Множественная интегрированная модель социального стресса для психических расстройств у самок мышей C57BL/6J

Сотни миллионов людей живут с психическими расстройствами, наиболее распространенными из которых являются тревожные и депрессивные расстройства. По данным Всемирной организации здравоохранения, в 2019 году более 280 миллионов и 301 миллион человек во всем мире жили с депрессией и тревогой^{соответственно1.} Из-за пандемии COVID-19 количество людей, страдающих тревожными и депрессивными расстройствами, значительно выросло — на 26% и 28% соответственно — всего за один год. Среди больных распространенность психических расстройств в течение жизни у женщин почти в два раза выше, чем у мужчин², при этом у женщин наблюдаются более тяжелые симптомы, большие функциональные нарушения, атипичные депрессивные фенотипы, более частые рецидивы и меньшая реакция на лекарства ^3,4,5.

Несмотря на то, что половые различия во многих аспектах психических расстройств хорошо задокументированы ^6,7,8, большинство доклинических исследований в основном сосредоточены на мужчинах, в первую очередь из-за отсутствия подходящих моделей животных женского пола ^9,10. В результате патогенез этих нарушений у женщин остается малоизученным. Это подчеркивает настоятельную необходимость разработки животных моделей, включающих женщин, что облегчило бы исследование нейробиологических механизмов, лежащих в основе психических расстройств у женщин.

Все большее число моделей социального стресса для самок мышей было разработано на основе парадигмы повторяющегося стресса социального поражения (RSDS) 11,12,13,14. Например, две недавно созданные модели RSDS у самок мышей включали искусственное усиление агрессии самцов путем введения мочи самцов мышей и хемогенетическую активацию вентролатерального подразделения вентромедиального гипоталамуса у самцов агрессоров 11,12,13. Тем не менее, утверждалось, что это индуцированное агрессивное поведение не является естественным явлением и может не представлять собой значимые стрессоры для самок мышей^. Кроме того, беременность, наступившая в результате поведения при скатывании, осложняет последующие механистические исследования.

Другой модифицированной моделью, основанной на RSDS, является парадигма заместительного социального поражения стресса, в которой самки мышей визуально становятся свидетелями межмужского^{социального} поражения. Протоколы социального поражения самки также были разработаны для различных штаммов грызунов 14,15,16. Несмотря на некоторые опасения, социальные стрессоры, используемые в этих двух последних моделях, кажутся более этиологически релевантными для психических расстройств человека^. Идеальная модель депрессии требует конструктной (этиологической) валидности, что означает, что методы, вызывающие стресс, используемые в модели, должны точно отражать реальные причины расстройства.

Считается, что этиология психических расстройств является многофакторной и включает в себя биологические, генетические, экологические и психосоциальные факторы. Манипулирование этими факторами риска у лабораторных животных имеет важное значение для разработки соответствующих моделей для механистических исследований и скрининга лекарств. Как социальные, так и несоциальные животные модели, которые имитируют один или несколько стрессоров, могут воспроизводить основные симптомы и нейробиологические изменения, связанные с психическими расстройствами человека. Например, модель хронического легкого стресса (CMS) индуцирует стабильные и эффективные нейропатологические и депрессивные поведенческие фенотипы путем случайного чередования комбинаций множественных физических стрессоров (например, мокрая постель, подвешивание хвоста, зажимание хвоста, голодание)17,18,19,20,21,22,23. Эти результаты свидетельствуют о том, что повторное моделирование множественных факторов риска является жизнеспособной стратегией для построения парадигм изучения психических расстройств. Модель хронического социального стресса (CSDS) является одной из наиболее широко используемых парадигм для депрессии, которая имитирует социальные стрессоры 24,25,26. Хотя эта модель ограничена имитацией одного типа стрессора, ее этиологическая актуальность привела к значительному прогрессу в трансляционных исследованиях. Например, исследования, основанные на CSDS, определили каналы калия (K⁺) на дофаминергических нейронах в вентральной тегментальной области как ключевые мишени, опосредующие устойчивость к депрессии, и выделили открывающие K⁺ каналы KCNQ, такие как ретигабин (эзогабин), в качестве перспективных кандидатов на антидепрессанты как у мышей с депрессией, так и у пациентов с депрессией 27,28,29,30,31. В результате, в нескольких основополагающих исследованиях была предпринята попытка модифицировать парадигму CSDS для моделирования женской депрессии путем индуцирования агрессии, направленной на женщин. Приведенные выше данные подтверждают идею о том, что интеграция множественных социальных стрессоров с повторным воздействием представляет собой важное направление для развития психиатрических моделей у самок животных.

