Method Article

Острая одноединичная многоэлектродная запись из ствола мозга мышей с фиксированной головой

DOI:

10.3791/67205

⸱

October 11th, 2024

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, University of Virginia, 2Neuroscience Graduate Program, University of Virginia, 3Department of Pharmacology, University of Virginia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает метод получения in vivo однонейронных записей высокой плотности из ствола мозга мышей с фиксированной головой. Этот подход используется для измерения потенциала активации нейронов в вентролатеральном периакведукальном сером состоянии - области ствола мозга, неактивной во время быстрого сна (REM) - до и во время общей анестезии.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Записи на основе кремния на основе нескольких электродов становятся все более популярными для изучения нейронной активности при временном разрешении потенциалов действия во многих областях мозга. Тем не менее, запись нейронной активности из глубоких каудальных структур, таких как ствол мозга, с помощью многоканальных зондов остается сложной задачей. Серьезной проблемой является поиск траектории введения зонда, которая позволяет избежать крупных кровеносных сосудов, таких как верхний сагиттальный венозный синус и поперечный венозный синус. Повреждение этих крупных вен может привести к обширному кровотечению, повреждению подлежащей ткани мозга и, возможно, к смерти. Этот подход описывает нацеливание на структуры ствола мозга путем сопряжения передних координат с угловым подходом, что позволяет записывающему зонду проникать в мозг ниже сосудистых структур высокого риска. По сравнению со строго вертикальным подходом, угловой подход максимизирует количество областей мозга, которые могут быть нацелены. Используя эту стратегию, можно воспроизводимо и надежно получить доступ к вентролатеральному периакведутокальному серому (vlPAG), области ствола мозга, связанной с быстрым сном, для получения однокомпонентных многоэлектродных записей у мышей с фиксированной головой до и во время анестезии севофлураном. Возможность регистрировать активность нейронов в vlPAG и окружающих ядрах с высоким временным разрешением является шагом вперед в понимании взаимосвязи между быстрым сном и анестезией.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Записи на основе кремниевых мультиэлектродов становятся все более популярными для измерения нейронной активности во многих областях мозга с разрешением потенциала одиночного действия 1,2,3,4. За последнее десятилетие технологии записи с высокой плотностью значительно выросли. Современные записывающие электроды на основе кремния могут работать с большим количеством каналов, оптическими волокнами и записывающими устройствами электрокортикографии (ЭКоГ) 5,6. Более того, хроническая имплантация этих электродов позволяет проводить длительные записи 7,8.

Несмотря на последние технологические достижения, воздействие на глубокие каудальные структуры, такие как ствол мозга, с помощью многоканальных зондов остается сложной задачей. При нацеливании на структуры ствола мозга, такие как вентролатеральный периакqueductal gray (vlPAG), одним из существенных препятствий является определение траектории зонда, которая избегает крупных кровеносных сосудов, например, верхнего сагиттального венозного синуса и поперечного венозного синуса. Повреждение этих крупных вен может вызвать обширное кровотечение, повреждение подлежащей ткани мозга и даже летальный исход 9,10. Мы предлагаем нацеливаться на структуры ствола мозга от передних координат под углом, что позволяет записывающему зонду проникать в мозг ниже таких сосудистых структур высокого риска (см. рис. 1). Такой угловой подход, по сравнению с вертикальным, максимизирует количество областей мозга, доступных для записи. Кроме того, в экспериментальных условиях, когда желательны записи ЭКоГ, наклонный передний доступ обеспечивает большую поверхность черепа, доступную для имплантации гарнитуры ЭКоГ, поскольку краниотомическое окно для введения зонда расположено более кпередо10,11.

