Методическая статья

Оценка антителозависимой, клеточно-опосредованной цитотоксичности в раковых клетках с помощью антителозависимого клеточно-опосредованного репортерного биоанализа

1.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67077

⸱

13 сентября 2024 г.

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), A*STAR 61 Biopolis Drive, 2Department of Radiation Oncology, Affiliated Hangzhou Cancer Hospital, 3Key Laboratory of Head and Neck Cancer Translational Research of Zhejiang Province, Zhejiang Cancer Hospital, 4Department of Thyroid Surgery of Zhejiang Cancer Hospital

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол антителозависимого, клеточно-опосредованного анализа цитотоксичности (ADCC) с использованием набора для биотестирования ADCC. Этот метод является ценным инструментом для выяснения механизма ADCC и оценки терапевтического потенциала антител в иммунотерапии рака.

Аннотация

Метод антителозависимой, клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) представляет собой важный инструмент для оценки эффективности терапевтических антител в иммунотерапии рака. Оценка активности ADCC в раковых клетках имеет важное значение для разработки и оптимизации методов лечения на основе антител. В данной работе мы предлагаем методологический подход к использованию набора для биотестирования ADCC для количественной оценки реакции ADCC с использованием клеток рака щитовидной железы в качестве эффекторных клеток. Протокол предполагает совместное культивирование эффекторных клеток с раковыми клетками-мишенями в различных соотношениях в присутствии терапевтического антитела. Набор для биотестирования ADCC, использованный в этом эксперименте, включает в себя генетически модифицированные эффекторные клетки, экспрессирующие репортерный ген люциферазы под контролем элементов ответа ядерного фактора активированных Т-клеток (NFAT). При связывании поверхностного антигена на клетках-мишенях с антителами и эффекторными клетками эффекторные клетки высвобождают люциферазу, что позволяет количественно оценить цитотоксичность путем измерения сигнала люминесценции. В отличие от обычных анализов ADCC, этот метод доказал связывание целевого антигена с антителами и эффекторными клетками, что может дать достоверные результаты за короткий промежуток времени.

Введение

Антителозависимая, клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC) является важным механизмом, с помощью которого антитела оказывают иммуноопосредованное действие на уничтожение клеток 1,2,3. Иммунные клетки активируются путем связывания с терапевтическим антителом, которое взаимодействует с поверхностными антигенами клеток-мишеней для высвобождения гранзимов, перфорина, что приводит к гибели клеток-мишеней. Эти иммунные клетки включают естественные киллеры (NK) клетки и нейтрофилы 2,3,4,5,6,7. Анализ ADCC стал важным инструментом для оценки эффективности терапевтического антитела 8,9.

В традиционном анализе ADCC мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) или естественные клетки-киллеры используются в качестве эффекторных клеток для мониторинга эффективности терапевтического антитела путем количественного определения уровня смертности клеток-мишеней. В нашем методе используется набор для биотестирования ADCC, который включает в себя генетически модифицированные эффекторные клетки, экспрессирующие репортерный ген люциферазы под контролем элементов ответа ядерного фактора активированных Т-клеток (NFAT). Затем мы количественно оцениваем связывание поверхностного антигена на клетках-мишенях с антителом и эффекторными клетками. Этот метод основан на том, что реакция ADCC протекает за короткий промежуток времени без необходимости использования клеток PBMC человека. Экспериментальные этапы включают совместное культивирование эффекторных клеток с клетками-мишенями в присутствии терапевтических антител.

Во время инкубации терапевтическое антитело связывается с антигеном-мишенью на поверхности клеток-мишеней, что приводит к связыванию эффекторных клеток и Fc-фрагмента антитела. Это активирует чувствительный элемент NFAT и высвобождает сигналы люминесценции для количественной оценки реакции ADCC.

Перед проведением эксперимента экспрессия целевого антигена в клетках-мишенях должна быть подтверждена либо с помощью проточной цитометрии, либо с помощью вестерн-блоттинга. Клетки-мишени культивируют и пропускают в 96-луночные планшеты за 24 ч до начала эксперимента. Различные концентрации терапевтического антитела добавляются вместе с различным количеством эффекторных клеток для достижения рассчитанного соотношения эффекторов и клеток-мишеней.