У самок мышей C57BL/6J недавно была разработана 10-дневная парадигма множественного интегрированного социального стресса (MISS) для моделирования психических расстройств, демонстрирующая надежную этиологическую, лицевую, конструкционную и прогностическую^{валидность.} Для создания модели MISS самки мышей C57BL/6J каждый день в течение 10 дней подряд случайным образом подвергались четырем последовательным стрессорам: неудаче в социальной конкуренции (тест на пробирке), модифицированному викарному стрессу социального поражения, неизбежному стрессу перенаселенности и последующей социальной^{изоляции.} В этом исследовании представлен подробный протокол для моделирования парадигмы MISS.

Все экспериментальные процедуры были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Медицинского университета Сюйчжоу (Одобрение No 202207S127) и проводились в соответствии с рекомендациями Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. Самки мышей C57BL/6J (возраст 7-8 недель для испытуемых мышей; 10-14 недель для кандидатов-победителей), самцы мышей C57BL/6J (7-8 недель для агрессивного скрининга CD1) и выведенные на пенсию мыши CD1, использованные в этих экспериментах, были получены из коммерческого источника. Все мыши содержались в 12-часовом цикле свет/темнота с пищей и водой в неограниченном количестве^. Исходные поведенческие измерения были проведены (хотя и не обязательно для каждой когорты) до начала парадигмы MISS, чтобы гарантировать, что последующие поведенческие исходы были связаны с воздействием стресса, а не с индивидуальной вариабельностью. Полный обзор протокола представлен на рисунке 1, а завершенные экспериментальные настройки показаны на рисунке 2. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в данном исследовании, представлена в Таблице материалов.

1. Привыкание

1. Привыкание к окружающей среде
   1. Выделите отдельное помещение исключительно для протокола MISS, поддерживая постоянную температуру (23 °C ± 2 °C), влажность (50%-60%) и интенсивность света (15-20 люкс) в течение 12-часового цикла свет-темнота.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если не указано иное, размещайте мышей в этом помещении на протяжении всего модельного периода.
   2. Подготовьте стандартные клетки для мышей (Д × Ш × В: 37 см × 16 см × 12 см) с крышками из стальной проволоки и подстилкой из кукурузных початков.
   3. В качестве подопытных мышей используйте самок мышей C57BL/6J в возрасте 7-8 недель. Случайным образом распределите мышей по наивным группам и группам MISS и разместите их по пять мышей в клетке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите самок мышей с сопоставимым возрастом и массой тела для эксперимента.
   4. Используйте самок мышей C57BL/6J в возрасте 10-14 недель в качестве кандидатов для скрининга победителей³⁰. Размещайте этих мышей группами по четыре человека в клетке, чтобы установить стабильные социальные ранги.
   5. Используйте самцов выведенных на пенсию мышей CD1 в качестве кандидатов в агрессора. Размещайте мышей CD1 индивидуально, чтобы установить территориальность и предотвратить боевые действия. Используйте выращенных в когорте мышей-самцов C57BL/6J (по 5 мышей в клетке, в возрасте 7-8 недель) в качестве ингентов для агрессивного скрининга CD1.
   6. Дайте всем мышам привыкнуть и восстановиться после транспортного стресса в течение 7 дней после покупки (рисунок 1A1).
   7. Разместите всех мышей с едой и водой, доступными в неограниченном количестве.
2. Привыкание к трубкам и обращение с ними
   1. Поместите короткую акриловую трубку (рис. 2А; длина 10 см, внутренний диаметр 26 мм) в каждую клетку с самками мышей и кандидатами в победители. Дайте мышам акклиматизироваться к трубкам и научитесь проходить через них в течение 3 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диаметр трубки должен быть достаточным для того, чтобы одна взрослая мышь могла плавно пройти через нее, не оборачиваясь.
   2. Обрабатывайте самок мышей и кандидатов в победители в течение 1-2 минут в день в течение 3 дней, чтобы уменьшить стресс, связанный с незнакомыми экспериментаторами (рисунок 1A2).
   3. В конце периода привыкания отметьте хвост каждой мыши красным или черным маркером на масляной основе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Регулярно проверяйте маркировку и при необходимости наносите ее повторно.