Идентификация конкретных групп клеток и цепей, ответственных за вызванные анестезией изменения быстрого сна, остается основной целью исследований в области анестезии. Таким образом, целью здесь был воспроизводимый и надежный доступ к vlPAG - области ствола мозга, связанной с быстрым сном - для получения однокомпонентных многоэлектродных записей у мышей с фиксированной головой до и во время анестезии севофлураном12,13. В предыдущих исследованиях использовались электрофизиологические измерения потенциала локального поля (LFP) vlPAG у бодрствующих мышей для выявления изменений состояния нейронов, связанных с анестезией14,15. Тем не менее, измерения LFP в первую очередь чувствительны к синаптической активности, а не к потенциалам действия, в пределах регистрируемой области16. Следовательно, остается ограниченное понимание того, как анестетики напрямую влияют на паттерны нейронной активности, производимые нейронами vlPAG. В данной работе описан метод получения однонейронных записей высокой плотности из ствола мозга мышей с фиксированной головой. Этот метод также может быть адаптирован для регистрации активности одиночных нейронов из различных других глубоких и задних структур ствола мозга.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все исследования были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию в Университете Вирджинии (Шарлоттсвилль, штат Вирджиния). Использовали пять самцов мышей C57BL/6J в возрасте 3-7 месяцев массой 25-30 г. Подробная информация о реагентах и используемом оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Имплантация оголовья и гарнитуры

  1. Изготовьте гарнитуру ECoG, припаяв провод из нержавеющей стали с покрытием перфторалкокси (PFA) к 3-контактному разъему разъема (рис. 2A).
  2. Определение координат вставки на основе стереотаксического атласамыши 17. Использование теоремы Пифагора для расчета угла и глубины введения зонда, особенно когда в литературе мало информации, является разумной отправной точкой (Рисунок 1)18.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В конечном счете, координаты будут корректироваться методом проб и ошибок. Для наведения на vlPAG у взрослых мышей использовали следующие координаты: переднезаднюю (AP) -3,6 мм, медиолатеральную (ML) +0,5 мм, дорсовентральную (DV) -4 мм. Щуп был введен под углом 20° (AP).
  3. Вызвать общую анестезию, поместив мышь в индукционную камеру (1,5%-3% изофлурана в кислороде). После обезболивания поместите мышь в стереотаксическую рамку, поместив нос животного в носовой конус и стабилизируя голову с помощью перекладин для головы.
  4. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить повреждение роговицы. Используйте систему контроля температуры для поддержания температуры тела на уровне 37 °C.
  5. Нанесите крем для эпиляции или сбрейте шерсть на кожу головы, затем продезинфицируйте повидон-йодом и 70% спиртом. Используйте асептическую технику «только наконечники» для поддержания стерильности операционного поля.
  6. Проведите тест на защемление пальцев ног, чтобы проверить глубину анестезии.
  7. Обезболивание: карпрофен 2,5 мг/кг, вводится подкожно в спину.
  8. Сделайте разрез кожи головы диаметром 5 мм, чтобы удалить круглый участок кожи над теменной и затылочной костями. Аккуратно удалите мозговые оболочки, соскоблив их лезвием скальпеля.
  9. С помощью лезвия скальпеля разрежьте мышечные прикрепления и обнажите теменные и затылочные кости19. Применяйте перекись водорода по мере необходимости, чтобы остановить кровотечение и высушить поверхность черепа. Очень важно нанести стоматологический цемент и смолу на сухой череп для достижения прочного соединения.
  10. Во-первых, определите брегму и лямбду ориентиры на черепе20. Затем отрегулируйте положение носового конуса, чтобы выровнять передне-заднее положение черепа, убедившись, что разница в высоте между двумя ориентирами не превышает 100 мкм.
  11. Чтобы выровнять медиально-латеральное положение черепа, выберите две противоположные точки между брегмой и лямбдой, каждая из которых находится на расстоянии 1 мм от сагиттального шва, и проверьте их уровень. Если разница в высоте между ними превышает 100 мкм, отрегулируйте медиально-латеральное положение черепа, манипулируя головными брусьями.
  12. Измерьте расстояние между брегмой и лямбдой и сравните его с расстоянием, указанным в стереотаксическом атласе Франклина-Паксиноса (обычно 4,2 мм)17. Используйте разницу между измеренным и сообщенным расстояниями для пропорционального масштабирования координаты точки доступа. Отметьте координаты трепанации черепа на черепе стерилизованным карандашом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если измеренное расстояние брегма-лямбда отличается от 4,2 мм, то координаты необходимо масштабировать пропорционально. Все координаты AP, указанные в стереотаксическом атласе, соответствуют стандартизированному расстоянию брегма-лямбда. Поскольку размер мышиного черепа вариален, важно соответствующим образом настроить свои координаты.
  13. С помощью стереотаксического микроманипулятора расположите оголовье непосредственно поверх лямбда-шва и закрепите его на черепе, наложив стоматологический цемент на оголовье и вокруг него (рис. 3A, B). Дайте цементу высохнуть не менее 10 минут.
  14. Просверлите отверстия для заусенцев (0,5 мм в диаметре) для двух кортикальных электродов (лобной и теменной коры) и для одного, который будет служить электродом сравнения (мозжечок). Поместите зачищенные концы (0,5 мм) электродов из серебряной проволоки с покрытием в отверстия для заусенцев и закрепите с помощью смолы, активируемой ультрафиолетовым светом.
  15. Полностью покройте проволоку из нержавеющей стали с покрытием стоматологическим цементом, чтобы ни одна проволока не обнажалась. Покройте нижнюю и боковые стороны гарнитуры стоматологическим цементом, чтобы она надежно закрепилась на месте. Убедитесь, что шовные нити брегмы и лямбды остаются видимыми после того, как гарнитура будет закреплена на месте (рис. 2B).
  16. Дайте мыши восстановиться в течение как минимум 7 дней, ежедневно осматривайте животное и место операции на предмет каких-либо нарушений. При необходимости вводите анальгетики (Карпрофен 2,5 мг/кг,/к).

