Методическая статья

Культура кишечной глии лошадей и применение к изучению нервного воспалительного механизма при лошадиных коликах

1.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67244

⸱

4 октября 2024 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, NC State University

В этой статье

Краткое содержание

Энтеральная глия становится все более признанной за ее роль в кишечном гомеостазе и патологических процессах, включая послеоперационные осложнения. Пациенты с лошадьми, восстанавливающиеся после экстренной диагностической лапаротомии, страдают от высокого риска воспалительных послеоперационных состояний, что подчеркивает важность создания повторяемой культуры первичных глиальных клеток кишечника лошадей для исследования.

Аннотация

Воспалительные послеоперационные состояния лошадиных колик (острый живот) способствуют не только увеличению стоимости клиента, дискомфорта пациента и времени госпитализации, но во многих случаях оказываются опасными для жизни. Уникальная популяция кишечных клеток, кишечная глия, получает все большее признание за их роль в восприятии желудочно-кишечной среды и коммуникации с окружающими типами клеток. Взаимодействие между кишечной глией и кишечным эпителием может оказаться критически важным в установлении того, как кишечная глия лошадей может изменять слизистый барьер, модулируя воспаление в здоровом состоянии и при коликах.

Чтобы изучить это взаимодействие, мы представляем метод создания первичных культур кишечной глии лошадей из тощей кишки лошадей и воздействия на культуры воспалительных состояний, которые, как известно, присутствуют при коликах. Первичные культуры кишечной глии были получены от взрослых лошадей, усыпленных по причинам, не связанным с коликами. Ворсинки кишечника и собственные пластинки были микрорассечены для обнажения подслизистой оболочки. Выделенную подслизистую оболочку подвергали ферментативному расщеплению коллагеназой, протеазой и бычьим сывороточным альбумином в течение 2-3 ч. Затем с помощью механического разложения с использованием центрифугирования, пипетирования и клеточных фильтров (40-100 мкм) была получена гранула, используемая для нанесения покрытых поли-L-лизином лунок с концентрацией ~400 000 клеток/300 мкл среды.

После слияния и первого пассажа энтеральные глиальные клетки подвергались воздействию рекомбинантного IL-1β (0, 10, 25 нг) в течение 24 ч. Для моделирования эпителиально-глиальных взаимодействий во время колик среда, кондиционированная либо контрольной, либо обработанной кишечной глией, добавлялась непосредственно к сливающимся монослоям тощей кишки лошадей при измерении трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) с помощью двухэлектродной камеры EndOhm. Эти данные демонстрируют лишь одно из многих потенциальных эффективных применений интеральной глиальной культуры лошадей.

Введение

Лошадиные колики являются наиболее распространенной медицинской жалобой на неотложную консультацию1. Поскольку до 17% этих лошадей нуждаются в хирургической коррекции, усилия по улучшению послеоперационных результатов должны быть на переднем крае медицинских исследований лошадей2. В настоящее время у пациентов с послеоперационными коликами наблюдается высокий риск развития ряда жизнеугрожающих нарушений, включая сепсис/эндотоксемический шок (12,3% пациентов) и послеоперационную кишечную непроходимость кишечника (13,7% пациентов)3. Несмотря на прогресс в лечении послеоперационных осложнений, по-прежнему существует потребность в передовых методах лечения для профилактики или лечения этих состояний.

Недавние исследования выявили местный и системный воспалительный статус у пациентов с коликами4. Например, было показано, что экспрессия провоспалительных белков, таких как фактор некроза опухоли (ФНО) альфа, интерлейкин 1β (IL-1β), интерлейкин 6 (IL-6) и моноцитарный хемоаттрактантный белок-1, значительно повышена в экспрессии слизистой оболочки кишечника при коликах по сравнению снормальной кишечной тканью. С системной точки зрения было продемонстрировано, что повышенный уровень ФНО-альфа в кишечной ткани коррелирует с повышенным риском послеоперационного назогастрального рефлюкса более 2 л, что является общим показателем послеоперационной дисмотории4. Известно также, что введение интерлейкина IL-1β и ФНО альфа способно индуцировать клинические признаки септического шока5.