Ключевые этапы этого метода включают (1) получение клеток-мишеней и эффекторных клеток, (2) соотношение эффекторных клеток-мишеней, (3) получение различных концентраций антитела и (4) различную продолжительность инкубации. После инкубации с помощью люминометра измеряются сигналы люминесценции, обеспечивающие количественное считывание активности ADCC. По сравнению с другими методами измерения ADCC, этот метод относительно прост в эксплуатации, а результаты точны.

Репортерный биоанализ ADCC указывает на связывание целевого антигена, терапевтического антитела и иммунных клеток в активации пути ADCC. Это связывание активирует транскрипцию генов через путь NFAT в эффекторных клетках Jurkat со стабильно экспрессирующим рецептором FcγRIIIa, вариантом V158 (высокоаффинный). Элемент ответа NFAT опосредует экспрессию люциферазы в эффекторных клетках10,11. Биологическая активность антитела в механизме действия (MOA) ADCC количественно оценивается с помощью сигнала люциферазы, производимого путем NFAT. Сигнал люциферазы в эффекторных клетках — клетках Jurket, экспрессирующих рецептор FcγRIIIa, — количественно определяется с помощью люминесцентного считывателя (рис. 1). Отношение сигнал/шум анализа высокое.

Протокол

1. Определение экспрессии EGFR и VEGFR в клетках-мишенях

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте вестерн-блоттинг для обнаружения экспрессии целевого антигена в клетках-мишенях.

  1. Подготовка образцов
    1. Культивировали клетки (клеточные линии рака щитовидной железы человека BHT-101 и SW-1736) в колбах T75 с использованием среды Roswell Park Memorial Institute (RPMI) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% L-глутамина и 1% антибиотиков (пенициллин-стрептомицин).
    2. Собирайте клетки, когда они сливаются на 80%, удаляя питательную среду и промывая клетки PBS. Добавьте 5 мл PBS и удалите клетки с помощью скребка для клеток, чтобы извлечь клетки из колбы для культур. Переложите клетки в коническую трубку объемом 15 мл.
    3. Подсчитайте ячейки с помощью счетчика ячеек.
    4. Аликвота 5 × 106 клеток BHT-101 и SW-1736 в конические пробирки объемом 15 мл.
    5. Раскрутите ячейки при 135 × г в течение 5 минут при комнатной температуре. Удалите надосадочную жидкость PBS.
    6. Лизировать клеточную гранулу путем добавления 100 мкл буфера для лизиса RIPA, содержащего ингибиторы протеазофосфатазы, в течение 5 минут на лед. Перенесите лизат в пробирку объемом 2 мл, центрифугируйте при 15 000 × г в течение 15 мин и переложите надосадочную жидкость в новую пробирку объемом 2 мл.
    7. Измерьте концентрацию белка в клеточном лизате с помощью набора для анализа бицинхониновой кислоты (BCA).
    8. Добавьте 70 г белка из клеточного лизата из каждого образца, добавьте 2x буфер для образцов Laemmli с добавлением 10% 2-меркаптоэтанола и кипятите образцы при 100 °C в течение 5 минут для денатурации образцов.
  2. Гель-электрофорез и мембранный перенос
    1. Приготовьте 8% полиакриламидный гель додецилсульфата натрия (SDS) с использованием дистиллированной воды (4,7 мл), 30% акриламида (2,7 мл), 1,5 М трис-буфера, pH 8,8 (2,5 мл), 10% додецилсульфата натрия (0,1 мл), 10% персульфата аммония (100 мкл) и TEMED (10 мкл).
    2. Пропустите 70 мкг денатурированных образцов в 8% гель SDS-полиакриламида при 80 В в течение 20 мин и при 120 В в течение 100 мин.
    3. Перенесите белок на геле на мембрану из поливинилиденфторида (PVDF) при напряжении 100 В в течение 90 минут.
    4. После переноса заблокируйте мембрану 7% обезжиренным молоком, разведенным в буфере TBS-T (20 мМ Tris pH 7,6, 140 мМ NaCl, 0,2% Tween-20) на 1 ч.
  3. Инкубация антител
    1. Инкубируйте заблокированную мембрану с мышиным антиэпидермальным рецептором фактора роста (EGFR) и моноклональными антителами кролика против рецептора эндотелиального фактора роста (VEGFR) (разведенными в соотношении 1:1000 в 7% обезжиренном молоке) в течение ночи при 4 °C.
    2. После инкубации тщательно промойте мембрану трис-буферным физиологическим раствором (TBS-T) буфером (20 мМ Tris pH 7,6, 140 мМ NaCl, 0,2% Tween-20) в течение 7 минут и повторите 4 раза.
    3. Инкубируйте мембрану с HRP-конъюгированным вторичным антителом (разведенным в соотношении 1:4000 в 7% обезжиренном молоке (TBS-T)) в течение 1 ч.
    4. После инкубации тщательно промойте мембрану буфером TBS-T в течение 7 мин и повторите 4 раза.
  4. Обнаружение белка
    1. Инкубируйте мембрану в хемилюминесцентном субстрате HRP, приготовленном путем смешивания 1 мл раствора перекиси субстрата HRP с 1 мл реагента Luminol для субстрата HRP (оба реагента входят в комплект хемилюминесцентного субстрата) в течение 2 мин.
    2. Визуализируйте мембрану с помощью системы визуализации.

