Методическая статья

Визуализация реакции на повреждение ДНК в клетках Пуркинье с использованием мозжечковых органотипических культур

DOI:

10.3791/67167

⸱

27 декабря 2024 г.

 ,  , 
1The David and Inez Myers Laboratory for Cancer Genetics, Department of Human Molecular Genetics and Biochemistry, Faculty of Health and Medical Sciences, School of Medicine, Tel Aviv University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мозжечковые клетки Пуркинье (ПК) особенно чувствительны к дефициту в ответе на повреждение ДНК. Представлен протокол визуальной оценки динамики ответа ПК на повреждение ДНК, который включает окрашивание связанных с белками поли(АДФ-рибозных) цепей в мозжечковых органотипических культурах.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки мозжечка Пуркинье (ПК) демонстрируют уникальное взаимодействие высоких скоростей метаболизма, специфической архитектуры хроматина и обширной транскрипционной активности, что делает их особенно уязвимыми к повреждению ДНК. Это обуславливает необходимость эффективного ответа на повреждение ДНК (DDR) для предотвращения мозжечковой дегенерации, часто инициированной дисфункцией или потерей РПЖ. Ярким примером является синдром нестабильности генома, атаксия-телеангиэктазия (А-Т), характеризующийся прогрессирующим истощением РПЖ и ухудшением состояния мозжечка. Изучение механизмов РДР в РПЖ имеет жизненно важное значение для выяснения путей, ведущих к их дегенерации при таких расстройствах. Тем не менее, сложность выделения и культивирования ПК in vitro долгое время препятствовала исследовательским усилиям. Мышиные мозжечковые органотипические (срезовые) культуры представляют собой возможную альтернативу, близко имитируя тканевую среду in vivo . Тем не менее, эта модель ограничена показателями РДР, поддающимися микроскопической визуализации. Мы усовершенствовали протокол органотипических культур, продемонстрировав, что флуоресцентная визуализация связанных с белками поли(АДФ-рибоз) (ФАР) цепей, быстрый и ранний индикатор DDR, эффективно выявляет динамику DDR в ПК в этих культурах в ответ на генотоксический стресс.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Целостность клеточной ДНК постоянно находится под угрозой из-за повреждающих ДНК агентов, преимущественно побочных продуктов метаболизма, таких как активные формы кислорода,которые ежедневно наносят десятки тысяч повреждений ДНК на клетку. Постоянное поддержание стабильности генома имеет важное значение для клеточного гомеостаза 2,3. Краеугольным камнем этого поддержания является реакция на повреждение ДНК (DDR) - сложная слоистая сигнальная сеть, которая инициирует определенные пути репарации ДНК, тщательно регулируя многие другие клеточные процессы 4,5. Дефицит РДР обычно проявляется в виде «синдромов нестабильности генома», характеризующихся хромосомной нестабильностью, прогрессирующим разрушением тканей, нарушением роста или развития, предрасположенностью к раку и повышенной чувствительностью к определенным агентам, повреждающим ДНК 6,7,8,9. Примечательно, что нейродегенерация, которая часто включает в себя мозжечковую атрофию, является отличительной чертой многих синдромов нестабильности генома 7,10,11,12.

Аутосомно-рецессивное заболевание, атаксия-телеангиэктазия (А-Т), является хорошо задокументированным примером нарушения нестабильности генома 13,14,15. Это состояние возникает из-за нулевых мутаций в гене ATM (A-T, мутированный), ответственном за кодирование ключевой протеинкиназы, ATM, которая известна в первую очередь как мобилизатор DDR в ответ на двухцепочечные разрывы ДНК (DSB)16,17. А-Т проявляется как мультисистемное расстройство, характеризующееся преимущественно прогрессирующей мозжечковой дегенерацией, приводящей к острым двигательным нарушениям, иммунодефициту, атрофии гонад, предрасположенности к раку и крайней чувствительности к ионизирующему излучению. Культивируемые клетки индивидуумов с А-Т демонстрируют хромосомную нестабильность и повышенную чувствительность к генотоксическим агентам, особенно вызывающим DSB 15,18,19. Важно отметить, что ATM также играет роль в восстановлении других повреждений ДНК, подчеркивая его широкое значение в поддержании стабильности генома 20,21,22.

Несмотря на тщательные исследования многочисленных ролей ATM, конкретный механизм, приводящий к мозжечковой дегенерации при А-Т, остается темой активных дебатов, с различными моделями, предложенными для объяснения этого процесса 23,24,25,26,27,28,29,30. Наша модель28 предполагает, что мозжечковая дегенерация у пациентов с А-Т начинается с дисфункции и последующей потери клеток Пуркинье (РПЖ). Учитывая решающую роль ATM в сохранении стабильности генома в условиях продолжающегося повреждения ДНК, ПК особенно уязвимы к отсутствию ATM. Мы связываем эту уязвимость с сочетанием их высокой метаболической активности, характерной структуры хроматина и обширной транскрипционной активности. В конечном счете, предполагается, что потеря функции ПК и, следовательно, их дегенерация обусловлены стохастической, функциональной инактивацией генов, являющейся следствием производства дефектных транскриптов28.

