с антителами и эффекторными клетками эффекторные клетки высвобождают люциферазу, что позволяет количественно оценить цитотоксичность путем измерения сигнала люминесценции. В отличие от обычных анализов ADCC, этот метод доказал связывание целевого антигена с антителами и эффекторными клетками, что может дать достоверные результаты за короткий промежуток времени.
Введение
Антителозависимая, клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC) является важным механизмом, с помощью которого антитела оказывают иммуноопосредованное действие на уничтожение клеток 1,2,3. Иммунные клетки активируются путем связывания с терапевтическим антителом, которое взаимодействует с поверхностными антигенами клеток-мишеней для высвобождения гранзимов, перфорина, что приводит к гибели клеток-мишеней. Эти иммунные клетки включают естественные киллеры (NK) клетки и нейтрофилы 2,3,4,5,6,7. Анализ ADCC стал важным инструментом для оценки эффективности терапевтического антитела 8,9.
В традиционном анализе ADCC мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) или естественные клетки-киллеры используются в качестве эффекторных клеток для мониторинга эффективности терапевтического антитела путем количественного определения уровня смертности клеток-мишеней. В нашем методе используется набор для биотестирования ADCC, который включает в себя генетически модифицированные эффекторные клетки, экспрессирующие репортерный ген люциферазы под контролем элементов ответа ядерного фактора активированных Т-клеток (NFAT). Затем мы количественно оцениваем связывание поверхностного антигена на клетках-мишенях с антителом и эффекторными клетками. Этот метод основан на том, что реакция ADCC протекает за короткий промежуток времени без необходимости использования клеток PBMC человека. Экспериментальные этапы включают совместное культивирование эффекторных клеток с клетками-мишенями в присутствии терапевтических антител.
Во время инкубации терапевтическое антитело связывается с антигеном-мишенью на поверхности клеток-мишеней, что приводит к связыванию эффекторных клеток и Fc-фрагмента антитела. Это активирует чувствительный элемент NFAT и высвобождает сигналы люминесценции для количественной оценки реакции ADCC.
Перед проведением эксперимента экспрессия целевого антигена в клетках-мишенях должна быть подтверждена либо с помощью проточной цитометрии, либо с помощью вестерн-блоттинга. Клетки-мишени культивируют и пропускают в 96-луночные планшеты за 24 ч до начала эксперимента. Различные концентрации терапевтического антитела добавляются вместе с различным количеством эффекторных клеток для достижения рассчитанного соотношения эффекторов и клеток-мишеней.
Ключевые этапы этого метода включают (1) получение клеток-мишеней и эффекторных клеток, (2) соотношение эффекторных клеток-мишеней, (3) получение различных концентраций антитела и (4) различную продолжительность инкубации. После инкубации с помощью люминометра измеряются сигналы люминесценции, обеспечивающие количественное считывание активности ADCC. По сравнению с другими методами измерения ADCC, этот метод относительно прост в эксплуатации, а результаты точны.
Репортерный биоанализ ADCC указывает на связывание целевого антигена, терапевтического антитела и иммунных клеток в активации пути ADCC. Это связывание активирует транскрипцию генов через путь NFAT в эффекторных клетках Jurkat со стабильно экспрессирующим рецептором FcγRIIIa, вариантом V158 (высокоаффинный). Элемент ответа NFAT опосредует экспрессию люциферазы в эффекторных клетках10,11. Биологическая активность антитела в механизме действия (MOA) ADCC количественно оценивается с помощью сигнала люциферазы, производимого путем NFAT. Сигнал люциферазы в эффекторных клетках — клетках Jurket, экспрессирующих рецептор FcγRIIIa, — количественно определяется с помощью люминесцентного считывателя (рис. 1). Отношение сигнал/шум анализа высокое.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Определение экспрессии EGFR и VEGFR в клетках-мишенях
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте вестерн-блоттинг для обнаружения экспрессии целевого антигена в клетках-мишенях.
- Подготовка образцов
- Культивировали клетки (клеточные линии рака щитовидной железы человека BHT-101 и SW-1736) в колбах T75 с использованием среды Roswell Park Memorial Institute (RPMI) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% L-глутамина и 1% антибиотиков (пенициллин-стрептомицин).
- Собирайте клетки, когда они сливаются на 80%, удаляя питательную среду и промывая клетки PBS. Добавьте 5 мл PBS и удалите клетки с помощью скребка для клеток, чтобы извлечь клетки из колбы для культур. Переложите клетки в коническую трубку объемом 15 мл.
