Этот протокол обеспечивает оптимизированный рабочий процесс для создания и тестирования химических антигенных рецепторов регуляторных Т-клеток человека (CAR Tregs).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Генерация Т-клеток, регуляторных химерных антигенных рецепторов человека
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Терапия Т-клетками с помощью химерных антигенных рецепторов (CAR) изменила подход к лечению рака, что привело к рекордным показателям ремиссии при ранее неизлечимых гематологических опухолях. Эти успехи вызвали интерес к адаптации платформы CAR к небольшому, но ключевому подмножеству CD4+ Т-клеток, в первую очередь ответственных за регуляцию и ингибирование иммунного ответа, регуляторных Т-клеток (Tregs). Способность перенаправлять иммуносупрессивную активность Tregs на любую внеклеточную мишень имеет огромное значение для создания клеточной терапии аутоиммунных заболеваний, отторжения трансплантата органов и реакции «трансплантат против хозяина». В этой статье мы подробно описываем методологии для добросовестного выделения Treg из периферической крови человека, генетической модификации человеческих Tregs с использованием лентивируса или CRISPR/Cas9-подобного ввода с использованием аденоассоциированного вируса, опосредованного гомологичной направленной репарацией (HDR) матрицы, а также ex vivo экспансии стабильных человеческих CAR Tregs. Наконец, мы описываем оценку фенотипической стабильности CAR Treg человека и супрессивной функции in vitro , что дает представление о том, как CAR Treg человека будут вести себя в доклинических и клинических приложениях.
Введение
Терапия Т-клетками с использованием химерных антигенных рецепторов (CAR) произвела революцию в лечении гематологических злокачественных новообразований, достигнув удивительно высоких показателей ремиссии при ранее неизлечимых видах рака. Обнадеживающие первые результаты использования CAR-Т-клеток для лечения глиобластомы 3,4,5 подчеркивают универсальность технологии CAR и будущий потенциал для борьбы с широким спектром злокачественных новообразований. По мере того, как в этой области ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Изоляция Treg человека
- Переработка лейкопака
- Переложите содержимое лейкопака в коническую пробирку объемом 50 мл. Добавьте равный объем фосфатно-солевого буфера (DPBS) Дульбекко + 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS), аккуратно перемешав с помощью пипетки.
- Отжим при 300 × г в течение 10 мин при комнатной температуре (RT). Осторожно отсасывайте надосадочную жидкость. Восстановите клеточную гранулу в 2 мл DPBS + 2% FBS. Добавьте 8 мл раствора хлорида аммония пипеткой в клеточную суспензию в соотношении 4:1, перемешайте путем легкой инверсии и дайте лизису оставшихся эритроцитов на льду в течение 15 минут. ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Описанный здесь протокол обеспечивает оптимизированный и стандартизированный конвейер для оценки новых конструкций химерных антигенных рецепторов (CAR) в регуляторных Т-клетках человека (Tregs) с целью создания живых терапевтических средств для лечения аутоиммунных заболеваний, реакции «трансплантат против хозяина», отторжения трансплантата органов и аллергии. На рисунке 1 показано, как мы получаем высокочистые человеческие Tregs из периферической крови с помощью FACS (р.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол предоставляет оптимизированную и всестороннюю методологию для генерации и оценки химерных антигенных рецепторов регуляторных Т-клеток человека (CAR Tregs). Успех технологии CAR в лечении гематологических раковых заболеваний вдохновил на ее применение к иммуносупрессивному подмножеству Т-клеток, Tregs. В отличие от обычных Т-клеток, Tregs подавляют иммунные реакции, предлагая потенциальные методы лечения состояний, возникающих в результате нежелательного иммунитета, таких ка.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
LMRF является изобретателем и получает роялти от патентов на сконструированные иммунные клетки, а также консультирует Guidepoint Global и McKesson. Остальные авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Благодарности
