В настоящем исследовании подчеркиваются преимущества использования метода, разработанного Джеффри и Хамфри для извлечения и количественного определения жирорастворимых пигментов из микроводорослей. Этот метод служит ценным инструментом для оценки влияния факторов роста на продукцию хлорофилла и содержание клеток в этих организмах.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Оценка влияния факторов роста на продукцию хлорофиллов а и в из микроводорослей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Микроводоросли содержат две основные группы пигментов: хлорофиллы и каротиноиды. Хлорофилл – это зеленый пигмент, который поглощает световую энергию и преобразует ее в химическую энергию, способствуя синтезу органических соединений. Этот пигмент служит ценным первичным источником для биотехнологических продуктов в пищевой, фармацевтической и косметической промышленности благодаря своим высоким антиоксидантным свойствам и красящим свойствам. Целью данного исследования была оценка влияния факторов роста (концентрация CO2 , цвет и интенсивность света) с помощью экспериментального дизайна Taguchi L4 на рост клеток и содержание хлорофилла a и b в клетках Chlorella sorokiniana с последующей валидацией метода с использованием Haematococcus pluvialis микроводоросли в качестве дополнительной модели для исследования. Количественный рост клеток определяли с помощью спектрофотометрического метода оптической плотности на длине волны 550 нм. Для количественного определения хлорофиллов был получен клеточный экстракт с использованием 90% чистого раствора ацетона, а затем концентрации хлорофиллов a и b количественно определяли с помощью спектрофотометрических методов на длинах волн 647 нм и 664 нм, согласно методу, описанному Jeffrey and Humphrey. Экспериментальные результаты показали, что контроль условий низкого присоединенияCO2 , фиолетового света и низкой интенсивности света увеличивает как рост клеток, так и концентрацию хлорофиллов a и b в клетках. Реализация этого метода количественного определения хлорофилла позволяет быстро, просто и точно определить содержание хлорофилла, поскольку используемые длины волн находятся на пиках поглощения обоих типов хлорофиллов, что делает этот метод легко воспроизводимым для любых изучаемых микроводорослей.
Введение
В последние годы растущие экологические проблемы, вызванные антропогенной деятельностью, и ее негативное воздействие на здоровье и баланс экосистем привели к поиску более эффективных и экологически чистых производственных систем. Это ускорило процессы в промышленности и способствовало внедрению биомедикационных процедур и разработке биосоединений для смягчения этих вредных последствий1.
Этот контекст привел к значительному росту изучения микроводорослей, что обусловлено необходимостью поиска инновационных решений текущих экологических и экономических проблем. Микроводоросли процветают в водной среде, используя солнечный свет и углекислый газ в качестве источников энергии и углерода соответственно. Эта характеристика делает их устойчивой и перспективной альтернативой для производства различных ценных продуктов. Исследования в этой области были сосредоточены на понимании физиологии и метаболизма этих клеток, а также на разработке эффективных технологий их культивирования и переработки2.
Существует очевидная потребность в разработке доступных и надежных инструментов для изучения микроводорослей для ускорения исследовательских процессов и углубления понимания их физиологии, метаболизма и потенциального применения. Эти инструменты должны позволить проводить оперативный анализ влияния факторов окружающей среды и производства на ключевые параметры, такие как концентрация хлорофилла, которая является фундаментальным показателем здоровья и развития этих организмов. Снижение содержания хлорофилла может указывать на экологический стресс, дефицит питательных веществ или заболевания.
Эти зеленые пигменты играют решающую роль в фотосинтезе, улавливая энергию солнечного света для преобразования углекислого газа и воды в глюкозу и кислород и составляют от 0,5% до 5% биомассы микроводорослей. Помимо своей важной роли в поддержании жизненных процессов, хлорофиллы нашли применение в различных отраслях промышленности. Экстракты хлорофилла используются в пищевой промышленности и производстве напитков в качестве натуральных красителей, придавая продуктам яркие зеленые оттенки, а также обладая антиоксидантными свойствами. Кроме того, добавки на основе хлорофилла набирают популярность в секторе здоровья и хорошего самочувствия из-за их предполагаемого детоксикационного и противовоспалительного действия. Используя многогранные свойства хлорофилла, промышленность может разрабатывать инновационные продукты, способствующие как визуальной привлекательности, так и благополучию потребителей.
