Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Раскрытие переноса ксенобиотиков и их эффектов в изолированных митохондриях: результаты респирометрических и ферментативных анализов

1.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67146

⸱

7 марта 2025 г.

 ,  , 
1Grupo de Investigación en Bioquímica y Microbiología (GIBIM), Escuela de Química, Universidad Industrial de Santander, 2Centro de Investigaciones en Enfermedades Tropicales - Cintrop. Escuela de Medicina, Departamento de Ciencias Básicas, Universidad Industrial de Santander, Parque Tecnológico y de Investigaciones Guatiguará Km 2 El Refugio Piedecuesta

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании представлена методология изучения влияния ксенобиотиков на функцию митохондрий с помощью респирометрических и ферментативных анализов. В нем рассматривается модуляция электронно-транспортной цепи у различных видов, что дает представление о целенаправленной разработке биопестицидов против трансмиссивных болезней насекомых.

Аннотация

Митохондрии часто называют электростанцией клетки из-за их решающей роли в производстве энергии через цепь переноса электронов (ETC). Однако их значение выходит далеко за рамки производства энергии. Нарушение регуляции митохондриальной биоэнергетики может вызвать внутриклеточные каскады, которые влияют на здоровье и функцию клеток. Учитывая их физиологическую важность, растет интерес к изучению фармакологического потенциала функции митохондрий для разработки новых методов лечения и биопродуктов. Модуляция митохондриальной биоэнергетики может обеспечить инновационные подходы к решению таких проблем, как нейродегенеративные расстройства, метаболические заболевания и рак, а также к разработке биопродуктов для борьбы с вредителями и трансмиссивными болезнями.

В данной работе представлен метод оценки влияния ксенобиотиков на электронно-транспортную цепь (ЭТЦ) с использованием различных субстратов, включая глутамат и НАДН для комплекса I, сукцинат для комплекса II и цитохром с (как окисленный, так и восстановленный) для комплексов III и IV. Эта методология позволяет оценить активацию или ингибирование транспорта электронов через митохондриальные комплексы с помощью респирометра и спектрофотометра. Митохондрии могут быть получены из изолированных митохондрий, фрагментированных клеток или гомогенизированных тканей различных видов.

В лабораторных условиях митохондриальная функция была проанализирована у крыс Aedes aegypti и Wistar, но этот метод применим и к другим видам, таким как Rhipicephalus microplus и Rhodnius prolixus. Этот подход обеспечивает основу для теоретизирования о существовании развязывающихся белков и видоспецифичных предпочтений окисляемого субстрата под влиянием их уникальных энергетических потребностей. Последние результаты дают ценную информацию об инновационных стратегиях разработки биоинсектицидов, которые нацелены на функцию митохондрий и обладают значительным потенциалом для эффективной борьбы с трансмиссивными болезнями и заражением вредителями.

Введение

Митохондрии всегда называли электростанцией клеток из-за выработки ими химической энергии в процессе окислительного фосфорилирования 1,2. Помимо своих основных метаболических функций, митохондрии также участвуют во многих других клеточных процессах, начиная от внутриклеточного уровня регуляцииCa2+, воспалительных процессов и производства активных форм кислорода до процессов индукции клеточной смерти. Митохондриальная биоэнергетика и ее нарушение регуляции связаны с внутриклеточными процессами, которые влияют на клеточную функцию и общее состояние здоровья. Это вызвало растущий интерес к исследованию фармацевтического потенциала нацеливания на митохондриальную функцию для разработки инновационных методов лечения и безопасных биопродуктов 4,5,6. Кроме того, понимание сложного взаимодействия митохондриальных процессов и их влияния на клеточную функцию имеет решающее значение для разработки таргетной терапии и предоставления возможностей для разработки биопродуктов для борьбы с трансмиссивными болезнями и заражением вредителями 7,8.

Нацеливание ксенобиотиков на определенные компоненты электронно-транспортной цепи стало стратегией модуляции функции митохондрий для производства биопестицидов. Было показано, что природные и синтетические соединения, входящие в состав пестицидов, такие как пестициды, нацеленные на митохондрии на основе наночастиц, влияют на функцию митохондрий путем снижения митохондриального потенциала и синтеза АТФ у S. frugiperda9.

