Method Article

Выделение, характеристика и протеомный анализ внеклеточных везикул плазмы крови для обнаружения сердечно-сосудистых биомаркеров

DOI:

10.3791/67083

⸱

January 31st, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Angiology and Pulmonology, University Hospital Heidelberg, 2Heart and Vascular Center, Semmelweis University, 3Core Facility for Mass Spectrometry and Proteomics, Centre for Molecular Biology at Heidelberg University (ZMBH), 4German Centre for Cardiovascular Research (DZHK), Partner site Heidelberg/Mannheim

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье описывается методология выделения, характеризации и количественного определения внеклеточных везикул (ВВ), полученных из плазмы крови человека, а также представлен рабочий процесс безметочного анализа протеома ВВ с использованием жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой невоспроизводимые наночастицы клеточного происхождения, окруженные липидным бислоем. В настоящее время ВВ привлекают внимание в исследованиях сердечно-сосудистых заболеваний из-за их роли в регулировании межклеточной коммуникации, потенциально служа ценными биомаркерами сердечно-сосудистых заболеваний. Тем не менее, протеом EV и его потенциал в качестве биомаркера в сердечно-сосудистой диагностике остаются малоизученными. Этот протокол представляет собой стандартизированный метод выделения и количественной оценки ВВ, полученных из плазмы, и анализа их белкового груза с использованием образцов плазмы пациентов, поступивших в отделение боли в грудной клетке крупной университетской больницы. После рутинной флеботомии EV выделяют из плазмы путем дифференциального ультрацентрифугирования. Обогащение специфических маркерных белков EV в изолятах EV визуализируется с помощью иммуноблоттинга, а среднее распределение по размерам и концентрации EV в плазме крови количественно оцениваются с помощью анализа с отслеживанием наночастиц. Наконец, сверхэффективная жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия используется для безметочного анализа протеома EV. Таким образом, данный протокол обеспечивает комплексный подход к изучению и использованию ВВ, полученных из плазмы, в качестве потенциальных носителей критически важной биологической информации, а также к изучению их потенциала в качестве новых биомаркеров.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внеклеточные везикулы (ВВ), по номенклатуре не имеющие равномерного определения, представляют собой наночастицы, окруженные липидным бислоем и высвобождаемые различными типами клеток, не способные к репликации1. Эта разнообразная группа включает экзосомы, субпопуляцию EV эндосомального происхождения, обычно варьирующуюся от примерно 40 нм до 160 нм вдиаметре2. Обнаруживаемые во многих жидкостях организма3, ВВ облегчают межклеточную коммуникацию, перенося различные активные биомолекулы, такие как белки, мРНК, микроРНК и липиды. Таким образом, EV предоставляют информацию о своей клетке происхождения через специфичные для клетки поверхностные маркеры и биомолекулы, причем их свойства сильно зависят от состояния родительской клетки иокружающей среды. Эти характеристики привели к растущему интересу к потенциальной роли ВВ в качестве биомаркеров, особенно в контексте сердечно-сосудистых заболеваний.

Многочисленные исследования in vitro и in vivo показали, что гипоксический стресс миокарда приводит к повышенному выбросу EV 5,6,7. Современные исследования грузов EV в основном сосредоточены на связанной с EV микроРНК, которая может служить биомаркером в диагностике различных сердечно-сосудистыхзаболеваний. В отличие от этого, данные о циркулирующем протеоме EV остаются относительно скудными, и еще меньше исследований, изучающих EV в плазме крови у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями. В двух комплексных исследованиях ВВ плазмы крови у пациентов с инфарктом миокарда авторы определили специфический профиль протеома, индуцированный ишемией, с потенциальной диагностической значимостью 6,11.

