Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Генерация сосудистых органоидов из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток

3.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67125

⸱

13 декабря 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2College of Dental Medicine, Division of Periodontics, Columbia University, 3Department of Pharmaceutical Sciences, University at Buffalo, The State University of New York

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе представлен метод получения сосудистых органоидов с использованием плюрипотентных стволовых клеток человека.

Аннотация

Сосудистые органоиды, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК), повторяют разнообразие типов клеток и сложную архитектуру сосудистых сетей человека. Эта трехмерная (3D) модель обладает значительным потенциалом для моделирования сосудистой патологии и скрининга лекарственных препаратов in vitro . Несмотря на последние достижения, ключевой технической проблемой остается воспроизводимое получение органоидов стабильного качества, что имеет решающее значение для последующих анализов и приложений. Здесь представлен модифицированный протокол, который улучшает как однородность, так и воспроизводимость генерации сосудистых органоидов. Модифицированный протокол включает в себя использование микролунок и коктейля CEPT (хроман 1, эмриказан, полиамины и интегрированный ингибитор реакции на стресс, транс-ISRIB) для улучшения формирования эмбриоидных тел и выживаемости клеток. Дифференцированные, зрелые сосудистые органоиды, полученные с использованием этого протокола, характеризуются 3D-иммунофлуоресцентной микроскопией для анализа их морфологии и сложной сосудистой системы. Этот протокол позволяет производить высококачественные сосудистые органоиды масштабируемым образом, потенциально облегчая их использование в моделировании заболеваний и скрининге лекарств.

Введение

Микрофизиологические модели in vitro, включая органоидные системы и системы «ткань на чипе», появились за последнее десятилетие 1,2,3. Эти трехмерные (3D) системы, полученные из человеческих клеток, устраняют ограничения обычных двумерных (2D) клеточных культур и животных моделей, такие как отсутствие многих компонентов в физиологическом микроокружении и генетические различия между видами, соответственно. Они дают больше физиологических знаний и больше подходят для моделирования заболеваний и скрининга лекарств, чем обычные модели. Среди микрофизиологических моделей было доказано, что органоиды, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК), эффективно повторяют архитектурные особенности нативных тканей человека и были разработаны для имитации различных органов человека, включая мозг 4,5, почку6, печень 7,8 и сетчатку 9. В этой статье мы уделяем особое внимание получению сосудистых органоидов из ИПСК и описываем оптимизированный протокол, направленный на минимизацию различий между различными образцами органоидов и партиями, тем самым улучшая общую воспроизводимость.

Сосудистая сеть играет решающую роль в поддержании физиологического гомеостаза во всех органах человека. Формирование сосудистой сети включает в себя процессы васкулогенеза и ангиогенеза, которые организуются посредством взаимодействия между эндотелиальными и пристеночными клетками (например, перицитами и гладкомышечными клетками сосудов) и под воздействием различныхстимулов. Пеннингер, Виммер и их коллеги разработали первый метод генерации сосудистых органоидов 11,12, который имитирует эти два процесса. С помощью органоидов, полученных с помощью этого метода, их группа12 и группа13,14 продемонстрировали потенциал сосудистых органоидов для моделирования сосудистых нарушений при заболеваниях. Например, в наших последних работах13,14 наблюдались различные фенотипы, такие как прорастание сосудов и вариации состава клеток стенки, между сосудистыми органоидами, имитирующими болезнь, и их аналогами дикого типа. Эти примеры показывают, что модель сосудистого органоида может служить платформой для скрининга лекарств, имитируя сосудистые сбои, связанные с заболеванием.