Изучение биологии РПЖ в лаборатории затруднено проблемами культивирования изолированных РПЖ, поскольку эти клетки в значительной степени зависят от своей естественной среды и соседних клеток для выживания и функционирования, что делает их несовместимыми с ростом диссоциированной культуры. Тем не менее, ПК могут оставаться жизнеспособными в течение длительного периода времени в культурах срезов тканей. Мозжечковые органотипические культуры, представляющие собой срезы тканей, обычно получаемые из церебеллы грызунов, поддерживают структурную организацию ткани и поддерживают различные экспериментальные манипуляции, аналогичные тем, которые возможны с культивируемыми клетками. Таким образом, эти культуры позволяют проводить исследования мозжечка в контролируемых условиях 31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43. В частности, в контексте А-Т органотипические культуры мозжечка мышей сыграли важную роль в изучении РДР в ПК с дефицитом ATM 40,41,42,43. В то время как мыши с дефицитом ATM демонстрируют лишь едва заметный мозжечковый фенотип 44,45,46,47, предположительно из-за различий между физиологией мозжечка человека и мыши, предполагается, что роль ATM в значительной степени сохраняется у всех этих видов. Это мнение подтверждается нашими наблюдениями о том, что дефицитный ответ на DSB ДНК в мышиных ПК Atm-/- соответствует тому, который наблюдается у других типов клеток ATM/ATM у других мышей и человека с дефицитом ATM/ATM 40,41,42,43.

Ограничением в анализе реакции ПК на различные стимулы или стрессы в органотипических культурах является необходимость полагаться на микроскопическую визуализацию для считывания. DDR обычно изучают с помощью объемных биохимических считываний, хотя используются и общие иммунофлуоресцентные маркеры, такие как отслеживание динамики образования и разрешения ядерных очагов фосфорилированного гистона H2AX (γH2AX) и белка 53BP1, которые считаются индикаторами DSB48,49. Более широким показателем является флуоресцентная визуализация формирования поли(АДФ-рибозы) (PAR) цепи на белках, что обеспечивает быструю и устойчивую раннюю реакцию на повреждение ДНК, особенно на разрывы цепи 7,50. Мы модифицировали протокол Komulainen et al.51 для окрашивания PAR в мозжечковых органотипических культурах. Мы наблюдали выраженный ответ ФАР в крупных ядрах РПЖ. Здесь представлен наш усовершенствованный протокол для создания органотипических культур мозжечка у мышей и для визуализации ответа ФАР в условиях генотоксического стресса.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Подробную информацию о материалах, оборудовании и антителах см. в Таблице материалов . Процедуры с животными применялись в соответствии с этическими принципами Комитета по этике Тель-Авивского университета после одобрения. Процедура проводится на 10-дневных щенках мыши, независимо от их пола. При необходимости генотипирование проводится в предыдущий день с помощью биопсии хвоста и стандартных методов. Растворы стерильны и хранятся при температуре 4 °C, если не указано иное; см. Таблицу 1.

1. Подготовка культур

ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите процедуру в стерильной среде и заранее продезинфицируйте рабочую поверхность с использованием 70% этанола.