Методологическая обработка EV исторически оказалась сложной задачей, и в настоящее время нет однозначных рекомендаций по оптимальному подходу к выделению, характеризации и количественной оценке EV. Обычно используемые методы выделения EV включают дифференциальное ультрацентрифугирование, центрифугирование с градиентом плотности и методы фильтрации, такие как эксклюзионная хроматография1. В соответствии с текущими согласованными рекомендациями, характеристика изолятов EV должна включать доказательства наличия как минимум трех типичных маркеров поверхностных белков EV, таких как тетраспанины или аннексины, в сочетании с методом визуализации. Для исследования груза ВВ на белковом уровне чаще всего используются методы на основе антител, такие как вестерн-блот или ИФА.

Учитывая методологические проблемы, связанные с выделением и обработкой циркулирующих ВВ, этот протокол представляет собой комплексный путь от набора пациентов и сбора образцов до последующей изоляции ВВ, характеризации и количественного определения изолятов ВВ в плазме. Кроме того, в этом исследовании демонстрируется рабочий процесс немедленной изоляции ВВ, полученного из плазмы, у пациентов, поступающих в отделение неотложной помощи (отделение боли в грудной клетке) в центре третичной медицинской помощи на юго-западе Германии, с последующим безмаркерным анализом протеома ВВ плазмы, специфичного для конкретного заболевания, с использованием жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС). Цель состоит в том, чтобы облегчить высокопроизводительный анализ для идентификации дифференциально обогащенных EV-связанных белков в большой когорте пациентов с различными ишемическими, врожденными или (ауто)иммунными сердечно-сосудистыми заболеваниями при первоначальном диагнозе и на протяжении прогрессирования и/или разрешения заболевания. Этот подход к протеомному скринингу направлен на выявление закономерностей обогащения ВВ-специфичных белков, связанных с различными путями заболевания, с конечной целью выявления новых биомаркеров ВВ-связанного белка для улучшения текущей диагностики и терапевтического мониторинга сердечно-сосудистых заболеваний.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для этого протокола была набрана образцовая когорта пациентов, состоящая из трех здоровых пациентов контрольной группы без признаков явных или сопутствующих сердечно-сосудистых заболеваний и двух пациентов с инфарктом миокарда с повышенным уровнем сегмента ST (NSTEMI). Предварительное одобрение было предоставлено Институциональным наблюдательным советом медицинского факультета Гейдельбергского университета (одобрение IRB #S-351/2015), и до набора было получено письменное согласие от всех пациентов. Пациенты были отобраны из отделения боли в грудной клетке отделения кардиологии университетской клиники Гейдельберга на основе первичной клинической картины, истории болезни и результатов диагностических исследований.

Критерии включения здоровых пациентов контрольной группы включали атипичную или неспецифическую клиническую картину, уровни сердечных биомаркеров в пределах нормы, отсутствие сердечно-сосудистых заболеваний в анамнезе и нормальные результаты любых дальнейших диагностических тестов. Критерии исключения включали в себя лечение злокачественных новообразований или цитостатическую терапию в течение последних пяти лет, гемодиализ, синдромы семейной гиперлипидемии и наличие в анамнезе сердечно-сосудистых заболеваний. Диагноз NSTEMI был поставлен в соответствии с текущими рекомендациями12, при этом гемодинамически значимый стеноз коронарных артерий был подтвержден коронарографией. Для каждого пациента с помощью стандартной флеботомии13 собирали до 36 мл крови из предкубитальной вены в пробирки для сбора, дополненные цитратами, и образцы крови немедленно транспортировали при температуре 4 °C для дальнейшей обработки. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в данном исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Изоляция EV с помощью дифференциального центрифугирования

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол дифференциального центрифугирования был использован для выделения EV из образцов плазмы человека. Были проведены два цикла ультрацентрифугирования (UC) с возрастающей центробежной силой для достижения максимальной чистоты полученной EV-гранулы.