На основе первоначальных работ по генерации сосудистых органоидов11,12 представлен пересмотренный протокол, который включает использование микролунки для облегчения формирования гомогенных эмбриоидных тел (БЭ), что является критическим фактором для минимизации вариаций, часто наблюдаемых в одной и той же партии генерации органоидов. Кроме того, коктейль CEPT, комбинация хромана 1, эмриказана, полиаминов и интегрированного ингибитора реакции на стресс (trans-ISRIB)15, используется для улучшения жизнеспособности ИПСК и дифференцированных клеток в процессе образования БЭ. Эта модификация в основном предназначена для уменьшения различий между различными образцами органоидов и партиями. Однородные сосудистые органоиды могут быть получены с помощью этого примерно двухнедельного протокола, в котором васкулогенез индуцируется, чтобы помочь эндотелию организоваться в примитивные канальцевые сети в 1-й день, а затем индукция ангиогенеза в 5-й день для развития сложных сосудистых сетей в органоидах. На 12-15-й день сгенерированные органоиды должны показать зрелые сосудистые сети, состоящие как из эндотелия, так и из мочковых клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

На рисунке 1 представлен обзор шагов, связанных с этим протоколом. Подробная информация о реагентах и материалах, используемых в этом протоколе, приведена в Таблице материалов. Рекомендуется предварительно нагреть все носители до 37 °C перед использованием, если не указано иное. Все материалы и принадлежности для клеточных культур должны быть либо автоклавными, либо стерильными, а работа с клетками должна производиться в шкафу биобезопасности. Кроме того, значение pH смеси коллагена I должно быть тщательно отрегулировано до pH 7,3, чтобы избежать возможных проблем с затвердеванием.

1. Обслуживание ИПСК человека

  1. Разморозьте экстракт матрицы базальной мембраны на льду, осторожно встряхните флакон, чтобы перемешать раствор, и внесите 0,5 мл аликвот в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл с помощью пипетки P1000 и предварительно охлажденных наконечников. Хранить аликвоты при температуре -20 °C до 1 года.
  2. Разморозьте одну аликвоту матричного экстракта (0,5 мл) на льду. Смешайте с 49,5 мл предварительно охлажденной среды DMEM/F12 в пробирке объемом 50 мл. Распределите смесь по каждой лунке (1,5 мл/лунка) в 6-луночных планшетах, а затем осторожно встряхните пластину, чтобы жидкий раствор покрыл всю лунку. Заклейте пластины парафиновой пленкой и храните при температуре 4 °C до 1 недели.
  3. Приготовьте расширяющую среду hiPSC, как описано в таблице 1. Изготовьте аликвоты из полной среды (40 мл/тюбик) и храните при -20 °C до 1 года.
  4. Поместите предварительно покрытую пластину в инкубатор при температуре 37 °C на 1 час до культивирования гиПСК.
  5. Предварительно подогрейте расширяющую среду hiPSC (40 мл) при 37 °C и приготовьте среду для посева hiPSC, как описано в таблице 2.
  6. Перенесите пластину с покрытием из инкубатора с температурой 37 °C в шкаф биобезопасности. Замените среду в пластине с покрытием на среду для посева hiPSC (1 мл/лунка).
  7. Разморозьте криоконсервированный флакон с ИПСК из криотанки на водяной бане при температуре 37 °C в течение 1 минуты.
  8. Перенесите клетки в пробирку объемом 15 мл, а затем добавьте 5 мл среды DMEM/F12, после чего центрифугируйте при 100 x g в течение 3 минут при комнатной температуре для сбора клеток.
  9. Отсадите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки 1,5 мл посевной среды hiPSC. Аккуратно ресуспендируйте клетки в пробирке объемом 15 мл.
  10. Аликвотировать 10 мкл клеточной суспензии и смешать с 10 мкл раствора трипанового синего. Переложите 10 мкл смеси на предметное стекло гемацитометра и накройте его покровным стеклом.
  11. Установите предметное стекло на держатель и вставьте его в автоматический счетчик ячеек. Подождите, пока прибор найдет фокус, или вручную отрегулируйте фокус, нажав кнопку фокусировки +/- на экране. После этого используйте настройки по умолчанию и нажмите кнопку «Захват ». Используйте показания плотности живых клеток в качестве концентрации суспензии ИПСК приготовленной на шаге 1.9.
  12. Засейте 2 × 10 по5 клеток в каждую лунку и следите за тем, чтобы ячейки равномерно распределились в лунке.
  13. Культивируйте клетки при 37 °C с 5%CO2 и замените среду расширяющей средой hiPSC (1,5 мл/лунку) через 24 ч.
  14. Меняйте среду ежедневно до тех пор, пока клетки не достигнут слияния 80%. Регулярно проверяйте морфологию клеток и размер колонии, чтобы убедиться в отсутствии спонтанной дифференцировки. Откажитесь от культуры и возобновите прием новой партии ИПСК при обнаружении обширной (>5%) спонтанной дифференцировки.

