Method Article

Эффективная обработка и функциональный анализ фолликулярных клеток тонзиллярного Т-фолликуляра с помощью многомерной проточной цитометрии

DOI:

10.3791/67188

⸱

July 11th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Signaling and Immunity Section, Laboratory of Immune System Biology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 2Laboratory of Immunogenetics, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 3Rheumatology Fellowship Training Program, National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, National Institutes of Health, 4Division of Pediatric Otolaryngology, Children's National Hospital, 5Division of Otolaryngology, Department of Surgery, George Washington University School of Medicine and Health Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол сбора и обработки образцов миндалин, фенотипирования с помощью многомерной спектральной проточной цитометрии и проведения неконтролируемого анализа.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Т-фолликулярные хелперы (Tfh) представляют собой подмножество CD4+ Т-хелперных клеток, которые способствуют переключению изотипов В-клеток, формированию зародышевого центра (GC), соматической гипермутации и созреванию аффинности, тем самым помогая организовать адаптивные гуморальные иммунные реакции во вторичных лимфоидных тканях во время инфекции, аутоиммунных и вакцинации. Понимание развития и функции клеток Tfh имеет решающее значение для разработки эффективных вакцин и разработки стратегий целенаправленного лечения заболеваний, затрагивающих эту группу населения. Клетки миндалин человека являются доступными слизистыми лимфоидными органами. Они предоставляют уникальную возможность профилировать различные иммунные популяции, такие как Tfh и GC-клетки, исследовать межклеточные взаимодействия, оценить динамические клеточные функции и раскрыть их регуляторные механизмы на уровне органов. Кроме того, культуры клеток миндалин in vitro просты в обработке и позволяют оценить биологию клеток Tfh в различных условиях. Здесь мы представляем протокол сбора, выделения, сохранения и культивирования клеток миндалин человека. Мы также описываем две оптимизированные панели спектральной проточной цитометрии, предназначенные для углубленной характеризации Tfh-клеток. Наконец, используя в качестве примера лечение ингибитором белка фосфатазы 2A (PP2A), мы демонстрируем эффективность и мощность неконтролируемого анализа данных проточной цитометрии высокой размерности, эффективно выявляя различия, вызванные лечением, в масштабах больших размеров.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Т-фолликулярные хелперы (Tfh) представляют собой отдельную подгруппу CD4+ хелперных Т-клеток, которые необходимы для формирования и функционирования зародышевых центров (ГЦ) и производства антител к В-клеткам. Tfh-клетки происходят из наивных CD4+ Т-клеток в результате взаимодействия с антигенпрезентирующими клетками и интеграции внутренних и внешних факторов, включая передачу сигналов рецепторов Т-клеток, костимулирующие взаимодействия с В-клетками, цитокинами и хемокинами1. Tfh-ячейки экспрессируют CXCR5 и PD-1, которые определяют их положение внутри или рядом с GC. BCL-6 является мастер-фактором транскрипции, критически важным для развития, поддержания и функции Tfh 1,2. Tfh-клетки играют ключевую роль в формировании гуморального иммунного ответа, особенно в ответе на вакцины и в защите от бактериальных и вирусных патогенов. Аномальные реакции Tfh-клеток связаны с различными расстройствами, включая аутоиммунные заболевания, иммунодефицит и, возможно, некоторые формы рака 3,4,5,6. Поэтому понимание их функции и регуляции имеет важное значение для разработки эффективных вакцин и терапевтических стратегий7.

В отличие от других CD4+ Т-хелперных клеток, таких как Th1, Treg и Th17, для которых системы дифференцировки in vitro хорошо известны8, Tfh-клетки более сложны для изучения, поскольку их развитие включает в себя динамические межклеточные взаимодействия и специализированные анатомические структуры. Таким образом, исследования Tfh-клеток в значительной степени опирались на фенотипирование ex vivo периферических циркулирующих Tfh-клеток человека (cTfh) и мышиных моделей in vivo . Таким образом, исследование регуляции специфических молекул на Tfh-клетках является сложной задачей, особенно для Tfh-клеток человека9. Таким образом, углубленное исследование клеток Tfh ex vivo , полученных из лимфоидных тканей, имеет важное значение для улучшения нашего понимания клеток Tfh человека.