2. Подготовка клеток-мишеней

  1. Культивируйте целевые Т-клетки, клетки BHT-101 и SW-1736 экспоненциально до 80% конфлюентности в средах RPMI с добавлением 10% FBS, 1% L-глутамина и 1% антибиотиков (пенициллин-стрептомицин) в колбах с Т-75.
  2. После удаления носителя промойте клетки один раз с помощью PBS. Инкубируйте клетки с 1 мл неферментативного буфера для диссоциации клеток в течение 5 минут, чтобы вытеснить адгезивные клетки. Добавьте PBS, чтобы остановить реакцию неферментативного буфера для диссоциации клеток. Уменьшите количество клеток при 135 × г в течение 5 минут и добавьте 5 мл PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы используем неферментативный буфер для диссоциации клеток для сохранения целостности поверхностного белка мембраны.
  3. Подсчитайте клетки и засейте их в 15 000 ячеек/лунок в 96-луночные микропланшеты из белого полистирола с прозрачным плоским дном.

3. Получение различных концентраций терапевтического антитела

  1. Чтобы следовать этому протоколу, используйте цетуксимаб (химерное антитело против EGFR) для связывания с EGFR и используйте бевацизумаб (гуманизированное антитело против VEGF-A) в качестве отрицательного контроля.
  2. Приготовьте буфер для биоанализа ADCC, добавив 1,4 мл сыворотки с низким содержанием IgG в 33,6 мл RPMI-1640 (входит в комплект).
  3. Используйте буфер ADCC Bioassay для разведения антител. Приготовьте по 400 мкл каждого антитела в трех различных концентрациях: 30 мкг/мл, 3 мкг/мл и 0,3 мкг/мл (3-кратная концентрация), чтобы получить конечную концентрацию 10 г/мл, 1 мкг/мл и 0,1 мкг/мл для широкого спектра охвата и определения оптимальной дозы.
    Примечание: Конечные концентрации антител основаны на 25 мкл культивируемых клеток-мишеней, 25 мкл эффекторных клеток и 25 мкл антител в каждой лунке 96-луночного планшета.

4. Подготовка эффекторных клеток

  1. Перед использованием эффекторные клетки храните при температуре -80 °C.
  2. Перед использованием нагрейте буфер для биотестирования ADCC на водяной бане при температуре 37 °C не менее чем на 30 минут.
  3. Разморозьте клетки ADCC Bioassay Effector при температуре -80 °C, поместив их на водяную баню при температуре 37 °C (примерно 2-3 минуты). Аккуратно покачивайте и визуально осматривайте флакон, но не переворачивайте его в процессе размораживания.
  4. Перенесите 630 мкл эффекторных клеток в пробирку объемом 15 мл, содержащую 3,6 мл буфера для анализа ADCC. Хорошо перемешайте, аккуратно перевернув трубку в 2 раза.