2. Подготовка к соревнованиям по пробирке, скрининг победителей и скрининг CD1 агрессора

1. Подготовка к соревнованиям по трубам
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации об этой процедуре обратитесь к предыдущим отчетам^32,34.
   1. Подготовьте самок мышей-испытуемых, женщин-кандидатов в победители, прозрачные акриловые трубки (рис. 2B; длина 30 см, внутренний диаметр 26 мм), пластиковые палочки, 75% этанол и бумажные полотенца. Очистите стол, трубки и пластиковые палочки 75% этанолом, чтобы устранить запахи.
   2. Осторожно возьмитесь за хвост каждой мыши женского пола или кандидата на победу и положите мышь на стол. Дайте ему свободно исследовать его в течение примерно 1 минуты для экологической акклиматизации.
   3. Держите мышь за хвост и поместите ее на один конец трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что голова мыши обращена к концу трубки, а ее передние лапы касаются стола, чтобы свести к минимуму напряжение и облегчить вход.
   4. Отпустите хвост, как только мышь войдет в трубку, и позвольте ей произвольно пройти через нее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пластиковую палочку, чтобы осторожно коснуться хвоста, если мышь останавливается или пытается дать задний ход.
   5. Поместите мышь на противоположный конец трубки и повторите шаг 2.1.4. Считайте шаги 2.1.3 - 2.1.5 как один цикл.
   6. Повторите шаги 2.1.3 и 2.1.5 в течение двух циклов (рисунок 1B1).
   7. Верните мышь в домашнюю клетку. Очистите трубку 75% этанолом, чтобы удалить запахи, мочу и кал.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что трубка чистая, сухая и без остаточного запаха спирта, прежде чем использовать ее со следующей мышью.
   8. Повторяйте шаги 2.1.2-2.1.7 для всех самок мышей в течение 3 дней подряд, следя за тем, чтобы каждая мышь привыкла к прохождению через трубку.
2. Отбор победителей
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации об этой процедуре обратитесь к предыдущим отчетам^32,34.
   1. Подготовьте кандидаток в победительницы, пробирки (длина 30 см, внутренний диаметр 26 мм), пластиковые палочки, 75% этанол, бумажные полотенца и таймер. Очистите и высушите оборудование, чтобы свести к минимуму запахи.
   2. Перед скринингом повторно обучите каждую мышь проходить через трубку в течение одного цикла. Нарисуйте на трубке видимую среднюю линию.
   3. Держите обеих мышей за хвосты и поместите их на противоположные концы трубки. Позвольте им войти и встретиться в середине точки, затем одновременно отпустите их и запустите таймер.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте мышей из одной клетки для каждого соревнования.
   4. Определите «победителя» как мышь, которая выталкивает другую из трубки; Присудите ему 1 балл. «Проигравший» получает 0 очков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пластиковую палку, чтобы не дать победителю отступить. Если обе мыши замерзнут и не отступят в течение 1 минуты, осторожно коснитесь хвоста каждой мыши пластиковыми палочками, чтобы ускорить действие.
   5. Поменяйте местами исходное положение мышей и повторите шаги 2.2.3-2.2.4, снова оценив результат (рисунок 1B2).
   6. Верните обеих мышей в их домашнюю клетку и тщательно очистите пробирку 75% этанолом.
   7. Используйте циклический формат, чтобы сопоставить каждую мышь со всеми остальными соседями по клетке, повторяя шаги 2.2.3-2.2.5 для каждой пары.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Такой подход обеспечивает всестороннее и справедливое ранжирование.
   8. Ранжируйте мышей на основе общего количества очков. Выберите мышь с наибольшим количеством баллов в каждой клетке в качестве «победителя» для последующих экспериментов.
3. Скрининг агрессора CD1
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации об этой процедуре обратитесь к предыдущему отчету³⁵.
   1. Подготовьте выведенных на пенсию мышей-селекционеров CD1, самцов мышей-самцов C57BL/6J (злоумышленников) и таймер.
   2. Поместите самца мыши C57BL/6J непосредственно в домашнюю клетку самца CD1 (резидентного агрессора) на 3 минуты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Злоумышленник не может сбежать во время сеанса.
   3. Запишите задержку до первой атаки, количество атак и продолжительность агрессивного поведения в течение 3-минутного периода в качестве индикаторов агрессивности.
   4. Повторяйте шаги 2.3.2-2.3.3 один раз в день в течение 3 дней подряд, используя разных мышей-нарушителей каждый день (рисунок 1B3).
   5. Отбирайте мышей CD1 в качестве агрессоров для дальнейших экспериментов на основе двух критериев: (1) они должны атаковать по крайней мере в двух из трех сеансов, и (2) их задержка атаки должна быть менее 1 минуты в каждом сеансе.