2. Формирование EB (день 0)

  1. В день 0 приготовьте и подогрейте среду DMEM/F12, среду для посева hiPSC и раствор для отделения клеток при температуре 37 °C в течение 20-30 минут.
  2. Снимите питательную среду с 6-луночного планшета и добавьте предварительно подогретый раствор для отслоения клеток (1,5 мл/лунка). Выдержать тарелку при температуре 37 °C в течение 5-7 минут.
  3. Перенесите пластину в шкаф биобезопасности, постучите по пластине, чтобы отделить колонии ИПСК и разбить агрегаты.
  4. Переложите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл. Добавьте 4,5 мл среды DMEM/F12. Аккуратно переведите смесь вверх и вниз с помощью серологической пипетки объемом 10 мл пять раз, чтобы диссоциировать клетки в одноклеточную суспензию. Избегайте образования пузырей.
  5. Центрифугируйте при 100 х г в течение 3 мин при комнатной температуре для сбора клеток.
  6. Отсадите надосадочную жидкость и аккуратно ресуспендируйте клетки 1 мл затравочной среды hiPSC с помощью пипетки P1000.
  7. Смешайте 10 мкл клеточной суспензии с 10 мкл раствора трипанового синего для подсчета клеток. Переложите 10 мкл смеси на предметное стекло гемацитометра и накройте его покровным стеклом. Установите предметное стекло на держатель и вставьте его в автоматический счетчик ячеек. После того, как прибор найдет фокус, нажмите кнопку Capture и используйте показания плотности клеток LIVE для определения концентрации суспензии hiPSC.
  8. Засейте клетки в микролуночный планшет с круглым дном со сверхнизким уровнем крепления плотностью 2,7 ×10 5 клеток/лунку, чтобы получить 500-1000 клеток на EB.
  9. Добавьте 2 мл посевной среды hiPSC в каждую лунку и аккуратно перемешайте раствор для равномерного распределения клеток.
  10. Культивируйте клетки при 37 °C с 5%CO2 в течение 24 ч.

3. Сосудистая дифференцировка (день 1 - 5)

  1. В день 1 приготовьте среду для индукции мезодермы (MIM), как описано в Таблице 3 и Таблице 4 , и предварительно подогрейте ее при 37 °C в течение 20 минут. Среда MIM должна быть свежей.
  2. С помощью пипетки P200 осторожно отсасывайте среду из микролуночного планшета, не повреждая БЭ на дне.
  3. Медленно добавляйте 2,5 мл MIM с помощью пипетки P200. Культивируйте EBs в MIM при 37 °C с 5%CO2 в течение 2 дней.
  4. На 3-й день аккуратно замените среду на предварительно подогретые, только что приготовленные 2,5 мл среды для сосудистой дифференцировки 1 (VDM1, таблица 5), не нарушая БЭ на дне микролунки. Культивируйте клетки при 37 °C с 5%CO2 в течение еще 2 дней.

4. Заделка гидрогеля (день 5)