5. Инкубация эффекторных клеток с антителами и клетками-мишенями

  1. После ночной инкубации удалите среду из клеток-мишеней (15 000 раковых клеток на лунку) и добавьте 25 мкл буфера ADCC Bioassay и 25 мкл цетуксимаба (антагониста EGFR) и бевацизумаба (антагониста VEGF), чтобы получить конечную концентрацию 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл или 10 мкг/мл клеток-мишеней в каждой лунке в соответствии с рисунком 2.
  2. Добавьте 75 000 эффекторных клеток в 25 мкл буфера для биоанализа ADCC на лунку в 96-луночный микропланшет, содержащий клетки-мишени. Лунки, помеченные как No mAb, действуют как контроль антител (Рисунок 2).
  3. Добавьте буфер ADCC Bioassay в лунки с маркировкой AB (буфер ADCC Bioassay) для контроля заготовок.
  4. Выдерживаем тарелку в течение 6 ч.

6. Количественное считывание активности ADCC

  1. Приготовьте реагент для анализа люциферазы за 4 ч до измерения, добавив буфер для анализа люциферазы в субстрат для анализа люциферазы (лиофилизированный).
  2. После 6 ч инкубации клеток-мишеней, антител и эффекторных клеток добавьте 75 мкл реагента для анализа люциферазы в каждую лунку и инкубируйте в течение 30 мин.
  3. После инкубационного периода измерьте сигнал люминесценции в каждой лунке с помощью люминометра, обеспечивающего количественное считывание активности ADCC.
  4. Для анализа данных рассчитайте индукцию сгибания следующим образом:
    Индукция складчатости = RLU (индуцированное антитело - фон) / RLU (контроль антител отсутствует - фон).
    где RLU — единицы относительной люминесценции; Антитела индуцируются лунками от B3 до B8 и от C3 до C8; Контроль антител отсутствует = В2 и С2; Фон = Среднее значение RLU от скважины A2 до A5 (Рисунок 2).

Результаты

Экспрессия EGFR и VEGFR в клетках-мишенях BHT-101 и SW-1736 была обнаружена с помощью вестерн-блоттинга. Экспрессия EGFR была обнаружена в клетках BHT-101 и SW-1736, но не экспрессия VEGFR (рис. 3).

Используя набор для биотестирования ADCC, мы обнаружили реакцию ADCC антитела против EGFR, цетуксимаба, с использованием EGFR-положительных клеточных линий, BHT-101 и SW-1736, в качестве клеток-мишеней. Бевацизумаб, инактиватор VEGF, использовался в качестве антитела отрицательного контроля. Различные концентрации антител и эффекторных клеток инкубировали с клетками-мишенями. Сигнал люминесценции регистрировался с помощью считывателя пластин (рис. 2). Более высокая индукция активности ADCC была обнаружена в группах цетуксимаба (антитело против EGFR), но активность ADCC не наблюдалась в бевацизумабе (антагонисте VEGF) для обеих клеточных линий. Это продемонстрировало эффект ADCC, нацеленный на антигены внеклеточных мембран EGFR для обеих клеточных линий. С помощью этого метода реакцию ADCC валидировали в присутствии цетуксимаба в двух клеточных линиях анапластического рака щитовидной железы (BHT101 и SW1736) (рис. 4).