2. Размещение и запись силиконового зонда

  1. Приучите мышь к записывающему устройству и фиксации головы (не менее 1,5 ч в два отдельных дня) (Рисунок 2D).
  2. В день записи поместите мышь в анестезиологическую камеру (изофлуран 1,5%-3% в кислороде).
  3. Расположите мышь в стереотаксической рамке, отрегулируйте носовой обтекатель и перекладины головы, как описано в 1.3. Поддерживайте анестезию (изофлуран 1,5%-3% кислорода) на протяжении всей стереотаксической операции. Проведите тест на защемление пальцев ног, чтобы проверить глубину анестезии.
  4. Наносите офтальмологическую мазь на глаза и поддерживайте достаточную температуру тела.
  5. Определите брегму и лямбду, убедившись, что разница в высоте между двумя анатомическими ориентирами не превышает 100 мкм.
  6. Найдите и отметьте вычисленные координаты на черепе стерильным карандашом, затем создайте контур окна трепанации черепа размером 2 мм х 2 мм вокруг координат.
  7. Проведите тест на защемление пальцев ног, чтобы проверить глубину анестезии.
  8. С помощью высокоскоростного сверла создайте окно для трепанации черепа размером 2 мм x 2 мм. Нанесите 0,5-1 мл физиологического раствора, чтобы предотвратить высыхание поверхности мозга. Удалите твердую мозговую оболочку с помощью иглы шприца и тонких щипцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за крупными сосудами (верхний сагиттальный синус, поперечный синус), чтобы избежать чрезмерного кровотечения (Рисунок 3).
  9. С помощью высокоскоростного сверла создайте отдельное отверстие для заусенцев для электрода сравнения силиконового зонда, обычно на расстоянии ~1-2 мм от краниального окна.
  10. Нанесите 0,2 мл малотоксичного силиконового клея на череп, чтобы полностью закрыть трепанацию черепа, с помощью прилагаемого аппликатора.
  11. Дайте мыши восстановиться в течение примерно 1 часа.
  12. Прикрепите головку мыши к электрофизиологическому регистрирующему стенду с помощью оголовья и винтов (рис. 2D).
  13. Покройте кремниевый хвостовик зонда флуоресцентным красителем DiI (1:4 DiI:Ethanol), чтобы траекторию зонда можно было реконструировать после эксперимента.
  14. Установите щуп на манипулятор и установите нужный угол. Для наведения vlPAG применялся угол AP 15-20°.
  15. Опустите записывающий зонд на поверхность мозга в центре черепного окна. Сначала вручную вставьте щуп на глубину ~300 мкм. После введения на эту глубину медленно опустите зонд автоматически (например, на 200 мкм/мин) на заданную глубину, чтобы свести к минимуму повреждение тканей21 (рисунок 2C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначально рекомендуется вводить щуп вручную. Ручное введение датчика обеспечивает возможность остановки и втягивания датчика в случае его изгиба при первоначальном введении. После того, как зонд полностью проникнет в ткань, как правило, безопасно продолжать опускание зонда в автоматическом режиме.
  16. Нанесите минеральное масло на поверхность мозга в пределах окна трепанации черепа, чтобы предотвратить высыхание.
  17. Дайте записывающему щупу отстояться в течение 10 минут после введения.
  18. Записывайте данные с кремниевого зонда и ЭКГ на частоте 30 кГц с помощью записывающего контроллера Intan.
  19. Через 1-2 ч после записи используйте технику транскардиальной перфузии для фиксации мозга в 4% параформальдегида22.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за цемента может быть трудно удалить ростральную часть черепа. Вот почему предпочтительнее иссекать мозг путем удаления дорсальных частей черепа.
  20. Обезглавите мышь, разрежьте кожу по средней линии на спинной стороне, от шеи до нижней челюсти. Удалите мышцы и ткани, прикрепленные к черепу, отрежьте нижнюю челюсть для более легкого доступа к мозгу.
  21. Если перфузия выполнена правильно, мозг должен немного сузиться, оставив достаточно места для вставки тонких ножниц в дорсальную часть большого затылочного отверстия. Сделайте один медиальный надрез, один боковой и один контралатеральный надрез размером около 1 мм в затылочной кости.
  22. Аккуратно удалите тыльную часть черепа с помощью офтальмологических щипцов. Начните с затылочной кости, удалите все фрагменты черепа до тех пор, пока не обнажится вся дорсальная часть мозга.
  23. Проведите микрошпателем под мозг, начиная с обонятельных луковиц, чтобы вычерпать мозг.
  24. После перфузии и удаления мозг может храниться в 4% параформальдегиде при 4 °C в течение 24-48 часов.