Миндалины, как вторичные лимфоидные органы, содержат уникальные клеточные популяции, которые отсутствуют в периферической крови, такие как пре-Tfh (CXCR5intPD-1int CD4+) и GC-Tfh (CXCR5hiPD-1hi CD4+) клетки, которые играют важную роль в образовании GC. Кроме того, небные миндалины являются одними из наиболее часто удаляемых тканей при педиатрических операциях и легкодоступны, что делает их бесценным источником тканей человека для изучения сложных иммунных механизмов с участием клеток Tfh. Поскольку они расположены в верхних дыхательных путях, основном месте для респираторных вирусных инфекций, миндалины представляют собой благоприятную ткань для исследования иммунных реакций на такие вирусные инфекции. Например, наша лаборатория ранее охарактеризовала клетки Tfh в миндалинах и аденоидах детей, выздоравливающих от COVID-19, и сравнила эти ткани с тканями неинфицированных контрольных групп10. Здесь мы опишем наш протокол обработки и хранения клеток миндалин. Используя в качестве примера миндалины, обработанные ингибитором PP2A, мы подробно описываем, как охарактеризовать эти клетки с помощью многомерной спектральной проточной цитометрии и проанализировать данные с помощью неконтролируемого анализа.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этический кодекс Всемирной медицинской ассоциации (Хельсинкская декларация) соблюдался во всех исследованиях на людях в этом исследовании. Образцы миндалин человека были получены от пациентов с аденотонзиллярной гипертрофией, вызывающей нарушение дыхания во сне или обструктивное апноэ сна, полученные из отделения детской отоларингологии Детской национальной больницы, Вашингтон, округ Колумбия, США. Это исследование получило одобрение Институционального наблюдательного совета (IRB) при Детской национальной больнице (протокол IRB номер 00009806). Информированное согласие подписывалось родителями или опекунами всех зарегистрированных участников, а согласие было получено от несовершеннолетних участников в возрасте 7 лет и старше.

1. Сбор и выделение и хранение миндалин человека

  1. Выделение одиночных клеток миндалин
    1. Сбор хирургических образцов
      1. Получить миндалины у пациентов, перенесших тонзиллэктомию, и собрать свежие кусочки ткани в операционной в центрифужную пробирку объемом 50 мл, заполненную 25-35 мл ледяной стерильной миндалинной среды: RPMI с добавлением 5% инактивированной тепловой сывороткой плода крупного рогатого скота (FBS), 0,05 мг/мл гентамицина, 10 мМ глутамина и антибактериально-антимикотической смесью (100 ЕД/мл стрептомицина, 100 ЕД/мл пенициллина, и 0,25 мкг/мл амфотерицина В).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Миндалины в вышеуказанной среде можно хранить при температуре 4 °C в течение ночи и обрабатывать на следующий день. Минимальная потеря жизнеспособности клеток была отмечена при хранении в течение ночи по сравнению с обработкой в тот же день (рис. 1A). Миндалины также могут быть отправлены на ночь на льду.
    2. Обработка миндалин
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все среды, буферы и хирургические инструменты должны быть стерильными, а выделение клеток миндалин следует проводить на льду в капюшоне с биологической защитой.
      1. Поместите миндалины на пластиковую чашку для клеточных культур диаметром 60 мм, содержащую 5 мл охлажденной миндалинной среды. Работа на льду. С помощью стерильного пинцета и ножниц или скальпеля осторожно удалите все видимые сгустки крови, жир и соединительную ткань (рисунок 1B, C).
      2. Переместите миндалины в новую чашку для клеточных культур диаметром 60 мм с 5 мл ледяной миндалинной среды. Нарежьте кусочки миндалин на фрагменты по 3-5 мм.
      3. Приготовьте новую чашку для клеточных культур диаметром 60 мм с 10 мл холодной миндалины и поместите в чашку клеточное ситечко размером 70 мкм.
      4. Переместите фрагменты миндалин в ситечко и разбейте фрагменты миндалин с помощью конца поршня стерильного шприца объемом 3 мл через ситечко.
      5. Соберите среду, содержащую клетки, за пределами ситечка в чашке и переложите в коническую пробирку объемом 50 мл.
      6. Добавьте еще 10 мл миндалинной среды в чашку с ситечком, раздавите фрагменты миндалин поршенем и соберите среду в коническую трубку. Для больших миндалин повторите этот шаг еще 2-3 раза, пока в ситечке не останутся только фрагменты соединительной ткани. Остатки салфеток и использованные пластины положите в пакет с биологической опасностью и в медицинские отходы.