В связи с этим одной из микроводорослей, имеющих большое биотехнологическое значение, является C. sorokiniana. Этот микроорганизм отличается быстрыми темпами роста, что делает его очень эффективным в производстве биомассы. Кроме того, C. sorokiniana отличается разнообразным содержанием высокопитательных соединений, включая белки, липиды и витамины, что делает его ценным для различных применений в продуктах питания, кормахи производстве биотоплива. Кроме того, было обнаружено, что этот вид микроводорослей продуцирует внеклеточные ферменты с различными функциями, открывая возможности для биотехнологических применений, таких как очистка сточных вод, биоремедиация и фармацевтика4. В дополнение к быстрому росту и универсальному применению, C. sorokiniana также демонстрирует значительный потенциал для производства хлорофилла. Являясь фотосинтезирующим микроорганизмом, C. sorokiniana обладает механизмами, необходимыми для синтеза хлорофилла, который составляет от 0,5% до 5% биомассы микроводорослей3. Эта способность делает C. sorokiniana привлекательным кандидатом для производства хлорофилла в промышленных масштабах и обещает стать устойчивым решением насущных экологических и пищевыхпроблем5.
С другой стороны, еще одним видом микроводорослей, представляющим значительный интерес, является H. pluvialis. Эта микроводоросль известна своим производством астаксантина, мощного антиоксидантного пигмента с многочисленными промышленными применениями. Астаксантин служит защитным механизмом для фотосистемы H. pluvialis , защищая ее от окислительного стресса, вызванного факторами окружающей среды. Этот пигмент пользуется большим спросом в косметической, нутрицевтической промышленности и аквакультуре благодаря своим антиоксидантным свойствам и потенциальной пользе для здоровья. Обладая обширной способностью продуцировать астаксантин, H. pluvialis представляет собой многообещающее направление для разработки инновационных продуктов, отвечающих различным промышленным и потребительским потребностям6.
Недавние исследования также выявили потенциал H. pluvialis1 для производства хлорофилла, что еще больше повысило его промышленное значение. Например, в исследовании изучалось содержание хлорофилла в H. pluvialis при различных условиях роста и было обнаружено, что при оптимальных параметрах культивирования H. pluvialis демонстрирует замечательные темпы производства хлорофилла, превосходящие показатели других видов микроводорослей7. Это открытие подчеркивает потенциал H. pluvialis в качестве устойчивого источника хлорофилла, предлагая новые возможности для его использования в различных отраслях промышленности.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Приготовление питательных сред и посевного материала
- Приготовьте 1 л питательной среды 3N-BBM+ V(CCAP) (макроэлементы: NaNO3 [0,75 г л-1], CaCl2 [0,019 г л-1], MgSO4 [0,019 г л-1], K2HPO4 [0,057 г л-1], NaCl [0,025 г л-1], KH2PO4 [0,175 г л-1]; микроэлементы: Na2 EDTA [0,0186 г л-1], FeCl3 [0,0024 г L-1], MnCl2 [0,001 г L-1], ZnCl2 [1,25 x 10-4 г L-1], CoCl2 [5 x 10-5 г L-1], Na2MoO4 [9,98 x 10-5 г L-1])8 и стерилизуют в течение 15 мин при 121 °C и давлении 1,5 фунта на квадратный дюйм.