  1. Приготовьте смесь коллагена I, как описано в таблице 6. Поместите пробирку объемом 50 мл на лед и добавьте раствор коллагена I, H2O, среду 10× DMEM/F12, бикарбонат натрия и HEPES. Тщательно перемешайте, осторожно встряхивая тюбик. Добавьте 1 М раствор NaOH по каплям, встряхивая смешанный раствор, чтобы довести значение pH до 7,3, и проверьте значение pH смеси с помощью pH-метра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием все растворы должны быть предварительно охлаждены на льду. Выполняйте процедуру на льду в шкафу биобезопасности все время. Добавление раствора NaOH имеет решающее значение, а быстрое диспергирование для получения однородного раствора необходимо, чтобы избежать локального отверждения коллагена I. Объем NaOH может варьироваться в зависимости от количества используемой партии раствора коллагена I. Не пипетируйте энергично для смешивания, так как напряжение сдвига может привести к нежелательному предварительному отверждению.
  2. Приготовьте смесь матрицы коллагеновой I-базальной мембраны, как описано в таблице 7. Добавьте 1,25 мл матрицы базальной мембраны к смеси коллагена I объемом 5 мл, приготовленной на шаге 4.1. Аккуратно перемешайте раствор, встряхивая тюбик.
  3. Поместите 12-луночную тарелку на лед на 2 минуты.
  4. Медленно добавьте смесь матрицы коллагеновой I-базальной мембраны в 12-луночный планшет (1,5 мл/лунку) с помощью широкопроходных наконечников. Следите за тем, чтобы смесь распределилась равномерно.
  5. Поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C на 2 ч для застывания первого слоя гидрогеля.
  6. Храните оставшуюся смесь коллагеновых матриц I-базальной мембраны на льду для последующего использования.
  7. Перенесите ~60 клеточных агрегатов в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и охладите пробирку на льду в течение 5 минут. Осторожно извлеките среду с помощью наконечника для дозатора P200.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Начните этот шаг через 1,5 часа после шага 4.5.
  8. По каплям добавьте к агрегатам 1,5 мл коллагеновой мембраны I-basement и аккуратно перемешайте их с помощью наконечников для пипеток P200 с широким отверстием.
  9. Перенесите тарелку с первым слоем гидрогеля из инкубатора (шаг 4.5) в шкаф биобезопасности.
  10. Добавьте 1,5 мл суспензии заполнителя на отвержденный слой. Аккуратно встряхните пластину, чтобы равномерно распределить агрегаты. Избегайте образования пузырей.
  11. Инкубируйте планшет при температуре 37 °C с 5%CO2 в течение еще 2 часов.
  12. Готовят среду для сосудистой дифференцировки 2 (VDM2; Таблица 8) и предварительно нагрейте среду на водяной бане при температуре 37 °C в течение 20 минут перед использованием.
  13. Добавьте 2 мл VDM2 в каждую лунку и культивируйте клетки при 37 °C с 5%CO2.
  14. Меняйте среду каждые 3 дня с предварительно подогретым, свежеприготовленным VDM2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: (Необязательно) Сосудистые органоиды могут быть высвобождены из гелевой смеси путем удаления геля с помощью иглы шприца. Сосудистые органоиды, извлеченные из геля, можно поддерживать по отдельности в 96-луночном планшете с VDM2 (200 мкл/лунка). Меняйте средство каждые 2-3 дня.