Кроме того, большинство карбаматов и продуктов на основе пиретроидов были зарегистрированы как комплексные ингибиторы I у комаров; тем не менее, их длительное воздействие создало некоторые устойчивые к пиретроидам популяции у Anopheles gambiae, часто связанные с повышенными уровнями P450, которые могут метаболизировать эти субстраты10,11. Аналогичным образом, растения и их эфирные масла, экстракты и вторичные метаболиты были задокументированы как потенциальные инсектициды, обладающие широким диапазоном смертности на различных стадиях развития насекомых12,13. Инсектицидная активность этих природных соединений может быть связана с ингибированием транспорта электронов в определенной точке митохондриальной дыхательной цепи путем модуляции продукции активных форм кислорода, митохондриального потенциала ΔΨm и синтеза АТФ, которые могут запускать процессы гибели клеток 6,8.

Природные соединения в качестве источников для разработки пестицидов и их воздействие на митохондрии играют решающую роль в разработке новых и безопасных биопестицидов. В этом контексте в данной рукописи описывается методология определения способности ксенобиотиков активировать или ингибировать транспорт электронов через митохондриальные комплексы. Этот комплексный подход позволяет точно измерить влияние ксенобиотиков на функцию митохондрий с использованием различных субстратов с использованием методов респирометрии и спектрофотометрии. Эта методология была применена для анализа митохондриальной функции ключевых видов переносчиков, включая Aedes aegypti, что привело к теоретическому обоснованию наличия развязывающихся белков и различных предпочтений окисляемого субстрата, специфичных для каждого вида.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все методы, описанные в настоящем протоколе, были одобрены Комитетом по этике "Comité de ética en investigación científica CEINCI": Комитетом по этике научных исследований Индустриального университета Сантандера. Кроме того, эти анализы соответствовали руководящим принципам Arrive, а также Колумбийскому закону 1989 года No 84 (глава IV, статьи 23-26) и резолюции 8430 (1993 г., раздел IV, ст. 83-93), которые регулируют исследования на животных в Колумбии.

ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется прочитать главу об окислительном фосфорилировании в любой книге по биохимии перед началом работы по этому протоколу.

1. Реагенты и растворы

  1. Чтобы изолировать митохондрии печени крыс, приготовьте 250 мл изолирующего буфера для митохондрий: 250 мМ D-маннитола, 10 мМ HEPES pH 7,2 и 1 мМ EGTA. Выньте 50 мл изоляционного буфера (это будет называться изоляционным буфером без BSA), а затем добавьте 0,2 г BSA к остальным 200 мл (это будет называться изоляционным буфером с BSA).
  2. Для гомогенизации личинок Aedes aegypti готовят 100 мл буфера: 250 мМ сахарозы, 10 мМ HEPES, 1 мМ EGTA pH 7,2.
  3. Приготовьте реакционный буфер: 80 мМ буферный раствор фосфата натрия, pH 7,4, 50 мкМ ЭДТА.
  4. Подготовьте запас реагентов, используемых для ферментативной активности при pH 7,2, как описано ниже: 25 мМ NADH (свежеприготовленный для каждого анализа), 2 М сукцинат натрия, 4 мМ цитохрома c (свежеприготовленный для каждого анализа), 200 мкМ ротенон, 0,5 мМ KCN, 6 мМ 2,6-дихлорфенолиндофенол (DCPIP), 100 мМ феназинамесульфата (PMS) и 60 мМ феррицианида калия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех экспериментов и приготовления реагентов использовалась сверхчистая вода с удельным сопротивлением 18,2 МОм·см при 25 °С. Эта вода была получена с использованием системы очистки Milli-Q, обеспечивающей удаление органических, неорганических и микробных загрязнителей до уровней ниже обнаруживаемых пределов, что делает ее пригодной для высокочувствительных биохимических и молекулярных биологических применений.