- Инокулировать колбу 1 л питательной среды в приблизительной концентрации 3 х 106 клеток мл-1 для микроводоросли C. sorokiniana; Или добавьте от 5% до 10% (v/v) инокулюма в питательную среду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания стерильных условий рекомендуется использовать капюшон с ламинарным потоком, перчатки, лабораторный халат и маску для лица. - Инкубируют инокулированную колбу при источниках красного света с приблизительной интенсивностью от 3 600 до 4 200 лк, при температуре от 22 до 26 °С, с фотопериодом 12 ч в свете и 12 ч в темноте для C. sorokiniana и 16 ч в светлой и 8 ч в темноте для H. pluvialis, и вручную перемешивают каждые 24 ч. Примерно в течение 7 дней для обоих штаммов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выдерживайте в условиях роста не менее 7-10 дней (до получения интенсивного зеленого цвета) для C. sorokiniana и 10-12 дней для H. pluvialis. Для получения концентрата микроводорослей, который будет служить инокулюмом в кинетике, необходимо удалить надосадочную среду из образующихся водорослей. - В стерильной среде наполните стерильные конические центрифужные пробирки объемом 15 мл приблизительно 10 мл инокулированной среды и центрифугируйте при давлении 3000 x g в течение 20 минут при температуре 25-30 °C.
- В стерильных условиях надосадочную жидкость удаляют с помощью микропипетки или путем наливания и концентрирования биомассы в стерильной конической центрифужной пробирке объемом 50 мл.
- Повторяйте этот процесс по мере необходимости до тех пор, пока не будет получен необходимый для кинетики объем инокулята.
- Измерьте оптическую плотность (наружный диаметр550 нм) инокулюма, чтобы определить клеточную концентрацию микроводорослей и храните его при температуре 3-4 °C до готовности к использованию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Прямой подсчет клеток первоначально проводился для корреляции концентрации клеток с абсорбцией. После подсчета инокулят можно хранить в холодильнике не более 4 дней.
2. Изучение кинетики роста
- Приготовьте необходимое количество 3N-BBM+ V(CCAP), подходящее для каждого эксперимента (8 л для испытаний на уровне фотобиореактора для C. sorokiniana и 0,5 л для испытаний на уровне колбы для H. pluvialis) в соответствии со стандартными лабораторными процедурами, обеспечив надлежащую стерилизацию.
- Как для фотобиореактора, так и для колб настройте источник света на желаемый цветовой спектр (синий на 460 нм, фиолетовый, смесь 460 нм и 630 нм для C. sorokiniana и красный на 630 нм для H. pluvialis); Накройте обе системы, чтобы избежать внешних световых помех.
Примечание: Из-за изменения длины волны, излучаемой каждым светоизлучающим диодом, спектрорадиометрия была выполнена с использованием спектрорадиометра на источниках света для определения длины волны и мощности излучения каждого диода9. Фиолетовый свет был получен путем объединения красных и синих светодиодов, в результате чего длина волны составила 460 нм с мощностью излучения 1,65 Вт нм-1 для синих светодиодов и 630 нм с мощностью излучения 0,6 Вт нм-1 для красных светодиодов. Эти измерения использовались для испытаний, проводимых исключительно под синим и красным светом. - Запрограммируйте таймер на чередование 12-часовых световых и 12-часовых темновых циклов для C. sorokiniana и 16-часовых световых и 8-часовых темных циклов для H. pluvialis.
- Подключите систему аэрации CO2 к емкости для культивирования фотобиореактора для обеспечения подачи углекислого газа с интервалом в 12 часов для C. sorokiniana.
- Инокулируют культуральный сосуд достаточным объемом предварительного инокулята для достижения исходной клеточной плотности 3 х 105 клеток мл-1 или ее эквивалента по оптической плотности (наружный диаметр550 нм) = 0,180.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте асептическую технику во время инокуляции, чтобы предотвратить загрязнение. - Образец культуры с регулярными интервалами 12 ч для C. sorokiniana и 8 ч для H. pluvialis для мониторинга роста клеток и физиологических параметров. Соберите образцы с использованием стерильных методов для поддержания целостности культуры.