      7. Заполните коническую трубку объемом 50 мл доверху миндалинной средой.
      8. Центрифуга при 400 × г в течение 5 мин при 4 °C.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение времени центрифугирования до 20 минут может увеличить выход.
      9. Удалите надосадочную жидкость путем осторожного отсасывания или пипетирования, и повторно суспендируйте гранулу в 5 мл буфера для лизинга хлорида аммония-калия (ACK) при комнатной температуре (ЛТ) для лизирования эритроцитов. Инкубировать в течение 5 минут при лучевой терапии, затем добавить 35 мл охлажденного PBS для предотвращения дальнейшего лизиса. Центрифуга при 400 × г в течение 5 мин при 4 °C.
      10. Промойте один раз 50 мл охлажденного PBS и центрифугу. Ресуспендируйте 10 мл PBS и процедите клетки через пластиковое ситечко 70 мкм. Подсчитайте ячейки.
  2. Криоконсервация клеток миндалин
    1. Приготовьте замораживающую среду (90% термоинактивированный FBS и 10% диметилсульфоксид (ДМСО)).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Его можно хранить при температуре 4 °C до 1 месяца.
    2. Центрифугирование клеточной суспензии (шаг 1.1.2.10) при 400 × g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу с замораживающей средой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем замораживать клетки при плотности от 10 ×10 6 до 50 ×10 6 клеток/мл замораживающей среды11.
    3. Аликвоту 0,5-1 мл клеточной суспензии вводят в стерильные криовиалы. Заморозьте флаконы в контейнерах для заморозки с регулируемой скоростью в морозильной камере при температуре -80 °C. Переложите флаконы в резервуар для хранения, содержащий жидкий азот, в течение одной недели для длительного хранения.
  3. Размораживание замороженных клеток
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подход к размораживанию с последовательным разведением, основанный на протоколе подготовки образцов для секвенирования РНК одиночных клеток, описан ниже12. Другие методы размораживания также могут работать, но мы обнаружили большую жизнеспособность клеток при этом подходе по сравнению с немедленным помещением клеток в теплый буфер для размораживания (рис. 1D). Буфер для стирки можно подготовить заранее. Буфер для размораживания состоит из буфера для промывки и 0,1 мг/мл ДНКазы I (ДНКазу I следует добавлять непосредственно перед началом размораживания). Увеличение времени центрифугирования до 1 мин/мл (для пробирок объемом 15 мл) является необязательным для увеличения выхода клеток.
    1. Нагрейте водяную баню до 37 °C. Разогрейте буфер для размораживания и промывки на водяной бане при температуре 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все промывки клеток выполняются в RT.
    2. Разморозьте криовиалы на водяной бане при температуре 37 °C в течение 2-3 минут сразу после снятия с хранения. Избегайте полного погружения флакона в водяную баню. Снимите флакон с водяной бани, пока маленький кристалл льда остается видимым.
    3. Аккуратно перенесите размороженные клетки в коническую пробирку объемом 15 мл с помощью наконечника для пипетки с широким отверстием в колпаке с биозащитой. Промойте криовиал 0,5 мл предварительно подогретого буфера для размораживания и добавляйте промывку по капле (1 капля каждые 5 с) в коническую пробирку объемом 15 мл, осторожно встряхивая пробирку для перемешивания.
    4. Разбавляйте клетки последовательно в конической пробирке объемом 15 мл путем постепенного добавления 2 мл, а затем 4 мл среды с интервалом ожидания ~1 минута между добавлениями. Добавляйте в пробирку среду из расчета 1 мл каждые 3-5 с, аккуратно перемешивая.
    5. Центрифугировать при 400 × г в течение 5 мин при RT.
    6. Удалите надосадочную жидкость; ресуспендировать клеточную таблетку в 300 мкл буфера для размораживания; и инкубировать при RT в течение 5 мин.
    7. Добавьте 10 мл промывочного буфера (без ДНКазы I). Снова центрифугируйте при 400 × г в течение 5 мин при RT.
    8. Промойте еще раз: удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 10 мл буфера для промывки. Центрифугировать при 400 × г в течение 5 мин при RT.
    9. Отфильтруйте элементы через ситечко 70 мкм. Снова центрифугируйте в течение 5 мин при 400 × g при RT и подсчитайте ячейки. Суспендия в питательной среде.