  1. Добавьте 1 мл BME в каждую лунку 6-луночных планшетов. С помощью стерильных щипцов поместите в каждую лунку вкладыш для одной клеточной культуры и инкубируйте планшеты в инкубаторе с температурой 37 °C/5%CO2 в течение как минимум 2 часов до процедуры вскрытия.
  2. Установите зону диссекции внутри биологического колпака, содержащую тканевой измельчитель, 30-миллиметровые культуральные планшеты, бинокулярный микроскоп и источник света.
  3. Погружайте хирургические инструменты в 70% этанол на протяжении всего процесса. Используйте мочевую чашу, наполненную 70% этанолом, для погружения и отдельную мочевую чашу с 1x PBS, чтобы смыть этанол перед использованием.
  4. Для каждого рассечения (т. е. для каждого мозжечка) подготовьте две 30 мм культуральные пластины, заполненные средой для холодной диссекции, и оставьте их на льду.
  5. Опрыскайте животное 70% этанолом.
  6. С помощью острых ножниц быстро обезглавьте животное. Чтобы обнажить мозг, сделайте небольшой разрез ножницами в сторону от мозжечка. С помощью пинцета с закругленными концами аккуратно снимите череп. Удаляйте череп небольшими частями, чтобы не повредить ткань мозжечка.
  7. Немедленно перенесите мозг в холодную среду для рассечения или непосредственно удалите мозжечок изнутри черепа. Для этого обнажите мозжечок и отделите кору мозжечка от ствола мозга, отсоединив три пары цветоносов, с помощью тонкого изогнутого шпателя радужной оболочки. Чтобы определить цветоносы, посмотрите с рострального на каудальный: парные верхние ножки мозжечка соединяют средний мозг с каждой стороны мозжечка; Парные средние ножки мозжечка соединяют мосты с каждой стороны мозжечка; а парные нижние ножки мозжечка соединяются с мозговым веществом с каждой стороны мозжечка. Как только мозжечок станет виден, отделите его от головного мозга с помощью того же шпателя: проведите шпателем между мозжечком, верхним колликулусом и стволом мозга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не прилагайте особых усилий для удаления мозговых оболочек, так как они легко отделяются после разрезания мозжечка.
  8. Установите измельчитель тканей на толщину среза 350 мкм.
  9. Перед размещением мозжечка на основании измельчителя удалите излишки рассекающего буфера из тканей. Это улучшит адгезию ткани к основанию измельчителя.
  10. Расположите мозжечок на режущей платформе в вертикальной ориентации и проведите парасагиттальную нарезку при толщине среза 350 мкм. Аккуратно разделите ломтики с помощью тонкого шпателя для радужки и положите их в холодную среду для рассечения.
  11. Перенесите срезанную ткань обратно в свежий буфер для холодного рассечения. Используйте наконечник объемом 1 000 мкл, чтобы аккуратно направить срезы ткани в чашку, содержащую буфер для холодной диссекции.
  12. Под бинокль используют два изогнутых шпателя радужной оболочки, чтобы аккуратно отделить срезы тканей друг от друга. Для культур используйте срезы, полученные из червей мозжечка, расположенных в медиальной кортико-ядерной зоне органа.
  13. Переложите каждый срез ткани на вкладыш для культуры с помощью широкого шпателя и переместите каждый вкладыш, содержащий срез ткани, в лунку в 6-луночных планшетах, содержащих предварительно нагретую среду. Оставьте пластины в инкубаторе.
  14. Заменяйте среду через день: отсасывайте использованную среду с помощью стерильной стеклянной пипетки, а с помощью серологической пипетки объемом 5 мл добавьте 1 мл свежей MBE так, чтобы кончик пипетки был прислонен к стенке лунки. Следите за тем, чтобы поток среды не направлялся на ткани.
    Примечание: Срез ткани будет иметь воспаленный вид в течение первых 5-7 дней в культуре и будет готов к экспериментам, как только это явление исчезнет, и в течение 2 недель после создания культуры.

2. Лечение ДНК-повреждающими препаратами, фиксация, окрашивание и микроскопическая визуализация

