Методическая статья

Оптимизация пробоподготовки для криогенной электронной микроскопии

DOI:

10.3791/67237

⸱

11 апреля 2025 г.

 ,  , 
1Department of Precision Medicine, Graduate School of Basic Medical Science (GSBMS), Institute for Antimicrobial Resistance Research and Therapeutics, Sungkyunkwan University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе представлен практический метод с использованием Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) в качестве примера для решения проблемы неравномерного распределения частиц за счет оптимизации пробоподготовки, предоставляя исследователям справочный материал для эффективного выяснения макромолекулярных структур с помощью криогенной электронной микроскопии (крио-ЭМ).

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Криогенная электронная микроскопия (крио-ЭМ) произвела революцию в структурной биологии, позволив изучать макромолекулярные структуры в условиях, близких к нативным, взвешенных во стекловидном льду. Этот метод позволяет визуализировать белки и другие биомолекулы с высоким разрешением без необходимости кристаллизации, что дает значительное представление об их функциях и механизмах. Последние достижения в анализе отдельных частиц в сочетании с улучшенной вычислительной обработкой данных сделали крио-ЭМ незаменимым инструментом в современной структурной биологии. Несмотря на растущее распространение, крио-ЭМ сталкивается с постоянными проблемами, которые могут ограничить его эффективность, особенно с неравномерным распределением частиц. Эта проблема часто приводит к плохому разрешению и снижению точности реконструированных белковых структур. В этой статье изложен простой практический подход к решению этой проблемы на примере небольшого белка теплового шока от Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5). Этот метод оптимизирует пробоподготовку для минимизации преимущественной адсорбции, обеспечивая более однородное распределение частиц и более высокое качество крио-ЭМ структур белка. Этот метод предлагает ценное руководство для исследователей, стремящихся преодолеть аналогичные проблемы в структурных исследованиях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Благодаря недавним достижениям как в аппаратном обеспечении прибора 1,2, так и в программном обеспечении для обработки изображений 3,4,5, криогенная электронная микроскопия (крио-ЭМ) стала популярным и мощным инструментом в современной структурной биологии. Несмотря на эти прорывы, сохраняются узкие места в достижении высокоразрешающих макромолекулярных структур с помощью крио-ЭМ. Одной из таких существенных проблем является неравномерное распределение частиц, включая явление предпочтения ориентации, которое преимущественно наблюдается на границе раздела воздух-вода 6,7,8,9.

Во время витрификации образца некоторые молекулы проявляют тенденцию выстраиваться вдоль определенных осей на сетке. Это приводит к неравномерному распределению представлений частиц в итоговом наборе данных. Некоторые ориентации могут быть чрезмерно представлены, в то время как другие недостаточно представлены или полностью отсутствуют, что приводит к неполной выборке общей архитектуры белка. Области белка, которые преимущественно ориентированы на электронный пучок, будут казаться более заметными на карте плотности, в то время как области, ориентированные в сторону от пучка, могут быть плохо разрешены или полностью отсутствовать10,11. Следовательно, неравномерное распределение частиц вносит потенциальные смещения и артефакты в окончательную реконструированную трехмерную (3D) структуру. В частности, ключевые структурные элементы, такие как альфа-спирали и бета-листы, могут быть искажены, аминокислотные или нуклеотидные цепи могут казаться фрагментированными, а плотность специфических белковых или нуклеиновых кислотных сегментов может демонстрироватьискажение12. В конечном счете, эти искажения представляют собой серьезную проблему для точного раскрытия структуры и функций биологических молекул.