- Подсчитайте ячейки с помощью счетчика ячеек.
- Аликвота 5 × 106 клеток BHT-101 и SW-1736 в конические пробирки объемом 15 мл.
- Раскрутите ячейки при 135 × г в течение 5 минут при комнатной температуре. Удалите надосадочную жидкость PBS.
- Лизировать клеточную гранулу путем добавления 100 мкл буфера для лизиса RIPA, содержащего ингибиторы протеазофосфатазы, в течение 5 минут на лед. Перенесите лизат в пробирку объемом 2 мл, центрифугируйте при 15 000 × г в течение 15 мин и переложите надосадочную жидкость в новую пробирку объемом 2 мл.
- Измерьте концентрацию белка в клеточном лизате с помощью набора для анализа бицинхониновой кислоты (BCA).
- Добавьте 70 г белка из клеточного лизата из каждого образца, добавьте 2x буфер для образцов Laemmli с добавлением 10% 2-меркаптоэтанола и кипятите образцы при 100 °C в течение 5 минут для денатурации образцов.
- Гель-электрофорез и мембранный перенос
- Приготовьте 8% полиакриламидный гель додецилсульфата натрия (SDS) с использованием дистиллированной воды (4,7 мл), 30% акриламида (2,7 мл), 1,5 М трис-буфера, pH 8,8 (2,5 мл), 10% додецилсульфата натрия (0,1 мл), 10% персульфата аммония (100 мкл) и TEMED (10 мкл).
- Пропустите 70 мкг денатурированных образцов в 8% гель SDS-полиакриламида при 80 В в течение 20 мин и при 120 В в течение 100 мин.
- Перенесите белок на геле на мембрану из поливинилиденфторида (PVDF) при напряжении 100 В в течение 90 минут.
- После переноса заблокируйте мембрану 7% обезжиренным молоком, разведенным в буфере TBS-T (20 мМ Tris pH 7,6, 140 мМ NaCl, 0,2% Tween-20) на 1 ч.
- Инкубация антител
- Инкубируйте заблокированную мембрану с мышиным антиэпидермальным рецептором фактора роста (EGFR) и моноклональными антителами кролика против рецептора эндотелиального фактора роста (VEGFR) (разведенными в соотношении 1:1000 в 7% обезжиренном молоке) в течение ночи при 4 °C.
- После инкубации тщательно промойте мембрану трис-буферным физиологическим раствором (TBS-T) буфером (20 мМ Tris pH 7,6, 140 мМ NaCl, 0,2% Tween-20) в течение 7 минут и повторите 4 раза.
- Инкубируйте мембрану с HRP-конъюгированным вторичным антителом (разведенным в соотношении 1:4000 в 7% обезжиренном молоке (TBS-T)) в течение 1 ч.
- После инкубации тщательно промойте мембрану буфером TBS-T в течение 7 мин и повторите 4 раза.
- Обнаружение белка
- Инкубируйте мембрану в хемилюминесцентном субстрате HRP, приготовленном путем смешивания 1 мл раствора перекиси субстрата HRP с 1 мл реагента Luminol для субстрата HRP (оба реагента входят в комплект хемилюминесцентного субстрата) в течение 2 мин.
- Визуализируйте мембрану с помощью системы визуализации.
2. Подготовка клеток-мишеней
- Культивируйте целевые Т-клетки, клетки BHT-101 и SW-1736 экспоненциально до 80% конфлюентности в средах RPMI с добавлением 10% FBS, 1% L-глутамина и 1% антибиотиков (пенициллин-стрептомицин) в колбах с Т-75.
- После удаления носителя промойте клетки один раз с помощью PBS. Инкубируйте клетки с 1 мл неферментативного буфера для диссоциации клеток в течение 5 минут, чтобы вытеснить адгезивные клетки. Добавьте PBS, чтобы остановить реакцию неферментативного буфера для диссоциации клеток. Уменьшите количество клеток при 135 × г в течение 5 минут и добавьте 5 мл PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы используем неферментативный буфер для диссоциации клеток для сохранения целостности поверхностного белка мембраны. - Подсчитайте клетки и засейте их в 15 000 ячеек/лунок в 96-луночные микропланшеты из белого полистирола с прозрачным плоским дном.
3. Получение различных концентраций терапевтического антитела
- Чтобы следовать этому протоколу, используйте цетуксимаб (химерное антитело против EGFR) для связывания с EGFR и используйте бевацизумаб (гуманизированное антитело против VEGF-A) в качестве отрицательного контроля.