  1. Добавляйте разрушающие ДНК химические вещества непосредственно в питательную среду в соответствующих конечных концентрациях в течение заданного периода времени. По истечении периода воздействия удалите химикаты, заменив среду свежей питательной средой.
  2. Если считывание DDR включает окрашивание PAR, добавьте ингибитор поли(АДФ-рибозы) гликогидролазы (PARG) в питательную среду в конечной концентрации 10 мкМ за 30 мин до фиксации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это лечение имеет решающее значение, так как модификация PAR кратковременна и постоянно разрушается под действием PARG.
  3. Непосредственно перед фиксацией аспирируйте среду и замените ее 1 мл 0,1 М фосфатного буфера комнатной температуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Холодный буфер может привести к отслоению срезов ткани от вставки.
  4. Немедленно закрепите ломтики, заменив буфер на предварительно охлажденную (-20 °C) смесь ацетона:метанола (1:1) так, чтобы срез ткани был погружен в эту смесь, и оставьте на 20 минут при -20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе можно остановиться и продолжить иммуноокрашивание позже. Для этого промойте салфетки 3 раза 0,1 М фосфатным буфером, предварительно охлажденным до 4 °C, убедившись, что ткань погружена в буфер. В настоящее время ткани могут храниться в 0,1М фосфатном буфере до 2 недель при 4 °C.
  5. Переложите срез ткани в лунку в 48-луночной пластине.
  6. С помощью скальпеля и разделочной доски удалите края вставки, разрезая вокруг среза ткани. Поместите каждый ломтик в лунку 48-луночной тарелки. Добавьте 100 мкл 0,1 М фосфатного буфера.
  7. Для пермеабилизации аспирируют буфер, добавляют в лунку 100 мкл 0,1 М фосфатного буфера, содержащего 1% Triton X-100, и оставляют на 5 мин при комнатной температуре.
  8. Отсадите раствор и добавьте 100 мкл блокирующего раствора (см. таблицу 1) в лунку. Аккуратно встряхивайте при комнатной температуре в течение 2 часов.
  9. На этапе блокирования разведите первичное антитело или реагент против PAR (1:800) в блокирующем растворе.
  10. Удалите блокирующий раствор (не нужно мыть) и добавьте по 100 мкл первичной смеси антител в каждую лунку. Применять при легком встряхивании в течение 2 ч при комнатной температуре.
  11. Вторичные антитела разбавляют в 0,1 М фосфатном буфере, содержащем 0,2% Triton X-100 (1:500), сводя к минимуму их воздействие света.
  12. Отсадите первичный раствор антитела и промойте срезы 3 x 5 мин 0,1 М фосфатным буфером, содержащим 0,2% Triton X-100, при комнатной температуре, с легким встряхиванием.
  13. Замените раствор для промывки 100 μл раствора вторичного антитела (разведение 1:500). Продолжайте осторожное встряхивание в течение 2 ч при комнатной температуре в темноте (накройте пластины алюминиевой фольгой).
  14. Чтобы приготовить раствор DAPI, разбавьте исходный раствор (2 мг/мл) до 1 мкг/мл в 1x PBS.
  15. За двадцать минут до окончания 2-часовой инкубации с вторичным антителом добавьте по 20 мкл окончательного раствора DAPI в каждую лунку и продолжайте встряхивание в течение 20 минут. Отсадите жидкость и промойте раствором для мытья в течение 3 х 5 минут, осторожно встряхивая.
  16. Для монтажа поместите салфетку на предметное стекло микроскопа салфеткой вверх, добавьте монтажный материал и накройте покровным стеклом. Поместите слайды на плоскую поверхность и дайте им высохнуть в течение ночи в темноте, при комнатной температуре (избегайте использования монтажной среды, содержащей DAPI, чтобы предотвратить размытие).
  17. Храните предметные стекла при температуре 4 °C в светонепроницаемой коробке.
  18. Захватывайте микроскопические изображения с помощью конфокального микроскопа и соответствующих фильтров.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 1 показан общий вид органотипических культур мозжечка. В верхнем ряду на рисунке 1A показано отслоение мозжечка, которое сохраняется в культуре, в то время как в нижнем ряду показаны PC, окрашенные на Calbindin D-28k (зеленый), и ядра нейронов, окрашенные на NeuN (красный). На рисунке 1B астроциты в ПК (красный) окрашены на GFAP (зеленый), промежуточный белок филамента типа III. На рисунках 2 и 3 показано окрашивание PAR, наблюдаемое после обработки этих культур двумя повреждающими ДНК агентами, оба из которых являются сильными окислителями: броматом калия (конечная концентрация 10 мМ в течение 12 ч) и паракватом. Ответ на ФАР был отмечен у обработанных РПЖ в мозжечковой фолиуме по сравнению с контролем.

figure-results-1
Рисунок 1: Обзор органотипических культур мозжечка у мышей. (A) Верхний ряд иллюстрирует расслоение мозжечка, которое сохраняется в культуре. Нижний ряд фокусируется на слое ПК. ПК выделены Calbindin D-28k (зеленый). Окрашивание NeuN (красный) идентифицирует ядра нейронов по всему слою. (B) Более пристальный взгляд на ПК (красный). GFAP (зеленый), промежуточный белок филамента типа III, который выделяет астроциты. Масштабные линейки = 968,8 мкм (А, верхний ряд), 42,1 мкм (А, второй ряд), 72,7 мкм (В, верхний ряд), 18,2 мкм (В, второй ряд). Сокращения: PC = клетки Пуркинье; GFAP = глиальный фибриллярный кислый белок; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Окрашивание ФАР в срезе мозжечка, обработанном броматом калия. Срез мозжечка обрабатывали броматом калия (KBrO3) - мощным окислителем в конечной концентрации 10 мМ в течение 12 ч. Масштабные линейки = 775 мкм. Сокращения: PAR = poly(ADP-рибоза); DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Реакция ФАР в срезах мозжечка, подвергшихся воздействию параквата, сильного продуцента супероксидных анионов. (А) Общий вид мозжечкового листа. Обратите внимание на устойчивый отклик PAR, особенно в ПК, по сравнению с контрольной группой. (B) Более тщательное изучение показывает реакцию PAR в ПК и других типах клеток. Масштабные линейки = 193,8 μм (А), 18,2 μм (В). Сокращения: PAR = poly(ADP-рибоза); DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Решения и буферы
Решение  Ингредиенты
Среда для рассеченияСбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS), содержащий 0,5% D-глюкозы. Добавьте 0,5 мл 50% раствора D-глюкозы к 50 мл HBSS без Mg2+ и Ca2+.
Питательная среда BMEСмешайте 100 мл базального Medium Eagle (BME), содержащего фенол красный, но не L-глутамин или HEPES, с 50 мл HBSS с феноловым красным, 50 мл инактивированной при нагревании лошадиной сыворотки, 2 мл 50% D-глюкозы и 1 мл 200 мл L-глутамина. Смешайте и отфильтруйте через фильтр 0,22 мкм в стерильной среде. Хранить при температуре 4 °C
Блокирующий раствор для иммуноокрашиванияв 0,1 М Фосфатный буфер: добавить 0,5% Тритон Х-100, 10% Козью сыворотку
Буфер для вторичного разведения антител0,1 М фосфатный буфер, 0,2% Тритон Х-100
Буфер для промывки0,1 М фосфатный буфер, 0,2% Тритон Х-100
Фиксирующий растворАктеноэ:метанол (1:1 v:v)
Решение для пермеабилизации0,1 М фосфатный буфер, 1% Тритон Х-100
Решение DAPIИсходный раствор (2 мг/мл) разбавленный до 1 мкг/мл в 1x PBS
Фосфатный буферПриготовьте две души А и Б (см. ниже). Смешайте растворы в соответствии с указанными ниже соотношениями, чтобы получить 0,2 М фосфатного буфера. Затем разбавьте 0,2М раствор DDW (1:1) до получения 0,1 М фосфатного буфера (рабочего раствора).
раствор А (для 0,2 М)12 г натрия фосфата одноосновного безводного (Na2HPO4 FW 141.96)
500 мл DDW
Раствор Б (для 0,2 м)14,2 г натрия фосфата диаосновного безводного (Na2HPO4 FW 141,96)
500 мл DDW
Смешанные растворы для получения 0,2 мПриготовьте 1 л: 230 мл раствора А и 770 мл раствора В
0,1 М фосфатный буферРазбавьте смешанный раствор DDW (1:1)