figure-results-1
Рисунок 1: Принципиальная схема, показывающая реакцию ADCC с помощью набора для биотестирования ADCC. Антигенсвязывающие сайты в терапевтическом антителе связываются с поверхностными антигенами в клетках-мишенях. Это связывание приводит к связыванию Fc-части антитела с рецепторами FcƳRIIIa эффекторных клеток, которые были генетически модифицированы с помощью NFAT-RE luc, производя сигнал люминесценции в эффекторных клетках. Этот рисунок был изменен из руководства по набору ADCC Reporter Bioassay Core с разрешением12. Сокращения: ADCC = антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность; Fc = кристаллизованная область фрагмента; NFAT = ядерный фактор активированных Т-клеток; RE = Элемент ответа; luc = Люцифераза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Иллюстрация 2: Показания люминесценции и экспериментальная диаграмма 96-луночной конструкции планшета системы совместного культивирования ADCC. Сигналы люминесценции считываются люминесцентным считывателем. Ряд А: 1-9 лунки содержат буфер для биотестирования ADCC. Ряд В: 3-8 лунки содержат реакционную систему ADCC BHT101 (клетки-мишени + антитела + эффекторные клетки). 2-я лунка без антител. 9-я лунка содержит только буфер ADCC Bioassay. Ряд C:3-8-я лунки содержат реакционную систему ADCC SW-1736 (клетка-мишень + антитело + эффекторные клетки). 2-я лунка без антител. 9-я лунка содержит только буфер ADCC Bioassay. Ряд D: 1-9 лунки содержат пробирный буфер. Сокращения: ADCC = антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность; AB = буфер для биотестирования ADCC; VEGFR = рецептор фактора роста эпителия сосудов; EGFR = рецептор эпидермального фактора роста; mAb = моноклональное антитело. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Обнаружение экспрессии EGFR и VEGFR при карциноме щитовидной железы BHT-101 и SW-1736 с помощью вестерн-блоттинга. Экспрессия EGFR, но не VEGFR, была обнаружена в обеих клеточных линиях. В качестве контроля загрузки использовался В-актин. Сокращения: EGFR = рецептор эпидермального фактора роста; VEGFR = сосудистый эпидермальный фактор роста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Кратная индукция активности ADCC. (A) Клеточная линия рака щитовидной железы BHT-101 проявляет ADCC-эффект в присутствии антитела против EGFR цетуксимаба. (B) Клеточная линия рака щитовидной железы SW-1736 проявляет ADCC-эффект в присутствии антитела против EGFR цетуксимаба. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Здесь мы представили метод биотестирования ADCC для оценки реакции ADCC терапевтического антитела. Метод прост и использует простой формат «добавление-микширование-чтение» для измерения.

Перед проведением эксперимента экспрессия целевого антигена в клетках-мишенях должна быть подтверждена либо с помощью проточной цитометрии, либо с помощью вестерн-блоттинга. Проточная цитометрия будет лучшим инструментом для обнаружения поверхностного антигена. Тем не менее, использование проточной цитометрии может подвергнуть клетки стрессу, вызывая апоптоз и влияя на жизнеспособность клетки и, следовательно, на общий анализ. Кроме того, он стоит дороже, чем вестерн-блоттинг. В этом эксперименте мы использовали вестерн-блоттинг как более быстрый и экономически эффективный метод, поскольку целевые антигены являются известными антигенами клеточной поверхности.

В качестве эффекторных клеток были использованы сконструированные клетки Jurkat, которые стабильно экспрессировали рецептор FcγRIIIa, вариант V158 (высокоаффинный) и элемент ответа NFAT, который управляет экспрессией люциферазы светлячков. Активация пути NFAT приводит к выработке люциферазы, а ее активность количественно оценивается в виде считывания люминесценции. Сигнал также представляет собой активность ADCC.

Во-первых, клетки-мишени (Т) инкубируют с эффекторными клетками (Е) в присутствии различных количеств антител в 96-луночных планшетах в течение 6 ч при 37 °С в увлажненном инкубаторе сСО2 . Для оптимизации сигнала используется соотношение эффектор:цель 5:1. Например, к 15 000 клеток-мишеней было добавлено 75 000 эффекторных клеток. В конце инкубации в каждую лунку добавляют реагент для анализа люциферазы Bio-Glo, инкубируют в течение 30 мин и измеряют люминесценцию (RLU, относительные единицы люциферазы) с помощью считывателя люминесцентных планшетов.