  1. Изоляция плазмы
    1. Начните обработку образцов цельной крови, охлажденных до 4 °C, в течение 120 минут после сбора, чтобы обеспечить целостность EV в плазме. Используйте пробирки для сбора крови с добавлением цитрата (0,106 моль/л цитрата) для предотвращения свертывания.
    2. Разведите 9 мл цитратированной цельной крови в соотношении 1:1 в ледяном фосфатно-солевом буфере (PBS) для снижения вязкости. Добавьте 5 мл градиентной среды плотности (1,077 г/мл) для разделения во время центрифугирования.
    3. Центрифуга при 600 × г в течение 25-30 мин при 4 °C. Осторожно отпидайте фракцию плазмы с верхней части каждой колонки в специализированные центрифужные пробирки. Переходите к следующим шагам или заморозьте при -80 °C.
  2. Удаление клеточного мусора и апоптотических тел
    1. Центрифугируйте плазму при давлении 20 000 × g в течение 15 мин при 4 °C с помощью ультрацентрифуги с ротором с фиксированным углом наклона, не торможа. На дне пробирки должна образоваться видимая гранула клеточного мусора и апоптотических тел.
  3. Изоляция электромобиля
    1. Переложите надосадочную жидкость в новую трубку. Ультрацентрифугу при 100 000 × г в течение 2 ч при 4 °C, без торможения, чтобы изолировать EV, который образует видимую гранулу на стенке пробирки.
    2. Осторожно отпидайте надосадочную жидкость с помощью электронной пипетки, оставив около 1 мл обедненной EV плазмы. Переключитесь на пипетку объемом 1000 мкл для оставшейся плазмы, медленно пипетируя, чтобы не повредить гранулу EV. Постепенно наклоняйте пробирку во время пипетирования, чтобы в пробирке не осталось плазмы.
  4. Подготовка к последующему анализу
    1. Ресуспендируйте выделенную EV-гранулу в соответствии с требованиями последующего анализа: для отслеживания наночастиц ресуспендируйте EV-гранулу из 9 мл цельной крови в 200 μл PBS; ЖХ-МС/МС ресуспендировать EV, выделенную из 36 мл цельной крови в 50 мкл 1x буфера RIPA с 1% ингибитором протеазы/фосфатазы
    2. Переложите ресуспендированную гранулу EV в пробирку объемом 1,5-2 мл. Хранить при температуре -80 °C до дальнейшего анализа или действовать по мере необходимости.

2. Анализ слежения за наночастицами

ПРИМЕЧАНИЕ: Количественная оценка среднего распределения EV по размерам в образцах плазмы человека проводилась с использованием анализа отслеживания наночастиц (NTA), лазерного метода обнаружения, который анализирует броуновское движение наночастиц.

  1. Рабочие разведения для НТА
    1. Разбавьте исходный раствор EV (гранулы EV, ресуспендированные в 200 мкл PBS) ледяным PBS в соотношении 1:10, 1:50, 1:100 и 1:200. Создание различных рабочих разведений для определения наиболее подходящего разведения для достижения конечного количества 10-100 наночастиц на кадр во время отслеживания наночастиц.
  2. Запуск NTA
    1. Включите прибор NTA и запустите соответствующее программное обеспечение на подключенном компьютере. Поместите камеру внутрь лазерного гроба и нажмите « Запустить камеру », чтобы активировать ее.
    2. Наберите в шприц 1 мл PBS. Вставьте шприц в переднюю трубку и тщательно промойте систему трубок, убедившись, что в камере не остается воздуха. Следите за камерой, чтобы обнаружить любые пузырьки воздуха или загрязняющие частицы.
    3. Наберите подготовленный рабочий раствор EV в шприц объемом 1 мл и введите его в камеру.
    4. Отрегулируйте усиление экрана в соответствии с яркостью монитора на вкладках «Захват» и «Обработка». Измените уровень камеры, чтобы четко различать наночастицы на экране.
    5. Установите подходящий порог обнаружения на вкладке «Процесс », чтобы настроить чувствительность для дифференциации частиц от фонового шума. Сохраняйте это значение постоянным для всех измерений в рамках одного эксперимента.
    6. Сфокусируйте камеру с помощью колесика с каждой стороны прибора до тех пор, пока наночастицы не станут четкими на экране.
    7. Установите постоянную температуру (в идеале 22 °C) для всех измерений в настройках оборудования , так как броуновское движение зависит от температуры.
    8. Нажмите на кнопку «Запустить », чтобы начать измерение. Введите идентификатор образца и растворитель во всплывающем окне.
    9. Записывайте не менее трех видеороликов продолжительностью 30 секунд для каждого образца прогона. Перемещайте образец между измерениями, чтобы получить репрезентативный образец раствора наночастиц. Если имеется шприцевой насос, установите его на постоянную скорость и непрерывно записывайте.
    10. После записи программное обеспечение автоматически рассчитывает концентрацию и распределение наночастиц по размерам. Нажмите « Изменить », чтобы ввести коэффициент разбавления, используемый для образца, а затем сохраните результаты, нажав « Экспорт».
  3. Анализ данных
    1. Анализируйте результаты с помощью выходных файлов в статистической программе.