Таблица 1: Растворы и их состав.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Общие замечания
Основное преимущество органотипической системы культивирования заключается в том, что она облегчает исследования с использованием ткани коры мозжечка, сохраняя ее структурную организацию в течение нескольких недель в культуральной чашке. Эта система полезна для проведения углубленного морфологического анализа клеток Пуркинье (ПК), включая детальное изучение дендритных шипиков и ультраструктурных особенностей 52,53,54,55,56,57,58,59. Наши наблюдения показывают, что реакция на повреждение ДНК (DDR) особенно активна у ПК в этих культурах. Тем не менее, основными ограничениями этой системы являются ограниченная продолжительность ее использования и ее зависимость от микроскопической визуализации для мониторинга клеточных процессов, что подчеркивает постоянную потребность в разработке или адаптации подходящих методов визуализации.

Еще одно предостережение относится к мозжечковой части, которая рассекается для подготовки срезов ткани. Мы заметили, что разные доли мозжечка могут давать культуры с заметно отличающейся внутренней организацией и общим качеством. Поэтому мы предпочитаем создавать культуры из срезов, полученных через среднесагиттальные срезы червей мозжечка. На этих срезах удобно видны листы коры мозжечка.

Рекомендуется использовать срезы ткани, полученные из червей мозжечка, которые демонстрируют характерное отслоение коры мозжечка. Эти срезы сохраняют свою организационную структуру в культуре в течение нескольких недель. Кроме того, рекомендуется начинать экспериментальные процедуры с культурами примерно через 7-12 дней после укоренения. Типичный эксперимент, предназначенный для оценки реакции на повреждение ДНК в этих культурах, включает в себя инициирование повреждения путем облучения или добавления химических веществ, повреждающих ДНК, в питательную среду. В последующем проводится фиксация тканей и окрашивание через различные временные промежутки времени. Для оценки восстановления после повреждений, вызванных химическими веществами, включается период инкубации в свежей среде. Рекомендуется начинать долгосрочные эксперименты как можно раньше, в идеале примерно через 7 дней после создания культуры.

Органотипические культуры мозжечка поддерживаются в среде, лишенной антибиотиков; Таким образом, поддержание стерильной среды во время их создания является обязательным условием. Возраст детенышей, с которых добываются мозжечки, имеет решающее значение, рекомендуемый диапазон составляет 9-12 дней. Этот возрастной диапазон является оптимальным, так как кора мозжечка достаточно развита для проведения секционирования. Примечательно, что у пожилых животных ткани имеют тенденцию прилипать к лезвию. Очень важно держать мозжечок погруженным в холодный раствор для вскрытия до тех пор, пока он не будет вскрыт.

В течение первых 5-7 дней в культуре на срезах ткани могут проявляться признаки, напоминающие воспаление, характеризующиеся отеком и молочным обесцвечиванием. Эти характеристики потенциально могут влиять на измерение физиологических параметров и эффективность методов иммуноокрашивания.

Настоятельно рекомендуется не резать мозжечок тоньше 350 мкм, чтобы избежать непостоянства толщины во время нарезки. Имейте в виду, что ткань среза размером 350 мкм становится намного тоньше после 7 дней культивирования примерно до 90 мкм (на основе измерения Z-стека).