2. Диссекция печени, гомогенизация и выделение митохондрий из печени крыс

  1. Прежде чем начать, поместите все материалы и буферы на лед, убедившись, что все материалы охлаждены в течение всего анализа, чтобы избежать повреждения митохондрий.
  2. Поместите 10 мл изолирующего буфера митохондрий в ледяную коническую трубку.
  3. Усыпьте самца крысы Вистар путем обезглавливания шейки матки, избегая использования CO2 , который может помешать анализу дыхания. Для этого Комитет по этике в научных исследованиях Индустриального университета Сантандера (CEINCI) утвердил методики резолюции 13 от 2022 года.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крысы должны весить не более 170 г; Жир также может влиять на анализ дыхания.
  4. Сделайте надрез (примерно 4-5 см) стерильным скальпелем через брюшную часть крысы.
  5. Полностью рассеките печень, как только станет видна область живота. Печень крысы представляет собой многодольчатый орган, темно-красного цвета примерно 10 см х 5 см.
  6. Осторожно поместите печень в ледяной изолирующий буфер и дважды промойте этой средой.
  7. Печень (размером менее 1 см) мелко пропустить через мясорубку острыми ножницами в чашке Петри с 10 мл изоляционной среды.
  8. Налейте раствор в пробирку тканевого гомогенизатора Potter Elvehjem и тщательно гомогенизируйте не менее десяти раз с низкой скоростью (~390 об/мин).
  9. Перелейте раствор в коническую пробирку и центрифугируйте при температуре 600 x g в течение 10 минут при температуре 4 °C.
  10. После центрифугирования осторожно перелейте надосадочную жидкость в новую коническую пробирку. Выбросьте гранулу вместе с частью ткани, кровью и неповрежденными клеточными компонентами.
  11. Заполните пробирку большим количеством изоляционного буфера (~35 мл) и центрифугируйте при 6000 x g в течение 10 минут при 4 °C.
  12. После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость и осторожно ресуспендируйте гранулу (митохондрии) в новом изоляционном буфере без БСА.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для ресуспензии митохондрий рекомендуется использовать мягкую щетку.
  13. Затем центрифугируйте при 7000 x g в течение 10 мин при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте изолированные митохондрии в 2 мл изоляционного буфера без BSA.
  14. Определите концентрацию белка с помощью метода Брэдфорда или аналогичного14.

3. Гомогенизация колонии и личинок Aedes aegypti .

Примечание: Для этой процедуры колонию Ae. aegypti содержали в клетках для разведения (40 см × 40 см × 40 см) в таких условиях, как влажность (70% ± 5%), фотопериод (12:12) и температура (27 ± 5 °C). Яйца собирали на фильтровальной бумаге.

  1. Убедитесь, что яйца вылупляются в лотках с фильтрованной и дехлорированной водой за неделю до эксперимента. Определите возраст по процессу линьки в цикле личинок. Наблюдайте за каждым процессом линьки, чтобы убедиться в его статусе L1, L2 и L3. Когда личинка попадет в L3, подождите максимум 12 часов, чтобы собрать материал.
  2. Соберите не менее 100 личинок Ae. aegypti в возрасте L3-L4 в воде, не содержащей хлора (~30 мл воды). Возьмите личинок с помощью пастеровской пипетки.
  3. Отфильтруйте личинок с помощью фильтровальной бумаги, промойте собранных личинок и снова суспендируйте их в буфере для гомогенизации Aedes aegypti (~2 мл).
  4. Перелейте раствор с личинками в пробирку для тканевого гомогенизатора Potter Elvehjem и тщательно гомогенизируйте не менее десяти раз при ~390 об/мин.
  5. Перенесите гомогенизированную ткань и отфильтруйте ее через шприц из стекловаты, чтобы удалить крупные остатки экзоскелета.
  6. Определите концентрацию белка с помощью метода Брэдфорда или аналогичногометода 15.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости изолировать митохондрии от личинок комаров; Оценить действие ксенобиотиков можно с помощью полученного на этом этапе белкового экстракта.

4. Определение влияния ксенобиотиков на митохондриальную цепь переноса электронов

Примечание: Этот протокол был разработан для оценки влияния ксенобиотиков на биоэнергетику митохондрий на изолированные митохондрии из гомогенизированной печени крыс и тканей насекомых.

Анализы разделены на два: полярографический (НАДН и сукцинатоксидаза) и спектрофотометрический (НАДН дегидрогеназа - комплекс I, сукцинатдегидрогеназа - комплекс II, цитохром с редуктаза - комплекс III и цитохром с оксидаза - комплекс IV).