Безметочный анализ протеома EV с помощью жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС)

ЗАМЕТКА: Анализ безметочного протеома EV проводили с использованием начального разделения белков с помощью гель-электрофореза белков EV после лизиса мембраны. После расщепления белка в геле с помощью трипсина пептиды анализировали с помощью ЖХ-МС/МС, при этом отдельные спектры сопоставлялись с базой данных протеома человека. В частности, если требуется нецелевой анализ лизатов ЭВ, рекомендуется использовать протеомику дробовика без предварительного выбора конкретного диапазона молекулярных масс, что делает ненужными шаги 3.1.1-3.1.7 данного протокола.

  1. Расщепление трипсина в геле
    1. Приготовьте раствор EV, ресуспендированного в буфере 1x RIPA, добавив загрузочный буфер Laemmli в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). Варить образцы при температуре 95 °C в течение 5 минут.
    2. Загрузите образцы EV, дополненные загрузочным буфером, вместе с белковой лестницей в 4%-12% гели Bis-Tris для электрофореза в геле додецилсульфата натрия и полиакриламида (SDS-PAGE)14. Окрашивайте гель Coomassie Blue в течение 1-4 часов, чтобы визуализировать белковые полосы. Удалите пятно с геля водой, инкубировав в течение ночи.
    3. Вырежьте окрашенные Кумасси полосы из гелевых областей, содержащих представляющие интерес белки, с помощью лезвия скальпеля.
    4. Промойте кусочки геля 60 мкл 1:1 (v/v) 50 мМ буфера бикарбоната триэтиламмония (TEAB) и ацетонитрила (ACN) pH 8,5 в течение 10 минут. Сожмите кусочки геля три раза в течение 10 минут каждый в 60 μл ACN. Снова промойте 60 μL 50 mM TEAB, pH 8,5.
    5. Уменьшите содержание белков с помощью 10 мМ дитиотреитола (DTT) в 100 мМ TEAB при температуре 57 °C в течение 30 минут и обезвожьте кусочки геля.
    6. Алкилировать белки 10 мМ йодоацетамидом (IAA) в 100 мМ TEAB при 25 °C в течение 20 мин в темноте.
    7. Промойте кусочки геля 60 мкл 100 мМ TEAB и дважды усадите их в течение 10 мин каждый в 60 мкл ACN.
    8. Добавьте 50 мМ раствора трипсина TEAB, концентрированного соответственно, в сухие кусочки геля. Выдерживать в течение 4 ч при 37 °C. Угасите реакцию, добавив 20 мкл 0,1% трифторуксусной кислоты (ТЖК).
    9. Полученные пептиды экстрагируют путем инкубации с 30 мкл 1:1 (v/v) 0,1% TFA и ACN в течение 30 мин. Обезвожьте гели с 20 μL ACN в течение 20 минут, затем снова промойте 30 μL 100 mM TEAB в течение 20 минут.
    10. Дважды сожмите гель с 20 μL ACN в течение 20 минут каждый.
    11. Концентрируйте надосадочную жидкость, собранную на каждой стадии экстракции, в вакуумной центрифуге и растворите образец в 15 мкл 0,1% TFA.
  2. Анализ ЖХ-МС/МС
    1. Выполняйте анализ нанопотока ЖХ-МС/МС с помощью масс-спектрометра с жидкостной хроматографией высокого разрешения, подключенного к электростатическому анализатору ионных ловушек.
    2. Используйте 0,1% муравьиной кислоты (ФК)/1% АКН в качестве растворителя А и 0,1% ФК/89,9% АКН в качестве растворителя В.
    3. Разделите пептиды в 25-минутном линейном градиенте: начните с 3% растворителя В, увеличьте В до 23% в течение 21 минуты, затем до 38% в течение 4 минут и продолжайте вымывать при 95% В.
    4. Работайте с масс-спектрометром в режиме сбора данных, автоматически переключаясь между MS и MS2. Получение спектров MS (m/z 400-1600) с разрешением 60 000 на m/z 400, генерирование спектров MS2 для 15 предшественников с использованием нормированной энергии столкновения 27 и ширины изоляции 1,4 м/z.
  3. Поиск по базе данных белков
    1. Поиск спектров МС/МС по базе данных белков Swiss-Prot Homo sapiens (UP000005640, июнь 2020 г.) и специализированной базе данных загрязняющих веществ (входит в состав MaxQuant, MPI Martinsried15,16) с помощью Proteome Discoverer 2.5 с Sequest HT.
    2. Настройте параметры программы следующим образом: установите допуск по массе фрагмент-ионов равным 0,02 Да и допуск по массе родительских ионов равным 5 ppm. Укажите трипсин в качестве фермента, используемого для пищеварения, и установите карбамидометил в качестве фиксированной модификации цистеина, с окислением (метионин) и дезаминированием (аспарагин, глутамин) в качестве вариабельных модификаций. Включают ацетилирование, потерю метионина и их комбинацию в качестве вариабельных модификаций конца белка.