В этой статье мы представляем окрашивание PAR 7,50 в инструментарий, используемый для исследования DDR на ПК. Это быстрое и чувствительное считывание данных отражает динамическую природу DDR, что особенно полезно при анализе DDR в ПК дикого типа и с дефицитом ATM. Изложенные здесь протоколы должны быть особенно полезны для исследователей, изучающих синдромы геномной нестабильности, которые влияют на мозжечок.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, связанного с данным исследованием.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работа в нашей лаборатории поддерживается Фондом медицинских исследований доктора Мириам и Шелдона Г. Адельсона и Израильской ассоциацией по борьбе с болезнью А-Т.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Реагент и оборудование
150 x 30 см чашка ПетриCorning Inc.3261
Чашка Петри 35 x 10 ммCorning Inc.3294
АцетонИнвитроген25030081
АцетонSigma-Aldrich270725-1L
Адгезивные предметные стекла для микроскопаMarienfeld4818776 x 26 x 1 мм
Лезвия для измельчителяTED PELLAМодельTC752-1  Бритвенные лезвия
Style BME GIBCO41010-026 500мл. Отсутствие L-избытка
Клеточная культура вставляетMilliporePICM0RG50
D-GlucoseBiological Indo.02-015-1A
HBSS без фенола красногоSigma-AldrichH-1138-500LNo Ca+,No Mg+
HBSS с фенолом краснымSartorius02-015-1A
Лошадиная сыворотка GIBCO26050088термоинактивированные
щипцы радужной оболочкиглаза CellPathGZX-0100-00A130 мм тупой зубчатый
шпатель для ирисаF.S.T10092-12
L-глютамин (200 мМ)Gibco41010026
метанолSigma-Aldrich322412-1L
Метанол Sigma-AldrichG5767
МикроскопOlympus
Монтажная среда безGRIGENE. Ltd, ИзраильK239320A
ПаракватСигма-Олдрич856177-250MGПаракват дихлорид (метилвиологен)
ПАРГ-поли(АДФ-рибоза) ингибитор гликогидролазыTocris Bioscience, ВеликобританияPDD 00017273светочувствительный 
Фосфатный буферBiological Indo.02-018-1A
Ножницы, кожа-ткань
шестилуночные пластиныCorning IncorporatedCLS3516
запасные измельчающие диски TED PELLAModel 10180-01
Измельчитель тканейMcIlwainModel TC75210180-220
Пинцет, заостренный
Мочевые чашки
Антитела
Alexa fluor 488 donkey anti Rabbit IgG 
Invitrogen		A212061:500; вторичный ab; Буфер для вторичного разбавления;   Инкубация в течение 2 ч при комнатной температуре
Anti glial fibrillary acid protienMilliphoreMAB34021:1500; первичный ab; блокирование; Хост:мышь
Anti-calbindin-D-28KSwant CB3001:2000; первичный ab; блокирование; хозяин: rabbit 
Анти-кальбиндин-D-28KSwantCB-38a1:2000; первичный ab; блокирование 
Анти-пан-АДФ-рибоза реагентMilliphoreMABE10161:800; первичный ab; блокирование; инкубация в течение 2 ч при комнатной температуре
DAPI (4',6-Diamidine-2'-фенилиндола дигидрохлорид)Клеточная сигнализация40841:1000; вторичный буфер для разведения; инкубация в течение 20 мин при комнатной температуре
,