5. 3D Иммунофлуоресцентный анализ

  1. Сосудистые органоиды должны стать зрелыми примерно на 13-й день. Для органоидов, встроенных в гидрогель, тщательно отсадите среду и промойте 2 мл PBS три раза (каждый раз по 10 минут). Для органоидов, извлеченных из геля (после шага 4.14), соберите 6-10 органоидов в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл, отасуньте среду и промойте 2 мл PBS три раза (по 10 мин каждый).
  2. Добавьте в образец 2 мл 4% параформальдегида (PFA) и инкубируйте при 4 °C в течение ночи с герметизацией парафиновой пленки.
  3. Удалите раствор PFA и промойте образец 2 мл PBS четыре раза (каждый раз по 15 минут).
  4. Добавьте 2 мл блокирующего буфера (Таблица 9) и инкубируйте при комнатной температуре в течение 2 ч.
  5. Удалите блокирующий буфер и добавьте 1,5 мл первичных антител (информацию об антителах см. в Таблице материалов ; антитела следует разводить в блокирующем буфере). Инкубируйте образец с первичными антителами при 4 °C в течение 2 дней с легким встряхиванием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первичное антитело (CD31, PDGFRβ и ERG1) рекомендуется разводить в блокирующем буфере в соотношении 1:400 (см. Таблицу материалов для получения дополнительной информации).
  6. Удалите первичный раствор антител и промойте 2 мл PBST в течение 1 ч шесть раз.
  7. Добавьте в образец 2 мл вторичных антител (информацию об антителах см. в Таблице материалов ; антитела следует разводить в PBST). Оберните тарелку алюминиевой фольгой и выдерживайте при температуре 4 °C в течение 2 дней, осторожно встряхивая.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вторичное антитело рекомендуется разводить в PBST в соотношении 1:1000 (см. Таблицу материалов для получения дополнительной информации). Держите тарелку от света во время инкубации и мойте после этого этапа.
  8. Удалите вторичный раствор антитела и смойте 2 мл TBST шесть раз (каждый раз по 1 часу). Добавьте DAPI (1 мкг/мл) в буфер для промывки, используемый для последнего этапа промывки, если необходимо окрашивание ядер.
  9. Для этих органоидов, залитых гелем, разрежьте гель на 4 части и осторожно перенесите их в микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл с помощью шпателя. Для извлеченных органоидов снимите буфер для промывки.
  10. Используйте салфетки, чтобы впитать остатки раствора, не прикасаясь к гелю или органоидам.
  11. Добавьте 2 мл водорастворимого реагента для очищения тканей (показатель преломления = 1,49) в каждую пробирку. Инкубируйте образцы с очищающим реагентом при комнатной температуре в темноте до тех пор, пока органоиды не станут прозрачными (обычно на ночь). Не встряхивайте образцы.
  12. Осторожно перенесите органоиды с очищающим реагентом в центр посуды со стеклянным дном с помощью шпателя.
  13. Накройте органоиды или гелевую часть покровным стеклом диаметром 24 мм × 24 мм.
  14. Осторожно надавите на покровную крышку, пока она не ляжет ровно, и прижмите образцы к стеклянному дну.
  15. Удалите излишний очищающий реагент из чашки и заклейте покровное стекло лаком для ногтей.
  16. Для 3D-визуализации используйте конфокальный микроскоп с объективом 10×. Используйте сканирование листов и сканирование Z-стека для получения изображений органоидов целиком.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1А представлена схема этого протокола, включая ключевые компоненты, используемые на каждом этапе. Дифференцировка началась с формирования БЭ, за которой последовала индукция мезодермы и уточнение сосудистой линии (Рисунок 1B-D). Со временем агрегаты становились больше и менее сферическими. Органоиды начали показывать шероховатости на 5-й день. После встраивания в матричную смесь коллагеновых I-базальных мембран клетки...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Описанный протокол включает в себя две ключевые модификации для гомогенной и воспроизводимой генерации высококачественных сосудистых органоидов. Первая модификация заключается в использовании микролуночного планшета для лучшего контроля однородности EB. В качестве отправной точки для сосудистой дифференцировки размер БЭ имеет решающее значение, поскольку он регулирует судьбу стволовых клеток и эффективность дифференцировки в отношении различных линий. Вариации в размерах БЭ обычно привод...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы хотели бы выразить признательность за техническую поддержку со стороны совместного ресурса по конфокальной и специализированной микроскопии Комплексного онкологического центра Герберта Ирвинга при Колумбийском университете, частично финансируемой за счет гранта Центра NIH (P30CA013696). Эта работа поддержана NIH (R21NS133635, Y.-H.L.; UH3TR002151, K. W. L.). Рисунок 1А был создан с помощью BioRender.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-Меркаптоэтанол (1000x)Gibco21985023