2. Измерение экспрессии внутриклеточных цитокинов и факторов транскрипции после лечения ex vivo

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы подробно описываем наш метод фенотипической характеристики тонзиллярных Tfh-клеток с использованием двух многомерных панелей проточной цитометрии. Учитывая, что активность PP2A имеет важное значение для оптимальной экспрессии белка BCL-6 и дифференцировки Tfh4, мы иллюстрируем нашу оценку поддержания и функциональности клеток Tfh с помощью исследования клеток миндалин, обработанных ингибитором PP2A кантаридином (CAN).

  1. Проточное цитометрическое окрашивание
    1. Внутриклеточное окрашивание цитокинов
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация проводится в темное время суток. Реагенты, антитела и их соответствующие количества на лунку, используемые в обеих панелях, перечислены в Таблице материалов. Для оценки дегрануляции Т-клеток анти-CD107a антитело добавляют на этапе лечения, чтобы свести к минимуму ложноотрицательные результаты, вызванные его интернализацией13.
      1. Планшет 2 × 10 6 клетками6 миндалин с 200 мкл питательной среды (1 × 107 клеток/мл) в 96-луночный U-образный колодец со следующими количествами ингибитора PP2A CAN в течение 16 ч: контроль носителя, 3 мкМ и 6 мкМ.
        ПРИМЕЧАНИЕ: CAN был восстановлен при 0,1 М с 1% ДМСО.
      2. Добавьте монензин (0,7 мкл/мл), брефелдин (1:1000), форболмиристата ацетат (50 нг/мл, PMA), иономицин (1000 нг/мл) и 2 мкл анти-CD107a в каждую лунку в течение 2,5 ч в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 при 37 °C. Общий объем культуры составляет 200 мкл на лунку.
      3. Центрифуга окрашивает антитела при температуре ~16 000 × г в течение 3-5 мин при 4 °C для удаления агрегатов антител. Приготовьте смесь поверхностных антител для этапа 2.1.1.8, которая включает все поверхностные антитела, за исключением хемокиновых рецепторов, Brilliant Stain Buffer Plus и буфера FACS (объем каждого из них указан в таблице материалов, всего 112 мкл смеси на реакцию).
      4. После завершения 2,5 ч в культуре промойте клетки 2 раза 200 мкл ледяного PBS центрифугированием при 400 × г в течение 2 мин при 4 °C. Между стирками выбросьте надосадочную жидкость, быстро перевернув пластину. Выполняйте окрашивание в той же тарелке.
      5. Инкубируйте клетки в 100 μл/лунку разбавленного красителем LIVE/DEAD Blue в PBS в течение 15 минут при RT. Промойте 2 раза 200 μл буфера FACS.
      6. Ресуспендировать клетки с помощью блокатора моноцитов True Stain (5 мкл блокатора моноцитов + 45 мкл буфера FACS на лунку) в течение 5 мин при ЛТ.
      7. Последовательно добавляйте антитела к хемокиновым рецепторам непосредственно в реакцию окрашивания (сначала анти-CXCR3 и анти-CCR7 в течение 10 мин каждая, затем смесь анти-CXCR5 и анти-CCR6 вместе с 10 мкл Brilliant Stain Buffer Plus в течение 5 мин при ЛТ). Хорошо перемешивайте после каждого добавления, несколько раз пипетируя вверх и вниз. Объемы антител см. в Таблице материалов .
      8. Смесь поверхностных антител, приготовленную на стадии 2.1.1.3, добавляют непосредственно в реакцию окрашивания и инкубируют в течение 30 мин при ОТ. Общий объем окрашивания за реакцию составляет 180 мкл: 50 мкл блокатора моноцитов в буфере (см. стадию 2.1.1.6) + 18 мкл антител против хемокиновых рецепторов (см. стадию 2.1.1.7) + 112 мкл поверхностной смеси антител (см. стадию 2.1.1.3).
      9. Промойте 2 раза 200 мкл холодного буфера FACS.
      10. Ресуспендируют клетки и инкубируют с 80 мкл/лунку фиксирующего буфера на основе параформальдегида в режиме ОТ в течение 20 мин.
      11. Добавьте 160 мкл 1x пермеабилизационного буфера в каждую лунку, которая уже содержит фиксирующий буфер. Центрифугируйте планшет при 400 × г в течение 2 минут при RT и промойте 1x 200 μл буфера для пермеабилизации.
      12. Готовят смесь антител к внутриклеточным цитокинам (ИКС), в состав которой входят антицитокиновые антитела, Brilliant Stain Buffer Plus и пермеабилизационный буфер (общий объем 50 мкл/лунка, Таблица материалов). Инкубируйте клетки с этой смесью внутриклеточных цитокиновых антител в режиме ЛТ в течение 30 минут.
      13. Промойте 2 раза 200 мкл буфером для проникновения. Суспендия с 200 мкл буфера FACS на лунку.
      14. Храните окрашенные клетки при температуре 4 °C в темноте и получайте данные на спектральном проточном цитометре в течение 24 ч, чтобы свести к минимуму потерюинтенсивности окрашивания.
    2. Окрашивание ядерного транскрипционного фактора
      1. Культивируйте клетки с помощью CAN, как описано в шаге 2.1.1.1 (без стимуляции клеток).
      2. Добавьте антитело против человеческого CD40 (0,5 мкг/мл) в питательную среду и культивируйте клетки в течение 15 мин до начала окрашивания. Если клетки стимулируются, добавьте это антитело за 15 минут до начала стимуляции, чтобы предотвратить интернализацию CD40L при активации15,16.
      3. Центрифугируйте окрашивающие антитела и приготовьте поверхностную смесь антител аналогично этапу 2.1.1.3: поверхностные антитела в таблице материалов, 10 мкл/лунка Brilliant Stain Buffer Plus и 54,1 мкл/лунку буфера FACS.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем окрашивания на лунку составляет 180 μл: 50 μЛ блокатора моноцитов в буфере + 13 μЛ антител к хемокиновым рецепторам + 117 μЛ поверхностной смеси антител.
      4. Промойте ячейки и выполните окрашивание ЖИВОЙ/МЕРТВЫМ синим, а также окрашивание и промывку поверхности, как указано в пунктах 2.1.1.5-2.1.1.8.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Антитело против CXCR3 не входит в состав этой панели.
      5. Зафиксируйте клетки 80 мкл буфера для фиксации ядерного фактора транскрипции из набора буферов для окрашивания фактора транскрипции FoxP3. Инкубировать в течение 30 минут при RT.
      6. Промойте клетки пермеабилизационным буфером, как описано в шаге 2.1.1.11.
      7. Приготовьте смесь антител к внутриклеточному фактору транскрипции (TF), которая включает антитела против фактора транскрипции, перечисленные в Таблице материалов, 10 мкл Brilliant Stain Buffer Plus и 16 мкл буфера для пермеабилизации (общий объем 40 мкл/лунка). Инкубируйте клетки с этой смесью в течение 1 ч при 4 °C.
      8. Промойте и приобретите на спектральном цитометре как на этапах 2.1.1.13-2.1.1.14.