Потенциальным объяснением воспалительного статуса кишечных колик в кишечной ткани и его связи с послеоперационными осложнениями является кишечный эпителиальный барьер. В здоровом случае плотные соединительные комплексы, связывающие один слой столбчатого эпителия, выстилающий кишечный тракт, обеспечивают функциональный барьер для ограничения попадания содержимого люминала и его бактериальных компонентов в подслизистое пространство и кровоток. Тем не менее, вздутие и повреждение, вызванные кишечной непроходимостью, связанной с коликами, и кишечными манипуляциями во время операции могут нарушить эту функцию кишечного барьера.

С точки зрения функциональных компонентов кишечной стенки в целом, было показано, что подслизистая энтеральная глиальная сеть в пределах энтеральной нервной системы играет решающую роль в патофизиологическом развитии послеоперационных осложнений, связанных с воспалительными путями, и может обеспечить специфическую терапевтическую мишень 6,7,8,9 . Кишечная глия не только присутствует во всем желудочно-кишечном тракте, но и действует как датчики кишечной среды, влияет на передачу сигналов многочисленными типами клеток кишечной стенки и непосредственно регулирует кишечный барьер. Таким образом, можно с полным основанием предположить, что эти мощные рецепторы кишечника будут активированы при повреждении и воспалении и могут вызвать острую реакцию, такую как изменения проницаемости барьера.

Это исследование является первым, в котором описана культура кишечной глии лошадей и, в частности, роль воспалительной кишечной глии лошадей на барьерную функцию кишечника. Представлены методы первичного культивирования подслизистой оболочки кишечной глии лошадей и их реакция на воздействие воспалительного IL-1β, оценка влияния продуктов кишечной глии после воздействия IL-1β на проницаемость монослоев энтероцитов лошадей, а также возможная блокада путем применения лошадиной сыворотки.

Протокол

Первичные культуры кишечной глии лошадей были получены от трех лошадей, гуманно усыпленных с передозировкой барбитуратов по причинам, не связанным с данным исследованием. Лошади, отобранные для культуральных исследований, были взрослыми лошадьми без желудочно-кишечных заболеваний в анамнезе.