3. Гистология для реконструкции траектории зонда

  1. Разрез мозга на корональные участки по 70 мкм с помощью вибратома.
  2. Закрепите секции на предметных стеклах с помощью монтажной среды DAPI, которая окрашивает ядра клеток. Закройте слайд и заклейте горки прозрачным лаком для ногтей.
  3. Изобразите предметные стекла на флуоресцентном микроскопе. Отрегулируйте контрастность/яркость так, чтобы следы щупа были четко видны. Убедитесь, что размер результирующего файла изображения tiff меньше 10 МБ, чтобы коды MATLAB работали без проблем. Восстановите треки зонда с помощью кода MATLAB23.

4. Анализ электрофизиологических данных

  1. Анализируйте записанные нейронные сигналы от кремниевого зонда с помощью автономного программного обеспечения для обнаружения и автоматической сортировки (Kilosort)24.
  2. Классификация обнаруженных кластеров с помощью Phy вручную как много- или одиночных блоков25. Классифицируйте кластеры как отдельные единицы, если они имеют физиологическую форму волны спайка, демонстрируют рефрактерный период в перекрестной коррелограмме и нормальное распределение амплитудного представления.
  3. Импорт данных об отдельных единицах измерения в MATLAB и анализ23.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пятерым мужчинам C57BL/6J были имплантированы ЭКоГ-гарнитура и оголовье (Рисунок 4A). После выздоровления мышей приучили к фиксации головы и электрофизиологической регистрирующей установке в течение двух сеансов по 1,5 часа в разные дни (рис. 4B). Затем было создано окно для трепанации черепа размером 2 мм x 2 мм (рис. 4C) и силиконовый зонд был вставлен в рабочее состояние мыши и зафиксирована на голове (рис. 4D). Использовались два типа кремниевых зондов UCLA: (1) 64 M: однохвостовой, 64-электродный зонд; и (2) 256 ANS: четырехстоечный, 256-дюймовый электродный зонд. Севофлуран и кислород вводили с помощью носового конуса, закрепленного на электрофизиологической установке. Уровни кислорода и севофлурана контролировались каждые 5 минут с помощью встроенного газоанализатора. После транскардиальной перфузии мозг был собран (рисунок 4E) и оценен на траекторию зонда (рисунок 4F). Затем записанные потенциалы действия были собраны в данные по одной единице (рис. 4G).