  1. Полярографические анализы: Для этого используйте респирометрию высокого разрешения для измерения полного окисления NADH и сукцината при потребленииO2 и сообщайте о результатах в виде NADH и сукцинатоксидазы.
    1. Калибруйте прибор каждый день перед началом анализов. Этот шаг может варьироваться в зависимости от используемого оксиграфа. Следуйте инструкциям производителя.
      1. Для калибровки по Ороборосу в камеры добавляют реакционную среду с превышением не менее чем на 0,2 мл сверх объема экспериментальной камеры (2 мл), для заполнения камеры и инжекционного капилляра средой.
    2. Включите мешалки после среднего добавления.
    3. Подождите, пока сигнал концентрации кислорода стабилизируется, и запишите его.
    4. Для калибровки без кислорода добавьте митохондрии, клеточные суспензии, пекарские дрожжи или дитионит (рекомендуется использовать пекарские дрожжи), которые обеспечивают истощение кислорода, и запишите это. Подождите, пока сигнал достигнет фоновых уровней (обычно ± 2 пмоль/мл/с для системы O2k).
    5. Выполняйте активность НАДН и сукцинатоксидазы, контролируя потребление кислорода при добавлении в камеру реакционного буфера, 0,1 мг белка (гомогенизированного митохондриального или личиночного) и субстрата (0,17 мМ НАДН или 10 мМ сукцината натрия).
    6. Используйте ингибиторы белка переноса электронов, чтобы подтвердить, что наблюдаемое потребление кислорода обусловлено митохондриальной дыхательной цепью. Наиболее распространенными из них являются ротенон 1 мкМ и KCN 1 мМ16. В ячейку оксиграфа добавьте реактивы согласно таблице 1 (важна последовательность).
  2. Спектрофотометрические анализы
    Примечание: Для оценки переноса электронов через митохондриальные комплексы были проведены ферментативные анализы, которые были измерены с использованием спектрофотометра и искусственных акцепторов электронов, таких как PMS, DCPIP и цитохром с. Рекомендуется измерять по одному ферменту в день. Подготовьте буферы и реагенты не менее чем за сутки до проведения анализов. Некоторые соединения являются светочувствительными; видеть Таблица 2 для получения дополнительных рекомендаций.
    1. Для активности НАДН дегидрогеназы реакционные системы содержат 50 мМ фосфатного буферного раствора pH 7,4, 2 мМ ЭДТА, 0,1 мг/мл митохондриального белка, 1 мкМ ротенона и 1 мМ KCN. В ячейку спектрофотометра добавьте реагенты в соответствии с таблицей 2 (последовательность важна)17. Рекомендуемые шаги следующие:
      1. Приготовьте 100 мл буферного фосфата, смешанного с ЭДТА, и убедитесь, что pH не изменяется. Храните буфер в холодильнике, но обязательно держите его при комнатной температуре (RT; примерно 25 °C) во время анализов.
      2. Приготовьте свежие исходные растворы ротенона, KCN, NADH и феррицианида калия (стабильно до 4 ч). Рекомендуемый объем составляет 1 мл концентрированных растворов (см. первую колонку таблицы).
      3. Если испытуемое соединение имеет низкую растворимость в воде, включите в экспериментальный план дополнительный контроль активности фермента с использованием только растворителя соединения.
      4. Во-первых, контролируют активность дегидрогеназы NADH путем восстановления феррицианида калия при 420 нм. Рассчитайте его концентрацию по коэффициенту затухания моляров, равному 1,04 мМ-1·см-1. Спектрофотометр имеет возможность расчета максимальной активности в реакции; Обратитесь к руководству пользователя. Затем разделите зарегистрированную активность на концентрацию белка, используемого для получения специфической активности фермента.
    2. Оценить активность сукцинатдегидрогеназы путем добавления 20 мМ сукцината натрия и 1 мМ феназина-метосульфата (PMS) с 60 мкМ 2,6-дихлорфенолиндофенолом (DCPIP) в качестве искусственных акцепторов электронов. В ячейку спектрофотометра добавьте реактивы в соответствии с таблицей 3 (последовательность важна)17. Рекомендации заключаются в следующем:
      1. Приготовьте тот же буфер, который используется для НАДН-дегидрогеназы. Поддерживайте его в прежних условиях.
      2. Приготовьте свежие исходные растворы Сукцината, PMS и DCPIP. Рекомендуемый объем – 1 мл концентрированных растворов. Приготовьте растворы PMS и DCPIP в день проведения анализа.
      3. Если испытуемое соединение имеет низкую растворимость в воде, включите в экспериментальный дизайн дополнительный контроль активности фермента.