3. Моделирование

Примечание: Этот шаг включает в себя случайное воздействие неудачи в социальной конкуренции в пробирке, модифицированный викарный стресс социального поражения и неизбежный стресс перенаселенности, за которым следует социальная изоляция в течение 10 дней подряд.

1. Провал социальной конкуренции
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации см. предыдущие отчеты^32,34.
   1. Подготовьте самок мыши, просеянных мышей-победителей, трубки (длиной 30 см, внутренний диаметр 26 мм), пластиковые палочки, 75% этанол, бумажные полотенца и таймер.
   2. Размещайте самок мышей по отдельности (1 мышь в клетке) и размещайте наивных мышей в группах (по 5 мышей в клетке).
      Примечание: Переместите наивных мышей в новые групповые клетки в начале моделирования. Переход на новую корзину не требуется в течение периода моделирования.
   3. Очистите стол, трубки и пластиковые палочки 75% этанолом, чтобы устранить запахи.
   4. Осторожно выводите мышей из их домашних клеток. Поместите мышь MISS и мышь-«победителя» на противоположных концах трубки так, чтобы они шли вперед и встречались в средней точке. «Победитель» вытолкнет мышь MISS из трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Больший размер, большая масса тела и доминирующий социальный ранг «победителя» гарантируют, что экспериментальная мышь MISS почти всегда проигрывает соревнование по трубке. Если мыши остаются неподвижными более 30 с, осторожно коснитесь хвоста победителя пластиковой палочкой, чтобы стимулировать толчок.
   5. Поменяйте местами двух мышей и повторите шаг 3.1.4. Считайте шаги 3.1.4 и 3.1.5 как один цикл.
   6. Верните мышей MISS и «победителя» в их домашние клетки. Очистите стол, трубку и пластиковую палочку, чтобы удалить запахи.
   7. Введите мышь novel winner и повторите шаги 3.1.4-3.1.5 с той же мышью MISS. Таким образом, каждая мышь MISS проходит два последовательных цикла неудачной конкуренции за трубку (рис. 1C1, рис. 2E).
   8. Повторяйте шаги 3.1.4-3.1.7 для всех мышей MISS в течение 10 дней подряд.
2. Модифицированное подставное социальное поражение стрессом
   1. Подготовьте скрининг агрессивных мышей CD1, вышедших на пенсию (в одиночном жилье), самцов мышей C57BL/6J, самок мышей MISS и перфорированных акриловых оболочек (рис. 2C; Д × Ш × В: 8 см × 8 см × 5,5 см) с отверстиями (5 × 5 в верхней панели, 3 × 5 в боковых стенках; каждое отверстие 0,5 см в диаметре).
   2. Поместите самку мыши MISS в клетку CD1-агрессора, заключенную под перфорированной акриловой крышкой, чтобы обеспечить заместительное наблюдение за агрессивными взаимодействиями.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за возможным опрокидыванием акриловой крышки мышью CD1 или MISS. Уменьшение количества подстилки в кукурузных початках в клетках CD1 помогает предотвратить опрокидывание.
   3. Поместите самца мыши-нарушителя C57BL/6J в клетку, чтобы она могла подвергнуться физическому нападению мыши CD1 на 10 минут. Самка мыши MISS наблюдает за взаимодействием через перфорированную крышку (рис. 1C2, рис. 2F).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если мышь-нарушитель серьезно ранена, немедленно прекратите сеанс и вылечите животное. Использование небольших гранул из кукурузных початков усиливает эффект погружения для мыши MISS, увеличивая смещение подстилки во время боев.
   4. Через 10 минут уберите злоумышленника-самца и дайте мыши-самке MISS еще 5 минут сенсорного воздействия на мышь CD1.
   5. Повторите шаги 3.2.3-3.2.4 еще два раза с разными злоумышленниками-мужчинами.
   6. Верните мышь MISS в домашнюю клетку. Следите за любыми травмами у злоумышленников-мужчин и лечите их.
   7. Очистите перфорированные акриловые чехлы и подметите пролитое постельное белье.
   8. Повторите шаги 3.2.2-3.2.5 с новым выведенным из эксплуатации заводчиком CD1 в течение 10 дней подряд.
3. Неизбежный стресс от переполненности
   1. Подготовьте самки мышей MISS, белый непрозрачный рукав (Рисунок 2D; Д × Ш × В: 14 см × 10 см × 20 см), стандартные клетки для мышей с подстилкой из кукурузных початков, 75% этанолом, бумажными полотенцами и таймером.
   2. Поместите непрозрачный рукав внутрь стандартной клетки с подстилкой.
   3. Вводите 12-15 самок мышей (либо все мыши MISS, либо смешанные с другими самками) в рукав на 30 минут ежедневно (рисунок 1C3, рисунок 2G).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте количество мышей в соответствии с их размером, чтобы обеспечить скученность без вытаптывания. Предотвратите утечку, при необходимости накрыв рукав прозрачной перфорированной крышкой.
   4. Верните мышей в их домашние клетки и очистите рукав 75% этанолом.
   5. Повторяйте шаг 3.3.3 в течение 10 дней подряд.
4. Социальная изоляция
   1. Подготовьте самок мышей MISS и стандартные клетки для мышей с подстилкой из кукурузных початков.
   2. Домашние мыши MISS по отдельности, когда они не испытывают неудачи в социальной конкуренции, стресс викарного поражения или стресс перенаселенности, в течение оставшейся части 10-дневного периода моделирования (рис. 1C4, рис. 2H).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наивных мышей осторожно переносят за хвост во временную клетку, а затем возвращают в их домашнюю клетку без какого-либо стресса. Обеспечьте едой и водой в неограниченном количестве, как и в случае с мышами MISS.