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tubbs, A., Nussenzweig, A. Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer. Cell. 168 (4), 644-656 (2017).
  2. Negrini, S., Gorgoulis, V. G., Halazonetis, T. D. Genomic instability--an evolving hallmark of cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (3), 220-228 (2010).
  3. De Almeida, L. C., Calil, F. A., Machado-Neto, J. A., Costa-Lotufo, L. V. DNA damaging agents and DNA repair: From carcinogenesis to cancer therapy. Cancer Genet. 252-253, 6-24 (2021).
  4. Sirbu, B. M., Cortez, D. DNA damage response: Three levels of DNA repair regulation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a012724(2013).
  5. Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair, and mutagenesis. Environ Mol Mutagen. 58 (5), 235-263 (2017).
  6. Taylor, A. M. R., et al. Chromosome instability syndromes. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 64(2019).
  7. Caldecott, K. W. DNA single-strand break repair and human genetic disease. Trends Cell Biol. 32 (9), 733-745 (2022).
  8. Tiwari, V., Wilson, D. M. 3rd DNA damage and associated DNA repair defects in disease and premature aging. Am J Hum Genet. 105 (2), 237-257 (2019).
  9. Rieckher, M., Garinis, G. A., Schumacher, B. Molecular pathology of rare progeroid diseases. Trends Mol Med. 27 (9), 907-922 (2021).
  10. Qing, X., Zhang, G., Wang, Z. Q. DNA damage response in neurodevelopment and neuromaintenance. FEBS J. 290 (13), 3300-3310 (2023).
  11. Scheijen, E. E. M., Wilson, D. M. 3rd Genome integrity and neurological disease. Int J Mol Sci. 23 (8), (2022).
  12. Welch, G., Tsai, L. H. Mechanisms of DNA damage-mediated neurotoxicity in neurodegenerative disease. EMBO Rep. 23 (6), e54217(2022).
  13. Perlman, S. L., Boder Deceased, E., Sedgewick, R. P., Gatti, R. A. Ataxia-telangiectasia. Handb Clin Neurol. 103, 307-332 (2012).
  14. Rothblum-Oviatt, C., et al. Ataxia telangiectasia: A review. Orphanet J Rare Dis. 11 (1), 159(2016).
  15. Amirifar, P., Ranjouri, M. R., Yazdani, R., Abolhassani, H., Aghamohammadi, A. Ataxia-telangiectasia: A review of clinical features and molecular pathology. Pediatr Allergy Immunol. 30 (3), 277-288 (2019).
  16. Shiloh, Y., Ziv, Y. The atm protein kinase: Regulating the cellular response to genotoxic stress, and more. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (4), 197-210 (2013).
  17. Lee, J. H., Paull, T. T. Cellular functions of the protein kinase atm and their relevance to human disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (12), 796-814 (2021).
  18. Taylor, A. M., et al. Ataxia telangiectasia: A human mutation with abnormal radiation sensitivity. Nature. 258 (5534), 427-429 (1975).
  19. Shiloh, Y., Tabor, E., Becker, Y. Cellular hypersensitivity to neocarzinostatin in ataxia-telangiectasia skin fibroblasts. Cancer Res. 42 (6), 2247-2249 (1982).
  20. Shiloh, Y. Atm: Expanding roles as a chief guardian of genome stability. Exp Cell Res. 329 (1), 154-161 (2014).
  21. Shiloh, Y., Lederman, H. M. Ataxia-telangiectasia (a-t): An emerging dimension of premature ageing. Ageing Res Rev. 33, 76-88 (2017).
  22. Geng, A., et al. Sirt2 promotes base excision repair by transcriptionally activating ogg1 in an atm/atr-dependent manner. Nucleic Acids Res. 52 (9), 5107-5120 (2024).
  23. Biton, S., Barzilai, A., Shiloh, Y. The neurological phenotype of ataxia-telangiectasia: Solving a persistent puzzle. DNA Repair (Amst). 7 (7), 1028-1038 (2008).
  24. Kanner, S., et al. Astrocytes restore connectivity and synchronization in dysfunctional cerebellar networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (31), 8025-8030 (2018).
  25. Song, X., Ma, F., Herrup, K. Accumulation of cytoplasmic DNA due to atm deficiency activates the microglial viral response system with neurotoxic consequences. J Neurosci. 39 (32), 6378-6394 (2019).
  26. Levi, H., et al. Dysfunction of cerebellar microglia in ataxia-telangiectasia. Glia. 70 (3), 536-557 (2022).
  27. Bourseguin, J., et al. Persistent DNA damage associated with atm kinase deficiency promotes microglial dysfunction. Nucleic Acids Res. 50 (5), 2700-2718 (2022).
  28. Shiloh, Y. The cerebellar degeneration in ataxia-telangiectasia: A case for genome instability. DNA Repair (Amst). 95, 102950(2020).
  29. Lai, J., et al. Atm-deficiency-induced microglial activation promotes neurodegeneration in ataxia-telangiectasia. Cell Rep. 43 (1), 113622(2024).
  30. Woolley, P. R., et al. Regulation of transcription patterns, poly(adp-ribose), and rna-DNA hybrids by the atm protein kinase. Cell Rep. 43 (3), 113896(2024).
  31. Santos, G., Barateiro, A., Brites, D., Fernandes, A. S100b impairs oligodendrogenesis and myelin repair following demyelination through rage engagement. Front Cell Neurosci. 14, 279(2020).
  32. Iskusnykh, I. Y., Fattakhov, N., Buddington, R. K., Chizhikov, V. V. Intrauterine growth restriction compromises cerebellar development by affecting radial migration of granule cells via the jamc/pard3a molecular pathway. Exp Neurol. 336, 113537(2021).
  33. Gehmeyr, J., et al. Disabling vegf-response of purkinje cells by downregulation of kdr via mirna-204-5p. Int J Mol Sci. 22 (4), 2173(2021).