В настоящее время для решения таких проблем используются различные экспериментальные подходы, включая оптимизацию пробоподготовки13,14,15, обработку сетки 16,17,18,19,20,21,22 и стратегию сбора данных23. В частности, рекомендуется решать эту проблему на этапе подготовки образцов, когда это возможно7. Общие методы оптимизации при подготовке образцов включают изменение состава буфера, введение низкомолекулярных или макромолекулярных партнеров по связыванию, создание внутримолекулярных сшивок и изменение детергентов. Это справедливо и для мембранных белков24,25, хотя моющие средства должны использоваться именно в целях очистки и стабилизации. Среди них настраиваемость, экономичность и широкая доступность оптимизации белкового буфера делают ее предпочтительной стратегией в большинстве лабораторий. Такой подход позволяет точно и немедленно корректировать различные параметры в соответствии с конкретными потребностями каждого образца белка. Благодаря итеративному уточнению исследователи могут систематически тестировать различные условия буфера и корректировать различные параметры, направленные на минимизацию предпочтительных ориентаций и улучшение общего качества данных крио-ЭМ. Простое изменение компонентов белкового буфера и регулировка их концентраций продемонстрировало эффективность во влиянии на стабильность белка путем модуляции поверхностного заряда, что впоследствии влияет на поведение белка в стекловидном теле25. Поэтому оптимизация состава белкового буфера считается одним из наиболее удобных и простых подходов к решению общих проблем в крио-ЭМ.

В данной работе предлагается протокол для устранения общего препятствия в крио-ЭМ — преодоления неравномерного распределения частиц. В этом протоколе основные процедуры получения белка и буферного скрининга, дополненные сеточной подготовкой, описаны с использованием небольшого белка теплового шока из Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5)26 в качестве тематического исследования (рис. 1). Этот sHSP изначально стабилен, имеет молекулярную массу 16,5 кДа на мономер и собирается в 24-мерную октаэдрическую клетку26,27, что делает его привлекательным кандидатом для структурного анализа с помощью крио-ЭМ. Тем не менее, наблюдение неравномерного распределения частиц во время сбора данных крио-ЭМ не было ожидаемым, и это стало серьезной проблемой во время экспериментов. Кроме того, обсуждаются потенциальные подходы, полезные для исследователей, решающих аналогичные проблемы, что способствует эффективному выяснению макромолекулярных структур с помощью крио-ЭМ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Очистка белка

  1. Индуцировать экспрессию рекомбинантного MjsHSP16.5 в E. coli BL21(DE3) и очистить белок с помощью хроматографической колонки с хелатированием никеля, как описано ранее26. После очистки на колонке26 эксклюзионной хроматографии (SEC) исследуют чистоту белка, загружая 5 мкл пиковых фракций в 12,5% гель SDS-PAGE и визуализируя с помощью стандартного окрашивания синим цветом28 Кумасси (рис. 2).
  2. Концентрируйте фракции бассейна, содержащие MjsHSP16.5, при температуре от 4 °C до приблизительно 65 мг/мл с помощью центробежных фильтров с отсечкой молекулярной массы 50 кДа, в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно пипетируйте раствор белка каждые 5 минут во время центрифугирования, чтобы предотвратить агрегацию белка.
  3. После концентрирования образец центрифугируют при 16 000 x g в течение 10 минут при 4 °C для удаления заполнителей, аликвотируют надосадочную жидкость в объемах 50 мкл в тонкостенных ПЦР-пробирках объемом 0,2 мл, мгновенно замораживают пробирки в жидком азоте и хранят образцы при температуре -80 °C до дальнейшего использования.

2. Белковый препарат для визуализации с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ)

  1. Разморозьте две замороженные белковые пробирки на льду. После размораживания аккуратно перемешайте раствор, несколько раз перевернув пробирку, чтобы обеспечить однородность, и центрифугируйте белковый раствор при 16 000 × г в течение 10 минут при 4 °C для удаления агрегатов.
  2. Введите надосадочную жидкость в колонку SEC и соберите фракции элюирования 0,5 мл.
  3. Соберите фракции элюирования, соответствующие пику, демонстрирующему наибольшее поглощение ультрафиолета на длине волны 280 нм, и измерьте концентрацию белка в этих фракциях с помощью анализа Брэдфорда29.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить достаточную концентрацию белка в одной пиковой фракции для последующих применений, необходимо загружать большое количество образца белка в колонну SEC, оставаясь при этом в пределах рекомендуемой емкости колонки.