3. Неконтролируемый анализ данных многомерной проточной цитометрии

ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение, пакеты и их версии, используемые для анализа, перечислены в Таблице материалов. Снимки экрана с шагов 3.2 по 3.4 находятся в дополнительном файле 1. Примеры сценариев с шагов 3.5 по 3.7 находятся вдополнительном файле 2 и дополнительном файле 3, шагах с 3.8 по 3.9 — в дополнительном файле 4 и дополнительном файле 5. Файлы ICS raw и TF raw файлы для скриптов представлены в Дополнительном файле 6 и Дополнительном файле 7 соответственно.

  1. Откройте рабочее пространство программного обеспечения для анализа проточной цитометрии, в котором хранятся файлы «.fcs», и завершите стробирование, как показано на рисунке 1E.
  2. Щелкните правой кнопкой мыши целевой узел (в данном случае CD4+ Т-клетки). Выберите «Выбрать эквивалентные узлы».
  3. Снова щелкните правой кнопкой мыши по целевому узлу. Выберите Экспорт/Объединить популяции.
  4. Дождитесь открытия окна Популяции: Экспорт или Конкатенация , выберите значения CSV-канала и выберите место назначения для экспортируемых файлов. Включите все ячейки в поле Включить события и выберите Все компенсированные параметры в поле Параметры . Разверните раздел «Дополнительные параметры», введите префикс для переименования файлов и нажмите кнопку «Экспорт», чтобы экспортировать файлы в папку назначения (экспортируйте по одному файлу .csv для каждого образца).
  5. Чтение экспортированных файлов "*.csv" с помощью R (по одному для каждого образца). Назначьте идентификатор образца каждой ячейке и объедините ячейки из всех образцов в один кадр данных.
  6. Добавьте или объедините метаданные (дополнительную информацию о образцах) во фрейм данных.
  7. Случайным образом понизьте выборку равного количества клеток на выборку для следующего анализа. Этот шаг является необязательным.
    Примечание: В этом примере 8000 CD4+ Т-клеток были понижены из общего числа CD4+ Т-клеток каждого состояния, что составляет по меньшей мере 1/7 от общего числа CD4+ Т-клеток.
  8. Создание объекта Seurat: интерпретируйте значения канала для маркеров антител как уровни экспрессии генов при создании объекта Seurat.
    1. Создайте объект Seurat с фреймом данных, сгенерированным на шаге 3.6. Пропустите шаг NormalizeData и сохраните их непосредственно как анализ данных.
    2. Выберите маркеры поверхности на панели потока для использования в качестве VariableFeatures в кластеризации без обучения.
    3. Запустите ScaleData, RunPCA, FindNeighbors, FindClusters, RunUMAP в качестве стандартного конвейера, представленного в Seurat, за исключением шага 17 NormalizeData.
    4. Настройте параметр resolution на шаге FindClusters, чтобы изменить количество кластеров, чтобы они более точно отражали базовый биологический контекст.
  9. Используйте инструменты визуализации, такие как DimPlot и FeaturePlot, совместимые с пакетом Seurat. Для сравнения групп, содержащих несколько выборок на группу, рассчитайте процент каждого кластера для каждого субъекта и выполните статистическое сравнение. Затем используйте математические модели для более сложного статистического анализа10.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы сравнить общую жизнеспособность клеток, мы разрезали миндалины на три одинаковые части и обработали их по нашему протоколу в трех условиях: (1) обработка в тот же день, (2) хранение на ночь при 4 °C и (3) ночное хранение на льду. Жизнеспособность этих трех условий была весьма схожей без каких-либо существенных различий (рисунок 1А). Мы также оценили влияние процесса размораживания на жизнеспособность клеток. Использованный нами метод капельного размораживания привел к достоверно более ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В отличие от предыдущих сообщений о том, что свежие миндалины должны быть обработаны в течение 3 ч после операции19, мы обнаружили, что свежие образцы миндалин могут сохранять свою жизнеспособность при хранении при 4 °C и обработке в течение 24 ч. Для оптимизации жизнеспособности клеток из ткани миндалин после размораживания из хранилища жидкого азота мы приняли метод капельного размораживания, рекомендованный при секвенировании одиночных клеток, где высокая жизне...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Отделом внутренних исследований NIAID, NIH.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Машины и инструменты