1. Подслизистая интеральная глиальная первичная культура лошадей

  1. Вырастите монослои эпителия лошадей из крипт тощей кишки, полученных от трех отдельных взрослых лошадей.
    1. Покройте 24-луночные планшеты лакирующим раствором на 2 ч при температуре 37 °С или на ночь при комнатной температуре, промойте их 2 раза стерильной водой и храните при комнатной температуре до тех пор, пока ячейки не будут готовы к покрытию.
    2. После гуманной эвтаназии, в течение 60 минут, удалите часть тощей кишки и поместите ее в холодный раствор Рингера на льду.
    3. Удалите 10-сантиметровую часть из тощей кишки и откройте ее на границе антиментерии, чтобы сохранить нелимфоидные области в центре ткани. Обрежьте часть примерно до сечения 7 см х 7 см. Перед вскрытием хорошо промойте ткань в свежем растворе Рингера.
    4. Прикрепите ткань к чашке Петри, покрытой силиконовым эластомером, в холодном растворе Рингера или слизистой оболочкой PBS вверх, максимально растягивая ткань (рисунок 1А).
    5. Удалите кишечные ворсинки с помощью изогнутых щипцов (Рисунок 1B), а затем слой собственной пластинки из нелимфоидной области размером примерно 5 см x 5 см (Рисунок 1C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти слои легко отделяются от подслизистой оболочки (Рисунок 1B).
    6. Удалите подслизистую оболочку одним листом, освободив ее ножницами для микродиссекции в одном углу, и наблюдайте за естественным отделением, отслаивая подслизистую оболочку от внутреннего круглого мышечного слоя тощей кишки (рисунок 1D).
    7. Собранный подслизистый слой измельчить на кусочки по 2-5 мм и поместить их в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 5 мл «Органо-FBS» (табл. 1), 0,825 мг коллагеназы, 5 мг протеазы и 20 мг бычьего сывороточного альбумина. Инкубируйте ткань в течение 2-3 часов при 37 °C для ферментативного пищеварения.
    8. После инкубации добавьте 10 мл комнатной температуры «Органо + FBS», чтобы остановить действие фермента. Дозируйте тканевую смесь вверх и вниз примерно 15 раз с помощью серологической пипетки объемом 10 мл для диссоциации клеток из ткани, а затем центрифугируйте при 3000 × г в течение 3 минут при комнатной температуре.
    9. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу PBS при комнатной температуре 10 мл путем пипетирования вверх и вниз примерно 15 раз с помощью серологической пипетки объемом 10 мл для диссоциации клеток из ткани.
    10. Центрифугируйте коническую пробирку при температуре 3 000 × г в течение 3 минут при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу с 10 мл комнатной температуры «Organo + FBS», пипетируя вверх и вниз примерно 15 раз с помощью серологической пипетки объемом 10 мл для диссоциации клеток из ткани.
    11. Последовательно отфильтруйте ячейки через 100 мкм, 70 мкм, а затем через сетчатое фильтр размером с поры 40 мкм.
    12. Центрифугируйте отфильтрованные элементы и фильтрующий материал при концентрации 3 000 × г в течение 3 минут при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл «Органо + FBS».
    13. Окрашивание трипаном синим для выявления живых клеток и их подсчет с помощью гемоцитометра.
    14. Засейте приблизительно 400 000 клеток в 300 мкл "Organo + FBS" в каждую лунку 24-луночного планшета и добавьте в каждую лунку факторы роста: N2 5 мкл/лунка, G5 5 мкл/лунка и B27 10 мкл/лунка. Поместите 24-луночный планшет в инкубатор с температурой 37 °C и 5%CO2 , чтобы клетки прилипли. Через двадцать четыре часа смените среду на «глию» (Таблица 1) с вышеуказанными факторами роста и меняйте каждые 48 ч (Рисунок 2).

2. Иммунофлуоресцентная цитология

  1. Вырастите кишечные глиальные клетки из первичной культуры (P0) (шаг 2.1.14) до 70-80% слияния и пропустите их один раз (P1).
  2. Зафиксируйте клетки первичной культуры (P0) в лунках с использованием 4% параформальдегида за 5 мин до применения 0,1% азида PBS.
  3. Приготовьте питательный раствор, состоящий из азида PBS, 4% сыворотки осляка и 0,5% Triton-X. Добавьте в лунки 300 мкл раствора для насыщения ячеек в течение 2 ч при комнатной температуре.
  4. Добавьте первичное антитело к глиальному маркеру, глиальному фибриллярному кислотному белку (GFAP), и первичное антитело к маркеру фибробластов, альфа-гладкомышечному актину, в соотношении 1:1000 в насыщенном растворе для ночной инкубации при 4 °С.
  5. Промойте 3 раза PBS перед добавлением вторичных антител против осла IgG Alexa Fluor 594 и козьего антимышиного IgG Alexa Flour 488 в разведении 1:500 в растворе насыщения в течение 2-3 часов.
  6. Окрашивать ядра 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) в разведении 1:1000 в PBS в течение 5 минут.
  7. После трех промывок PBS храните элементы в 0,1% азиде PBS.

3. Воздействие IL-1β на подслизистую оболочку кишечника лошадей в первичной глиальной культуре

  1. Когда клетки из первого пассажа (P1) достигнут 70-80% слияния, проведите эксперимент по воздействию IL-1β. Подвергайте лунки воздействию 0 нг, 10 нг и 25 нг IL-1β в течение 24 ч. Через 24 часа насыпьте и храните среду из каждой лунки при температуре -80 °C.

4. Органоидная культура лошадей для получения монослоев энтероцитов

ПРИМЕЧАНИЕ: В соответствии с протоколом Stewart et al., опубликованным в 2018 году, хранящиеся в банках кишечные крипты и почки лошадей, которые были криобанкированы, были расширены для двухмерных энтероидных исследований10.