Было выполнено пять записей, в которых размещение зонда было валидировано с помощью доступных алгоритмов реконструкции зонда, разработанных в MATLAB23. С помощью этих алгоритмов каждый электрод кремниевого зонда был локализован в определенной структуре мозга, так что была получена трехмерная перспектива размещения зонда в мозге (рис. 5). Эти алгоритмы реконструкции были объединены с иммуногистохимическими маркерами для дальнейшей валидации траекторий зондов (рис. 6). Затем данные были сопоставлены с отобранными отдельными единицами (рис. 7).

Всего было захвачено 64 одиночных нейрона, из которых 13 были расположены в vlPAG. Остальные 51 нейрон находились в близлежащих ядрах: среднем мозге, ретикулярном ядре среднего мозга, паратрохлеарном ядре, клинописном ядре, латеродордальном тегментальном ядре, парабрахиальном ядре и верхних мозжечковых ножках. Активность возбуждения нейронов у каждой мыши представлена в виде тепловых карт (рис. 7). Мышь 3 была исключена из анализа из-за плохого качества записи на одну единицу. Большинство зарегистрированных нейронов снизили возбуждение во время анестезии севофлураном.

Среднее значение возбуждения нейронов vlPAG сравнивалось для каждой мыши через 5 минут после начала записи (т.е. через 10-15 минут после начала записи) и через 5 минут после приема севофлурана (т.е. через 40-45 минут после начала записи). Возбуждение vlPAG было значительно снижено (Рисунок 8A), и, кроме того, это увеличение было последовательным для всех нейронов vlPAG (Рисунок 8B).

figure-results-1
Рисунок 1: Вычисление стереотаксических координат для ввода зонда. Левая панель: Использование геометрии для расчета углового подхода для введения преобразователя. Были выделены следующие составляющие прямоугольного треугольника: (а) глубина DV целевой структуры от поверхности мозга (полученная с помощью стереотаксического атласа), (b) расстояние между координатой AP при условии строго вертикального спуска и координатой AP целевой структуры. Правая панель: С помощью пунктов (a) и (b) можно использовать теорему Пифагора для вычисления угла AP (β) и длины (c) вводимого зонда. Для наведения vlPAG использовались следующие координаты: (AP) -3,6 мм, (ML) +0,5 мм, (DV) -4 мм. Использовался угол AP (β) 20°. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Имплантация оголовья и запись на одну единицу. (А) Установка провода гарнитуры ЭКоГ во время имплантации. (B) Вид сверху на череп мыши после имплантации гарнитуры ECoG и оголовья. (C) Силиконовые хвостовики зонда, вставленные в мозг. (D) Мышь, закрепленная на голове, во время записи с помощью силиконового зонда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Расположение краниального окна относительно крупных кровеносных сосудов. Схематическое изображение сосудистой сети на поверхности головного мозга мыши с отмеченными верхним сагиттальным синусом и поперечным синусом. Белый квадрат указывает на расположение черепного окна, а красная точка представляет точку введения зонда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Экспериментальный дизайн. Пяти самцам мышей C57BL/6J были имплантированы ЭКоГ-гарнитура и оголовье (А). После выздоровления они были приучены к фиксации головы и записывающей установке (В). Затем была выполнена трепанация черепа (С) и введен силиконовый зонд, когда мышь находится в бодрствующем состоянии и в неподвижном положении головы. Летучие анестетики и кислород вводились с помощью носового конуса (D). После записи мозг был собран (E) и проанализирован с использованием иммуногистохимических методов для реконструкции траектории зонда (F). Затем записанные потенциалы действия были собраны в данные одной единицы (G). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: 3D-модель мозга с реконструированными следами зонда. Каждая прямая цветная линия представляет собой траекторию зонда. Каждая точка отмечает местоположение красителя DiI, видимого на корональных срезах мозга. Траектория зонда восстанавливается для каждого хвостовика кремниевого зонда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-6
Рисунок 6: Апостериорная реконструкция размещения зонда в vlPAG. Репрезентативный корональный срез мозга для каждой зарегистрированной мыши (1-5), окрашенный DAPI (синий), показывающий следы зонда (DiI, красный, отмечен зелеными стрелками) с контуром областей мозга. Масштабная линейка: 500 μм. Мыши 1-3 были зарегистрированы с помощью однокорпусных кремниевых зондов (т.е. 64 каналов), тогда как мыши 4 и 5 были зарегистрированы с помощью четырехстоечных кремниевых зондов (т.е. 256 каналов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-7
Рисунок 7: Активность группового возбуждения до и во время анестезии севофлураном. Тепловые карты представляют собой количество возбужденных потенциалов действия 64 отдельных нейронов с интервалом в одну минуту. Отдельным нейронам была присвоена структура происхождения на основе реконструкции траектории зонда. Белой пунктирной линией обозначено начало введения севофлурана, n = 4 мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-8
Рисунок 8: Отмена возбуждения нейронов vlPAG во время анестезии севофлураном. (А) Среднее число потенциалов действия, возбужденных до и во время анестезии для каждой мыши. (B) Количество потенциалов действия, возбуждаемых каждым нейроном vlPAG (B). Парный t-тест Стьюдента, **P = 0,0036, P = 0,0053 соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-9
Рисунок 9: Пример того, как неравномерное расположение оголовья может повлиять на траекторию зонда. (A) Неравномерное расположение оголовья на головке мыши. (B,C) 3D-реконструкция мозга мыши с визуализированной траекторией зонда, где существует непреднамеренный медиолатеральный угол, вызванный неравномерным размещением головных пластин на голове мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ядра ствола мозга опосредуют основные функции, такие как дыхание, сознание и сон 26,27,28. Расположение ствола мозга (глубоко и сзади) представляет собой проблему для изучения его нейронной активности in vivo с использованием стандартных методов. Здесь представлен угловой передний доступ, позволяющий воспроизводить одноединичную запись у мышей, закрепленных за головой.