3 мл Пластиковый шприцBD309657
96 Well U Нижняя пластинаThermo Scientific163320
1,2 мл Криогенные флаконыCorning430487
Клеточный фильтр 70 &микро; m НейлоновыйFalcon352350
Чашка для клеточных культур (60 мм)VWR10062-890
ЦентрифугаThermo ScientificSorvall Legend XTR
Benchmark B2000-2 MyBath 2L Цифровая водяная баняBenchmarkB2000-2
Тонкие ножницы - SharpF.S.T14060-11
Пластиковые чехлы для инструментовF.S.T20830-05
Спектральный проточный цитометр, AuroraCytek5L 16UV-16V-14B-10YG-8R
Стандартные щипцыF.S.T11000-13
Стандартные щипцыF.S.T11000-20
Vi-cell Blu Анализатор жизнеспособности клеток Beckman CoulterC19201
<сильный>Реагенты
0,5 м ЭДТА pH 8,0Качество Биология351-027-101
2-меркаптоэтанолGibco21985-023
ACK лизирующий буферGibcoA10492-01
Антибиотик-антимикотическая смесь (пенициллин-стрептомицин-амфотерицин B Суспензия, 100x)Gibco15240-062
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD566385
кантаридинSigmaC7632-25MG
Цитофиксный фиксирующий буферBD554655
диметилсульфоксидом (ДМСО)SigmaD8418-250ml
DNAase IRoche10104159001
плода Бычья сыворотка (FBS)VWR97068-085
FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer SeteBioscience00-5523-00
Gentamicin (50 мг/мл)Gibco15750-060
GolgiplugBD555029
GolgiSTOPBD554724
HEPES (1 M)Gibco15630-080
ИономицинСигма  I0634-1 мг
L-глутамина (200 мМ)Gibco25030-081
MEM NEAA (100x)Gibco11140-050
Параформальдегид 16% раствор, ЭМ класс (PFA)Электронная микроскопия
  Science		15710Разбавить PBS
PBS, pH 7,4Gibco10010072
пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл)Gibco15140-122
Phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA)SigmaP8139-1mg
Контейнеры для заморозки с регулируемой скоростьюMilliporeCorning CoolCell FTS30
RPMI (+L-глутамин)Gibco11875-085
Пируват натрия (100 мМ)Gibco11360-070
Блокатор моноцитов с истинным окрашиваниемBioLegend426103<
сильный>Буферы
культуральная среда10% термоинактивированный FBS (VWR),
2 нМ глутамин,
0,055 мМ 2-меркаптоэтанол,
1% пенициллин/ стрептомицин,
1 мМ пируват натрия,
10 мМ HEPES,
1% заменимых аминокислот
в RPMI (+L-глутамин)
БуфермМ ЭДТА и 2% инактивированный при нагревании FBS в
среде90% термоинактивированный FBS и 10% буфер
размораживанияБуфер для промывки + 0,1 мг/мл ДНКазаI
Миндалинная средаRPMI с добавлением 5% инактивированного при нагревании FBS,
10 мМ глутамина,
0,05 мг/мл гентамицина,
1% антибиотико-антимикотической смеси
  (пенициллин, стрептомицин и амфотерицин В).
Промывочный буферRPMI (+L-Glutamine) с добавлением 10%  инактивированного при нагревании FBS и 10 мМ HEPES
антител и других регентов для цитокиновой панели 
биотин античеловеческий CD107a (LAMP-1) АнтителоBioLegend3286042 μ L в 200 μ L полная культуральная среда на лунку.
Это антитело добавляли с клетками во время стимуляции PMA/иономицина.
Live Dead окрашивание100 μ L смеси на лунку
LIVE DEAD BlueThermoL23105  1 : 800, 0,125 μ L в 100 μ L PBS на скважину. 
Monocyte block50 μ L смеси на лунку
Блокатор моноцитов BioLegend4261035 мкм; L True Stain блокатор моноцитов и 45 μ L FACS буфер на хорошо
<сильный>поверхностный антитела для цитокиновой панели
Хемокиновые рецепторы смешиваютμ Л/ну 
Античеловеческий CCR6-BV711BioLegend3534361
Античеловеческий CCR7-BV421BioLegend3532081
Античеловеческий CXCR3-PE-Cy5BD5511285
Античеловеческий CXCR5-BV750BD7471111
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD56638510
             18 μ L смесь на лунку для хемокиновых рецепторов;
Добавить направленный в клетки с моноцитарным блок-буфером
Other surface антитела mixμ Л/ну 
Античеловеческий CD103-BUV661BD7499932,5
Античеловеческий CD14-Spark Blue 550BioLegend3671482,5
Античеловеческий CD19-Spark NIR 685BioLegend3022702,5
Античеловеческий CD25-BB515 BD56446710
Античеловеческий CD27-Super Bright 436Thermo62-0279-425
Античеловеческий CD3-BV510BioLegend3448282,5
Античеловеческий CD38 APC-Fire810BioLegend3035501
Античеловеческий CD4 CF YG584CytekR7-200412,5
Античеловеческий CD45RA-BUV395BD7403150,6
Античеловеческий CD56-BUV737BD6127663,5
Античеловеческий CD57-FITCBioLegend 3596041,2