  1. Используйте примерно 700-1 000 бутонов / фрагментов крипты (40 000-50 000 клеток при диссоциации на отдельные клетки) на одну вставку transwell. Перед добавлением энтероцитов нанесите на трансвелл 42 мкл 0,05% Матригеля. Закрепите Матригель на вкладыше путем инкубации в течение 1 ч при 37 °С. Отсадите лишнюю среду и дайте транслункам высохнуть в течение 30 минут без крышки. Добавьте 200 мкл среды DMEM-F12 в каждую вставку для транслунга и храните пластину при температуре 37 °C до использования.
  2. Промойте котлеты Matrigel, содержащие органоиды, с PBS, а затем подвергните их воздействию 500 μL Cell Recovery, находясь на льду. Пипетируйте их несколько раз, чтобы обеспечить полный сбор клеток в пробирку объемом 15 мл.
  3. Центрифугируйте пробирку при 300 × г в течение 5 мин при 4 °C, удалите надосадочную жидкость и суспензируйте клеточную гранулу в целевом объеме среды кишечных эпителиальных стволовых клеток (IESC). Рассчитайте целевой объем, умножив желаемое количество монослоев на 200 мкл среды. (Таблица 1).
  4. Предварительно покройте шприц объемом 1 мл в среде IESC и аспирируйте клеточную суспензию через иглу 16 G. Замените иглу 16 G на иглу 28 G и пропустите через нее клеточную суспензию, чтобы стимулировать разделение органоидов.
  5. Поместите 200 мкл полученной клеточной суспензии в апикальную сторону покрытых трансвеллами и 500 мкл IESC, а также ранее описанные факторы роста на базальную сторону трансвелловой вставки10. Меняйте среду и факторы роста каждые 24-48 ч до тех пор, пока не будет достигнуто слияние. Определите слияние как плотность ячеек, соответствующую TEER 1,000 Омxcm 2,11. Для измерения см. шаг 5.1.

5. Проницаемость монослоя энтероцитов лошадей после воздействия воспалительных цитокинов и продуктов кишечной глиали лошадей

  1. Используйте двухэлектродную измерительную камеру TEER для количественного определения TEER на монослоях и установления базовых показаний на каждой проницаемой мембране Transwell. Перед проведением измерений убедитесь, что у среды и трансвелла IESC есть 15 минут, чтобы нагреться до комнатной температуры. Заполните чашку для культивирования 1,5 мл среды IESC и убедитесь, что в трансвеллерной вставке присутствует ровно 200 мкл среды, чтобы линии жидкости совпадали во время измерения.
  2. Подвергайте базолатеральную сторону трансвеллированных вставок воздействию либо воспалительных цитокинов 25 нг IL-1β, 10 нг и 25 нг интерлейкина 6 (IL-6) на лунку, либо глиальных продуктов культур, подвергшихся воздействию 10 нг или 25 нг IL-1β. Подвергните базолатеральный аспект контрольных трансвеллерных вставок глиевым средам и глиевым средам из культур, не подвергавшихся воздействию IL-1β.
  3. Измеряйте TEER в течение 45 минут с интервалом 10-15 минут, помещая каждый трансвелл в чашку для культивирования.

6. Статистика

  1. Рассчитайте кратное изменение TEER каждого трансвелла для временных точек: 0, 10, 20, 30 и 45 мин.
  2. Используя выбранное программное обеспечение (см. Таблицу материалов), сравните корреляцию между сниженной TEER и базолатеральной экспозицией IL-1β (25 нг), IL-6 (10 нг, 25 нг и 100 нг) и глиевой средой (при воздействии 0 нг IL-1β, 10 нг IL-1β и 25 нг IL-1β) для контроля среды с использованием непарного одностороннего t-теста.