Ключевыми критическими шагами в этом протоколе являются: (1) Работа с эффекторными клетками. Флакон с клетками не должен быть перевернут во время процесса размораживания, мягко покачиваться и должен использоваться сразу после размораживания для предотвращения нежелательной гибели клеток или влияния на эффективность биологического обнаружения. (2). Для измерения люминесценции важно использовать 96-луночные микропланшеты из белого полистирола с прозрачным плоским дном, поскольку люминесценция захватывается снизу считывателя.

В этом исследовании мы наблюдали более сильные и слабые реакции ADCC антитела против EGFR, цетуксимаба, в зависимости от количества клеток-мишеней и концентрации антител. Некоторые причины для проведения калибровки слабых реакций ADCC: (1) Показания репортерного биоанализа ADCC поступают от эффекторных клеток (Е) с постоянным числом 75 000 клеток на лунку в реакционной системе ADCC данного исследования. Таким образом, оптимизация качества целевых клеток (T) является одним из аспектов, который можно улучшить. Соотношение E:T в этом исследовании составляло 5:1, которое можно было скорректировать до 20:1. (2) Концентрация антител также является одним из важных факторов, влияющих на реакцию ADCC. Корректировки могут быть выполнены путем последовательного разведения антител для исследования оптимального диапазона концентраций, что позволяет достичь максимального ответа в отчете ADCC. (3) Время инкубации антител, клеток-мишеней и эффекторных клеток также имеет решающее значение для экспериментальных результатов. В этом исследовании мы инкубировали в течение 6 часов, которые могут быть продлены до 24 часов для достижения оптимальной реакции ADCC. (4) Кроме того, необходимо изучить концентрацию буферного раствора (низкий уровень IgG) для анализа ADCC. Оптимальная концентрация в сыворотке крови для ответа ADCC может быть достигнута в диапазоне от 1% до 10%.

Этот экспериментальный метод является быстрым и простым, позволяя завершить его в течение одного дня с помощью простого протокола «добавление-микширование-чтение». Результаты стабильны и поддаются периодическому тестированию. Тем не менее, данный набор для биотестирования не обнаруживает гибель клеток, как обычные методы ADCC, в которых PBMC или NK-клетки используются в качестве эффекторных клеток12,13. Вместо этого он использует клетки, экспрессируемые рецептором FcγRIIIa, Jurkat в качестве эффекторных клеток, что будет стоить дороже, поскольку клетки генетически модифицированы. По сравнению с традиционными экспериментами ADCC 13,14, он устраняет необходимость донорства крови от здоровых людей и позволяет избежать сложного процесса извлечения иммунных клеток, тем самым смягчая индивидуальные вариации, которые могут повлиять на результаты. Регистрируемые сигналы люминесценции связаны со связыванием эффекторных клеток с клетками-мишенями, а не с фактической гибелью клеток-мишеней. Поэтому могут быть расхождения по сравнению со стандартными методами обнаружения ADCC. Кроме того, буфер для диссоциации клеток, который дороже трипсина, используется для отделения адгезивных клеток для поддержания целостности мембраны.

Репортерный генный анализ ADCC демонстрирует превосходную точность и стабильность, выступая в качестве метода анализа эффективности для массового обнаружения терапевтических антител. Он также может функционировать в качестве метода критического анализа для определения характеристик терапевтических молекул и разработки процессов15.

Таким образом, ADCC является важным иммунным механизмом, и количественное обнаружение ADCC имеет большое значение в области иммунотерапии. Этот экспериментальный метод предлагает эффективные средства для количественного измерения ADCC15.