аккутазаSigma-AldrichA6964
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immuno Research Labs711-546-152восстанавливается с 0,25 мл 50% глицерина,  хранить при -20 °°; C на срок до 1 года, коэффициент разведения для использования: 1:1000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Jackson Immuno Research Labs705-606-147восстанавливать с 0,25 мл 50% глицерина, хранить при температуре -20°С; C на срок до 1 года, коэффициент разведения для использования: 1:1000
добавка B27 минус витамин А (50x)Gibco12587010размораживание при 4 °°; С, аликвоту и хранить при -20 °°С; C, избегать цикла замораживания-оттаивания
BMP4ProSpecCYT-081восстанавливать стерильным ddH2O в концентрации 100 нг/β; L, аликвоту и хранить при -20°С; Антитела к
C CD31 abcamab28364коэффициент разведения: 1:400
ЦентрифугаEppendorf022626001
CHIR99021Tocris Bioscience4423/10сделать стоковый раствор при 12 мМ с ДМСО, и хранить при -20 °°; C на срок до 1 года.
Chroman 1Tocris7163/10сделать стоковый раствор при 100 & микро; М с ДМСО и хранить при -20 °°; C на срок до 1 года.
Коллаген I Corning40236
Конфокальный микроскопNikonAXRMP/Ti2
Corning Elplasia PlatesCorning4441
Countess II FL автоматический счетчик клетокThermo FisherAMQAF1000
DMEM/F-12, добавка GlutaMAXGibco10565018
DMEM/F-12, порошокGibco12500062приготовьте 10x стоковый раствор с биосортным ddH2O и простерилизуйте его 0,2 &микро; м. Хранить при температуре 4 °C.
Edi042AКедры Синай
ЭмрикасанМедхимэкспресс ООО HY1039610MGсделать стоковый раствор при 1 мМ с ДМСО, и хранить при -20 °°; C на срок до 1 года.
Антитела ERGCell Singali Technology97249коэффициент разведения: 1:400
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота - PremiumAtlanta BiologicalsS11150размораживание при 4 градусах; С  и аликвот, магазин at  -20 °°; C до пяти лет, или хранить при 4 °deg; C в течение месяца
FGF2ProSpecCYT557восстанавливают стерильным ddH2O в концентрации 100 нг/мкм; L, аликвоту и хранить при -20°С; C
Fluorodish Cell Culture DishWorld Precision InstrumentsFD35-100
ForskolinTocris Bioscience1099восстанавливают с ДМСО в концентрации 12 мМ, аликвоту и хранят при -20 °°; C
Гентамицин (50 мг/мл)Gibco15710064
добавка GlutaMAX (100x)Gibco35050061
гепарин, 100 кЕдMilliporeSigma375095100KUвосстанавливают стерильным ddH2O в концентрации 4 кЕд/мл
HEPES (1 M)Gibco15630080
ИнкубаторThermo Scientific13998123
Knockout Serum ReplacementGibco10828028размораживание при 4 ° deg; С, аликвоту и хранить при -20°С; C, избегайте цикла замерзания-размораживания
Matrigel, GFR Base Membrane MatrixCorning356230размораживание при 4 ° С, аликвоту и хранить при -80°С; C, избегайте цикла замораживания-размораживания
MEM Раствор заменимых аминокислот (NEAA, 100x)Gibco11140050
Молекулярная биология Класс водыCorning46000CV
mTeSR плюс наборSTEMCELL Technologies1001130размораживания при 4 °°; С, аликвоту и хранить при -20°С; C, избегайте цикла замораживания-размораживания
N2 добавка (100x)Gibco17502048размораживать при 4 градусах; С, аликвоту и хранить при -20°С; C, избежать цикла замерзания-оттаивания
раствор NaOH (1 М)Cytiva  HyCloneSH31088.01
NeuroBasal mediumGibco21103049
NIS-Elements, версия 5.42Сыворотка Nikon
Normal Donkey SerumJackson Immuno Research Labs17000121восстановиться с 10 мл стерильного ddH2O, хранить при температуре 4 °°; C на срок до двух недель
параформальдегид, 20%Электронная микроскопия Sciences15713Sразбавлен PBS
PBST, 20xThermofisher28352
PDGFR&бета; антителаR& КоэффициентAF385: полиаминовая добавка 1:400
(1000x)Очищающий реагент Sigma-AldrichP8483
Rapiclear, 1,49SUNJIN LABRC149001
бикарбонат натрия (7,5%)Gibco25080094
моногидрат дезоксихолата натрияThermofisherJ6228822растворить с ddH2O для получения 1% (масс./об.) стокового раствора
TBST, 20xThermofisher28360
trans-ISRIBTocris Bioscience5284/10сделать исходный раствор при 1 мМ с ДМСО, и хранить при -20°; C на срок до 1 года.
Tritin X-100Sigma-AldrichT8787-50ML
Трипановый синий краситель (0,4%)Thermo Fisher15250061
Tween 20Sigma-AldrichP7949-100ML
VEGF-AProSpecCYT-116ресульфат со стерильным ddH2O в концентрации 100 нг/β; L, аликвоту и хранить при -20°С; С
разбавления D