Результаты

Микродиссекция тощей кишки лошадей до подслизистого слоя (рис. 1) с дальнейшим ферментативным и механическим расщеплением позволяет получить жизнеспособные клеточные культуры кишечной глии лошадей. Клетки продемонстрировали плеоморфизм с преобладанием веретенообразных клеток, что согласуется с кишечной глией других видов (рис. 2А). Культуры были положительными на селективный глиальный маркер, глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP), с низкой контаминацией фибробластов (альфа-СМА, рис. 2B). В некоторых случаях микродиссекция подслизистых слоев не контролировалась в достаточно высокой степени, и культуры были загрязнены высоким процентом фибробластов, наблюдаемым через иммунофлуоресценцию маркера фибробластов гладкомышечного актина (рис. 3).

Далее, в качестве примера полезности культуры кишечной глии лошадей, была оценена влияние кишечной глии, подверженной воздействию IL-1β, на барьерную функцию эпителия кишечника. Базолатеральное воздействие сред из культуры подслизистой оболочки кишечника лошадей при воздействии 10 нг и 25 нг IL-1β в течение 24 ч достоверно повышало проницаемость (p = 0,05 и 0,04 соответственно, среднее значение контрольных сред = 0,9, среднее значение глиальной группы 10 нг IL-1β = 0,8, 95% доверительный интервал = от -0,2 до 0,02, среднее значение глиальной группы 25 нг IL-1β = 0,8, 95% доверительный интервал = от -0,1995 до 0,01060, n = 3-4) (Рисунок 4А). Тем не менее, воздействие на монослои эпителия лошадей базолатерального 10-25 нг IL-6 лошади, воспалительного цитокина, который, как было продемонстрировано, продуцируется кишечной глией, подвергшейся воздействию IL-1β, и индуцирует повышенную проницаемость энтероцитов у грызунов модели12, не привело к значительному увеличению проницаемости монослоя энтероцитов лошадей (рис. 4B)

figure-results-1
Рисунок 1: Выделение кишечной глии из тощей кишки лошади путем микродиссекции и ферментативного и механического пищеварения. (A) Тощую кишку разрезали вдоль антиментериальной границы и прикалывали слизистой оболочкой вверх. (Б) Кишечные ворсинки визуализировались с помощью микроскопии и удалялись с помощью осторожного соскабливания до тех пор, пока не визуализировалась тонкая собственная пластинка. (C) Затем удаляли слой собственной пластинки до тех пор, пока волокна гладкой мускулатуры не стали видны через полупрозрачную подслизистую оболочку. (D) Подслизистую оболочку натягивали и отслаивали от мышечного слоя, делая надрезы до фиброзных меток по мере необходимости. Изображения были получены с помощью 10-кратного диссекционного микроскопа (B,C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Визуализация культур подслизистой оболочки кишечной глии лошадей. (A) Морфология звездчатой (стрелки), веретенообразной (открытый наконечник стрелки) и ганглионарной (закрытый наконечник стрелки) кишечной глии лошадей была оценена с помощью фазово-контрастной микроскопии. (В) Чистоту культур оценивали путем окрашивания на GFAP, а на маркер фибробластов, гладкомышечный актин Scale bars = 100 мм (А), 400 мм (В). Сокращения: GFAP = глиальный фибриллярный кислый белок; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Визуализация неудачных культур подслизистой оболочки кишечника лошадей. Чистоту культур оценивали путем окрашивания на GFAP (красный), а на маркер фибробластов – гладкомышечный актин (зеленый), демонстрируя большой процент загрязнения фибробластов. Желтый стреловидный наконечник обозначает GFAP, а белый стреловидный актин гладкой мускулатуры. Масштабная линейка = 400 мм. Сокращение: GFAP = глиальный фибриллярный кислый белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Монослой эпителия лошадей TEER после воздействия воспалительных цитокинов и продуктов воспаления глиальных продуктов. (A) Базолатеральное воздействие сред из культуры подслизистой оболочки кишечника лошадей при воздействии 10 нг и 25 нг IL-1β в течение 24 ч значительно повысило проницаемость (*p = 0,05 и 0,04, соответственно, n = 3-4). (В) Острое воздействие монослоя энтероцитов лошадей базолатеральными 25 нг IL-1β и 10-25 нг IL-6 лошадей не приводило к значительному увеличению проницаемости монослоя эпителия лошадей (n = 2-4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Реагенты для выделения и посева. Следующие реагенты использовали для создания сред для выделения кишечной глии лошадей, культуры кишечной глии и культуры эпителиальных стволовых клеток кишечника лошадей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Обсуждение