Античеловеческий CD69-BUV563BD7487641
Античеловеческий CD8-BUV805BD6128891,2
Античеловеческий FAS-BB700BD5665420,6
Античеловеческий HLA-DR APC-Fire 750BioLegend3076582
Anti-human PD1-BV785BioLegend3299291,2
Anti-human-CD45-PerCPThermo MHCD45311,2
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD56638510
FACS буфер61
                                           112 μ L смеси на лунку для других поверхностных антител;
Добавить непосредственно в буфер моноцитарного блока (50 μ L) и смесь хемокиновых рецепторов (18 μ L, 50+18+112 = 180 μ L всего на лунку
)Intracelluar цитокиновые антитела к цитокиновой панелиμ Л/ну 
Античеловеческий Granzyme B-PEBD1
Античеловеческий IL10-PE-Dazzle 594BioLegend5068121
Античеловеческий IL17A-BV605BioLegend5123261
Античеловеческий IL2-BV650BioLegend5003343
Античеловеческий IL21- Alexa Fluor 647BD56049310
Античеловеческий IL4-PerCP Cy5.5BD5612341
Античеловеческий перфорин-APCBioLegend 3533122,5
Античеловеческий TNFa-PE-Cy7BioLegend5029300,1
Анти-ИФН&гамма;-Тихоокеанский синийBioLegend5025221
SAv-BUV615BD6130130,25
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD56638510
1x буфер для пермеабилизации eBioscience00-5523-0019.15
         (50 μ L смесь на лунку)
<сильные>антитела и другие регенты для панели факторов транскрипции
CD40 антитело, античеловеческоеMiltenyi Biotec130-094-1330,5 μ г/мл питательной среды для рабочей концентрации
<сильное>окрашивание живыми мертвецами100; L смеси на лунку
LIVE DEAD BlueThermoL23105  1 : 800, 0,125 μ L в 100 μ L PBS на скважину. 
Блокатор моноцитов BioLegend4261035 L True Stain блокатор моноцитов и 45 μ L буфер FACS на хорошо
<сильный>поверхностный антитела для группы транскрипционных факторов panel
>Chemokine рецепторов mixμ Л/ну 
Античеловеческий CCR6-BV711BioLegend3534361
Античеловеческий CCR7-BV421BioLegend3532081
Античеловеческий CXCR5-BV750BD7471111
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD56638510
             13 μ L-смесь на лунку
<сильную>Другая поверхностная смесь антителμ Л/ну 
Античеловеческий 4-1BB-PE-CY7BioLegend3098182,5
Античеловеческий CD14-Spark Blue 550BioLegend3671482,5
Античеловеческий CD19-Spark NIR 685BioLegend3022702,5
Античеловеческий CD200-PerCP-eFluor 710ThermoFisher46-9200-422,5
Античеловеческий CD25-PE-Cy5BioLegend3026085
Античеловеческий CD3-BV510BioLegend3448282,5
Античеловеческий CD38-APC-Fire810BioLegend3035501
Античеловеческий CD4-Pacific BlueBioLegend3174231
Античеловеческий CD40L-PEBD15
Античеловеческий CD45RA-BUV395BD7403150,6
Античеловеческий CD56-BUV737BD6127663.5
Античеловеческий CD69-BUV650BioLegend3109342.5
Античеловеческий CD8-BUV805BD6128891.2
Античеловеческий HLA-DR APC-Fire 750BioLegend3076582
Античеловеческий ICOS-BUV563BD7414211.2
Античеловеческий OX40-APCBioLegend3500085
Античеловеческий PD1-BV785BioLegend3299291.2
Anti-human-CD45-PerCPThermoMHCD45311.2
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD56638510
FACS буфер54.1
                 117  μ L смеси на лунку для других поверхностных антител;
Добавить непосредственно в моноцитарный блок  буфер (50 μ L) и смесь хемокиновых рецепторов (13 μ L, 50+13+117 = 180 μ L всего на лунку)
Transcription factor антитела для панели факторов транскрипцииμ Л/ну 
Античеловеческий T-bet-BV605BioLegend6448174
Античеловеческий Bcl6-PE-CF594BD5624014
Античеловеческий FoxP3-Alexa Fluor 488BD5608871,6
Античеловеческий GATA3-BB700BD5666422
Античеловеческий Ki67-Alexa Fluor 700BD5612770,4
Античеловеческий Rorgt-Alexa Fluor 647BD5636202
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD56638510
1 x Пермеабилизационный буфер eBioscience00-5523-0016
                             40 μ L mix per well
Программное обеспечение и пакеты для неконтролируемого анализа
Software/packageVersionSource
1data.table1.16.2The Comprehensive R Archive Network
2FlowJO10.9.0Becton, Dickinson and Company
3pheatmap1.0.12Всеобъемлющая сеть архивов R
4R4.3.2Всеобъемлющая сеть архивов R
5readxl1.4.3Всеобъемлющая сеть архивов R
6Rstudio2023.12.1+402Posit PBC
7Seurat5.1.0Комплексная сеть архивов R
8SeuratData0.2.2.9001Комплексная сеть архивов R
9SpectroFlo3.0Cytek
10tidyverse2.0.0Комплексная сеть архивов R
11viridis0.6.5Комплексная сеть архивов R
FACS 2 для заморозки PBS DMSO 561142 <strong 557299