3. Количественное определение хлорофиллов
ПРИМЕЧАНИЕ: Данные для количественного определения сотовой связи представлены в Дополнительном файле 1.
- Поместите 40 мл образца в пластиковые конические центрифужные пробирки.
- Центрифугируйте при давлении 3 000 x g в течение 20 минут при 15 °C и удалите надосадочную жидкость путем декантации или с помощью пастеровской пипетки.
- Переложите клеточную гранулу в стеклянную трубку, покрытую алюминиевой фольгой и завинчивающейся крышкой, чтобы предотвратить окисление.
- Суспендируйте клеточную гранулу 3 мл 90% чистого раствора ацетона с помощью вихря.
- Ультразвуковую обработку взвешенного образца на ледяной бане в течение двух циклов по 5 мин каждый и дать ему отдохнуть при температуре 4 °C в течение 16 ч10 мин.
- Через 16 ч снова провести ультразвуковую обработку в тех же условиях, упомянутых на предыдущем этапе (шаг 3.5), и снова центрифугировать в ранее описанных условиях (шаг 3.2).
- Отделите пигментный экстракт с помощью пастеровской пипетки и переложите его в другую чистую пробирку, защищенную от света.
- Поместите экстракт пигмента в кварцевую ячейку для считывания в спектрофотометре на длинах волн 630 нм, 647 нм и 664 нм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно откалибруйте спектрофотометр с 90% ацетоном. - Для расчета концентраций хлорофилла используют следующие уравнения11:
Хлорофилл А = 11,93 А664 - 1,93 А647
Хлорофилл b = 20,36 А647 - 5,50 А664
ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты выражаются в мкг-мл-1 экстракта, которые умножаются на объем экстракта и делятся на количество мл образца для получения концентраций хлорофилла в мкг-мл-1 культуры. - Для получения значений в μg chl cell-1 используют следующую формулу:
μг chl клетка-1 = μг chl в 1 мл культуры / [клетки мл-1] концентрация клеток в культуре.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для наблюдения за эффективностью метода обнаружения вариаций концентрации хлорофилла в клетках и оценки влияния факторов роста у C. sorokiniana был разработан экспериментальный дизайн Taguchi L4 , в котором оценивалось добавление объемаCO2 , цвет света и интенсивность света. Каждый фактор оценивался на низком и высоком уровнях, как показано в таблице 1, в условиях, определенных планом эксперимента в таблице 2.
После завершения эк...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Сравнительное исследование между H. pluvialis и C. sorokiniana выявило значимые различия в динамике продукции хлорофилла. В то время как H. pluvialis демонстрировала снижение концентрации хлорофилла на протяжении всего эксперимента, C. sorokiniana показала устойчивое увеличение. Кроме того, первоначально наблюдалась более низкая доля хлорофилла а у обоих видов, но это соотношение менялось в определенных условиях роста, что может указывать на и...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы выражают благодарность за частичное финансирование со стороны TecNM в рамках Призыва к научным исследованиям, технологическому развитию и инновациям (16898.23-P) для Institutos Tecnologicos Federales. Они также высоко оценивают поддержку со стороны Instituto de Ciencia, Tecnología e Innovación del Estado de Michoacán de Ocampo (FCCHTI23_ME-4.1.-0001).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| C3H6O | Meyer | 67-64-1 | Ацетон 90% |
| 15 мл Пробирка | Biologix | 10-9502 | Пробирка |
| 2510-DTH | Branson | D-73595 | Соникатор |
| 5 мл завинчивающаяся крышка пробирка | Kimax | 45066-13100 | Пробирка |