Тщательное введение многоэлектродного силиконового зонда имеет решающее значение для обеспечения последовательного нацеливания на структуры ствола мозга, связанные с быстрым сном, избегая при этом повреждения основных кровеносных сосудов. Требуется значительная степень ловкости, концентрации и терпения, чтобы определить наилучшие координаты и траекторию входа13.

Из-за наклонной траектории зонда и расстояния, необходимого для нацеливания на глубокие структуры, даже незначительные несоответствия в координатах и позиционировании налобной пластины, скорее всего, приведут к промаху в целевой структуре. Крайне важно, чтобы Bregma и Lambda находились на одном уровне во время имплантации оголовья и чтобы расстояние между ними было точно измерено. Примечательно, что поскольку операции проводятся на стереотаксической раме, а запись выполняется на отдельном электрофизиологическом стенде, крайне важно, чтобы оголовные пластины были закреплены на выровненном черепе. Введение дополнительных углов (например, наклон головы) увеличивает риск ошибки, который особенно высок для небольших глубоких структур мозга (рис. 9).

Поскольку силиконовые зонды хрупкие, важно удалить твердую мозговую оболочку с поверхности мозга и убедиться, что костные фрагменты не препятствуют краниальному окну. После удаления твердой мозговой оболочки может возникнуть легкое кровотечение, поэтому крайне важно очистить поверхность краниотомии от застывшей крови, которая может привести к изгибу зонда. Если введение силиконового зонда в мозг оказывается затруднительным (например, зонд изгибается), важно проверить, не осталось ли твердой мозговой оболочки или не высохла ли поверхность мозга, так как при отсутствии жидкости может образоваться тонкая мембрана. У человека27 области, близкие к кровеносным сосудам, имеют более толстую твердую мозговую оболочку, и аналогичная проблема обнаружена у мышей, где удаление твердой мозговой оболочки без разрыва сосудов может быть сложной задачей. Хотя тщательное удаление твердой мозговой оболочки обычно приводит к плавному введению зонда, большие углы введения могут представлять дополнительные трудности.