Целью данного исследования явилась разработка воспроизводимого метода первичного культивирования подслизистой оболочки кишечной глии лошадей и демонстрация его применения для моделирования эпителиально-глиальных взаимодействий в момент возникновения колик. Выделение и культивирование кишечной глии, которое является новым для лошадей, оказалось полезным для понимания путей развития кишечных заболеваний на моделях свиней и грызунов, а также у людей 6,7,13,14. Изучение этой популяции клеток потенциально важно из-за их роли в качестве субэпителиальных сенсоров кишечной среды, а также их способности взаимодействовать и общаться с окружающими клетками внутри кишечной стенки. Учитывая их острую сенсорную способность, нетрудно представить себе потенциально критическую роль глии при лошадиных коликах, когда кишечная ткань подвергается стрессу из-за растяжения, ишемии ишемии и, возможно, хирургических манипуляций.

Предыдущая работа Lisowski et al. продемонстрировала повышенный воспалительный статус кишечной ткани лошади во время операции по удалению колик. Важность смягчения этой воспалительной среды подчеркивается культурами кишечной глии грызунов, которые доказали свою способность синтезировать продукты со способностью нарушать функцию кишечного барьера 7,12. Утечка содержимого кишечного просвета в стенку кишечника приведет не только к воспалительной реакции, но и к потенциальной инфильтрации в кровоток, которая затем может вызвать эндотоксемический шок/сепсис. К сожалению, пациенты с послеоперационными коликами у лошадей страдают от многочисленных воспалительных послеоперационных осложнений, включая сепсис и послеоперационную кишечную непроходимость, которые не только снижают выживаемость и комфорт пациента, но и увеличивают затраты клиента и эмоциональный стресс. Создание модели эпителиально-глиальных взаимодействий во время колик может пролить свет на потенциальный путь проницаемости кишечного барьера лошади при коликах и возможную профилактику.

Культура подслизистой кишечной глии лошадей включает в себя адаптации и ограничения, обусловленные особенностями вида. Самое главное, что время, необходимое для эффективного ферментативного пищеварения, требовало титрования. Авторы обнаружили, что инкубация ферментами в течение 2-3 ч при 37 °C необходима для успешного выделения кишечной глии лошадей. Кроме того, разрешение культурам кишечных культур лошадей достигать более 80% конфлюенции до пассирования, по-видимому, наносит ущерб жизнеспособности культуры. Основным ограничением этого метода на данный момент является размер выборки. В этом исследовании участвовали только ткани/клетки, которые были получены от лошадей, перенесших операцию по поводу колик или эвтаназию по причинам, не связанным с исследованием. Продолжение культивирования кишечной глии лошадей от дополнительных субъектов, а также разработка протокола замораживания и хранения кишечной глии лошадей значительно увеличат эффективность данного исследования.

В этом исследовании представлена новая полезность субмукозальной культуры кишечной глии лошадей и первичной культуры энтероцитов лошадей в качестве потенциальных методологий, помогающих понять лошадиные колики и желудочно-кишечные заболевания. Кроме того, в то время как монослои эпителия лошадей, выращенные из изолированных кишечных крипт и органоидов, были хорошо известны в прошлом, это исследование не только продолжает демонстрировать их полезность в качестве модели, но и стимулирует дополнительные исследования, изучающие взаимодействие с кишечными энтероцитами лошадей и другими типами клеток, обнаруженными в стенке кишечника.