4. Поведенческие тесты

Поведенческие эксперименты проводятся в течение одной недели после моделирования для оценки депрессивного и тревожного поведения у мышей. Перед каждым испытанием самок мышей перемещают в комнату поведенческого тестирования (освещение 15-20 люкс) на 1 час привыкания. После каждого теста мышей возвращают в их исходное жилище.

1. Тест на предпочтения сахарозы
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации см. предыдущие отчеты 36,37,38.
   1. Подготовьте самок мышей, бутылочки для питья (50 мл) с шариковыми трубками, стандартные клетки для мышей с крышками из стальной проволоки, сахарозу, электронные весы, градуированный цилиндр, стержень для перемешивания, бумагу для взвешивания, воду, блокнот и ручку.
   2. Размещайте всех самок мышей (наивных мышей и мышей MISS) по отдельности.
   3. Наполните бутылки питьевой водой (~2/3 объема).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом эксперимента убедитесь в отсутствии утечки из бутылок.
   4. Предоставьте каждой мыши две наполненные водой бутылки, расположенные рядом друг с другом, на 2 дня привыкания.
   5. Приготовьте 1%-ную воду сахарозы (1 г сахарозы на 99 мл воды).
   6. В начале теста замените воду в одной бутылке на 1% раствор сахарозы. Запишите начальный вес обеих бутылок.
   7. Через 12 часов снова запишите вес бутылок и поменяйте положение бутылок, чтобы избежать смещения положения.
   8. Через 24 часа запишите окончательный вес и рассчитайте предпочтительность сахарозы следующим образом:Предпочтение сахарозы (%) = (Потребление сахарозы / Общее потребление жидкости) × 100
   9. В конце теста верните мышей в их домашние клетки с обычными бутылками с водой.
   10. Тщательно промойте все бутылки и шариковые трубки водой.
2. Испытание на хвостовую подвеску
   Примечание: Данный тест³² может быть проведен на той же или отдельной когорте мышей в зависимости от плана эксперимента. В данном исследовании он был проведен через 3 дня после теста на предпочтение сахарозы.
   1. Подготовьте самок мышей, коробку для проверки хвостовой подвески (высота 55 см × шириной 60 см × глубиной 12 см), скотч, секундомер, 75% спирт и бумажные полотенца.
   2. Настройка системы видеослежения³⁹. Определите активную зону и начните запись.
   3. Очистите тестовую коробку 75% этанолом.
   4. Аккуратно заклейте мышь скотчем на расстоянии ~2 см от конца хвоста и подвесьте ее вниз головой, следя за тем, чтобы ее голова находилась на расстоянии ~25 см от дна коробки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сведите к минимуму раскачивание и избегайте ненужного напряжения.
   5. Запись поведения с помощью программы слежения³⁵ 6 мин. Для анализа используйте время неподвижности за последние 4 минуты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Неподвижность определяется как отсутствие движения при пассивном повешении тела. Исключите данные, если мышь упадет или залезет вверх.
   6. Аккуратно отсоедините ленту и верните мышь в домашнюю клетку.
3. Испытание в открытом поле
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подробнее см. предыдущие отчеты^40,41.
   1. Подготовьте самок мышей, тестовый бокс для открытого поля (40 см × 40 см × 40 см), 75% этанол и бумажные полотенца.