      4. Контролируйте окисление сукцината путем восстановления DCPIP при 600 нм. Рассчитайте его концентрацию по коэффициенту молярного затухания, равному 21,0 мМ−1·см−1, применяя закон Бира. Затем разделите зарегистрированную активность на концентрацию белка, используемого для получения специфической активности фермента.
    3. Измерьте активность цитохром с-редуктазы (комплекс III) с использованием НАДН или сукцината в качестве окисляемых субстратов. С помощью этого фермента транспорт электронов из комплекса I (с использованием NADH) или комплекса II (с использованием сукцината) переходит в убихинон, а затем в комплекс III, который передает электроны цитохрому с. За этой реакцией следует восстановление цитохрома с. Готовят реакционную систему, содержащую 50 мМ фосфатного буферного раствора pH 7,4, 2 мМ ЭДТА, 0,1 мг митохондриального белка, 50 мкМ НАДН и 0,1 мМ KCN. В ячейку спектрофотометра добавьте реактивы в соответствии с таблицей 4 (важна последовательность)18. Рекомендации заключаются в следующем:
      1. Приготовьте тот же буфер, который используется для НАДН-дегидрогеназы. Поддерживайте его в прежних условиях.
      2. Используйте те же NADH и KCN из NADH дегидрогеназы.
      3. Если испытуемое соединение имеет низкую растворимость в воде, включите в экспериментальный дизайн дополнительный контроль активности фермента.
      4. Отслеживайте восстановление цитохрома с при длине волны 550 нм и рассчитывайте его концентрацию по коэффициенту молярного угасания 19,8 мМ-1·см-1, применяя закон Бира. Затем разделите зарегистрированную активность на концентрацию белка, используемого для получения специфической активности фермента.
    4. Измерьте цитохром с оксидазу (комплекс IV), экспрессирующуюся как активность цитохром с оксидазы. Для этого готовят системную реакцию, содержащую 50 мМ фосфатного буферного раствора, рН 7,4, 2 мМ ЭДТА и 0,1 мг митохондриального белка (табл. 5). Для этих ферментативных анализов снижение цитохрома с путем смешивания эквимолярных количеств цитохрома с и дитионита натрия, что обеспечивает полное восстановление цитохрома с.
    5. Затем пропустите полученную смесь через колонку с сшитым декстраном, используя тот же фосфатно-буферный раствор, что и подвижная фаза. Впоследствии количественно оценить собранные фракции с помощью спектрофотометра при длине волны 550 нм19. Рекомендации заключаются в следующем:
      1. Используйте тот же буфер, который используется для NADH дегидрогеназы. Поддерживайте его в прежних условиях.
      2. Если испытуемое соединение имеет низкую растворимость в воде, в план эксперимента следует включить дополнительный контроль активности фермента.
      3. Отслеживайте окисление цитохрома с при длине волны 550 нм и рассчитывайте его концентрацию по коэффициенту молярного экстинкции 19,8 мМ-1·см-1, применяя закон Бира. Затем разделите зарегистрированную активность на концентрацию белка, используемого для получения специфической активности фермента.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Файл электронной таблицы, показывающий процесс расчета удельной активности ферментов, измеренной с помощью потребления кислорода и спектрофотометрии, включен в качестве дополнительного файла 1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Прежде чем анализировать результаты, полученные с помощью этого протокола, важно немного вспомнить о биохимии цепи переноса электронов в митохондриях. Во-первых, NADH поставляет пару электронов в окислительно-восстановительные центры, расположенные в комплексе I. Там начинается транспортировка электронов, которые переходят из комплекса I в убихинон, затем в комплекс III, который отдает их цитохрому с, и, наконец, в комплекс IV, где кислород является конечным акцептором электронов, восстанавливая его до воды. С другой сто...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Для изучения влияния ксенобиотиков на функцию митохондрий был использован спектрофотометрический и полярографический метод с высоким разрешениемО2. В исследовании, в частности, оценивалось влияние эфирного масла и карвакрола Cymbopogon flexuosus на окисление NADH и сукцината, а также на транспорт электронов через митохондриальную цепь переноса электронов, используя две различные биологические модели: изолированные митохондрии из печени крысы и гомогенизированные личин...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Все авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