Наблюдаемые взаимодействия между этими типами клеток могут применяться как при коликах, так и при других воспалительных расстройствах желудочно-кишечного тракта, таких как воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) и колит. Кроме того, постоянное совершенствование методов культивирования кишечной глии и энтероцитов позволит в будущем проводить исследования кокультур. Кроме того, в то время как настоящее исследование сосредоточено на подслизистой кишечной глиальной популяции из-за ее близости к эпителиальному монослою и акцента на барьерной функции кишечника, может быть проведена дополнительная работа по культивированию и оценке функции кишечной глиальной глии лошади из миентерального сплетения кишечной стенки, что может помочь в определении влияния воспалительной кишечной глии лошадей намоторику15.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Morris Animal Foundation за финансирование этого проекта.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 м Буфер HEPESGibco15630-080
10 мМ HEPESLife Technologies15630-106
2 мМ GlutaMAXLife Technologies25050-061
4' 6-Диаминидино-2-ФенилиндолИнвитрогенD3571
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634-010
Альфа-антитело к гладкомышечному актинуAbcam7817
Амфотерицин BSigmaAA95294,4 г/мл стоковых аликвот, конечная концентрация 1,1 &микро; г/мл
Антимикотик 1xGibco15240-096
B27Gibco12587010
Бычья сыворотка АльбуминSigmaAA3311
BSA 50 мг/мл стоковый растворSigmaA3311
CaCL2ACROS Organiics206791000Компонент Equine Ringer ' s Бульон 1: смешайте с другими ингредиентами, затем добавьте 100 мл этого бульона в градуированный цилиндр и разбавьте до 1 л деионизированной водой. Отрегулируйте pH до 7,4 с 5% CO2,
Комбинируйте с Equine Ringer' s Stock 2 для полного " Звонарь» ».
КоллагеназаSigma9891
DMEM-F12 медиаThermo Fisher11320033
Donkey anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594Invitrogen21207
EVOM EndOhm двухэлектродная TEER-измерительная камераWorld Precision InstrumentsEVM-EL-03-01
EVOM Manual for TEER MeasurementWorld Precision InstrumentsEVM-MT-03-01
G5 Gibco17503012
раствор гентамицинаSigmaG1272Конечная концентрация 20 &; г/мл
антитела GFAPAbcam4674
Козий антимышиный IgG Alexa Fluor 488Invitrogen28175
IL-1β ELISAThermo FisherESIL1B
KClThermo FisherP330-500Компонент конского рингера s Бульон 1: смешайте с другими ингредиентами, затем добавьте 100 мл этого бульона в градуированный цилиндр и разбавьте до 1 л деионизированной водой. Отрегулируйте pH до 7,4 с 5% CO2,
Комбинируйте с Equine Ringer' s Stock 2 для полного " Звонарь» ».
L-глутаминовый растворCorning25-00-Cl
MatrigelBD Bioscience354277
MgCl2Thermo FisherM33-500Компонент Equine Ringer s Бульон 1: смешайте с другими ингредиентами, затем добавьте 100 мл этого бульона в градуированный цилиндр и разбавьте до 1 л деионизированной водой. Отрегулируйте pH до 7,4 с 5% CO2,
Комбинируйте с Equine Ringer' s Stock 2 для полного " Звонарь» ».
N2Gibco17502048
Na2HPO4Thermo FisherBP332-1Компонент конского рингера s Бульон 2: смешайте с другими ингредиентами, затем добавьте 100 мл этого бульона в градуированный цилиндр и разбавьте до 1 л деионизированной водой. Отрегулируйте pH до 7,4 с 5% CO2,
Комбинируйте с Equine Ringer' s Запас 1 для полного " Звонарь» ».
NaClThermo FisherS271-10Компонент конского рингера s Бульон 1: смешайте с другими ингредиентами, затем добавьте 100 мл этого бульона в градуированный цилиндр и разбавьте до 1 л деионизированной водой. Отрегулируйте pH до 7,4 с 5% CO2,
Комбинируйте с Equine Ringer' s Stock 2 для полного " Звонарь» ».
NaH2PO4Thermo FisherBP329-500Компонент Конского Рингера s Бульон 2: смешайте с другими ингредиентами, затем добавьте 100 мл этого бульона в градуированный цилиндр и разбавьте до 1 л деионизированной водой. Отрегулируйте pH до 7,4 с 5% CO2,
Комбинируйте с Equine Ringer' s Запас 1 для полного " Звонарь» ».
NaHCO3Thermo FisherS637-212Компонент конского рингера s Бульон 2: смешайте с другими ингредиентами, затем добавьте 100 мл этого бульона в градуированный цилиндр и разбавьте до 1 л деионизированной водой. Отрегулируйте pH до 7,4 с 5% CO2,
Комбинируйте с Equine Ringer' s Запас 1 для полного " Звонарь» ».
Пен/стрептококк растворGemini400-109
Поли-L-лизинSigmaP26360,5 мг/мл в 1x боратный буфер
Программное обеспечение Prism GraphPad
ProteaseSigmaP4630
Раствор бикарбоната натрияSigmaS87617,5% стоковый раствор

