Method Article

Выделение, характеристика и протеомный анализ внеклеточных везикул плазмы крови для обнаружения сердечно-сосудистых биомаркеров

DOI:

10.3791/67083

⸱

January 31st, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Angiology and Pulmonology, University Hospital Heidelberg, 2Heart and Vascular Center, Semmelweis University, 3Core Facility for Mass Spectrometry and Proteomics, Centre for Molecular Biology at Heidelberg University (ZMBH), 4German Centre for Cardiovascular Research (DZHK), Partner site Heidelberg/Mannheim

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье описывается методология выделения, характеризации и количественного определения внеклеточных везикул (ВВ), полученных из плазмы крови человека, а также представлен рабочий процесс безметочного анализа протеома ВВ с использованием жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой невоспроизводимые наночастицы клеточного происхождения, окруженные липидным бислоем. В настоящее время ВВ привлекают внимание в исследованиях сердечно-сосудистых заболеваний из-за их роли в регулировании межклеточной коммуникации, потенциально служа ценными биомаркерами сердечно-сосудистых заболеваний. Тем не менее, протеом EV и его потенциал в качестве биомаркера в сердечно-сосудистой диагностике остаются малоизученными. Этот протокол представляет собой стандартизированный метод выделения и количественной оценки ВВ, полученных из плазмы, и анализа их белкового груза с использованием образцов плазмы пациентов, поступивших в отделение боли в грудной клетке крупной университетской больницы. После рутинной флеботомии EV выделяют из плазмы путем дифференциального ультрацентрифугирования. Обогащение специфических маркерных белков EV в изолятах EV визуализируется с помощью иммуноблоттинга, а среднее распределение по размерам и концентрации EV в плазме крови количественно оцениваются с помощью анализа с отслеживанием наночастиц. Наконец, сверхэффективная жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия используется для безметочного анализа протеома EV. Таким образом, данный протокол обеспечивает комплексный подход к изучению и использованию ВВ, полученных из плазмы, в качестве потенциальных носителей критически важной биологической информации, а также к изучению их потенциала в качестве новых биомаркеров.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внеклеточные везикулы (ВВ), по номенклатуре не имеющие равномерного определения, представляют собой наночастицы, окруженные липидным бислоем и высвобождаемые различными типами клеток, не способные к репликации1. Эта разнообразная группа включает экзосомы, субпопуляцию EV эндосомального происхождения, обычно варьирующуюся от примерно 40 нм до 160 нм вдиаметре2. Обнаруживаемые во многих жидкостях организма3, ВВ облегчают межклеточную коммуникацию, перенося различные активные биомолекулы, такие как белки, мРНК, микроРНК и липиды. Таким образом, EV предоставляют инфор....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для этого протокола была набрана образцовая когорта пациентов, состоящая из трех здоровых пациентов контрольной группы без признаков явных или сопутствующих сердечно-сосудистых заболеваний и двух пациентов с инфарктом миокарда с повышенным уровнем сегмента ST (NSTEMI). Предварительное одобрение было предоставлено Институциональным наблюдательным советом медицинского факультета Гейдельбергского университета (одобрение IRB #S-351/2015), и до набора было получено письменное согласие от всех пациентов. Пациенты были отобраны из отделения боли в грудной клетке отделения кардиологии университетской клиники Гейдельберга на основе первичной к....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ЭВ выделяли из образцов плазмы (n = 3) пациентов без выраженных сердечно-сосудистых заболеваний, а также пациентов с инфарктом миокарда без подъема сегмента ST (NSTEMI; n = 2) с использованием установленного протокола дифференциального ультрацентрифугирования. Адекватное разделение EV в плазме крови было подтверждено иммуноблоттингом обогащенных EV белков TSG-101, аннексина 5 (Anx5) и CD9 в изолятах EV по сравнению с обедненной EV плазмой от тех же пациентов (рис. 1A). Трансферрин, служащий .