3. Обмен буфером

  1. Приготовьте желаемый буферный раствор (9 мМ MOPS-Tris (pH 7,2), 50 мМ NaCl и 0,1 мМ ЭДТА), распределите буферы в стаканы объемом 50 мл и поддерживайте температуру буферных стаканов при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Основываясь на предварительных знаниях биохимии целевого белка, приготовьте различные буферные растворы с различными составами (типы буферов, pH и ионная сила), такие как 20 мМ HEPES (pH 7,5), 100 мМ NaCl и 0-5 мМ DTT, чтобы определить условия, способствующие оптимальной растворимости белка, гомогенности и стабильности при последующем приготовлении сетки.
  2. Подготовьте диализную мембрану в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
  3. Разрежьте диализную мембрану на кусочки размером 30 мм х 30 мм с помощью ножниц. Уравновесьте эти мембраны, инкубируя их в дистиллированной воде или буферных растворах (рисунок 3A).
  4. Добавьте 55 мкл раствора белка (примерно 2,5 мг/мл) в камеру 50-мл кнопок микродиализа (рис. 3B).
  5. Держите диализную мембрану вертикально с помощью щипцов и осторожно коснитесь одного края мембраны папиросной бумагой, чтобы слить лишнюю жидкость (рисунок 3C). Тщательно закройте кнопку микродиализа мембраной, следя за тем, чтобы в камеру микродиализа не попадали пузырьки воздуха (Рисунок 3D). Поместите уплотнительное кольцо поверх диализной мембраны. Аккуратно сверните уплотнительное кольцо в углубление на краю кнопки.
  6. Альтернативный метод: Поместите уплотнительное кольцо вдоль оси футболки для гольфа и расположите футболку для гольфа вверх ногами на мембране (Рисунок 3E). Осторожно сдвиньте уплотнительное кольцо вниз по футболке для гольфа, пока оно не соскользнет на край кнопки (Рисунок 3F). Осторожно направьте уплотнительное кольцо в паз на краю кнопки (Рисунок 3G).
  7. Погрузите каждую кнопку диализа в отдельную мензурку, содержащую буфер назначения стороной мембраны вверх (Рисунок 3H).
  8. Во время процесса диализа держите стаканы при температуре 4 °C. Смените диализный буфер через 2 ч и продолжайте диализ в течение ночи.
  9. С помощью шприца с тонкой иглой (например, шприца Гамильтона или инсулинового шприца) осторожно проколите мембрану и извлеките белковый раствор из камеры микродиализа (рисунок 3I). Храните образец белка в микроцентрифужной пробирке на льду до дальнейшего использования. Измерьте концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда29.

4. Подготовка сетки

  1. Выберите подходящий тип сетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно используется аморфная дырчатая углеродная пленка на медной основе. Толщину углеродной пленки, размер отверстия и количество ячеек следует выбирать в зависимости от желаемой толщины льда. Для пробоподготовки MjsHSP16.5 были использованы сетки с углеродным покрытием Holey.
  2. Аккуратно возьмитесь за решетки по краям с помощью пинцета, чтобы не повредить отверстия в сетке. Расположите решетки на держателе решетки карбоновой стороной вверх. Поместите держатель решетки в камеру системы разряда накаливания.
  3. Выполните разрядку свечения в течение 60 с при 15 мА, чтобы сделать сетку гидрофильной. Во время этого процесса рекомендуется применять отрицательный заряд.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемые параметры служат отправной точкой для системы тлеющего разряда, используемой в данном исследовании. Оптимизация может потребоваться в зависимости от типа прибора для тлеющего разряда и для достижения желаемого уровня гидрофильности для конкретных материалов сетки. Для плазменной очистки рассмотрите возможность тестирования альтернативных газов или газовых смесей, таких как водород или аргоно-кислородные смеси.
  4. Дополнительный шаг: введите дополнительные химические растворы, такие как 99% амиламин в открытой стеклянной бутылке, в камеру, прилегающую к держателю решетки, чтобы создать чистый положительный заряд на решетке.
  5. Используйте разряженные решетки в течение 0,5-1 часа для обеспечения оптимальной производительности.