- Приготовьте буфер для биоанализа ADCC, добавив 1,4 мл сыворотки с низким содержанием IgG в 33,6 мл RPMI-1640 (входит в комплект).
- Используйте буфер ADCC Bioassay для разведения антител. Приготовьте по 400 мкл каждого антитела в трех различных концентрациях: 30 мкг/мл, 3 мкг/мл и 0,3 мкг/мл (3-кратная концентрация), чтобы получить конечную концентрацию 10 г/мл, 1 мкг/мл и 0,1 мкг/мл для широкого спектра охвата и определения оптимальной дозы.
Примечание: Конечные концентрации антител основаны на 25 мкл культивируемых клеток-мишеней, 25 мкл эффекторных клеток и 25 мкл антител в каждой лунке 96-луночного планшета.
4. Подготовка эффекторных клеток
- Перед использованием эффекторные клетки храните при температуре -80 °C.
- Перед использованием нагрейте буфер для биотестирования ADCC на водяной бане при температуре 37 °C не менее чем на 30 минут.
- Разморозьте клетки ADCC Bioassay Effector при температуре -80 °C, поместив их на водяную баню при температуре 37 °C (примерно 2-3 минуты). Аккуратно покачивайте и визуально осматривайте флакон, но не переворачивайте его в процессе размораживания.
- Перенесите 630 мкл эффекторных клеток в пробирку объемом 15 мл, содержащую 3,6 мл буфера для анализа ADCC. Хорошо перемешайте, аккуратно перевернув трубку в 2 раза.
5. Инкубация эффекторных клеток с антителами и клетками-мишенями
- После ночной инкубации удалите среду из клеток-мишеней (15 000 раковых клеток на лунку) и добавьте 25 мкл буфера ADCC Bioassay и 25 мкл цетуксимаба (антагониста EGFR) и бевацизумаба (антагониста VEGF), чтобы получить конечную концентрацию 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл или 10 мкг/мл клеток-мишеней в каждой лунке в соответствии с рисунком 2.
- Добавьте 75 000 эффекторных клеток в 25 мкл буфера для биоанализа ADCC на лунку в 96-луночный микропланшет, содержащий клетки-мишени. Лунки, помеченные как No mAb, действуют как контроль антител (Рисунок 2).
- Добавьте буфер ADCC Bioassay в лунки с маркировкой AB (буфер ADCC Bioassay) для контроля заготовок.
- Выдерживаем тарелку в течение 6 ч.
6. Количественное считывание активности ADCC
- Приготовьте реагент для анализа люциферазы за 4 ч до измерения, добавив буфер для анализа люциферазы в субстрат для анализа люциферазы (лиофилизированный).
- После 6 ч инкубации клеток-мишеней, антител и эффекторных клеток добавьте 75 мкл реагента для анализа люциферазы в каждую лунку и инкубируйте в течение 30 мин.
- После инкубационного периода измерьте сигнал люминесценции в каждой лунке с помощью люминометра, обеспечивающего количественное считывание активности ADCC.
- Для анализа данных рассчитайте индукцию сгибания следующим образом:
Индукция складчатости = RLU (индуцированное антитело - фон) / RLU (контроль антител отсутствует - фон).
где RLU — единицы относительной люминесценции; Антитела индуцируются лунками от B3 до B8 и от C3 до C8; Контроль антител отсутствует = В2 и С2; Фон = Среднее значение RLU от скважины A2 до A5 (Рисунок 2).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Экспрессия EGFR и VEGFR в клетках-мишенях BHT-101 и SW-1736 была обнаружена с помощью вестерн-блоттинга. Экспрессия EGFR была обнаружена в клетках BHT-101 и SW-1736, но не экспрессия VEGFR (рис. 3).
Используя набор для биотестирования ADCC, мы обнаружили реакцию ADCC антитела против EGFR, цетуксимаба, с использованием EGFR-положительных клеточных линий, BHT-101 и SW-1736, в качестве клеток-мишеней. Бевацизумаб, инактиватор VEGF, использовался в качестве антитела о...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы представили метод биотестирования ADCC для оценки реакции ADCC терапевтического антитела. Метод прост и использует простой формат «добавление-микширование-чтение» для измерения.