Авторы благодарят "Vicerrectoría de Investigación y Extensión VIE" Промышленного университета Сантандера за финансирование гранта No 3739, соответствующего проекту "Разработка иксодицида и иксорепеллента, разработанная в лаборатории и проверенная в полевых условиях, для предотвращения заражения клещами крупного рогатого скота".

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2,6-дихлорфенолиндофенолMerck119814приготовить в тот же день применения.
Брэдфордский реактивMerckB6916
BSA MerckA7030
CarvacrolMerckW224511
цитохром cMerckC2506Светочувствительный конвер покрыть его алюминиевой фольгой. В растворе его следует хранить в морозильной камере.
D-маннитMerckM4125
EGTAMerck>E3889
Этилендиаминтетрауксусная кислота дигидрат тетранатриевой солиMerckE6511
HEPESMerckH3375
KCNMerck60178В растворе действует в течение 2 недель.
KH2PO4MerckP5655
Multiskan FC Микропланшетный фотометрThermo Scientific 
Na2HPO4Merck567550
Oroboros O2k Oroboros Instruments10203-03https://www.oroboros.at/index.php/product/o2k-startup/
Феназин метосульфат MerckP9625Приготовьте в тот же день использования.
Феррицианид калия Merck244023Prepare в тот же день использования.
Гомогенизатор тканей Potter Elvehjem туба
RotenoneMerck557368растворим в этаноле. Светочувствительный конус накройте его алюминиевой фольгой. В растворе его следует хранить в морозильной камере.
Сукцинат натрияMerckS9637В растворе его следует хранить в морозильной камере.
СахарозаMerckS0389
β-никотинамидадениндинуклеотид, восстановленный гидрат динатриевой солиMerckN8129Светочувствительный конуфер покройте его алюминиевой фольгой. В растворе его следует хранить в морозильной камере.
51119100