5. Подготовка сетки с отрицательным пятном

  1. Загрузите 5 мкл образца (50-300 нМ или 20-120 нг/мл) на тлеющую решетку. Дайте образцу спокойно полежать на поверхности сетки в течение 1 минуты, чтобы облегчить оседание белков.
  2. Приготовьте три капли воды по 50 мкл каждая на листе парафиновой пленки. Аккуратно промойте образец на сетке, потерев поверхность сетки о поверхность первой капли воды. Повторите этап стирки с оставшимися двумя каплями воды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время стирки может быть оптимизировано в соответствии с конкретными требованиями каждого эксперимента.
  3. Загрузите 5 μл отфильтрованного 1% (по объему) раствора уранилацетата в решетку и немедленно удалите раствор уранилацетата пипеткой.
  4. Загрузите еще 5 мкл 1% (по массе) раствора уранилацетата в сетку. Дайте сетке инкубироваться в растворе уранилацетата в течение 90 с для окрашивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время окрашивания может быть отрегулировано и оптимизировано в соответствии с конкретными образцами.
  5. Осторожно коснитесь стороны сетки пинцетом фильтровальной бумагой, чтобы удалить излишки раствора для окрашивания. Дайте сетке полностью высохнуть на воздухе при комнатной температуре. Храните высушенную сетку в сетчатом контейнере при комнатной температуре до обсервации.

6. Витрификация образцов

  1. Разведите образец белка до нужной концентрации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация белка должна быть достаточно высокой, чтобы максимизировать количество частиц в каждом отверстии, но достаточно низкой, чтобы обеспечить распределение отдельных частиц. Концентрации крио-ЭМ белка обычно находятся в диапазоне от 0,5 до 2 мг/мл. Однако для некоторых белков, в зависимости от их молекулярной массы и конкретных условий пробоподготовки, могут потребоваться концентрации за пределами этого диапазона.
  2. Центрифугируйте образец при 16 000 × г в течение 10 минут при 4 °C для удаления любых агрегатов.
  3. Включите прибор для погружной заморозки. Наполните резервуар увлажнителя дистиллированной водой. Закрепите фильтровальную бумагу с помощью колец на блот-подушечках. Задайте параметры для остекловывания (температура: 4 °C, влажность: 100%, время промокания: 6 с, сила промокания: 5 единиц, время ожидания: 10 с).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время и сила блоттинга являются важными параметрами для оптимизации устройства витрификации, так как удаление воды из сетки и воздействие частиц на границе раздела воздух-вода может вызвать диссоциацию или смещение ориентации.
  4. Соберите компоненты криогенного контейнера, включая латунную чашку, держатель решетчатого ящика, блок паука и кольцо для защиты от загрязнения, в нижний лоток. Охладите контейнер в сборе, заполнив лоток жидким азотом. Наполните латунную чашку криогеном (жидким этаном). Снимите спайдерный блок, как только криоген достигнет температуры плавления.
  5. Установите пинцет и решетку в сборе на прибор, загрузите образец (обычно 4 мкл) на углеродную сторону сетки и начните процесс погружной заморозки.
  6. Осторожно отстыкуйте пинцет от прибора, поместите сетку на решетку для хранения и закройте коробку крышкой. Храните сетчатый ящик с остеклованными образцами в жидком азоте.

