Методическая статья

Выделение хондроцитов и хондропрогениторов с помощью анализа адгезии фибронектина и миграции

DOI:

10.3791/67160

⸱

4 октября 2024 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Christian Medical College, 2Centre for Stem Cell Research (A unit of InStem, Bengaluru), Christian Medical College, 3Department of Orthopedics, Christian Medical College, 4Faculty of Health and Medical Sciences, The University of Adelaide, 5Department of Orthopedics and Trauma, Royal Adelaide Hospital

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе подробно описывается выделение хондроцитов, хондропрогениторов, полученных методом анализа адгезии фибронектина (FAA-CPs), и мигрирующих хондропрогениторов (MCP) из суставного хряща человека. Он охватывает ферментативное расщепление, адгезию фибронектина и анализы на основе миграции для выделения и характеристики этих клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хондропрогениторные клетки (КПК), недавно идентифицированные как отдельная субпопуляция, демонстрируют многообещающие перспективы благодаря своим мезенхимальным свойствам, повышенному хондрогенезу и ограниченным гипертрофическим признакам. Обогащение предшественников достигается за счет дифференциальной адгезии фибронектина и анализа эксплантов на основе миграции, при этом хондропрогениторы, полученные из анализа адгезии фибронектина (FAA-CP) и мигрирующие хондропрогениторы (MCP), демонстрируют превосходный потенциал по сравнению с хондроцитами. В этой статье подробно рассматривается вопрос выделения резидентных хрящевых клеток, а именно хондроцитов и хондропрогениторов. В то время как ценные выводы из исследований хондроцитов вносят вклад в наше понимание восстановления хряща, текущие усилия направлены на использование хондропрогениторов и изучение их потенциала в качестве альтернативного терапевтического подхода. Кроме того, в этой методологической статье представлен подробный пошаговый протокол выделения трех конкретных типов клеток из хряща: хондроцитов, FAA-CP и MCP. Следуя стандартизированным процедурам, этот протокол способствует успешной экстракции этих подтипов клеток. Основанная на обширных исследованиях, статья фокусируется на сложных методах, используемых для выделения различных подмножеств, и оптимизированных условиях культивирования, необходимых для расширения и поддержания их культур. Методология включает в себя ферментативное выделение хондроцитов, полученных из суставного хряща человека, дифференциальную адгезию фибронектина после последовательного ферментативного расщепления, а также анализ эксплантов на основе миграции для получения хрящевых резидентных клеток.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Появление клеточной регенеративной терапии представляет собой важный подход к лечению заболеваний, связанных с хрящевой тканью, таких как остеоартрит (ОА) и хондральныедефекты. Эти заболевания, характеризующиеся разрывом или повреждением хряща в суставах, представляют собой значительные трудности во время лечения. Сообщается, что самовосстановление суставного хряща ограничено из-за его анейронной архитектуры, аваскулярности и низкой митотической активности2.

Наиболее часто используемыми клетками для регенерации хрящевой ткани являются мезенхимальные стволовые клетки (МСК) и хондроциты3. Тем не менее, в нескольких исследованиях сообщалось об ограничениях в использовании этих клеток длярегенерации4. Эти ограничения включают терминальную дифференцировку хондроцитов во время расширенной экспансии in vitro для достижения необходимого количества клеток и гипертрофическую тенденцию МСК. Эти факторы могут привести к образованию восстановительной ткани с неоптимальным сочетанием фиброзного хряща и гиалина 5,6,7,8.

Открытие хондропрогениторных клеток (КПК) стало результатом поиска альтернативных клеток в суставном хряще9. Они вызвали огромный интерес благодаря своему сходству с МСК и их превосходному хондрогенному потенциалу, при этом демонстрируя сниженную гипертрофию - незаменимую комбинацию, которую ищут10,11. В отличие от хондроцитов, эти популяции предшественников, как сообщается, демонстрируют повышенную репликативную и теломеразную активность, а также повышенную экспрессию нейрогенного локуса гомологического белка 1 (NOTCH-1) и SRY-боксового фактора транскрипции 9 (SOX-9)12,13,14,15. Существует два стандартных метода выделения ЦПК как из хряща, так и из мениска, в том числе один, основанный на экспрессии их интегриновых рецепторов (CD49e/CD29), выделенных с помощью анализа адгезии фибронектина - хондропрогениторы, полученные из фибронектиновой адгезии (FAA-CPs), и другой, основанный на их повышенном миграционном потенциале из хрящевых эксплантов - мигрирующие хондропрогениторы (МКП)11,13,16,17,18,19. Многочисленные исследования in vitro демонстрируют хондрогенное превосходство и сниженную гипертрофию как FAA-CPCs, так и MCP по сравнению с хондроцитами и костным мозгом (BM)-MSCs 20,21,22,23.

Недавние исследования in vitro, сравнивающие FAA-CPC с MCP, продемонстрировали повышенную способность к регенерации хряща у последней популяции предшественников при нормальных кислородных условиях24. Эти оптимистичные результаты in vitro демонстрируют гиалиноподобную регенерацию, что способствует дальнейшим экспериментам in vivo. Тем не менее, сообщалось, что обе популяции ЦПК эффективно восстанавливают и регенерируют хрящ при остеоартрите и других остеохондральных заболеваниях на животных моделях 25,26,27,28,29.