Ссылки

  1. Javadov, S., Kozlov, A. V., Camara, A. K. S. Mitochondria in health and diseases. Cells. 9 (5), 1177(2020).
  2. Kummer, E., Ban, N. Mechanisms and regulation of protein synthesis in mitochondria. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (5), 307-325 (2021).
  3. Bock, F. J., Tait, S. W. G. Mitochondria as multifaceted regulators of cell death. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (2), 85-100 (2019).
  4. Fulda, S., Galluzzi, L., Kroemer, G. Targeting mitochondria for cancer therapy. Nat Rev Drug Discov. 9 (6), 447-464 (2010).
  5. Liu, Y., Shi, Y. Mitochondria as a target in cancer treatment. MedComm. 1 (2), 129-139 (2020).
  6. Duque, J. E., et al. Insecticidal activity of essential oils from American native plants against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae): an introduction to their possible mechanism of action. Sci Rep. 13 (1), 2989(2023).
  7. Kesari, K. K., et al. Plant-derived natural biomolecule picein attenuates Menadione induced oxidative stress on neuroblastoma cell mitochondria. Antioxidants (Basel, Switzerland). 9 (6), 552(2020).
  8. Vanegas-Estévez, T., Duque, F. M., Urbina, D. L., Vesga, L. C., Mendez-Sanchez, S. C., Duque, J. E. Design and elucidation of an insecticide from natural compounds targeting mitochondrial proteins of Aedes aegypti. Pestic Biochem Physiol. 198, 105721(2024).
  9. Hao, Y., et al. Mitochondria-targeted nanocarriers doubled the toxicity of oxidative phosphorylation and ATP synthesis disruptive insecticides against Spodoptera frugiperda. Environ Sci Nano. 9 (10), 3873-3884 (2022).
  10. Lees, R. S., et al. New insecticide screening platforms indicate that Mitochondrial Complex I inhibitors are susceptible to cross-resistance by mosquito P450s that metabolise pyrethroids. Sci Rep. 10 (1), 16232(2020).
  11. Leung, M. C. K., Meyer, J. N. Mitochondria as a target of organophosphate and carbamate pesticides: Revisiting common mechanisms of action with new approach methodologies. Reprod Toxicol. 89, 83-92 (2019).
  12. Al-Harbi, N. A., et al. Evaluation of insecticidal effects of plants essential oils extracted from basil, black seeds and lavender against Sitophilus oryzae. Plants. 10 (5), 829(2021).
  13. Kim, S. -I., Roh, J. -Y., Kim, D. -H., Lee, H. -S., Ahn, Y. -J. Insecticidal activities of aromatic plant extracts and essential oils against Sitophilus oryzae and Callosobruchus chinensis. J Stored Prod Res. 39 (3), 293-303 (2003).
  14. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Bradford assay for determining protein concentration. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (4), 102269(2020).
  15. Zor, T., Selinger, Z. Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies. Anal Biochem. 236 (2), 302-308 (1996).
  16. Voss, D. O., Campello, A. P., Bacila, M. The respiratory chain and the oxidative phosphorylation of rat brain mitochondria. Biochem Biophys Res Commun. 4, 48-51 (1961).
  17. Gonçalves, M. J., et al. Composition and biological activity of the essential oil from Thapsia minor, a new source of geranyl acetate. Ind Crops Prod. 35 (1), 166-171 (2012).
  18. Somlo, M. Induction des lactico-cytochrome c reductases (d-et l-) de la levure aerobie par les lactates (d- et l). Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 97 (2), 183-201 (1965).
  19. Mason, T. L., Poyton, R. O., Wharton, D. C., Schatz, G. Cytochrome c Oxidase from Bakers' Yeast. J Biol Chem. 248 (4), 1346-1354 (1973).
  20. Nelson, D. L., Cox, M. Lehninger Principles of Biochemistry: International Edition. , Macmillan Learning. https://play.google.com/store/books/details?id=wZqp0AEACAAJ (2021).
  21. Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells. J Vis Exp. 120, e54985(2017).
  22. Maxwell, J. T., Tsai, C. -H., Mohiuddin, T. A., Kwong, J. Q. Analyses of mitochondrial calcium influx in isolated mitochondria and cultured cells. J Vis Exp. (134), e57225(2018).
  23. Vesga, L. C., Silva, A. M. P., Bernal, C. C., Mendez-Sánchez, S. C., Romero Bohórquez, A. R. Tetrahydroquinoline/4,5-dihydroisoxazole hybrids with a remarkable effect over mitochondrial bioenergetic metabolism on melanoma cell line B16F10. Med Chem Res. 30, 2127-2143 (2021).
  24. Vesga, L. C., Bueno, Y., Stashenko, E., Mendez Sánchez, S. C. Efecto del aceite esencial de Eucalyptus citriodora sobre el metabolismo energético mitocondrial. Rev Colomb Quím. 43 (2), 10-17 (2015).
  25. Borrero-Landazabal, M. A., Duque, J. E., Mendez-Sanchez, S. C. Model to design insecticides against Aedes aegypti using in silico and in vivo analysis of different pharmacological targets. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 229, 108664(2020).
  26. Valmas, N., Zuryn, S., Ebert, P. R. Mitochondrial uncouplers act synergistically with the fumigant phosphine to disrupt mitochondrial membrane potential and cause cell death. Toxicology. 252 (1-3), 33-39 (2008).
  27. Slocińska, M., Rosinski, G., Jarmuszkiewicz, W. Activation of mitochondrial uncoupling protein 4 and ATP-sensitive potassium channel cumulatively decreases superoxide production in insect mitochondria. Protein Pept Lett. 23 (1), 63-68 (2016).
  28. Borrero Landazabal, M. A., Carreño Otero, A. L., Kouznetsov, V. V., Duque Luna, J. E., Mendez-Sanchez, S. C. Alterations of mitochondrial electron transport chain and oxidative stress induced by alkaloid-like α-aminonitriles on Aedes aegypti larvae. Pestic Biochem Physiol. 144, 64-70 (2018).
  29. Castillo-Morales, R. M., Carreño Otero, A. L., Mendez-Sanchez, S. C., Da Silva, M. A. N., Stashenko, E. E., Duque, J. E. Mitochondrial affectation, DNA damage and AChE inhibition induced by Salvia officinalis essential oil on Aedes aegypti larvae. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 221, 29-37 (2019).
  30. Montagut, D. C., Bueno, Y., Vesga, L. C., Stashenko, E. E., Mendez-Sanchez, S. C. Cymbopogon flexuosus (nees ex steud.) w. watson essential oil effect on mitochondrial bioenergetics. J Essent Oil Res. 34 (3), 233-239 (2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Электронтранспортная цепьмитохондриальная биоэнергетикареспирометрический анализферментативный анализвыделение митохондрийпотребление кислородаактивность НАДН-дегидрогеназыцитохром-с-оксидаза
Раскрытие переноса ксенобиотиков и их эффектов в изолированных митохондриях: результаты респирометрических и ферментативных анализов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.