Ссылки

  1. Tinker, M. K., et al. Prospective study of equine colic incidence and mortality. Equine Vet J. 29 (6), 448-453 (1997).
  2. Morton, A. J., Blikslager, A. T. Surgical and postoperative factors influencing short-term survival of horses following small intestinal resection: 92 cases (1994-2001). Equine Vet J. 34 (5), 450-454 (2002).
  3. French, N. P., Smith, J., Edwards, G. B., Proudman, C. J. Equine surgical colic: risk factors for postoperative complications. Equine Vet J. 34 (5), 444-449 (2002).
  4. Lisowski, Z. M., Lefevre, L., Mair, T. S., Clark, E. L., Hudson, N. P. H., Hume, D. A., Pirie, R. S. Use of quantitative real-time PCR to determine the local inflammatory response in the intestinal mucosa and muscularis of horses undergoing small intestinal resection. Equine Vet J. 54 (1), 52-62 (2022).
  5. Sheats, M. K. A comparative review of equine SIRS, sepsis, and neutrophils. Front Vet Sci. 6, 69(2019).
  6. Mazzotta, E., Villalobos-Hernandez, E. C., Fiorda-Diaz, J., Harzman, A., Christofi, F. L. Postoperative ileus and postoperative gastrointestinal tract dysfunction: pathogenic mechanisms and novel treatment strategies beyond colorectal enhanced recovery after surgery protocols. Front Pharm. 11, 583422(2020).
  7. Stoffels, B., et al. Postoperative ileus involves interleukin-1 receptor signaling in enteric glia. Gastroenterology. 146 (1), 176-187 (2014).
  8. Yu, Y. B., Li, Y. Q. Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier. World J Gastroenterol. 20 (32), 11273-11280 (2014).
  9. Savidge, T. C., et al. Enteric glia regulate intestinal barrier function and inflammation via release of S-nitrosoglutathione. Gastroenterology. 132 (4), 1344-1358 (2007).
  10. Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells. Equine Vet J. 50 (2), 241-248 (2018).
  11. Hellman, S. Generation of equine enteroids and enteroid-derived 2D monolayers that are responsive to microbial mimics. Vet Res. 52 (1), 108(2021).
  12. Al-Sadi, R., et al. Interleukin-6 modulation of intestinal epithelial tight junction permeability is mediated by JNK pathway activation of claudin-2 gene. PLoS One. 9 (3), e85345(2014).
  13. Ochoa-Cortes, F., et al. Enteric glial cells: A new frontier in neurogastroenterology and clinical target for inflammatory bowel diseases. Inflamm Bowel Dis. 22 (2), 433-449 (2016).
  14. Ziegler, A. L., et al. Enteric glial cell network function is required for epithelial barrier restitution following intestinal ischemic injury in the early postnatal period. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 326 (3), G228-G246 (2024).
  15. Grubišić, V., Gulbransen, B. D. Enteric glia: the most alimentary of all glia. J Physiol. 595 (2), 557-570 (2017).

Перепечатки и разрешения

Теги

1
Культура кишечной глии лошадей и применение к изучению нервного воспалительного механизма при лошадиных коликах
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.