Наша лаборатория активно участвовала в стандартизации методик выделения ЦПК и сравнении их фенотипических характеристик с хондроцитами и МСК. В этой статье будет представлен подробный протокол, объясняющий шаги, связанные с выделением и культивированием резидентных клеток хряща, а именно хондроцитов, FAA-CPC и MCP.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол утвержден и соответствует соответствующим правилам и рекомендациям Институционального наблюдательного совета (Комитета по исследованиям и этике). После получения письменного информированного согласия берцово-бедренные суставы человека приобретаются у пациентов с остеоартритом (ОА) (радиологическая оценка Келлгрена-Лоуренса 4)30 , которым требуется полная замена коленного сустава в рамках их лечения. Суставы пациентов с любыми признаками опухолей, инфекций или воспалительного артрита (таких как ревматоидный артрит или подагра) были исключены из исследования. Гарантируется, что все процедуры проводятся в стерильных условиях, с соблюдением стандартных лабораторных протоколов на протяжении всего экспериментального процесса.

1. Получение большеберцово-бедренных суставов

  1. Получить коленные суставы (большеберцово-бедренные суставы) от доноров, которым требуется ампутация выше колена в рамках лечения, или у пациентов с остеоартритом IV степени30 (рентгенологические данные, показывающие заметное уменьшение суставной щели при хондральном склерозе), перенесших тотальную замену коленного сустава.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечить получение информированного согласия от пациентов в соответствии с принципами Хельсинкской декларации. Обеспечить соблюдение правил Комитета по этике и Институционального наблюдательного совета.
  2. Исключите суставы с симптомами инфекции или воспаления.

2. Обработка заготовленных швов

  1. Поместите собранные большеберцово-бедренные суставы в 1x фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) в стерильных условиях.
  2. Подготовьте стерильную зону под капюшоном, поместив стерильную пеленку. Переложите заготовленные стыки на пеленку.
  3. Стабилизируйте рассекреченные большеберцово-бедренные суставы, удерживая субхондральную кость хрящом вверх.
  4. С помощью лезвия скальпеля (No 22) соберите хрящевую стружку прямоугольной формы из областей без нагрузки у пациентов с остеоартритом в течение 1-2 часов после получения сустава.
  5. Соберите участки хряща размером 8 мм x 10 мм от поверхностного слоя к более глубокому.
  6. Промойте срезы хряща 1x раствором PBS и поместите их в чашку Петри, содержащую 1-2 мл простой среды DMEM.
  7. Аккуратно измельчите ломтики хряща до размера менее 1 мм x 1 мм x 1 мм с помощью лезвия скальпеля (No 22).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы срезы хряща или измельченный хрящ не пересыхали; поместите их в питательную среду или PBS, лишенную сыворотки.

3. Выделение хондроцитов

  1. Поместите измельченный хрящ в вертикальную колбу T-25, содержащую 10 мл модифицированного Eagle Medium F12 от Dulbecco (DMEM-F12) с 0,15% коллагеназы типа II для ферментативного пищеварения. Оставьте колбу в покое на 12-14 ч в инкубаторе сСО2 , обеспечив стандартные условия культивирования31.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует использовать обычную среду DMEM-F12 без следов сыворотки, так как сыворотка инактивирует ферментативное действие.
  2. После ночного сбраживания переложите среду, содержащую высвобожденные клетки, в свежую стерильную центрифужную пробирку, содержащую равный объем DMEM-F12 + 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), используя клеточный фильтр для отделения клеток от мусора. Высвобождающиеся клетки являются «хондроцитами».
  3. Центрифугируйте отфильтрованные ячейки со скоростью 1200 x g в течение 5 минут при 37 °C.
  4. Выбросьте надосадочную жидкость, не потревожив гранулы. Восстановите полученную гранулу в 1 мл среды и подсчитайте высвобождаемые жизнеспособные клетки с помощью теста исключения трипанового синего.
  5. Загрузите хондроциты в колбу Т-25 в концентрации 10 000 клеток/см² и разверните до необходимого количества проходов с помощью DMEM-F12, содержащего 10% FBS. Дополнительные компоненты в среде включают аскорбиновую кислоту (62 мкг/мл), L-глутамин (2,5 мкм/л), пенициллин-стрептомицин (100 МЕ/мл) и амфотерицин-B (2 мкг/мл).
  6. Обновляйте среду каждые 3 дня и собирайте клетки в момент субслияния, используя 0,125% трипсин, содержащий этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА).

4. Выделение хондропрогениторов, полученных из анализа адгезии фибронектина (FAA-CPs)