| для 50 мл центрифужная пробирка | Biologix | 10-9151 | Пробирка |
| Алюминиевая фольга | стандарта Reynolds | 611, 12 дюймов x 1000 футов | Крышка пробирки |
| CaCl2 | Meyer | 0925-250 | Центрифуга на основе хлорида кальция |
| Dynamica | 14 R | Центрифуга охлаждаемая | |
| CoCl2 | Merck | 1057-100 | Дихлорид кобальта |
| FeCl3 | Merck | 157740 | Хлорид железа (III) |
| K2HPO4 | Meyer | 2051-250 | Дикалийфосфат |
| KH2PO4 | Meyer | 2055-250 | Монокалийфосфат |
| MgSO4 | Meyer | 1605-250 | Микропипетка сульфата магния |
| LabNet | Model Beta-Pette | Micropipette | |
| MnCl2Merck | 429449 | Хлорид марганца(II) | |
| Na2 EDTA | Merck | 200-449-4 | Edatamil, Edetato Динатриевая соль дигидрат |
| Na2MoO4 | Merck | 243655 | Молибдат натрия |
| NaCl | Meyer | 2365-500 | Натрия хлорид |
| NaNO3 | Meyer | 2465-250 | Нитрат натрия |
| RGB светодиодная лента | Steren | GAD-LED2 | Light |
| источник Спектрофотометр | PerkinElmer | Модель Lambda35 | Спектрофотометр Спектрорадиометр |
| Gigahertz-Optik | модель BTS256 | ||
| Vortex | Scientific Industries | Vortex-Genie® 2 | Vortex |
| ZnCl2 | Merck | 208086 | Цинк Хлорид |
Ссылки
- Ramírez, M. E., Rendón, L., Veléz, Y. Microalgas para la industria alimenticia. , 1ra edición, Universidad Pontífica Bolivariana. http://hdl.handle.net/20.500.11912/2306 (2013).
- Khan, M. I., Shin, J. H., Kim, J. D. The promising future of microalgae: Current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products. Microb Cell Fact. 17 (1), 36(2018).
- Otero-Paternina, A. S. M., Cruz-Casallas, P. Effect of the hydrocarbon phenanthrene on Chlorella vulgaris (Chlorellaceae) growth. Acta Biol Col. 18 (1), 87-98 (2013).
- Pancha, I., et al. Salinity-induced oxidative stress enhanced the biofuel production potential of microalgae Scenedesmus sp. CCNM 1077. Bioresour Techno. 189, 341-348 (2015).
- Ortiz, M. L., Cortés, C. E., Sánchez, J., Padilla, J., Otero, A. M. Evaluating microalgae Chlorella sorokiniana growth in different culture mediums in autotrophic and mixotrophic conditions. Orinoquia. 16 (1), 11-20 (2012).
- Camacho Kurmen, J. E., González, G., Klotz, B. Astaxanthin production in Haematococcus pluvialis under different stress conditions. Nova. 11 (19), 94-104 (2013).
- Pérez Zambrano, E., Ayala Agudelo, Y. Production of chlorophyll and astaxanthin from Haematococcus pluvialis under nitrogen deficiency stress in a 5-liter Biostat Aplus bioreactor. , Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca. https://repositorio.unicolmayor.edu.co/handle/unicolmayor/2735 (2019).
- Bischoff, H. W., Bold, H. C. Phycological studies IV. Some soil algae from Enchanted Rock and related algal species. University of Texas. 6318, 95(1963).
- Cerezo, R. LED characterization through the use and programming of a spectrometer. Universidad Politécnica de. 22323, (2013).
- Arredondo, B. O. Analytical methods and tools for microalgal biomass evaluation. , CIBNOR. México. http://dspace.cibnor.mx:8080/handle/123456789/1403 (2017).
- Couso, I., Vila, M., Vigara, J., Cordero, B. F., Vargas, M. Á Synthesis of carotenoids and regulation of the carotenoid biosynthesis pathway in response to high light stress in the unicellular microalga Chlamydomonas reinhardtii. Eur J Phycol. 47 (3), 223-232 (2012).
- Vera-López, F., Martínez, A. Pigments in microalgae: Functions, applications, and overproduction techniques. BioTechnology. 25 (5), 35-51 (2021).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