7. Загрузка сеток в ПЭМ

  1. Соберите станцию сборки авторешетки и охладите ее жидким азотом.
  2. Поместите решетчатую коробку с остеклованными решетками и осторожно открутите крышку, чтобы получить доступ к решеткам. Расположите рядом пустой ящик для хранения авторешетки для удобной передачи собранных сеток.
  3. Поместите кольцо авторешетки в специально отведенное место для кольца на станции сборки. Осторожно переместите остекленную сетку из сетчатого ящика и поместите ее внутрь кольца авторешетки. Убедитесь, что сетка и кольцо выровнены.
  4. Выровняйте диск так, чтобы отверстие круга располагалось поверх кольца авторешетки и узла сетки. Чтобы закрепить сетку в кольце автосетки, поместите инструмент для вставки C-образного зажима поверх сетки и слегка надавите, чтобы щелкнуть C-образный зажим внутри.
  5. Поверните диск назад и переместите собранные сетки в коробку для хранения автосетки.
  6. Соберите станцию загрузки кассет и охладите станцию загрузки жидким азотом.
  7. Поместите накопительный ящик автосети на загрузочную станцию. Переместите сборку решетки из коробки для хранения автосети в кассету и осторожно постучите по ней, чтобы обеспечить правильное размещение.
  8. С помощью рукоятки поместите кассету в капсюль автомата заряжания. Проверьте штифт в автомате заряжания, чтобы убедиться в его свободном движении и убедиться, что он не замерз.
  9. Пристыкуйте капсулу автомата заряжания к ПЭМ для наблюдения по сетке.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для определения оптимальных условий сетки для MjsHSP16.5 был проведен первоначальный крио-ЭМ скрининг, в первую очередь сосредоточенный на изучении различных условий белкового буфера: (1) буфера окончательной очистки, который обеспечивает стабильность и однородность MjsHSP16.5 и важен для его кристаллизации30; (2) буферы, адаптированные к условиям, необходимым для роста кристаллов MjsHSP16,5 высокого дифракционного качества30; и (3) буферы, ранее использовавшиеся в исследов...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все структурные исследования белков начинаются с очистки белка — итеративного процесса для достижения баланса между выделением белковых мишеней с высокой чистотой и однородностью при сохранении их естественной функциональности. Несмотря на то, что буферные композиции для очистки и сохранения образцов белка тщательно отбираются в процессе очистки, эти буферы часто создают проблемы во время последующей подготовки образцов крио-ЭМи визуализации. Эта проблема возникае...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Кооперативный центр научно-исследовательских установок (CCRF) (Университет Сонгюнгван, Корея) за любезно предоставленный нам доступ к их крио-ЭМ установке. Эта работа была поддержана грантом Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), финансируемым правительством Кореи (MSIT) для K.K.K. (No 2021M3A9I4022936). Использование крио-ЭМ установок консорциума NEXUS было поддержано грантом Национального исследовательского фонда Кореи RS-2024-00440289.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Трубка с круглым дном 14 млSPL Life Sciences40114
250 &микро; L Газоплотный шприц модель 1725 LTNHamilton81100Цементированная игла, калибр 22s, 2 дюйма, тип точки 2
50 &; L Кнопка для диализаHampton ResearchHR3-326
50-мл Стеклянный стаканDIAMOND HA.1010D.50
Ä KTA pure 25 лCytiva29018224FPLC
Amicon Ultra-15 Центробежный фильтрующий блокMilliporeUFC90502450-KDa NMWL
Bradford ReagentSupelcoB6916
Dumoxel Style N5Dumont0103-N5-PO
Glacios 2 Cryo-TEMThermoFisher ScientificGLACIOSTEM
HiLoad 16/600 Superdex 200 pgCytiva28989335
Микроцентрифуга Пробирка 1,5 млHD MicroH23015
ПЦР Пробирки 0,2 мл, плоская крышкаAxygenPCR-02-C
PELCO easiGlow Glow РазгрузкаTed Pella91000
PELCO TEM Блок держателя сеткиTed Pella16820-25
Quantifoil R 1,2/1,3 200 меш, Cuэлектронная микроскопия SciencesQ2100CR1.3
Spectra/POR 3 RC Диализная мембранная трубка Fisher Scientific086705B3500 Dalton MWCO
Superose 6 Increase 10/300 GLCytiva29091596
Uranyl ацетатMerck8473
Vitrobot Mark IVThermoFisher ScientificVITROBOT
VitroEase Buffer Screening Kit и моющие средстваThermoFisher ScientificA49856