Перед проведением эксперимента экспрессия целевого антигена в клетках-мишенях должна быть подтверждена либо с помощью проточной цитометрии, либо с помощью вестерн-блоттинга. Проточная цитометрия будет лучшим инструментом для обнаружения поверхностного антигена. Тем не менее, ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Мы благодарны профессору Цзэну (IMCB, A*STAR) за поддержку этой работы. Это исследование было поддержано Молодежным фондом Национального фонда естественных наук Китая (NSFC) (82202231) и Проектом медицинских и медицинских наук и технологий провинции Чжэцзян, Китай (2021KY110,2024KY824).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,5% Трипсин-ЭДТА | Gibco | 15400-054 | Развести в 10 раз в PBS до получения 0,05% Трипсин |
| 1x Трис Буферный Солевой Раствор (TBS) | 1-е ОСНОВАНИЕ | BUF-3030-1X1L | Для промывки мембран в западном блоттинге |
| 1,5 М Трис Буфер, pH 8,8 | 1-е ОСНОВАНИЕ | BUF-1419-1L-pH8,8 | Для приготовления геля SDS |
| 2-Меркаптоэтанол | Sigma Aldrich | M7522-100ML | Для подготовки образцов вестерн-блоттинг |
| 30% Акриламид/Бис раствор | Bio-Rad | #1610158 | Для приготовления геля SDS |
| 4x Laemmli Buffer | Bio-Rad | #1610747 | Для пробоподготовки вестерн-блоттинг |
| 96-луночный белый полистирольный микропланшет с прозрачным плоским дном | Corning Incorporated | 3610 | Для анализа |
| ADCC Биопроба эффекторных клеток ADCC (0,65 мл) | Promega | G7011 | Включает в себя набор для биотестирования ADCC (Promega G7010), 1 флакон по 1 флакону |
| Набор для биоанализа репортера ADCC | Promega | G7010 | Упоминается как набор для биотестирования ADCC для анализа ADCC в этом эксперименте |
| Персульфат аммония | Sigma Aldrich | A3678-25G | Для препарата геля SDS |
| Бевацизумаб (гуманизированное антитело против VEGF) | MVASI-Использование | в качестве отрицательного контрольного антитела в анализе | |
| ADCCBHT-101 | Институт Лейбница DSMZ | ACC279 | Линия клеток анапластического папиллярного рака щитовидной железы человека |
| Bio-Glo Luciferase Assay Buffer | Promega | G7941 | Включает в состав ADCC reporter biotest core kit (Promega G7010), 1 x 10 мл |
| Bio-Glo Luciferase Assay Substrate (Lyophilized) | Promega | G7941 | Включает в ADCC reporter biotest core kit (Promega G7010), 1 x 1 флакон |
| Cell скребок | GenFollower | GD00235 | Для удаления клеток из колбы с культурой |
| Cetuximab (химерное антитело против EGFR) | ERBITUX-Использование | в качестве терапевтического антитела в анализе ADCC | |
| Хемилюминесцентный субстрат HRP | Merck Millipore | WBKLS0500 | Для обнаружения белка в вестерн-блоттинге |
| Дистиллированная вода | Gibco | 15230-162 | Для получения геля SDS |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Gibco | 10270-106 | Пищевая добавка к питательной среде |
| iBright CL1500 Система | визуализацииThermo Scientific | 2462621100038 | Для обнаружения белка в вестерн-блоттинге |
| L-глутамин, 200 мМ | Gibco | 25030-081 | Пищевая добавка к питательной среде |
| Сыворотка с низким уровнем IgG | Promega | G7110 | Включает в себя набор биотестов ADCC reporter (Promega G7010), 1 x 4 мл |
| Megafuge 8R | Thermo Scientific | 42876589 | Centrifuge |
| Mouse анти-EGFR моноклональные антитела | BD Biosciences | 610016 | Первичное антитело в западном блоттинге |
| Мышиные моноклональные антитела против VEGFR | BD Biosciences | 571194 | вестерн-блоттинга |
| Sigma Aldrich | C5789-100ML | Для забора клеток из колбы T75 | |
| Пенициллин-стрептомицин | PAN Biotech | P06-07100 | Антибактериальный для |
| питательные среды Фосфатно-солевой буфер (PBS), pH 7,2, стерильный фильтрованный | 1st BASE | CUS-2048-1x1L | Использование в качестве промывочного раствора для клеток |
| Набор для анализа BCA Pierce | Thermo Scientific | 23225 | Для измерения концентрации |
| белка Ингибитор протеазы и фосфатазы | Thermo Scientific | A32959 | Для расщепления белка в пробоподготовке для вестерн-блоттинга |