Качество записей может значительно варьироваться у разных животных и зависит от множества переменных. Одним из важных факторов является плотность нейронов в целевой структуре; Области с низкой плотностью нейронов (например, кора головного мозга), как правило, имеют более низкий выход зарегистрированных одиночных нейронов. Кроме того, повреждение тканей, такое как разрыв сосуда под поверхностью мозга, может привести к гибели нейронов или травме, что еще больше снижает выход21,29. Качество записей также имеет решающее значение, так как более высокое качество записей облегчает различие отдельных нейронов. Отклонение траектории зонда от цели также может привести к снижению производительности. Несмотря на то, что этот протокол был разработан для записи в vlPAG, он может быть использован для записи из близлежащих структур в стволе мозга.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов или других конфликтов интересов в связи с этой работой.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рисунок 1, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 8 и Рисунок 9 были созданы с помощью BioRender.com. Мы хотели бы поблагодарить Скотта Килянски за помощь с кодом MATLAB и за то, что он поделился своими скриптами. Благодарим Анну Грейс Карнс за помощь в реконструкции траектории зонда.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1024-канальный контроллер записи RHDIntan Technologies, Лос-Анджелес, Калифорния, СШАC3008Запись силиконового зонда; записывающее аппаратное и программное обеспечение
24 мм x 50 мм No 1.5 VWR coverslipVWR, Раднор, Пенсильвания, США48393-081Гистология
4% PFA в PBSThermoFisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, СШАJ61899. Гистология АК; перфузионный раствор
C& B метабондPatterson Dental, Ричмонд, Вирджиния, СШАпорошок: 5533559, быстрорастворимое основание: 5533492, катализатор: 55335007Оголовок и Имплантация гарнитуры
C57/6J мышам 4-6 недель, самцыThe Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, США000664
Capnomac UltimaDatex, Хельсинки, Финляндия Газоанализатор УЛТ-СВи-27-07; снят с производства; альтернативный газоанализатор можно приобрести в компании Bionet America 
CM-DiIThermoFisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, СШАV22888 Красныйфлуоресцентный краситель для покрытия силиконового зонда
Разъем HeaderDigiKey, Thief River Falls, Миннесота, США1212-1788-NDECoG Гарнитура
DAPI Fluoromount-GSouthernBiotech, Бирмингем, Алабама, США0100-20Гистология
iBOND UniversalPatterson Dental, Ричмонд, Вирджиния, США044-1113Оголовье и Имплантация гарнитуры; для  крепление проводов из нержавеющей стали к черепу
Низкотоксичный силиконовый клейWorld Precision Instruments, Сарасота, Флорида, СШАна головной пластинеKWIK-SIL
New Scale Technologies, Виктор, Нью-Йорк, СШАМультизондовый манипулятор: XYZ Столик в сборе: 06464-0000, Комплект системы MPM: 06267-3-0001, MPM-платформа-360, кольцо MPM для ручного оружия MPM, MPM_Ring-72 DEG: 06262-3-0000Запись с помощью силиконового зонда; введение зонда в мозг
МикрозондыUCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, США256 ANS, 64MСнято с производства; альтернативные силиконовые зонды можно приобрести в компании Neuropixels
Mineral OilSigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАM8410-100MLЗапись силиконового зонда; предотвращение высыхания ткани во время записи
Нормальный физиологический растворThermoFisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, СШАZ1376Оголовье и Имплантация гарнитуры; предотвращение высыхания мозга во время операции
проволока из нержавеющей стали с покрытием PFA-диаметр 0,008 дюйма с полосатыми концамиA-M systems, Sequim, Вашингтон, США791400ECoG Гарнитура и электрод сравнения для ECoG 
Проволока платиновая 24AWG World Precision Instruments, Сарасота, Флорида, СШАЭлектрод сравнения PTP201для записи кремниевого зонда 
Предметные стекла микроскопа Shandon Colorfrost PlusThermoFisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США99-910-01Гистология
Нержавеющая сталь ОголовьеСтар Рапид, Китайизготовленная на заказ детальОголовье и Имплантация гарнитуры; дизайн доступен по запросу
Стереотаксический аппаратKOPF, Туджунга, Калифорния, СШАМодель 940 Стереотаксический инструмент для мелких животных с цифровым дисплеем КонсольОголовье и Имплантация гарнитуры
Система микроманипулятора