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Crotty, S. T follicular helper cell biology: A decade of discovery and diseases. Immunity. 50 (5), 1132-1148 (2019).
  2. Choi, J., et al. Bcl-6 is the nexus transcription factor of t follicular helper cells via repressor-of-repressor circuits. Nat Immunol. 21 (7), 777-789 (2020).
  3. Goubet, A. G., et al. Escherichia coli-specific CXCL13-producing TFH are associated with clinical efficacy of neoadjuvant PD-1 blockade against muscle-invasive bladder cancer. Cancer Discov. 12 (10), 2280-2307 (2022).
  4. Jiang, Y., et al. Protein phosphatase 2A propels follicular T helper cell development in lupus. J Autoimmun. 136, 103028(2023).
  5. Overacre-Delgoffe, A. E., et al. Microbiota-specific T follicular helper cells drive tertiary lymphoid structures and anti-tumor immunity against colorectal cancer. Immunity. 54 (12), 2812-2824.e4 (2021).
  6. Patel, P. S., et al. Translational regulation of TFH cell differentiation and autoimmune pathogenesis. Sci Adv. 8 (25), eabo1782(2022).
  7. Alameh, M. G., et al. Lipid nanoparticles enhance the efficacy of mRNA and protein subunit vaccines by inducing robust T follicular helper cell and humoral responses. Immunity. 55 (6), 1136-1138 (2022).
  8. Sekiya, T., Yoshimura, A. In vitro Th differentiation protocol. Methods Mol Biol. 1344, 183-191 (2016).
  9. Ueno, H., Banchereau, J., Vinuesa, C. G. Pathophysiology of T follicular helper cells in humans and mice. Nat Immunol. 16 (2), 142-152 (2015).
  10. Xu, Q., et al. Adaptive immune responses to SARS-CoV-2 persist in the pharyngeal lymphoid tissue of children. Nat Immunol. 24 (1), 186-199 (2023).
  11. Higdon, L. E., Lee, K., Tang, Q. Z., Maltzman, J. S., Stee, V. G. T. L. Virtual global transplant laboratory standard operating procedures for blood collection, PBMC isolation, and storage. Transplant Direct. 2 (9), e101(2016).
  12. 10x Genomics. Cell thawing protocols for single cell assays. CG000447. , https://cdn.10xgenomics.com/image/upload/v1710525012/CG000447_Handbook_CellThawingProtocols_SingleCellAssays_Rev_B.pdf (2024).
  13. Betts, M. R., et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+T cells by a flow cytometric assay for degranulation. J Immunol Methods. 281 (1-2), 65-78 (2003).
  14. Diks, A. M., et al. Impact of blood storage and sample handling on quality of high dimensional flow cytometric data in multicenter clinical research. J Immunol Methods. 475, 112616(2019).
  15. Poloni, C., et al. T-cell activation-induced marker assays in health and disease. Immunol Cell Biol. 101 (6), 491-503 (2023).
  16. Dan, J. M., et al. Immunological memory to SARS-CoV-2 assessed for up to 8 months after infection. Science. 371 (6529), eabf4063(2021).
  17. Hao, Y., et al. Dictionary learning for integrative, multimodal and scalable single-cell analysis. Nat Biotechnol. 42 (2), 293-304 (2024).
  18. Ditoro, D., et al. Differential IL-2 expression defines developmental fates of follicular versus nonfollicular helper T cells. Science. 361 (6407), eaao2933(2018).
  19. Assadian, F., et al. Efficient isolation protocol for B and T lymphocytes from human palatine tonsils. J Vis Exp. (105), e53374(2015).
  20. Florek, M., et al. Loss of CD62L expression in CD4+FoxP3+regulatory T cells following freeze-and-thaw prevents protection against gvhd in murine models. Blood. 124 (21), 2427-2427 (2014).
  21. Frigyesi, I., et al. Robust isolation of malignant plasma cells in multiple myeloma. Blood. 123 (9), 1336-1340 (2014).
  22. Anselmo, A., et al. Flow cytometry applications for the analysis of chemokine receptor expression and function. Cytometry Part A. 85 (4), 292-301 (2014).
  23. Berhanu, D., Mortari, F., De Rosa, S. C., Roederer, M. Optimized lymphocyte isolation methods for analysis of chemokine receptor expression. J Immunol Methods. 279 (1-2), 199-207 (2003).
  24. Den Braanker, H., Bongenaar, M., Lubberts, E. How to prepare spectral flow cytometry datasets for high dimensional data analysis: A practical workflow. Front Immunol. 12, 768113(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

T Follicular HelperTonsil Cell IsolationFlow CytometrySpectral CytometryGerminal Center CellsAdaptive ImmunityIn Vitro CulturePP2A InhibitorCell Interaction AnalysisB Cell Isotype
Video Coming Soon

Related Articles