  1. За 12 ч до высвобождения хондроцитов приготовьте 10 мл 1x PBS, содержащего 1 мМ MgCl2( 10 мкл) и 1 мМ CaCl2 (10 мкл), а также 100 мкл фибронектина (10 мкл/мл)32.
  2. Покрыть необходимое количество лунок 6-луночным планшетом (1,5 мл/9,3 см2 ) приготовленным раствором.
  3. Плотно закройте тарелку и поставьте в холодильник на ночь при температуре 4 °C.
  4. Кроме того, получите хрящевую стружку способом, аналогичным описанному для выделения хондроцитов (шаги 2.1-2.5).
  5. Подвергают хрящевую стружку последовательному ферментативному разложению в течение ночи (0,2% проназы в течение 3 ч; затем 0,04% коллагеназы II типа в течение 12 ч) в встряхивающей водяной бане, поддерживаемой при температуре 37 °С, для получения отдельных хондроцитов.
  6. На следующий день достаньте из холодильника 6-луночную пластину, покрытую фибронектином, и удалите излишки фибронектина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избыток фибронектина следует удалять медленно и осторожно, не нарушая покрытие на дне колодца. Присутствие MgCl2 (10 мкл) и 1 мМ CaCl2 имеет решающее значение для обеспечения прикрепления клеток.
  7. Добавьте в лунки с покрытием 2-3 мл обычной среды DMEM-F12.
  8. Высвободившиеся хондроциты засейте в лунки с покрытием при плотности загрузки 4000 клеток/лунку и оставьте планшет в покое на период 20 минут.
  9. После инкубации удалите излишки среды и неадгезивные клетки. Добавьте 2-3 мл стандартной питательной среды, используемой для хондроцитов (DMEM-F12 + 10% FBS).
  10. Сохраняют адгезивные клетки в стандартных условиях культивирования в течение 10-12 дней для получения клонов CPC (колонии >32 клеток).
  11. Изолируют с использованием 0,125% трипсина-ЭДТА в течение 180 с, повторно наклеивают клоны в соотношении 1 клон/5 см² и расширяют обогащенные поликлональные ЦП до требуемого слияния. Полученные элементы называются «FAA-CPC».
  12. Далее культивируют клетки в среде DMEM-F12 + 10% FBS + трансформирующий фактор роста бета 2 (TGFβ2: 1 нг/мл) + фактор роста фибробластов (FGF2: 5 нг/мл).
    Примечание: Инкубация клеток на пластинах, покрытых фибронектином, не должна превышать 20 минут, так как хондроциты также могут начать склеиваться. В течение 20-минутного периода адгезии средство должно быть лишено сыворотки. Далее клетки, которые прилипают к форме клонов, должны быть культивированы в среде, дополнительно содержащей FBS. Клоны должны быть изолированы только после того, как убедится, что каждый клон имеет более 32 клеток; Это необходимо для того, чтобы избежать транзитных усилителей. Дальнейшая экспансия клонов после трипсинизации должна включать упомянутые дополнительные факторы роста. Плотность загрузки 4000 хондроцитов/9,3см2 пластины, покрытой фибронектином, после 20-минутной инкубации с последующей промывкой приводит к адгезии в общей сложности 80-100 клеток. Из них около 20 клонов будут развиваться и достигнут удвоения популяции на 5 в течение 10-12 дней.

5. Выделение мигрирующих хондропрогениторов

  1. Выбрейте экспланты хрящевой ткани (10 мм x 5 мм x 1 мм) из собранного суставного сустава и поместите их в стерильную 6-луночную пластину, содержащую среду DMEM-F12 с 10% FBS и 10 мМ глутамакс (2-3 экспланта/лунка)33.
  2. Оставьте планшет с эксплантами в покое на 48 часов в инкубаторе сCO2 при температуре 37 °C.
  3. Через 2 дня переложите экспланты в центрифужную пробирку, содержащую 10 мл 0,1% раствора коллагеназы для ферментативного расщепления. Инкубируйте пробирку при 37 °C в течение 2 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Экспланты необходимо промыть 1x PBS перед ферментативным перевариванием, так как следы сыворотки могут инактивировать действие фермента. Для промывки опустите экспланты в чашку Петри, наполненную 2-3 мл 1x PBS; Это также необходимо для обеспечения неконтаминации любыми высвобождающимися хондроцитами. Обращение с эксплантами должно быть сведено к минимуму, и это необходимо для того, чтобы не подвергать стрессу предшественников, которые начали мигрировать.
  4. После разложения промойте экспланты с помощью 1x PBS и поместите их обратно в те же лунки планшета, где содержится свежая среда DMEM-F12 с 10% FBS и 10 мМ среды Glutamax.
  5. Выдерживают тарелку в стандартных условиях культуры в инкубаторе. Наблюдайте за миграцией хондропрогениторов в последующие дни.
  6. По достижении субслияния собирают МКП, используя 0,125% трипсина, содержащего ЭДТА.
  7. Расширяйте МКП с помощью стандартной расширяющей среды, в состав которой входит DMEM-F12, содержащая 10% FBS и 10 мМ глутамакса.

6. Фенотипическая характеристика хондроцитов, FAA-CP и MCP

  1. Проточный цитометрический анализ (FACS)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа с помощью FACS собранных групп клеток выполняются следующие шаги.
    1. Трипсинизируйте клетки в соответствии со стандартным протоколом с использованием 0,125% трипсина и центрифугируйте при 1200 x g, 5 мин, комнатной температуре, чтобы получить клеточную гранулу.
    2. Выбросьте надосадочную жидкость, промойте и снова суспендируйте гранулу с 1x PBS.
    3. Переложите суспензию в пробирки с маркировкой для FACS.
    4. Разделите суспензию поровну на две пробирки: «неокрашенную» пробирку, которая действует как контрольную (клеточная суспензия без антител), и «окрашенную» пробирку, которая действует как тест (клеточная суспензия с антителом).
    5. Следуйте техническому паспорту отдельных антител/маркеров кластера дифференцировки (CD) для окрашивания. Антитела для сравнения включают CD105-FITC, CD73-PE, CD90-PE, CD106-APC (маркеры положительной экспрессии); CD34-PE, CD45-FITC и CD14-FITC (маркеры отрицательной экспрессии)34,35; CD166-BB515 и CD146-PE (потенциальные хондрогенные маркеры)36,37.
      ПРИМЕЧАНИЕ: CD-маркеры светочувствительны. Для обеспечения выполнения действий в темное время суток.
    6. Инкубировать клеточную суспензию с антителами в течение 30 минут в темноте.
    7. После окрашивания добавьте 1 мл 1x PBS в пробирки и центрифугируйте при 1200 x g, 5 минут, комнатной температуры, чтобы получить клеточную гранулу.
    8. Выбросьте три четверти надосадочной жидкости. Повторно суспендируйте гранулу в оставшемся содержании надосадочной жидкости путем осторожного растирания.
    9. Перейти к анализу FACS.

7. qRT-PCR

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ экспрессии генов методом qRT-PCR включает оценку коллагена I типа (COL1A1), коллагена типа X (COL10A1) и рант-связанного транскрипционного фактора (RUNX2) на гипертрофическую экспрессию, а также SOX-9, Aggrecan (ACAN) и коллагена II типа (COL2A1) на хондрогенез.