   2. Настройте систему видеослежения. Виртуально разделить арену на 4 × 4 подзоны; Определите центральные 4 единицы как центральную зону, а оставшуюся часть как периферийную зону.
   3. Очистите тестовую коробку 75% этанолом.
   4. Аккуратно поместите мышь в центр коробки так, чтобы ее голова была направлена в том же направлении. Дайте ему постоять 5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте поддон для переноса, чтобы снизить нагрузку на погрузочно-разгрузочные работы.
   5. Фиксируйте общее пройденное расстояние и время, проведенное в центральной зоне, с помощью системы видеонаблюдения.
   6. По окончании теста верните мышь в домашнюю клетку и очистите устройство.
4. Тест лабиринта с приподнятым плюсом
   ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробная информация содержится в предыдущем отчете^{No 32}.
   1. Подготовьте самок мышей, лабиринт с возвышенностью, 75% этанола и бумажные полотенца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лабиринт состоит из двух перпендикулярных взлетно-посадочных полос (50 см над уровнем пола), каждая из которых имеет два рукава (30 см в длину × 5 см в ширину). Один комплект имеет стенки высотой 15 см (закрытые дужки), в то время как другой набор открытый. Центральная площадь составляет 5 см × 5 см.
   2. Настройте систему видеослежения и определите открытые и сомкнутые руки, а также центральную зону.
   3. Очистите лабиринт с помощью этанола на 75%.
   4. Аккуратно поместите мышь в центр лабиринта, лицом к открытой руке. Оставьте на свободное исследование в течение 5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте поддон, чтобы свести к минимуму напряжение во время размещения.
   5. Записывайте время, проведенное в каждой руке, с помощью системы слежения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если мышь выпадает из лабиринта, исключите ее данные.
   6. Верните мышь в домашнюю клетку и тщательно очистите лабиринт.

Чтобы выяснить, вызывает ли воздействие MISS депрессивные поведенческие изменения, самки мышей C57BL/6J (n = 16 в группе; размер выборки определен с помощью анализа мощности, см. Дополнительный файл 1 и Дополнительный файл 2), подвергшиеся воздействию парадигмы MISS, были оценены с помощью тестов предпочтения сахарозы и подвешивания хвоста, которые оценивают основные симптомы депрессии-ангедонии и поведенческого отчаяния соответственно (Рисунок 3A-F). По сравнению с мышами в контрольной группе, мыши, подвергшиеся воздействию MISS, продемонстрировали значительное снижение предпочтения сахарозы без соответствующего изменения потребления воды (рисунок 3C-D). Кроме того, мыши в группе MISS продемонстрировали увеличенное время неподвижности в тесте на подвешивание хвоста (рис. 3F), что указывает на усиление поведенческого отчаяния.

Чтобы оценить, приводит ли воздействие MISS также к тревожному поведению, мышей тестировали в открытом поле и повышали парадигмы лабиринта. Мыши, подвергшиеся воздействию MISS, проводили значительно меньше времени в центральной зоне открытого поля (рисунок 4A-C) и в открытых объятиях лабиринта с возвышенностью плюс (рисунок 4D, E) по сравнению с наивными контрольными группами.