  34. Wolters, A., et al. Teriflunomide provides protective properties after oxygen-glucose-deprivation in hippocampal and cerebellar slice cultures. Neural Regen Res. 16 (11), 2243-2249 (2021).
  35. Gorter, R. P., Dijksman, N. S., Baron, W., Colognato, H. Investigating demyelination, efficient remyelination and remyelination failure in organotypic cerebellar slice cultures: Workflow and practical tips. Methods Cell Biol. 168, 103-123 (2022).
  36. Lamoureux, L., et al. Non-productive infection of glial cells with sars-cov-2 in hamster organotypic cerebellar slice cultures. Viruses. 14 (6), 1218(2022).
  37. Frontzek, K., et al. A conformational switch controlling the toxicity of the prion protein. Nat Struct Mol Biol. 29 (8), 831-840 (2022).
  38. Tellios, V., Maksoud, M. J. E., Nagra, R., Jassal, G., Lu, W. Y. Neuronal nitric oxide synthase critically regulates the endocannabinoid pathway in the murine cerebellum during development. Cerebellum. 22 (6), 1200-1215 (2023).
  39. Schroder, L. J., et al. Polysialic acid promotes remyelination in cerebellar slice cultures by siglec-e-dependent modulation of microglia polarization. Front Cell Neurosci. 17, 1207540(2023).
  40. Tzur-Gilat, A., Ziv, Y., Mittelman, L., Barzilai, A., Shiloh, Y. Studying the cerebellar DNA damage response in the tissue culture dish. Mech Ageing Dev. 134 (10), 496-505 (2013).
  41. Tal, E., et al. Inactive atm abrogates dsb repair in mouse cerebellum more than does atm loss, without causing a neurological phenotype. DNA Repair (Amst). 72, 10-17 (2018).
  42. Tal, E., Shiloh, Y. Monitoring the atm-mediated DNA damage response in the cerebellum using organotypic cultures. Methods Mol Biol. 1599, 419-430 (2017).
  43. Dar, I., et al. Investigation of the functional link between atm and nbs1 in the DNA damage response in the mouse cerebellum. J Biol Chem. 286 (17), 15361-15376 (2011).
  44. Barlow, C., et al. Atm-deficient mice: A paradigm of ataxia telangiectasia. Cell. 86 (1), 159-171 (1996).
  45. Elson, A., et al. Pleiotropic defects in ataxia-telangiectasia protein-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (23), 13084-13089 (1996).
  46. Xu, Y., et al. Targeted disruption of atm leads to growth retardation, chromosomal fragmentation during meiosis, immune defects, and thymic lymphoma. Genes Dev. 10 (19), 2411-2422 (1996).
  47. Borghesani, P. R., et al. Abnormal development of purkinje cells and lymphocytes in atm mutant mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (7), 3336-3341 (2000).
  48. Rahmanian, N., Shokrzadeh, M., Eskandani, M. Recent advances in gammah2ax biomarker-based genotoxicity assays: A marker of DNA damage and repair. DNA Repair (Amst). 108, 103243(2021).
  49. Furia, L., Pelicci, S., Scanarini, M., Pelicci, P. G., Faretta, M. From double-strand break recognition to cell-cycle checkpoint activation: High content and resolution image cytometry unmasks 53bp1 multiple roles in DNA damage response and p53 action. Int J Mol Sci. 23 (17), 10193(2022).
  50. Duma, L., Ahel, I. The function and regulation of adp-ribosylation in the DNA damage response. Biochem Soc Trans. 51 (3), 995-1008 (2023).
  51. Komulainen, E., et al. Parp1 hyperactivity couples DNA breaks to aberrant neuronal calcium signalling and lethal seizures. EMBO Rep. 22 (5), e51851(2021).
  52. Hendelman, W. J., Aggerwal, A. S. The purkinje neuron: I. A golgi study of its development in the mouse and in culture. J Comp Neurol. 193 (4), 1063-1079 (1980).
  53. Aggerwal, A. S., Hendelman, W. J. The purkinje neuron: Ii. Electron microscopic analysis of the mature purkinje neuron in organotypic culture. J Comp Neurol. 193 (4), 1081-1096 (1980).
  54. Hendelman, W. J., Jande, S. S., Lawson, D. E. Calcium-binding protein immunocytochemistry in organotypic cultures of cerebellum. Brain Res Bull. 13 (1), 181-184 (1984).
  55. Seil, F. J., Herndon, R. M., Tiekotter, K. L., Blank, N. K. Reorganization of organotypic cultures of mouse cerebellum exposed to cytosine arabinoside: A timed ultrastructural study. J Comp Neurol. 313 (2), 193-212 (1991).
  56. Tauer, U., Volk, B., Heimrich, B. Differentiation of purkinje cells in cerebellar slice cultures: An immunocytochemical and golgi em study. Neuropathol Appl Neurobiol. 22 (4), 361-369 (1996).
  57. Kapfhammer, J. P., Gugger, O. S. The analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures. J Vis Exp. (61), 3637(2012).
  58. Sherkhane, P., Kapfhammer, J. P. The plasma membrane ca2+-atpase2 (pmca2) is involved in the regulation of purkinje cell dendritic growth in cerebellar organotypic slice cultures. Neural Plast. 2013, 321685(2013).
  59. Sherkhane, P., Kapfhammer, J. P. Chronic pharmacological blockade of the na(+) /ca(2+) exchanger modulates the growth and development of the purkinje cell dendritic arbor in mouse cerebellar slice cultures. Eur J Neurosci. 46 (5), 2108-2120 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Ataxia TelangiectasiaATM DeficiencyFluorescent ImagingPoly ADP RiboseGenome InstabilityProtein CorrelationCalbindin Staining

Похожие статьи