Ссылки

  1. Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. Organoids-on-a-chip. Science. 364 (6444), 960-965 (2019).
  2. Takebe, T., Wells, J. M. Organoids by design. Science. 364 (6444), 956-959 (2019).
  3. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3d tissue physiology in vitro. Nat Rev Mol Cell Bio. 7 (3), 211-224 (2006).
  4. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  5. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3d culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  6. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  7. Koike, H., et al. Modelling human hepato-biliary-pancreatic organogenesis from the foregut-midgut boundary. Nature. 574 (7776), 112-116 (2019).
  8. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  9. Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 26 (2), 215-224 (2008).
  10. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  11. Wimmer, R. A., Leopoldi, A., Aichinger, M., Kerjaschki, D., Penninger, J. M. Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 14 (11), 3082-3100 (2019).
  12. Wimmer, R. A., et al. Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy. Nature. 565 (7740), 505-510 (2019).
  13. He, S., et al. Mapping morphological malformation to genetic dysfunction in blood vessel organoids with 22q11.2 deletion syndrome. Biorxiv. , (2021).
  14. He, S., et al. Human vascular organoids with a mosaic akt1 mutation recapitulate proteus syndrome. Biorxiv. , (2024).
  15. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nat Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  16. Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS ONE. 3 (2), e1565(2008).
  17. Hwang, Y. -S., et al. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of wnt5a and wnt11. Proc Natl Acad Sci. 106 (40), 16978-16983 (2009).
  18. Antonchuk, J. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using aggrewell plates. Methods Mol Biol. 946, 523-533 (2013).
  19. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 783-791 (2012).
  20. Nishihara, H., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions. Star Protoc. 2 (2), 100563(2021).
  21. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Sci Adv. 3 (11), e1701679(2017).
  22. Stebbins, M. J., et al. Human pluripotent stem cell-derived brain pericyte-like cells induce blood-brain barrier properties. Sci Adv. 5 (3), eaau7375(2019).
  23. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  24. Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Engineered 3D vascular and neuronal networks in a microfluidic platform. Sci Rep. 8 (1), 5168(2018).
  25. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Sci Adv. 4 (10), eaat5847(2018).
  26. Sakurai, Y., et al. A microengineered vascularized bleeding model that integrates the principal components of hemostasis. Nat Commun. 9 (1), 509(2018).
  27. Kim, J., et al. Engineering of a biomimetic pericyte-covered 3d microvascular network. PLoS ONE. 10 (7), e0133880(2015).
  28. Kosyakova, N., et al. Differential functional roles of fibroblasts and pericytes in the formation of tissue-engineered microvascular networks in vitro. Biorxiv. , (2019).
  29. Whisler, J. A., Chen, M. B., Kamm, R. D. Control of perfusable microvascular network morphology using a multiculture microfluidic system. Tissue Eng Part C Methods. 20 (7), 543-552 (2013).
  30. Haase, K., Kamm, R. D. Advances in on-chip vascularization. Regen Med. 12 (3), 285-302 (2017).
  31. Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic models of vascular functions. Annu Rev Biomed Eng. 14 (1), 205-230 (2012).
  32. Boerckel, J. D., Uhrig, B. A., Willett, N. J., Huebsch, N., Guldberg, R. E. Mechanical regulation of vascular growth and tissue regeneration in vivo. Proc Natl Acad Sci. 108 (37), E674-E680 (2011).
  33. Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nat Methods. 16 (3), 255(2019).
  34. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Сосудистые органоидыиндуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) человекадифференцировка органоидовкультивирование в микролункахкоктейль CEPT3D-иммунофлуоресценцияпросветление тканейплоскостная световая микроскопиямоделирование заболеваний
Генерация сосудистых органоидов из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.