Оптимизация пробоподготовки для криогенной электронной микроскопии

Summary

В этом протоколе представлен практический метод с использованием Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) в качестве примера для решения проблемы неравномерного распределения частиц за счет оптимизации пробоподготовки, предоставляя исследователям справочный материал для эффективного выяснения макромолекулярных структур с помощью криогенной электронной микроскопии (крио-ЭМ).

Abstract

Криогенная электронная микроскопия (крио-ЭМ) произвела революцию в структурной биологии, позволив изучать макромолекулярные структуры в условиях, близких к нативным, взвешенных во стекловидном льду. Этот метод позволяет визуализировать белки и другие биомолекулы с высоким разрешением без необходимости кристаллизации, что дает значительное представление об их функциях и механизмах. Последние достижения в анализе отдельных частиц в сочетании с улучшенной вычислительной обработкой данных сделали крио-ЭМ незаменимым инструментом в современной структурной биологии. Несмотря на растущее распространение, крио-ЭМ сталкивается с постоянными проблемами, которые могут ограничить его эффективность, особенно с неравномерным распределением частиц. Эта проблема часто приводит к плохому разрешению и снижению точности реконструированных белковых структур. В этой статье изложен простой практический подход к решению этой проблемы на примере небольшого белка теплового шока от Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5). Этот метод оптимизирует пробоподготовку для минимизации преимущественной адсорбции, обеспечивая более однородное распределение частиц и более высокое качество крио-ЭМ структур белка. Этот метод предлагает ценное руководство для исследователей, стремящихся преодолеть аналогичные проблемы в структурных исследованиях.

Introduction

Благодаря недавним достижениям как в аппаратном обеспечении прибора ^1,2, так и в программном обеспечении для обработки изображений ^3,4,5, криогенная электронная микроскопия (крио-ЭМ) стала популярным и мощным инструментом в современной структурной биологии. Несмотря на эти прорывы, сохраняются узкие места в достижении высокоразрешающих макромолекулярных структур с помощью крио-ЭМ. Одной из таких существенных проблем является неравномерное распределение частиц, включая явление предпочт....

Protocol

Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Очистка белка

1. Индуцировать экспрессию рекомбинантного MjsHSP16.5 в E. coli BL21(DE3) и очистить белок с помощью хроматографической колонки с хелатированием никеля, как описано ранее²⁶. После очистки на колонке²⁶ эксклюзионной хроматографии (SEC) исследуют чистоту белка, загружая 5 мкл пиковых фракций в 12,5% гель SDS-PAGE и визуализируя с помощью стандартного окрашивания синим цветом

Results

Для определения оптимальных условий сетки для MjsHSP16.5 был проведен первоначальный крио-ЭМ скрининг, в первую очередь сосредоточенный на изучении различных условий белкового буфера: (1) буфера окончательной очистки, который обеспечивает стабильность и однородность MjsHSP16.5 и важен для его кристаллизации³⁰; (2) буферы, адаптированные к условиям, необходимым для роста кристаллов MjsHSP16,5 высокого дифракционного качества³⁰; и (3) буферы, ранее использовавшиеся в исследов.......

Discussion

Все структурные исследования белков начинаются с очистки белка — итеративного процесса для достижения баланса между выделением белковых мишеней с высокой чистотой и однородностью при сохранении их естественной функциональности. Несмотря на то, что буферные композиции для очистки и сохранения образцов белка тщательно отбираются в процессе очистки, эти буферы часто создают проблемы во время последующей подготовки образцов крио-ЭМ^{и визуализации}. Эта проблема возникае.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Трубка с круглым дном 14 мл	SPL Life Sciences	40114
250 &микро; L Газоплотный шприц модель 1725 LTN	Hamilton	81100	Цементированная игла, калибр 22s, 2 дюйма, тип точки 2
50 &; L Кнопка для диализа	Hampton Research	HR3-326
50-мл Стеклянный стакан		DIAMOND HA.1010D.50
Ä KTA pure 25 л	Cytiva	29018224	FPLC
Amicon Ultra-15 Центробежный фильтрующий блок	Millipore	UFC905024	50-KDa NMWL
Bradford Reagent	Supelco	B6916
Dumoxel Style N5	Dumont	0103-N5-PO
Glacios 2 Cryo-TEM	ThermoFisher Scientific	GLACIOSTEM
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg	Cytiva	28989335
Микроцентрифуга Пробирка 1,5 мл	HD Micro	H23015
ПЦР Пробирки 0,2 мл, плоская крышка	Axygen	PCR-02-C
PELCO easiGlow Glow Разгрузка	Ted Pella	91000
PELCO TEM Блок держателя сетки	Ted Pella	16820-25
Quantifoil R 1,2/1,3 200 меш, Cu	электронная микроскопия Sciences	Q2100CR1.3
Spectra/POR 3 RC Диализная мембранная трубка	Fisher Scientific	086705B	3500 Dalton MWCO
Superose 6 Increase 10/300 GL	Cytiva	29091596
Uranyl ацетат	Merck	8473
Vitrobot Mark IV	ThermoFisher Scientific	VITROBOT
VitroEase Buffer Screening Kit и моющие средства	ThermoFisher Scientific	A49856