    3. Количественное определение пептидов с использованием режима квантификатора ионов-предшественников с использованием метода Top N Average (n = 3) для расчета численности белка17.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ЭВ выделяли из образцов плазмы (n = 3) пациентов без выраженных сердечно-сосудистых заболеваний, а также пациентов с инфарктом миокарда без подъема сегмента ST (NSTEMI; n = 2) с использованием установленного протокола дифференциального ультрацентрифугирования. Адекватное разделение EV в плазме крови было подтверждено иммуноблоттингом обогащенных EV белков TSG-101, аннексина 5 (Anx5) и CD9 в изолятах EV по сравнению с обедненной EV плазмой от тех же пациентов (рис. 1A). Трансферрин, служащий ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол представляет собой реальную, пошаговую, готовую к использованию методологию для разделения и определения характеристик ВВ в плазме, а также введение в анализ немеченного протеома, пригодный для интеграции в рутинную клиническую практику. Подробное описание и строгое следование единой методике выделения ВВ из образцов плазмы важны для обеспечения воспроизводимости полученных результатов. В современной литературе указывается, что преаналитические условия могут существенно пов...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EG получала гонорары лекторам от Roche Diagnostics, BRAHMS Thermo Scientific, Bayer Vital GmbH, AstraZeneca, Lilly Deutschland, Boehringer Ingelheim; он получил институциональные исследовательские гранты от Roche Diagnostics и Daiichi Sankyo, а также выступает в качестве консультанта для Roche Diagnostics, BRAHMS Thermo Scientific, Astra Zeneca, Novartis и Boehringer Ingelheim, вне представленной работы. Проект JBK получил от Немецкого центра сердечно-сосудистых исследований (DZHK) и компании Roche Diagnostics. Остальные авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, связанного с представленной работой.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят Хайди Дайгенташ, Амели Вернер и Элизабет Мерц за организационную поддержку во время этого проекта.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4x Laemmli buffferBio-rad1610747
10x RIPA-BufferAbcamab156034
26,3 мл Поликарбонатный флакон с крышкой в сборе для ультрацентрифугированияBeckman Coulter355654
5810R Настольная центрифугаEppendorf5811000015
Ацетонитрил (ACN)Biosolve0001204101BS
Дитиотреитол (DTT)Sigma-Aldrich43816-10ML
Фосфат Дульбекко буферизованный физиологический раствор (PBS)Sigma-AldrichD8537
Муравьиная кислота 99% ULC/MS 100Biosolve0006914143BS
Histopaque - 1077Sigma-Aldrich10771
Йодоацетамид (IAA)Sigma-AldrichI6125-5G
Масс-спектрометр Orbitrap Q Exactive HF ThermoFisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
MOPS SDS беговой буферThermo FisherB0001
NanoSight NS300Malvern Panalytical NS300
Nanosight NTA 3.2 Программное обеспечениеMalvern Panalytical 
NuPAGE 4  bis 12 %, Бис-Трис протеиновые гелиInvitrogenNP0323
Optima XPN-80 напольная ультрацентрифугаBeckman Coulter521-4180
PageRuler Plus предварительно окрашенный протеинлестница Thermo Fisher Scientific26619
коктейль ингибиторов протеазы/фосфатазы (100X)Технология клеточной сигнализации5872S
Белковый маркерThermo Fisher26616
Proteome Discoverer 2.5Thermo Fisher
Q Exactive Plus Гибридный квадруполь-орбитрап Масс-спектрометрThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
Быстрое окрашивание кумассисиServa35081.01
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 &; m 1 гDr. Maischr119.aq.0001
SDS-PAGE коммерческий гельThermo FisherNW00100BOX
S-Monovette  Citrat 9NC 0,106 моль/л 3,2%Sarstedt02.1067.001
Speed vac концентраторSavant
Swiss-Prot (Uniprot) Homo sapiens (UP000005640, июнь 2020) база данных белковUniProthttps://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640
буфер бикарбоната триэтиламмония (TEAB)Sigma-AldrichT7408
Трифторуксусная кислота (ТФК) для ВЭЖХ >99%, 100 млSigma-Aldrich302031-100ML
Trypsin MS-GradeThermo Fisher90058
Type 50.2 Ti Ротор с фиксированным угломBeckman Coulter337901
UHPLC Dionex Ultimate 3000Thermo Fisher ScientificULTIM3000RSLCNANO
WaterBiosolve0023214102BS
наклона