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, F., et al. Monolithically integrated µLEDs on silicon neural probes for high-resolution optogenetic studies in behaving animals. Neuron. 88 (6), 1136-1148 (2015).
  2. Hong, G., Lieber, C. M. Novel electrode technologies for neural recordings. Nat Rev Neurosci. 20 (6), 330-345 (2019).
  3. Li, N., Daie, K., Svoboda, K., Druckmann, S. Robust neuronal dynamics in premotor cortex during motor planning. Nature. 532 (7600), 459-464 (2016).
  4. Kipke, D. R., et al. Advanced neurotechnologies for chronic neural interfaces: New horizons and clinical opportunities. J Neurosci. 28 (46), 11830-11838 (2008).
  5. Steinmetz, N. A., Koch, C., Harris, K. D., Carandini, M. Challenges and opportunities for large-scale electrophysiology with Neuropixels probes. Curr Opinion Neurobiol. 50, 92-100 (2018).
  6. Nunez-Elizalde, A. O., et al. Neural correlates of blood flow measured by ultrasound. Neuron. 110 (10), 1631-1640.e4 (2022).
  7. Yang, L., Lee, K., Villagracia, J., Masmanidis, S. C. Open source silicon microprobes for high throughput neural recording. J Neural Eng. 17 (1), 016036(2020).
  8. Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).
  9. Augustinaite, S., Kuhn, B. Chronic cranial window for imaging cortical activity in head-fixed mice. STAR Protoc. 1 (3), 100194(2020).
  10. Dias, M., et al. Transection of the superior sagittal sinus enables bilateral access to the rodent midline brain structures. eNeuro. 8 (4), (2021).
  11. Gao, Z. R., et al. Tac1-expressing neurons in the periaqueductal gray facilitate the itch-scratching cycle via descending regulation. Neuron. 101 (1), 45-59.e9 (2019).
  12. Atluri, N., et al. Anatomical substrates of rapid eye movement sleep rebound in a rodent model of post-sevoflurane sleep disruption. Anesthesiology. 140 (4), 729-741 (2023).
  13. Weber, F., Dan, Y. Circuit-based interrogation of sleep control. Nature. 538 (7623), 51-59 (2016).
  14. Frontera, J., et al. Bidirectional control of fear memories by cerebellar neurons projecting to the ventrolateral periaqueductal grey. Nat Commun. 11 (1234567890), (2020).
  15. Weber, F., et al. Regulation of REM and Non-REM sleep by periaqueductal GABAergic neurons. Nat Commun. 9 (1), 354(2018).
  16. Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
  17. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Elsevier, AP. Amsterdam. (2008).
  18. Pythagorean theorem. , Available from: https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Pythagorean_theorem&oldid=1222259845 (2024).
  19. The Anatomy of the Laboratory Mouse. , Available from: https://www.informatics.jax.org/cookbook/chapters/skeleton.shtml (2024).
  20. Cecyn, M. N., Abrahao, K. P. Where do you measure the Bregma for rodent stereotaxic surgery. IBRO Neurosci Rep. 15, 143-148 (2023).
  21. Fiáth, R., et al. Slow insertion of silicon probes improves the quality of acute neuronal recordings. Sci Rep. 9, 111(2019).
  22. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-protocol. 11 (5), e3988(2021).
  23. Peters, A. petersaj/AP_histology. , https://github.com/petersaj/AP_histology (2024).
  24. Pachitariu, M., Sridhar, S., Stringer, C. Solving the spike sorting problem with Kilosort. , (2023).
  25. Akam, T., Walton, M. E. pyPhotometry: Open source Python based hardware and software for fiber photometry data acquisition. Sci Rep. 9 (1), 3521(2019).
  26. Leiras, R., Cregg, J. M., Kiehn, O. Brainstem circuits for locomotion. Ann Rev Neurosci. 45 (2022), 63-85 (2022).
  27. Benarroch, E. E. Brainstem integration of arousal, sleep, cardiovascular, and respiratory control. Neurology. 91 (21), 958-966 (2018).
  28. Guyenet, P. G., Bayliss, D. A. Neural control of breathing and CO2 homeostasis. Neuron. 87 (5), 946-961 (2015).
  29. Potter, K. A., Buck, A. C., Self, W. K., Capadona, J. R. Stab injury and device implantation within the brain results in inversely multiphasic neuroinflammatory and neurodegenerative responses. J Neural Eng. 9 (4), 046020(2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multi Electrode RecordingsBrainstem RecordingsHead Fixed MiceSilicon ProbesSingle Unit RecordingStereotaxic SurgeryCraniotomy ProcedureNeuronal ActivitySevoflurane AnesthesiaVentrolateral Periaqueductal Gray

Related Articles