  1. Извлекайте РНК из клеточных групп с помощью коммерчески доступных наборов в соответствии с инструкциями производителя.
  2. После экстракции оцените соотношение A260/A280 и концентрацию РНК.
  3. Используйте 280 нг экстрагированной РНК для создания комплементарной ДНК (кДНК).
  4. Инициируйте qRT-PCR с помощью Sybr Green, каждая реакция содержит конечную концентрацию 7 нг кДНК на термоциклере.
  5. Нормализуйте относительную экспрессию мРНК каждого гена к референсному гену GAPDH (ΔCt).
  6. Рассчитайте относительную экспрессию каждого гена с помощью метода 2-ΔΔCt путем сравнения значения ΔCt каждого отдельного гена с значением FAA-CPs (ΔΔCt)37.

8. Многолинейная дифференциация

ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерчески доступная дифференциальная среда индуцирует трехлинейную дифференцировку на адипогенные, остеогенные и хондрогенные линии.

  1. Для адипогенной дифференцировки затравливают клетки при плотности загрузки 1000 клеток/см2 в клеточной культуральной тарелке и культуре с использованием среды адипогенной дифференцировки (смена среды - 1 раз в 3 дня) до субслияния 80% в течение 3 недель.
  2. Для остеогенной и хондрогенной дифференциации следует применять 28-дневную систему культивирования гранул38.
  3. Центрифугируйте 0,5 x 106 клеток при 400 x g в течение 12 мин при 37 °C для образования гранул и инициирования дифференцировки с использованием остеогенной и хондрогенной среды для дифференцировки.
  4. Зафиксируйте, заделайте и разделите гранулы для подтверждающего окрашивания (шаг 9).

9. Подтверждающее окрашивание

  1. В случае адипогенных клеток линии закрепите клетки буферным формалином, промойте и окрашивайте маслом Red O (0,5%). Также покрасьте контрольные элементы (культивируемые на стандартной среде DMEM с 10% FBS).
  2. Наблюдайте под микроскопом и получайте изображения.
  3. Для дифференцированных остеогенных клеток линии окрашивают Ализарином красным (2%).
    Примечание: Для хондрогенных дифференцированных клеток применимы множественные подтверждающие протоколы окрашивания.
  4. Окрашивание Alcian Blue: Окрашивайте неподвижные элементы Alcian Blue в течение 5 минут и закрасьте нейтральным красным.
  5. Для оценки содержания гликозаминогликана (ГАГ) проводят окрашивание сафранином О: окрашивают предметные стекла железным гематоксилином Вигерта с последующей инкубацией кислым спиртом (1%), быстрым зеленым раствором (0,05%), уксусной кислотой (1%) и раствором сафранина О (1%).
  6. Окрашивание толуидиновым синим: Окрашивайте предметные стекла синим толуидином (0,1%) в течение 5 минут.
  7. Окрашивание PicroSirius Red: Окрасьте предметные стекла Picrosirius Red (0,1%) и контрокрашивание с помощью красителя Hematoxylin.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После окрашивания обезвоживайте предметные стекла с помощью отсортированного спирта и очистите их с помощью ксилола. Монтируйте предметные стекла с помощью монтанта из дибутилфталата полистирола ксилола (DPX), рассматривайте их под микроскопом и получайте изображения.
  8. Для иммуногистохимического окрашивания (коллаген II типа) хондрогенной дифференцированной пеллеты срезы гранул подвергают ферментативному забору антигена с использованием ферментов проназы (1 мг/мл) и гиалуронидазы (2,5 мг/мл).
  9. Инкубируйте срезы с первичным мышиным моноклональным антиколлагеновым антителом типа II, а затем вторичным козьим антимышиным антителом 1:250, меченным HRP.
  10. Окрашиваем предметные стекла хромогеном 3,3'-диаминобензидина (DAB) и противостоим им с помощью гематоксилина.
  11. Наблюдайте под микроскопом и делайте снимки.

10. Определение содержания ГАГ/ДНК

  1. Хондрогенные дифференцированные гранулы с использованием раствора папаин-цистеина при 65 °C в течение 16 ч.
  2. Оценить концентрацию ДНК с помощью реагента Picrogreen38 и получить интенсивность флуоресценции на длинах волн - возбуждение: 480 нм, излучение: 520 нм с помощью планшетного ридера ELISA.
  3. Оценка общего содержания ГАГ с использованием метода диметилметиленового синего красителя38.
  4. Измерьте оптическую плотность на длине волны 525 нм с помощью планшетного ридера ELISA.
  5. Нормализуйте значения GAG до значений DNA и рассчитайте общее соотношение GAG/DNA.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Из 86,9 мг срезов хряща был отмечен выход хондроцитарных клеток 1,72 х 105 клеток. При загрузке хондроциты быстро адгезируются, представляя первоначальный округлой булыжник и трансформируясь в фибробластическое состояние при дальнейшем расширении (рис. 1 A, B). Посев этих хондроцитов на фибронектиновые пластины обычно приводит к 2% адгезии, при этом каждая клетка подвергается клональному росту (рис. 2 C, D), достигая удвоения популяции в 5 к 10-12 дню (32 клетки/клон). Клоны в пределах площади 10 см² объединяются и расширяются до необходимого прохода для производства FAA-CP. Хрящевые экспланты, сохраняющиеся в культуре после инкубации коллагеназы, демонстрируют ослабление внеклеточного матрикса, и миграция обычно наблюдается уже на7-й день (рис. 2E). Как FAA-CP, так и MCP демонстрируют веретенообразную структуру, характеристику, обычно ассоциируемую с BM-MSC, приобретая сотовую структуру до слияния (рис. 1E, F).

Три типа изолированных клеток, а именно хондроциты, FAA-CP и MCP, тщательно контролируются с помощью фазово-контрастной визуализации. FAA-CP переводятся только после подтверждения пяти удвоений популяции.