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Faruqi, A. R., Mcmullan, G. Electronic detectors for electron microscopy. Q Rev Biophys. 44 (3), 357-390 (2011).
  2. Hamaguchi, T., et al. A new cryo-EM system for single particle analysis. J Struct Biol. 207 (1), 40-48 (2019).
  3. Kimanius, D., Dong, L., Sharov, G., Nakane, T., Scheres, S. H. W. New tools for automated cryo-Em single-particle analysis in relion-4.0. Biochem J. 478 (24), 4169-4185 (2021).
  4. Punjani, A., Fleet, D. J. 3Dflex: Determining structure and motion of flexible proteins from cryo-Em. Nat Methods. 20 (6), 860-870 (2023).
  5. Chen, M., Schmid, M. F., Chiu, W. Improving resolution and resolvability of single-particle cryo-EM structures using gaussian mixture models. Nat Methods. 21 (1), 37-40 (2024).
  6. Arnold, S. A., et al. Miniaturizing em sample preparation: Opportunities, challenges, and "visual proteomics". Proteomics. 18 (5-6), e1700176(2018).
  7. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (Pt 6), 560-571 (2018).
  8. Han, B. G., Avila-Sakar, A., Remis, J., Glaeser, R. M. Challenges in making ideal cryo-Em samples. Curr Opin Struct Biol. 81, 102646(2023).
  9. Lyumkis, D. Challenges and opportunities in cryo-em single-particle analysis. J Biol Chem. 294 (13), 5181-5197 (2019).
  10. Naydenova, K., Russo, C. J. Measuring the effects of particle orientation to improve the efficiency of electron cryomicroscopy. Nat Commun. 8 (1), 629(2017).
  11. Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-em through tilting. Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
  12. Liu, Y. T., Hu, J., Zhou, Z. H. Resolving the preferred orientation problem in cryo-EM reconstruction with self-supervised deep learning. Microsc Microanal. 29 (Supplement_1), 1918-1919 (2023).
  13. Choy, B. C., Cater, R. J., Mancia, F., Pryor, E. E. A 10-year meta-analysis of membrane protein structural biology: Detergents, membrane mimetics, and structure determination techniques. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1863 (3), 183533(2021).
  14. Li, B., Zhu, D., Shi, H., Zhang, X. Effect of charge on protein preferred orientation at the air-water interface in cryo-electron microscopy. J Struct Biol. 213 (4), 107783(2021).
  15. Chen, J., Noble, A. J., Kang, J. Y., Darst, S. A. Eliminating effects of particle adsorption to the air/water interface in single-particle cryo-electron microscopy: Bacterial RNA polymerase and CHAPSO. J Struct Biol X. 1, 100005(2019).
  16. Da Fonseca, P. C. A., Morris, E. P. Cryo-EM reveals the conformation of a substrate analogue in the human 20s proteasome core. Nature Commun. 6 (1), 7575(2015).
  17. Nguyen, T. H. D., et al. Cryo-EM structure of the yeast u4/u6.U5 tri-snrnp at 3.7 å resolution. Nature. 530 (7590), 298-302 (2016).
  18. Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. J Struct Biol. 170 (1), 152-156 (2010).
  19. Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-em grids. J Struct Biol. 204 (1), 80-84 (2018).
  20. Meyerson, J. R., et al. Self-assembled monolayers improve protein distribution on holey carbon cryo-EM supports. Sci Rep. 4 (1), 7084(2014).
  21. Patel, A. B., et al. Structure of human tfiid and mechanism of TBP loading onto promoter DNA. Science. 362 (6421), eaau8872(2018).
  22. Lander, G. C., et al. Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle. Nature. 482 (7384), 186-191 (2012).
  23. Tan, Y., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-em through tilting. Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
  24. Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-em. J Microsc. 276 (1), 39-45 (2019).
  25. Xu, Y., Dang, S. Recent technical advances in sample preparation for single-particle cryo-em. Front Mol Biosci. 9, 892459(2022).