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the international society for extracellular vesicles and update of the misev2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  2. Kalluri, R., Lebleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367, 6478(2020).
  3. Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. Circulating extracellular vesicles in human disease. N Engl J Med. 379 (22), 2180-2181 (2018).
  4. Zara, M., Amadio, P., Campodonico, J., Sandrini, L., Barbieri, S. S. Exosomes in cardiovascular diseases. Diagnostics (Basel). 10 (11), 943(2020).
  5. Ontoria-Oviedo, I., et al. Extracellular vesicles secreted by hypoxic ac10 cardiomyocytes modulate fibroblast cell motility. Front Cardiovasc Med. 5, 152(2018).
  6. Zara, M., et al. Plasma exosome profile in st-elevation myocardial infarction patients with and without out-of-hospital cardiac arrest. Int J Mol Sci. 22 (15), (2021).
  7. Anselmo, A., et al. Myocardial hypoxic stress mediates functional cardiac extracellular vesicle release. Eur Heart J. 42 (28), 2780-2792 (2021).
  8. Navickas, R., et al. Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease: A systematic review. Cardiovasc Res. 111 (4), 322-337 (2016).
  9. Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: Novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease. Circ Res. 110 (3), 483-495 (2012).
  10. Deddens, J. C., et al. Circulating microRNAs as novel biomarkers for the early diagnosis of acute coronary syndrome. J Cardiovasc Transl Res. 6 (6), 884-898 (2013).
  11. Gidlof, O., et al. Proteomic profiling of extracellular vesicles reveals additional diagnostic biomarkers for myocardial infarction compared to plasma alone. Sci Rep. 9 (1), 8991(2019).
  12. Byrne, R. A., et al. ESC guidelines for the management of acute coronary syndromes. Eur Heart J Acute Cardiovasc Care. 10, (2023).
  13. Garcia-Castrillo, L., et al. Recommendations for blood sampling in emergency departments from the European Society for Emergency Medicine (EUSEM), European Society for Emergency Nursing (EUSEN), and European Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (EFLM) working group for the pre-analytical phase. Clin Chem Lab Med. 62 (8), 1538-1547 (2024).
  14. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  15. Cox, J., et al. Andromeda: A peptide search engine integrated into the maxquant environment. J Proteome Res. 10 (4), 1794-1805 (2011).
  16. Cox, J., Mann, M. Maxquant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  17. Blein-Nicolas, M., Zivy, M. Thousand and one ways to quantify and compare protein abundances in label-free bottom-up proteomics. Biochim Biophys Acta. 1864 (8), 883-895 (2016).
  18. Lacroix, R., et al. Standardization of pre-analytical variables in plasma microparticle determination: Results of the international society on thrombosis and haemostasis SSC collaborative workshop. J Thromb Haemost. 11 (6), 1190-1193 (2013).
  19. Nieuwland, R., Siljander, P. R. A beginner's guide to study extracellular vesicles in human blood plasma and serum. J Extracell Vesicles. 13 (1), e12400(2024).
  20. Lacroix, R., et al. Impact of pre-analytical parameters on the measurement of circulating microparticles: Towards standardization of protocol. J Thromb Haemost. 10 (3), 437-446 (2012).