Фенотипическая характеристика изолированных и разросшихся клеток обычно включает проточный цитометрический анализ предполагаемых маркеров хондрогенеза, а именно CD146 и CD166, а также анализ экспрессии генов на маркеры хондрогенеза (SOX-9, ACAN, COL2A1), фиброзно-хрящевой маркер COL1A1 и маркеры гипертрофии (RUNX2 и COL10A1). Все три группы клеток демонстрируют высокую экспрессию (>95%) CD105, CD73 и CD90; низкая или отрицательная экспрессия CD34 и CD45; и высокая экспрессия (>98%) CD166 с умеренной, донор-зависимой экспрессией CD146 (40%-75%) (Рисунок 2A).

Результаты qRT-ПЦР показывают сопоставимую и высокую экспрессию SOX-9, ACAN, а также COL1A1, фиброзного маркера хряща, поскольку клетки культивируются перед оценкой (рис. 2B). Для подтверждения хондрогенеза во всех группах клеток наблюдается положительное поглощение оранжево-красных комплексов в областях, содержащих ГАГ, после Safranin O и голубовато-фиолетовых комплексов после Alcian Blue и толуидинового синего, с более высокой долей в группах FAA-CP и MCP. Иммуногистохимический анализ хондроген-дифференцированных гранул коллагена II типа показывает коричневатое фибриллярное поглощение во всех трех группах (Рисунок 3). Кроме того, анализ ГАГ/ДНК также показал подтверждение хондрогенной дифференцировки с группами FAA-CP, демонстрирующими более высокую экспрессию (рис. 2C).

figure-results-1
Рисунок 1: Выделение и характеристика хондроцитов и хондропрогениторов. Алгоритм исследования изображает выделение трех групп клеток и их морфологические особенности под фазово-контрастным микроскопом сразу после выделения и после нескольких дней расширения. (А) Свежевыделенные хондроциты прикрепляются к адгезивным культурам в первые дни культивирования, приобретая фибробластический вид с дальнейшим расширением (В). (C) Хондроциты, подвергнутые анализу адгезии фибронектина, демонстрируют клональный рост, достигая удвоения популяции до 5 к 10-му дню (D). (E) Хондропрогениторы мигрируют с края экспланта к 10-му дню культивирования и демонстрируют веретенообразный характер роста с дальнейшим расширением (F). Фазово-контрастное увеличение изображения: 10x; Масштабные линейки: 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Данные молекулярной характеристики. (A) Проточный цитометрический анализ положительных и отрицательных маркеров МСК и потенциальных маркеров хондрогенеза. (B) Данные экспрессии ОТ-ПЦР для трех групп клеток для анализа экспрессии генов хондрогенных и гипертрофических маркеров. (C) Общий анализ GAG/ДНК хондрогенных дифференцированных гранул. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Подтверждающее окрашивание после хондрогенной дифференцировки. Сафранин О и иммуногистохимический анализ на коллаген II типа между тремя клеточными группами. Масштабные линейки: для 10-кратного увеличения, 50 мкм; 40-кратное увеличение, 200 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Потенциальная регенерация суставного хряща, содержащего гиалиновую ткань, может быть достигнута за счет оптимизации двух типов его нативных клеток: хондроцитов и хондропрогениторов. В то время как обширные исследования хондроцитов предоставили ценную информацию об их роли в восстановлении хряща, вопросы о природе регенерированной ткани подтолкнули к усилиям по улучшению их фенотипа и изучениюальтернативных методов лечения. Хондропрогениторы, идентифицированные как относительно недавняя клеточная субпопуляция, демонстрируют многообещающие перспективы благодаря присущим им мезенхимальным свойствам, повышенному хондрогенезу иограниченным гипертрофическим признакам. Два основных метода сбора и улучшения предшественников включают дифференциальную адгезию фибронектина и анализ эксплантов на основе миграции18,32. Выделение FAA-CP человека также было описано с использованием ткани мениска, что свидетельствует о высоком пролиферативном и мультипотентном потенциале16,17. Исследования по характеризации in vitro, сравнивающие FAA-CP и MCP с хондроцитами, указывают на превосходный потенциал FAA-CP и MCP проявлять более высокие хондрогенные и более низкие гипертрофические фенотипы, что отражает благоприятный профиль с повышенным накоплением и продукцией GAG 15,24,31,39. Ограниченные исследования in vivo показывают, что хондропрогениторы могут ослаблять прогрессирование остеоартрита и демонстрировать положительные результаты в восстановлении остеохондральных дефектов при использовании в сочетании с биоскаффолдами. В последние годы были предприняты значительные исследовательские усилия для расширения и раскрытия полного потенциала хондропрогениторов.

В этой статье представлен подробный протокол выделения резидентных в хряще клеток. Основными и наиболее распространенными клетками, выделяемыми из хряща, являются хондроциты. Тем не менее, ферментативно расщепленный хрящ представляет собой гетерогенную популяцию клеток, которая содержит не только хондроциты, но и предшественники в очень низкой концентрации, что требует обогащения в условиях in vitro .

Наблюдая косвенные данные, указывающие на участие этих клеток в стимулировании аппозиционного роста, Dowthwaite et al. предприняли выделение и характеристику хондропрогениторов. Эти предшественники были получены из поверхностного слоя суставного хряща с помощью анализа адгезии фибронектина10. Эта особая популяция была извлечена из эмбриональных телят с помощью процесса, включающего селективную адгезию к фибронектину. Было продемонстрировано, что он обладает фенотипической гибкостью и высокой способностью к образованию колоний, наряду с экспрессией гена Notch-1 селектора судьбы клетки. Помимо этих первоначальных исследований, характеристика предшественников из суставного хряща человека выявила повышенные уровни экспрессии SOX9 и Notch1, предпочтение CD49e/CD29 и повышенную активность теломеразы по сравнению со зрелыми хондроцитами12,32. Этот протокол также был установлен в хрящевой ткани человека, при этом сообщения показывают его присутствие не только в поверхностном хряще, но и в более глубоких слоях хряща, причем многие группы используют поликлональные культуры для моноклональных культур11,12.