  26. Lee, J., Ryu, B., Kim, T., Kim, K. K. Cryo-em structure of a 16.5-kda small heat-shock protein from Methanocaldococcus jannaschii. Int J Biol Macromol. 258 (Pt 1), 128763(2024).
  27. Kim, K. K., Kim, R., Kim, S. H. Crystal structure of a small heat-shock protein. Nature. 394 (6693), 595-599 (1998).
  28. Chakavarti, B., Chakavarti, D. Electrophoretic separation of proteins. J Vis Exp. (16), e758(2008).
  29. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  30. Kim, K. K., et al. crystallization, and preliminary x-ray crystallographic data analysis of small heat shock protein homolog from Methanococcus jannaschii, a hyperthermophile. J Struct Biol. 121 (1), 76-80 (1998).
  31. Kim, R., et al. On the mechanism of chaperone activity of the small heat-shock protein of Methanococcus jannaschii. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (14), 8151-8155 (2003).
  32. Shi, J., Koteiche, H. A., Mchaourab, H. S., Stewart, P. L. Cryoelectron microscopy and EPR analysis of engineered symmetric and polydisperse hsp16.5 assemblies reveals determinants of polydispersity and substrate binding. J Biol Chem. 281 (52), 40420-40428 (2006).
  33. Kim, R., Kim, K. K., Yokota, H., Kim, S. H. Small heat shock protein of Methanococcus jannaschii, a hyperthermophile. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (16), 9129-9133 (1998).
  34. Zbacnik, T. J., et al. Role of buffers in protein formulations. J Pharm Sci. 106 (3), 713-733 (2017).
  35. Collins, B., Stevens, R. C., Page, R. Crystallization optimum solubility screening: Using crystallization results to identify the optimal buffer for protein crystal formation. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 61 (Pt 12), 1035-1038 (2005).
  36. D'arcy, A. Crystallizing proteins - A rational approach. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50 (Pt 4), 469-471 (1994).
  37. Jancarik, J., Pufan, R., Hong, C., Kim, S. H., Kim, R. Optimum solubility (os) screening: An efficient method to optimize buffer conditions for homogeneity and crystallization of proteins. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60 (Pt 9), 1670-1673 (2004).
  38. Zhang, C. Y., et al. A strategy for selecting the ph of protein solutions to enhance crystallization. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 69 (Pt 7), 821-826 (2013).
  39. Basanta, B., Hirschi, M. M., Grotjahn, D. A., Lander, G. C. A case for glycerol as an acceptable additive for single-particle cryo-EM samples. Acta Crystallogr D Struct Biol. 78 (Pt 1), 124-135 (2022).
  40. Michon, B., et al. Role of surfactants in electron cryo-microscopy film preparation. Biophys J. 122 (10), 1846-1857 (2023).
  41. Chen, S., Li, J., Vinothkumar, K. R., Henderson, R. Interaction of human erythrocyte catalase with air-water interface in cryo-EM. Microscopy (Oxf). 71 (Supplement_1), i51-i59 (2022).
  42. Vinothkumar, K. R., Henderson, R. Single particle electron cryomicroscopy: Trends, issues and future perspective. Q Rev Biophys. 49, e13(2016).
  43. Kim, L. Y., et al. Benchmarking cryo-em single particle analysis workflow. Front Mol Biosci. 5, 50(2018).
  44. Bagby, S., Tong, K. I., Liu, D., Alattia, J. R., Ikura, M. The button test: A small scale method using microdialysis cells for assessing protein solubility at concentrations suitable for NMR. J Biomol NMR. 10 (3), 279-282 (1997).
  45. Gewering, T., Januliene, D., Ries, A. B., Moeller, A. Know your detergents: A case study on detergent background in negative stain electron microscopy. J Struct Biol. 203 (3), 242-246 (2018).
  46. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  47. Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-em. Nat Methods. 18 (5), 463-471 (2021).
  48. Earl, L. A., Falconieri, V., Milne, J. L., Subramaniam, S. Cryo-EM: Beyond the microscope. Curr Opin Struct Biol. 46, 71-78 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

plunge

Похожие статьи