LMRF финансируется грантом Human Islet Research Network (HIRN) «Новый лидер в области диабета 1 типа» U24DK104162-07, грантом Американского онкологического общества (ACS) на институциональные исследования IRG-19-137-20, грантом на открытие пилотного проекта Южной Каролины Clinical and Translational Research (SCTR) 1TL1TR001451-01, грантом Diabetes Research Connection (DRC) IPF 22-1224 и грантом Swim Across America 23-1579. RWC поддерживается грантом на обучение в области клеточных, биохимических и молекулярных наук T32GM132055 и стипендией для выпускников Онкологического центра Холлингса Lowvelo. Это исследование было частично поддерж....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Аденоассоциированный вирус ( AAV) | Charles River Laboratories | ||
| CAR мишенно-экспрессирующие клетки | например, облучатель | ||
| Cesium-137 | |||
| Anti-human CD8 PerCP (клон SK1) | Biolegend | 344708 | |
| Anti-human CD4 PE/Cy7 (клон SK3) | Biolegend | 344612 | |
| магнит DynaMag-15 | ThermoFisher | 12301D | |
| Ghost BV510 краситель для повышения жизнеспособности | TONBO | 13-0870-T100 | |
| K562 клетки | Американская коллекция типовых культур | CCL-243 | |
| 0,5 М ЭДТА, pH 8,0 | Gibco | ||
| 1 м HEPES | Gibco | 15630080 | |
| раствор хлорида аммония | STEMCELL Technologies | 7850 | |
| Anti-human CD127 PE (клон hIL-7R-M21) | BD Biosciences | 557938 | |
| Anti-human CD25 APC (клон BC96) | Biolegend | 302610 | |
| Античеловеческий CD4 FITC (клон SK3) | Biolegend | ||
| Античеловеческий CD71 PE (клон SK1) | Biolegend | 334106 | |
| Античеловеческий CD8 PerCP (клон SK1) | Biolegend | ||
| Античеловеческий CTLA-4 PerCP-e710 | ThermoFisher | 46-1529-42 | |
| Античеловеческий EGFR APC (клон AY13) | Biolegend | 352905 | |
| Античеловеческий FOXP3 eFluor 450 | ThermoFisher | 48-4776-42 | |
| Античеловеческий HELIOS PE | Biolegend | 137216 | |
| Ca2+ и Mg2+ свободный Dulbecco' s Фосфатно-солевой буфер (DPBS) | Счетчик клеток Gibco | 14190144 | |
| (автоматический счетчик клеток TC20) | Горки для | ||
| Bio-Rad | 1450016 | ||
| Набор для пролиферации фиолетовых клеток CellTrace | ThermoFisher | C34571 | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
| Easy 50 EasySep магнит | STEMCELL Technologies | 18002 | |
| EasySep Human CD4+ Набор для обогащения Т-клеток | STEMCELL Technologies | 19052 | |
| EasySep Human CD8+ Набор для обогащения Т-клеток | STEMCELL Technologies | 19053 | |
| EasySep magnet | STEMCELL Technologies | 18000 | |
| eBioscience Foxp3 набор буферов для окрашивания транскрипционного фактора | ThermoFisher | 00-5523-00 | |
| Falcon Круглодонные полистирольные пробирки с клеточным фильтром Snap Cap, 5 мл | Fisher Scientific | 08-771-23 | 40μ m |
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS) | Gibco | 26140079 | |
| Проточный цитометр | Beckman Coulter | CytoFLEX LX U3-V5-B3-Y5-R3-I2 | |
| Флуоресцентно-активируемый сортировщик клеток | BD Biosciences | FACS Сортировщик клеток Aria III | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| Расширение и активация CD3/28 Т-клеток человека Dynabeads | Gibco | 11131D | |
| Неоновая трансфекционная система Invitrogen | ThermoFisher | 10431915 | |
| Invitrogen Neon Transfection System 100 μ L Kit | ThermoFisher | 10114334 | |
| Лентивирус | VectorBuilder | ||
| MEM Раствор заменимых аминокислот | Gibco | 11140050 | |
| Myc Tag антитело A647 (клон 9B11) | Cell Signaling Technologies | 2233S | |
| Opti-MEM I Редуцированная сыворотка среда | ThermoFisher | 31985062 | |
| раствор пеницилина-стрептомицина | Gibco | 15140122 | |
| рекомбинантный человеческий интерлейкин-2 (rhIL-2) | Пепротех | 200-02 | |
| RPMI 1640 среда, Без глютамина | Gibco | 11875093 | |
| пируват натрия | Gibco | 11360070 | |
| спектральный проточный цитометр | Cytek | Northern Lights | |
| TRAC гРНК | Синтего | последовательность (CAGGGTTCTGGATATCTGT) | |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | ThermoFisher | A36496 | |
| Trypan Blue раствор | Сигма | T8154-100ML | |
| 1/10 Leukopak | STEMCELL Technologies | 200-0092 | 1-2 миллиарда PBMC |
Ссылки
- Zhang, X., Zhu, L., Zhang, H., Chen, S., Xiao, Y. CAR-T cell therapy in hematological malignancies: current opportunities and challenges. Front Immunol. 13, 927153(2022).
- Cappell, K. M., Kochenderfer, J. N. Long-term outcomes following CAR T cell thera....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