С другой стороны, Koelling et al. исследовали потенциальное участие хондропрогениторов в хоуминге и миграции в ответ на повреждение хряща, тем самымспособствуя восстановлению тканей. Кроме того, Seol et al. продемонстрировали, что в ответ на повреждение хряща предшественники демонстрировали повышенную миграцию через белок High Mobility Group Box 1 (HMGB1) и RAGE-опосредованную хемотаксис19. Elsaesser et al. также наблюдали более высокую миграционную способность назальных хондропрогениторов по сравнению с хондроцитами и BM-MSCs22. Исследование, проведенное Joos et al., показало, что высвобождение тромбоцитарного фактора роста-BB (PDGF-BB) и инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1) усиливает миграцию хондропрогениторов, в то время как интерлейкин 1 бета (IL-1β) и фактор некроза опухоли-альфа (TNFα) подавляют движение предшественников после травмы. Был проведен недавний отчет, в котором сравниваются четыре различных метода выделения МКП с точки зрения их методов изоляции и условий культивирования, и рекомендуемый метод объясняется в данной статье33. Подход к выделению предшественников на основе их миграционных способностей привел к получению клеток, которые не только проявляли высокий хондрогенный потенциал, но и демонстрировали характеристики, сходные с мезенхимальными стволовыми клетками.

В лабораторных условиях, следуя стандартизированным протоколам, было достигнуто успешное выделение всех трех подтипов. Кроме того, новаторские сравнительные исследования продемонстрировали превосходные свойства FAA-CP по сравнению с хондроцитами 12,15,41. Также были изучены сравнения между хондропрогениторами, показывающие, что МКП демонстрируют более высокийпотенциал24. Следует иметь в виду, что, поскольку три подтипа выделены из одной и той же ткани, а присутствие предшественника в его нативной форме при первоначальном высвобождении из суставного хряща, который в основном содержит хондроциты, существует необходимость в их обогащении с помощью культур in vitro.

Комплексные методы оценки включали в себя сортировку клеток, активируемую флуоресценцией (FACS), полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), электронно-микроскопический анализ, исследования титрования фактора роста, методы мечения клеток, иммунопрофилирование и оценку их терапевтического потенциала для лечения остеоартрита и хондральных дефектов с использованием моделей in vivo 12,24,42.

Полученные в настоящее время данные свидетельствуют о том, что выделение всех трех подтипов возможно даже из остеоартритных суставов, хотя и требует длительной продолжительности расширения. В частности, мы подчеркиваем важность избегания добавления факторов роста во время клонального роста, подчеркивая острую необходимость введения дополнительных факторов во время экспансии этих клеток. Важнейшие этапы, такие как время инкубации на пластинах, покрытых фибронектином, добавление факторов роста в разные моменты времени и минимальная обработка эксплантов, среди прочих упомянутых важных элементов, играют важную роль в культивировании и расширении собранных клеток. Также важно убедиться, что в любой момент времени клетки достигают слияния не более 75-80%.