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол представляет собой реальную, пошаговую, готовую к использованию методологию для разделения и определения характеристик ВВ в плазме, а также введение в анализ немеченного протеома, пригодный для интеграции в рутинную клиническую практику. Подробное описание и строгое следование единой методике выделения ВВ из образцов плазмы важны для обеспечения воспроизводимости полученных результатов. В современной литературе указывается, что преаналитические условия могут существенно пов.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EG получала гонорары лекторам от Roche Diagnostics, BRAHMS Thermo Scientific, Bayer Vital GmbH, AstraZeneca, Lilly Deutschland, Boehringer Ingelheim; он получил институциональные исследовательские гранты от Roche Diagnostics и Daiichi Sankyo, а также выступает в качестве консультанта для Roche Diagnostics, BRAHMS Thermo Scientific, Astra Zeneca, Novartis и Boehringer Ingelheim, вне представленной работы. Проект JBK получил от Немецкого центра сердечно-сосудистых исследований (DZHK) и компании Roche Diagnostics. Остальные авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, связанного с представленной работой.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят Хайди Дайгенташ, Амели Вернер и Элизабет Мерц за организационную поддержку во время этого проекта.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4x Laemmli buffferBio-rad1610747
10x RIPA-BufferAbcamab156034
26,3 мл Поликарбонатный флакон с крышкой в сборе для ультрацентрифугированияBeckman Coulter355654
5810R Настольная центрифугаEppendorf5811000015
Ацетонитрил (ACN)Biosolve0001204101BS
Дитиотреитол (DTT)Sigma-Aldrich43816-10ML
Фосфат Дульбекко буферизованный физиологический раствор (PBS)Sigma-AldrichD8537
Муравьиная кислота 99% ULC/MS 100Biosolve0006914143BS
Histopaque - 1077Sigma-Aldrich10771
Йодоацетамид (IAA)Sigma-AldrichI6125-5G
Масс-спектрометр Orbitrap Q Exactive HF ThermoFisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
MOPS SDS беговой буферThermo FisherB0001
NanoSight NS300Malvern Panalytical NS300
Nanosight NTA 3.2 Программное обеспечениеMalvern Panalytical 
NuPAGE 4  bis 12 %, Бис-Трис протеиновые гелиInvitrogenNP0323
Optima XPN-80 напольная ультрацентрифугаBeckman Coulter521-4180
PageRuler Plus предварительно окрашенный протеинлестница Thermo Fisher Scientific26619
коктейль ингибиторов протеазы/фосфатазы (100X)Технология клеточной сигнализации5872S
Белковый маркерThermo Fisher26616
Proteome Discoverer 2.5Thermo Fisher
Q Exactive Plus Гибридный квадруполь-орбитрап Масс-спектрометрThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
Быстрое окрашивание кумассисиServa35081.01
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 &; m 1 гDr. Maischr119.aq.0001
SDS-PAGE коммерческий гельThermo FisherNW00100BOX
S-Monovette  Citrat 9NC 0,106 моль/л 3,2%Sarstedt02.1067.001
Speed vac концентраторSavant
Swiss-Prot (Uniprot) Homo sapiens (UP000005640, июнь 2020) база данных белковUniProthttps://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640
буфер бикарбоната триэтиламмония (TEAB)Sigma-AldrichT7408
Трифторуксусная кислота (ТФК) для ВЭЖХ >99%, 100 млSigma-Aldrich302031-100ML
Trypsin MS-GradeThermo Fisher90058
Type 50.2 Ti Ротор с фиксированным угломBeckman Coulter337901
UHPLC Dionex Ultimate 3000Thermo Fisher ScientificULTIM3000RSLCNANO
WaterBiosolve0023214102BS
наклона

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the international society for extracellular vesicles and update of the misev2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  2. Kalluri, R., Lebleu, V. S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Plasma Extracellular VesiclesCardiovascular BiomarkersEV IsolationProteomic AnalysisNanoparticle TrackingDifferential UltracentrifugationImmunoblottingProtein BiomarkersClinical ProteomicsPlasma Biomarker Discovery

Related Articles