В совокупности эти результаты демонстрируют, что воздействие парадигмы MISS вызывает как депрессивное, так и тревожное поведение у самок мышей.

Рисунок 1: Принципиальная схема модели MISS. (А) Привыкание: подопытные мыши восстанавливались после стресса при транспортировке в течение 7 дней, после чего в течение 3 дней их проводили с помощью трубки. (B) Обучение и скрининг: (B1) Экспериментальные мыши с помощью трубки были обучены проходить через трубку 2 цикла в день в течение 3 дней подряд. (В2) Схема процедуры отбора победителей. (В3) Схема агрессивной процедуры скрининга выведенных из обращения производителей CD1. (C) Фаза моделирования, состоящая из рандомизированного воздействия трех стрессоров с последующей социальной изоляцией в течение 10 дней подряд: (C1) Неудача в соревновании по трубке. (С2) Подставное социальное поражение стрессом. (С3) Неизбежный стресс от переполненности. (С4) Социальная изоляция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Экспериментальная установка для парадигмы MISS. (A) Акриловая трубка длиной 10 см (внутренний диаметр: 26 мм), используемая для привыкания. (B) Акриловая трубка длиной 30 см (внутренний диаметр: 26 мм), используемая для соревнований по трубкам. (C) Перфорированная крышка (L × W × H: 8 × 8 × 5,5 см) для заместительного социального стресса. (D) Акриловая втулка, используемая для снятия напряжения переполненности. (E) Репрезентативное изображение процедуры соревнований по трубе. (Е) Фотография заместительной установки социального поражения от стресса. (G) Вид сверху вниз на установку напряжения переполненности. (H) Фотография мыши, содержащейся в социальной изоляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Депрессивное поведение, вызванное воздействием MISS, у самок мышей C57BL/6J. (A) Временная шкала эксперимента. (В) Схема теста на предпочтение сахарозы. (C) Предпочтение сахарозы в наивных vs. Мыши, подвергшиеся воздействию MISS (непарный t-критерий Стьюдента, t30 = 3,108, **P < 0,01; n = 16 мышей в группе). (D) Общее потребление жидкости в тесте предпочтения сахарозы (непарный t-критерий Стьюдента, t30 = 0,8669, P > 0,05; n = 16 мышей в группе). (E) Схема испытания на хвостовую подвеску. (F) Время неподвижности в тесте на подвешивание хвоста (t-критерий Стьюдента без пары, t30 = 2,589, *P < 0,05; n = 16 мышей в группе). Полосы погрешностей представляют собой SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Тревожное поведение, вызванное воздействием MISS, у самок мышей C57BL/6J. (A) Репрезентативные траектории активности наивных мышей и мышей, подвергшихся воздействию MISS, в тесте на открытом воздухе. (В) Время, проведенное в центральной зоне (непарный t-критерий Стьюдента, t30 = 2,365, *P < 0,05; n = 16 мышей в группе). (C) Общее пройденное расстояние (t-критерий Стьюдента без пары, t30 = 1,467, P > 0,05; n = 16 мышей в группе). (D) Репрезентативные траектории в тесте лабиринта с повышением плюса. (E) Время, проведенное в распростертых объятиях (t-критерий Стьюдента без пар, t30 = 2,786, **P < 0,01; n = 16 мышей в группе). Полосы погрешностей представляют собой SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1: Нормальность и однородность тестов на вариативность для теста предпочтения сахарозы. Результаты теста Шапиро-Уилка (таблица А) и теста Левена (таблица В), выполненных с помощью SPSS, подтвердили, что данные соответствуют предположениям, необходимым для непарного t-критерия Стьюдента. Результаты показывают, что данные были нормально распределены и демонстрировали однородность дисперсии, что подтверждает использование параметрического тестирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Оценка размера выборки для теста на предпочтение сахарозы. (A) Размер выборки был рассчитан с помощью онлайн-калькулятора размера выборки (https://www.trialstats.com/statbox/index.htm/samplesize/estimation?sid=4). (B) На основе экспериментальных данных было оценено, что минимум 15 мышей в группе достигают адекватной статистической мощности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.