| PVDF мембрана (Иммобилин-) | Merck Millipore | IPVH00010 | Для переноса белка в западном блоттинге |
| Кролик против мышей IgG, Fc&гамма; HRP-конъюгированное вторичное антитело | Jackson ImmunoResearch | 315-035-046 | Вторичное антитело в вестерн-блоттинге |
| Мемориальный институт Розуэлл Парк (RPMI) среда | Capricorn Scientific | RPMI-XA | Среда для культивирования клеток |
| RPMI-1640 | Promega | G7080 | Входит в набор биотестов ADCC reporter (Promega G7010), 1 x 36 мл |
| сухого обезжиренного молока | Merck Millipore | 70166-500G | Для блокировки мембран в вестерн-блоттинге |
| Додецилсульфат натрия | 1st BASE | BIO-2050-500g | Для получения геля |
| SDS SW-1736 | Цитион | 300453 | Клеточная линия плоскоклеточного рака щитовидной железы человека |
| T75 Культивальные колбы | SPL Lifesciences | 70075 | Колба для клеточных культур |
| Tecan Multimode Reader модель Spark 10M | Tecan 1607000294 | для Количественное определение люминесценции | |
| TEMED | Bio-Rad | #1610801 | Для получения геля SDS |
| Tween-20 | Promega | H5151 | Для промывки мембран в вестерн-блоттинге |
| Vi-cell XR анализатор жизнеспособности клеток | Beckman Coulter | AL15072 | Счетчик клеток |
Ссылки
- Zahavi, D., AlDeghaither, D., O'Connell, Enhancing antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: a strategy for improving antibody-based immunotherapy. Antib Ther. 1 (1), 7-12 (2018).
- Fenis, A., Demaria, O., Gauthier, L., Vivier, E. New immune cell engagers for cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol. 24 (7), 471-486 (2024).
- Pinto, S., Pahl, J., Schottelius, A., Carter, P. J. Reimagining antibody-dependent cellular cytotoxicity in cancer: the potential of natural killer cell engagers. Trends Immunol. 43 (11), 932-946 (2022).
- Ochoa, M. C., et al. Antibody-dependent cell cytotoxicity: immunotherapy strategies enhancing effector NK cells. Immunol Cell Biol. 95 (4), 347-355 (2017).
- Wang, W., Erbe, A. K., Hank, J. A., Morris, Z. S. NK cell-mediated antibody-dependent cellular cytotoxicity in cancer immunotherapy. Front Immunol. 6, 368(2015).
- Chung, S., et al. Characterization of in vitro antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity activity of therapeutic antibodies - impact of effector cells. J Immunol Methods. 407, 63-75 (2014).
- Shimasaki, N., Jain, A., Campana, D. NK cells for cancer immunotherapy. Nat Rev Drug Discov. 19 (3), 200-218 (2020).
- Cheng, Z. J., et al. Development of a robust reporter-based ADCC assay with frozen, thaw-and-use cells to measure Fc effector function of therapeutic antibodies. J Immunol Methods. 414, 69-81 (2014).
- Parekh, B. S., et al. Development and validation of an antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity-reporter gene assay. MAbs. 4 (3), 310-318 (2012).
- Hogarth, P. M., Pietersz, G. A. Fc receptor-targeted therapies for the treatment of inflammation, cancer and beyond. Nat Rev Drug Discov. 11 (4), 311-331 (2012).
- Chung, S., et al. Quantitative evaluation of fucose reducing effects in a humanized antibody on Fcgamma receptor binding and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity activities. MAbs. 4 (3), 326-340 (2012).
- Promega. ADCC Reporter Bioassay Core Kit Technical Manual. , https://www.promega.sg/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/adcc-reporter-bioassay-core-kit-protocol.pdf?rev=bec36264c0b6470591ded081377d207d&sc_lang=en (2023).
- Miller, A. S., Tejada, M. L., Gazzano-Santoro, H. Methods for measuring antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity in vitro. Methods Mol Biol. 1134, 59-65 (2014).
- Lo Nigro, C., et al. NK-mediated antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity in solid tumors: biological evidence and clinical perspectives. Ann Transl Med. 7 (5), 105(2019).
- Gómez Román, V. R., Murray, J. C., Weiner, L. M. Antibody Fc. Ackerman, M. E., Nimmerjahn, F. , Academic Press. 1-27 (2014).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