Потенциал хондропрогениторов вызвал значительный интерес из-за их превосходства над широко используемыми клеточной терапией в области восстановления хряща, а именно ММК-КМ и хондроцитами. Эти предшественники являются многообещающими, а несколько экспериментов in vivo продемонстрировали их эффективность в замене текущего стандарта лечения. Поскольку это недавно обнаруженная подгруппа, характеристика и информация об их фенотипе все еще находятся в стадии разработки, а первое клиническое испытание с использованием FAA-CP для лечения хондральных дефектов запланировано на 2024 год. Таким образом, выделение и экспансия хрящевых клеток, в частности хондропрогениторов, имеют решающее значение и являются перспективными для восстановления клеток в области регенерации хряща.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы выразить признательность г-же Бхавини Кришнан и г-же Мерин Мэри Захария за их интеллектуальный вклад, а также Центру исследований стволовых клеток (подразделение inStem Bengaluru), факультету физиологии, Христианскому медицинскому колледжу, Веллор, за инфраструктурную поддержку. Текущие проекты поддерживаются Департаментом биотехнологии (BT/PR32777/MED/31/415/2019), Правительством Индии, Советом по научным и инженерным исследованиям (CRG/2022/004277), Правительством Индии и грантами на исследования жидкостей, Христианский медицинский колледж, Веллор.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
22-скальпельное лезвие СТЕКЛЯННАЯ ВАН
6-луночная пластина CORNING3516
Альциан СинийTHERMO SCIENTIFICJ6012
Ализарин Красный SIGMA130223
амфотерицин-B (2 μ г/мл).GIBCO15240062
аскорбиновой кислотой (62; g/mL)SIGMA ALDRICHA4544-25G
BC CytoFLEX LX проточный цитометр Программное обеспечение BECKMAN COULTERCYTExpert версии 2.5
CaCl2SIGMA ALDRICH  C34006
CD105-FITCBD BIOSCIENCE
CD106-APCBD BIOSCIENCE
CD14-FITCBD BIOSCIENCE
CD29-APCBD BIOSCIENCE
CD34-PEBD BIOSCIENCE
CD45-FITCBD BIOSCIENCE
CD49b-FITCМИЛТЕНИЛ БИОТЕК MACS 130/100337
CD49e-PEBD BIOSCIENCE
CD73-PEBD BIOSCIENCE
CD90-PEBD BIOSCIENCE561970
Счетчик клетокDE NOVIXCell Drop BF
Клеточный фильтрHIMEDIATCP024
ЦентрифугаBECKMAN COULTERAllegra X-30R
CO2 инкубатор THERMO SCIENTIFICMODEL-371
Коллаген типа X (COL10A1), Фактор транскрипции, связанный с коротышкой (RUNX2), Фактор транскрипции SRY-Box 9 (SOX-9), Aggrecan (ACAN) и Коллаген типа II (COL2A1)  EUROGENTEC, БЕЛЬГИЯ
Коллагеназа типа IIWORTHINGTONLS004176
DMEM F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium F-12)SIGMA ALDRICHD8900-1L
ИФА планшетный ридерМОЛЕКУЛЯРНЫЕ УСТРОЙСТВАSpectraMax i3x Reader
Fast GreenFISHER SIENTIFIC2353459
Фетальная бычья сывороткаGIBCO10270106
FGF2CLOUD CLONE CORPAPA551Hu01
Фибронектин (10 & микро; L/mL)SIGMA ALDRICHF1141
Система синтеза первой цепиTAKARA BIO6110A
GlutamaxGIBCO35050061
ГематоксилинQUALIGENSQ39411
MgCl2 SIGMA ALDRICHM8787
Масло красное OSIGMA1320065
PBS (Фосфатный буферный солевой раствор)GIBCO10010023
ПЦР термоамплификатор ПРИКЛАДНЫЕ БИОСИСТЕМЫТермоамплификатор Quantstudio 12K Flex 
Пенициллин-стрептомицин (100 МЕ/мл)GIBCO15240062
Picrosirius RedALFA AESAR2610108
Первичное антитело (мышиный коллаген типа II)DSHBDSHB II II6B3
ПроназаROCHE10165913103
Quant-iT Picogreen dsDNA реактивTHERMO SCIENTIFICP7589
ХолодильникELANPRO
RNeasy MiniKitQIAGEN74104
Safranin OQUALIGENSQ39962
Вторичное антитело (Goat Anti-Mouse IgG антитело, конъюгат HRP)THERMO SCIENTIFIC31430
Встряхивание водяной бани REMI
StemPro GIBCO1007201, A1007001 и A1007101
фляга Т-25 CORNING430639
TakyonTM Low Rox SYBR Master Mix dTTP Blue EUROGENTECUF-LSMT-B0701
TGFβABCAMab277760
Культура тканей ПетридишаTARSONS960010
Толуидин синийQUALIGENS2040
Трифан синий GIBCO15250061
Trypsin EDTAGIBCO25200072
561443 551147 555397 559883 348057 347463 555617 550257 Дифференцирующие наборы