Раскрытие информации

Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарны профессору Цзэну (IMCB, A*STAR) за поддержку этой работы. Это исследование было поддержано Молодежным фондом Национального фонда естественных наук Китая (NSFC) (82202231) и Проектом медицинских и медицинских наук и технологий провинции Чжэцзян, Китай (2021KY110,2024KY824).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,5% Трипсин-ЭДТАGibco15400-054Развести в 10 раз в PBS до получения 0,05% Трипсин
1x Трис Буферный Солевой Раствор (TBS)1-е ОСНОВАНИЕBUF-3030-1X1LДля промывки мембран в западном блоттинге
1,5 М Трис Буфер, pH 8,81-е ОСНОВАНИЕBUF-1419-1L-pH8,8Для приготовления геля SDS
2-МеркаптоэтанолSigma AldrichM7522-100MLДля подготовки образцов вестерн-блоттинг
30% Акриламид/Бис растворBio-Rad#1610158Для приготовления геля SDS
4x Laemmli BufferBio-Rad#1610747Для пробоподготовки вестерн-блоттинг
96-луночный белый полистирольный микропланшет с прозрачным плоским дномCorning Incorporated3610Для анализа
ADCC Биопроба эффекторных клеток ADCC (0,65 мл)PromegaG7011Включает в себя набор для биотестирования ADCC (Promega G7010), 1 флакон по 1 флакону
Набор для биоанализа репортера ADCCPromegaG7010Упоминается как набор для биотестирования ADCC для анализа ADCC в этом эксперименте
Персульфат аммонияSigma AldrichA3678-25GДля препарата геля SDS
Бевацизумаб (гуманизированное антитело против VEGF)MVASI-Использованиев качестве отрицательного контрольного антитела в анализе
ADCCBHT-101Институт Лейбница DSMZACC279Линия клеток анапластического папиллярного рака щитовидной железы человека 
Bio-Glo Luciferase Assay BufferPromegaG7941Включает в состав ADCC reporter biotest core kit (Promega G7010), 1 x 10 мл
Bio-Glo Luciferase Assay Substrate (Lyophilized)PromegaG7941Включает в ADCC reporter biotest core kit (Promega G7010), 1 x 1 флакон
Cell скребокGenFollowerGD00235Для удаления клеток из колбы с культурой
Cetuximab (химерное антитело против EGFR)ERBITUX-Использованиев качестве терапевтического антитела в анализе ADCC
Хемилюминесцентный субстрат HRPMerck MilliporeWBKLS0500Для обнаружения белка в вестерн-блоттинге
Дистиллированная водаGibco15230-162Для получения геля SDS
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Gibco10270-106Пищевая добавка к питательной среде
iBright CL1500 СистемавизуализацииThermo Scientific2462621100038Для обнаружения белка в вестерн-блоттинге
L-глутамин, 200 мМGibco25030-081Пищевая добавка к питательной среде
Сыворотка с низким уровнем IgGPromegaG7110Включает в себя набор биотестов ADCC reporter (Promega G7010), 1 x 4 мл
Megafuge 8RThermo Scientific42876589Centrifuge
Mouse анти-EGFR моноклональные антителаBD Biosciences610016Первичное антитело в западном блоттинге
Мышиные моноклональные антитела против VEGFRBD Biosciences571194вестерн-блоттинга
Sigma AldrichC5789-100MLДля забора клеток из колбы T75
Пенициллин-стрептомицинPAN BiotechP06-07100Антибактериальный для
питательные среды Фосфатно-солевой буфер (PBS), pH 7,2, стерильный фильтрованный1st BASECUS-2048-1x1LИспользование в качестве промывочного раствора для клеток
Набор для анализа BCA PierceThermo Scientific23225Для измерения концентрации
белка Ингибитор протеазы и фосфатазыThermo ScientificA32959Для расщепления белка в пробоподготовке для вестерн-блоттинга
PVDF мембрана (Иммобилин-)Merck MilliporeIPVH00010Для переноса белка в западном блоттинге
Кролик против мышей IgG, Fc&гамма; HRP-конъюгированное вторичное антителоJackson ImmunoResearch315-035-046Вторичное антитело в вестерн-блоттинге
Мемориальный институт Розуэлл Парк (RPMI) средаCapricorn ScientificRPMI-XAСреда для культивирования клеток
RPMI-1640PromegaG7080Входит в набор биотестов ADCC reporter (Promega G7010), 1 x 36 мл
сухого обезжиренного молокаMerck Millipore70166-500GДля блокировки мембран в вестерн-блоттинге
Додецилсульфат натрия1st BASEBIO-2050-500gДля получения геля
SDS SW-1736Цитион300453Клеточная линия плоскоклеточного рака щитовидной железы человека
T75 Культивальные колбыSPL Lifesciences70075Колба для клеточных культур
Tecan Multimode Reader модель Spark 10MTecan 1607000294для Количественное определение люминесценции
TEMEDBio-Rad#1610801Для получения геля SDS
Tween-20PromegaH5151Для промывки мембран в вестерн-блоттинге
Vi-cell XR анализатор жизнеспособности клетокBeckman CoulterAL15072Счетчик клеток
Первичное антитело в неферментативном буфере диссоциации клеток

Ссылки

  1. Zahavi, D., AlDeghaither, D., O'Connell, Enhancing antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: a strategy for improving antibody-based immunotherapy. Antib Ther. 1 (1), 7-12 (2018).
  2. Fenis, A., Demaria, O., Gauthier, L., Vivier, E. New immune cell engagers for cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol. 24 (7), 471-486 (2024).
  3. Pinto, S., Pahl, J., Schottelius, A., Carter, P. J. Reimagining antibody-dependent cellular cytotoxicity in cancer: the potential of natural killer cell engagers. Trends Immunol. 43 (11), 932-946 (2022).
  4. Ochoa, M. C., et al. Antibody-dependent cell cytotoxicity: immunotherapy strategies enhancing effector NK cells. Immunol Cell Biol. 95 (4), 347-355 (2017).
  5. Wang, W., Erbe, A. K., Hank, J. A., Morris, Z. S. NK cell-mediated antibody-dependent cellular cytotoxicity in cancer immunotherapy. Front Immunol. 6, 368(2015).
  6. Chung, S., et al. Characterization of in vitro antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity activity of therapeutic antibodies - impact of effector cells. J Immunol Methods. 407, 63-75 (2014).
  7. Shimasaki, N., Jain, A., Campana, D. NK cells for cancer immunotherapy. Nat Rev Drug Discov. 19 (3), 200-218 (2020).
  8. Cheng, Z. J., et al. Development of a robust reporter-based ADCC assay with frozen, thaw-and-use cells to measure Fc effector function of therapeutic antibodies. J Immunol Methods. 414, 69-81 (2014).
  9. Parekh, B. S., et al. Development and validation of an antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity-reporter gene assay. MAbs. 4 (3), 310-318 (2012).
  10. Hogarth, P. M., Pietersz, G. A. Fc receptor-targeted therapies for the treatment of inflammation, cancer and beyond. Nat Rev Drug Discov. 11 (4), 311-331 (2012).
  11. Chung, S., et al. Quantitative evaluation of fucose reducing effects in a humanized antibody on Fcgamma receptor binding and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity activities. MAbs. 4 (3), 326-340 (2012).
  12. Promega. ADCC Reporter Bioassay Core Kit Technical Manual. , https://www.promega.sg/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/adcc-reporter-bioassay-core-kit-protocol.pdf?rev=bec36264c0b6470591ded081377d207d&sc_lang=en (2023).
  13. Miller, A. S., Tejada, M. L., Gazzano-Santoro, H. Methods for measuring antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity in vitro. Methods Mol Biol. 1134, 59-65 (2014).
  14. Lo Nigro, C., et al. NK-mediated antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity in solid tumors: biological evidence and clinical perspectives. Ann Transl Med. 7 (5), 105(2019).
  15. Gómez Román, V. R., Murray, J. C., Weiner, L. M. Antibody Fc. Ackerman, M. E., Nimmerjahn, F. , Academic Press. 1-27 (2014).

Перепечатки и разрешения

Теги

антителозависимая клеточная цитотоксичностьбиоанализ ADCCиммунотерапия ракатерапевтические антителаэффекторные клеткитаргетные раковые клеткилюциферазный репортерный анализантиген EGFRизмерение люминесценциикокультивирование клеток
Оценка антителозависимой, клеточно-опосредованной цитотоксичности в раковых клетках с помощью антителозависимого клеточно-опосредованного репортерного биоанализа
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.