  21. Coumans, F. aW., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circ Res. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  22. Clayton, A., et al. Considerations towards a roadmap for collection, handling and storage of blood extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 8 (1), 1647027(2019).
  23. Lucien, F., et al. Miblood-EV: Minimal information to enhance the quality and reproducibility of blood extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 12 (12), e12385(2023).
  24. Zhang, X., Takeuchi, T., Takeda, A., Mochizuki, H., Nagai, Y. Comparison of serum and plasma as a source of blood extracellular vesicles: Increased levels of platelet-derived particles in serum extracellular vesicle fractions alter content profiles from plasma extracellular vesicle fractions. PLoS One. 17 (6), e0270634(2022).
  25. Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. J Extracell Vesicles. 11 (2), e12162(2022).
  26. Sluijter, J. P. G., et al. Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position paper from the working group on cellular biology of the heart of the European Society of Cardiology. Cardiovasc Res. 114 (1), 19-34 (2018).
  27. Davidson, S. M., et al. Methods for the identification and characterization of extracellular vesicles in cardiovascular studies: From exosomes to microvesicles. Cardiovasc Res. 119 (1), 45-63 (2023).
  28. Karimi, N., et al. Detailed analysis of the plasma extracellular vesicle proteome after separation from lipoproteins. Cell Mol Life Sci. 75 (15), 2873-2886 (2018).
  29. Brennan, K., et al. A comparison of methods for the isolation and separation of extracellular vesicles from protein and lipid particles in human serum. Sci Rep. 10 (1), 1039(2020).
  30. Palviainen, M., et al. Extracellular vesicles from human plasma and serum are carriers of extravesicular cargo-implications for biomarker discovery. PLoS One. 15 (8), e0236439(2020).
  31. Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: A position statement from the international society for extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913(2014).
  32. Gemoll, T., et al. Protein profiling of serum extracellular vesicles reveals qualitative and quantitative differences after differential ultracentrifugation and ExoQuick TM isolation. J Clin Med. 9 (5), 1429(2020).
  33. Kreimer, S., et al. Mass-spectrometry-based molecular characterization of extracellular vesicles: Lipidomics and proteomics. J Proteome Res. 14 (6), 2367-2384 (2015).
  34. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  35. Bateman, N. W., et al. Maximizing peptide identification events in proteomic workflows using data-dependent acquisition (dda). Mol Cell Proteomics. 13 (1), 329-338 (2014).
  36. Pino, L. K., Just, S. C., Maccoss, M. J., Searle, B. C. Acquiring and analyzing data independent acquisition proteomics experiments without spectrum libraries. Mol Cell Proteomics. 19 (7), 1088-1103 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Plasma Extracellular VesiclesCardiovascular BiomarkersEV IsolationProteomic AnalysisNanoparticle TrackingDifferential UltracentrifugationImmunoblottingProtein BiomarkersClinical ProteomicsPlasma Biomarker Discovery

Related Articles