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Muthu, S., Visawanathan, V., Chellamuthu, G., Thabrez, M. Clinical effectiveness of various treatments for cartilage defects compared to microfracture: A network meta-analysis of randomized controlled trials. J Cartilage Joint Preserv. 4 (2), 100163(2023).
  2. Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. The basic science of articular cartilage. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
  3. Brittberg, M. Clinical articular cartilage repair-An up-to-date review. Annals of Joint. 3 (0), (2018).
  4. Muthu, S., et al. Failure of cartilage regeneration: emerging hypotheses and related therapeutic strategies. Nat Rev Rheumatol. 19 (7), 403-416 (2023).
  5. Lavrentieva, A., Hatlapatka, T., Neumann, A., Weyand, B., Kasper, C. Potential for osteogenic and chondrogenic differentiation of MSC. Adv Biochem Eng Biotechnol. 129, 73-88 (2013).
  6. Fernandez-Moure, J. S., et al. Enhanced osteogenic potential of mesenchymal stem cells from cortical bone: a comparative analysis. Stem Cell Res Ther. 6, 203(2015).
  7. Goldberg, A., Mitchell, K., Soans, J., Kim, L., Zaidi, R. The use of mesenchymal stem cells for cartilage repair and regeneration: a systematic review. J Orthop Surg Res. 12, 39(2017).
  8. Zha, K., et al. Heterogeneity of mesenchymal stem cells in cartilage regeneration: From characterization to application. NPJ Regen Med. 6 (1), 1-15 (2021).
  9. Hayes, A. J., Tudor, D., Nowell, M. A., Caterson, B., Hughes, C. E. Chondroitin Sulfate sulfation motifs as putative biomarkers for isolation of articular cartilage progenitor cells. J Histochem Cytochem. 56 (2), 125-138 (2008).
  10. Dowthwaite, G. P., et al. The surface of articular cartilage contains a progenitor cell population. J Cell Sci. 117 (Pt 6), 889-897 (2004).
  11. Williams, R., et al. Identification and clonal characterization of a progenitor cell sub-population in normal human articular cartilage. PloS One. 5 (10), e13246(2010).
  12. Vinod, E., Parameswaran, R., Ramasamy, B., Kachroo, U. Pondering the potential of hyaline cartilage-derived chondroprogenitors for tissue regeneration: A systematic review. Cartilage. , (2020).
  13. Khan, I. M., Bishop, J. C., Gilbert, S., Archer, C. W. Clonal chondroprogenitors maintain telomerase activity and Sox9 expression during extended monolayer culture and retain chondrogenic potential. Osteoarthritis Cartilage. 17 (4), 518-528 (2009).
  14. Fellows, C. R., et al. Characterization of a divergent progenitor cell sub-populations in human osteoarthritic cartilage: the role of telomere erosion and replicative senescence. Sci Rep. 7, 41421(2017).
  15. Vinod, E., Kachroo, U., Amirtham, S. M., Ramasamy, B., Sathishkumar, S. Comparative analysis of fresh chondrocytes, cultured chondrocytes and chondroprogenitors derived from human articular cartilage. Acta Histochem. 122 (1), 151462(2019).
  16. Korpershoek, J. V., et al. Selection of highly proliferative and multipotent meniscus progenitors through differential adhesion to Fibronectin: A novel approach in meniscus tissue engineering. Int J Mol Sci. 22 (16), 8614(2021).
  17. Wang, J., Roberts, S., Li, W., Wright, K. Phenotypic characterization of regional human meniscus progenitor cells. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1003966(2022).
  18. Koelling, S., et al. Migratory chondrogenic progenitor cells from repair tissue during the later stages of human osteoarthritis. Cell Stem Cell. 4 (4), 324-335 (2009).
  19. Seol, D., et al. Chondrogenic progenitor cells respond to cartilage injury. Arthritis Rheum. 64 (11), 3626-3637 (2012).
  20. Xue, K., et al. Isolation and identification of stem cells in different subtypes of cartilage tissue. Expert Opin Biol Ther. 15 (5), 623-632 (2015).
  21. McCarthy, H. E., Bara, J. J., Brakspear, K., Singhrao, S. K., Archer, C. W. The comparison of equine articular cartilage progenitor cells and bone marrow-derived stromal cells as potential cell sources for cartilage repair in the horse. Vet J. 192 (3), 345-351 (2012).
  22. Elsaesser, A. F., et al. Characterization of a migrative subpopulation of adult human nasoseptal chondrocytes with progenitor cell features and their potential for in vivo cartilage regeneration strategies. Cell & Biosci. 6, 11(2016).
  23. Batschkus, S., et al. Mapping the secretome of human chondrogenic progenitor cells with mass spectrometry. Ann Anat. 212, 4-10 (2017).
  24. Vinod, E., et al. Migratory chondroprogenitors retain superior intrinsic chondrogenic potential for regenerative cartilage repair as compared to human fibronectin-derived chondroprogenitors. Sci Rep. 11, 23685(2021).
  25. Vinod, E., et al. Intraarticular injection of allogenic chondroprogenitors for treatment of osteoarthritis in rabbit knee model. J Clin Orthop Trauma. 10 (1), 16-23 (2018).
  26. Xue, K., et al. Cartilage progenitor cells combined with PHBV in cartilage tissue engineering. J Trans Med. 17 (1), 104(2019).
  27. Carluccio, S., et al. Progenitor cells activated by platelet lysate in human articular cartilage as a tool for future cartilage engineering and reparative strategies. Cells. 9 (4), E1052(2020).
  28. Wang, R., et al. Intra-articular delivery of extracellular vesicles secreted by chondrogenic progenitor cells from MRL/MpJ superhealer mice enhances articular cartilage repair in a mouse injury model. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 93(2020).
  29. Wang, H. C., Lin, T. H., Hsu, C. C., Yeh, M. L. Restoring osteochondral defects through the differentiation potential of cartilage stem/progenitor cells cultivated on porous scaffolds. Cells. 10 (12), 3536(2021).
  30. Kellgren, J. H., Lawrence, J. S. Radiological assessment of osteo-arthrosis. Ann Rheum Dis. 16 (4), 494-502 (1957).
  31. Vinod, E., Kachroo, U., Rebekah, G., Yadav, B. K., Ramasamy, B. Characterization of human articular chondrocytes and chondroprogenitors derived from non-diseased and osteoarthritic knee joints to assess superiority for cell-based therapy. Acta Histochem. 122 (6), 151588(2020).
  32. Nelson, L., McCarthy, H. E., Fairclough, J., Williams, R., Archer, C. W. Evidence of a viable pool of stem cells within human osteoarthritic cartilage. Cartilage. 5 (4), 203-214 (2014).
  33. Vinod, E., et al. Comparison of methods for the isolation and culture of Migratory chondroprogenitors from Human articular cartilage. Connect Tissue Res. 64 (4), 389-399 (2023).
  34. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  35. Vinod, E., Boopalan, P. R. J. V. C., Sathishkumar, S. Reserve or resident progenitors in cartilage? Comparative analysis of chondrocytes versus chondroprogenitors and their role in cartilage repair. Cartilage. , (2017).
  36. Dicks, A., et al. Prospective isolation of chondroprogenitors from human iPSCs based on cell surface markers identified using a CRISPR-Cas9-generated reporter. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 66(2020).
  37. Vinod, E., et al. Prospective isolation and characterization of chondroprogenitors from human chondrocytes based on CD166/CD34/CD146 surface markers. Cartilage. , (2021).
  38. Vinod, E., et al. Migratory chondroprogenitors retain superior intrinsic chondrogenic potential for regenerative cartilage repair as compared to human Fibronectin-derived chondroprogenitors. Sci Rep. 11 (1), 23685(2021).
  39. Vinod, E., et al. Human fetal cartilage-derived chondrocytes and chondroprogenitors display a greater commitment to chondrogenesis than adult cartilage resident cells. PloS One. 18 (4), e0285106(2023).
  40. Joos, H., Wildner, A., Hogrefe, C., Reichel, H., Brenner, R. E. Interleukin-1 beta and tumor necrosis factor-alpha inhibit migration activity of chondrogenic progenitor cells from non-fibrillated osteoarthritic cartilage. Arthritis Res Ther. 15 (5), R119(2013).
  41. Vinod, E., Parameswaran, R., Amirtham, S. M., Rebekah, G., Kachroo, U. Comparative analysis of human bone marrow mesenchymal stem cells, articular cartilage derived chondroprogenitors and chondrocytes to determine cell superiority for cartilage regeneration. Acta Histochem. 123 (4), 151713(2021).
  42. Vinod, E., Padmaja, K., Ramasamy, B., Sathishkumar, S. Systematic review of articular cartilage derived chondroprogenitors for cartilage repair in animal models. J Orthopaed. 35, 43-53 (2022).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи