Методическая статья

Селекция функционального риса с помощью технологий редактирования генома

DOI:

10.3791/67336

⸱

3 января 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Bellagen Biotechnology Co. Ltd, 2School of Life Sciences, Shandong Normal University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол описывает выведение устойчивых сортов крахмального риса с использованием технологий редактирования генома точным, эффективным и технически простым способом.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Традиционные подходы к селекции сельскохозяйственных культур, которые опираются преимущественно на трудоемкие и трудоемкие методы, такие как традиционная гибридизация и мутационная селекция, сталкиваются с проблемами эффективного внедрения целевых признаков и создания разнообразных популяций растений. С другой стороны, появление технологий редактирования генома привело к смене парадигмы, позволив точно и быстро манипулировать геномами растений для преднамеренного введения желаемых характеристик. Одним из наиболее распространенных инструментов редактирования является система CRISPR/Cas, которая используется исследователями для изучения важных биологических проблем. Тем не менее, точный и эффективный рабочий процесс редактирования генома не был четко определен в селекции сельскохозяйственных культур. В этом исследовании мы продемонстрировали весь процесс селекции сортов риса, обогащенных высоким уровнем резистентного крахмала (RS), функционального признака, который играет решающую роль в профилактике таких заболеваний, как диабет и ожирение. Рабочий процесс включал в себя несколько ключевых этапов, таких как выбор функционального гена SBEIIb , разработка однонаправляющей РНК (sgRNA), выбор подходящего вектора для редактирования генома, определение метода доставки вектора, проведение культивирования тканей растений, генотипирование мутаций и фенотипический анализ. Кроме того, были четко продемонстрированы временные рамки, необходимые для каждого этапа процесса. Этот протокол не только оптимизирует процесс селекции, но и повышает точность и эффективность внедрения признаков, тем самым ускоряя разработку функциональных сортов риса.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Традиционная селекция опирается на внесение признаков в сельскохозяйственные культуры или получение популяций растений с достаточной изменчивостью, что требует длительного полевого наблюдения 1,2. В связи с ограничениями традиционной селекции была разработана технология редактирования генов, которая позволяет точно модифицировать геном сельскохозяйственных культур для получения желаемых признаков популяций растений3. Наиболее широко используемой системой редактирования генов у растений является CRISPR/Cas (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-ассоциированная Cas endonucleasea), которая опирается на программируемую РНК-управляемую эндонуклеазу для создания целевых двухцепочечных разрывов (DSB) в ДНК 4,5. Эти DSB затем восстанавливаются с помощью естественных механизмов репарации ДНК клетки 6,7, что часто приводит к внесению желаемых генетических изменений. Хотя эта технология была реализована на различных культурах, включая пшеницу8, кукурузу9, сою10 и рис11, она в основном используется для выявления биологических проблем. По сравнению с его широким применением для выяснения функций генов растений, исследования по применению технологий редактирования генов в селекции сельскохозяйственных культур остаются относительно редкими.

Процесс редактирования генов в сельскохозяйственных культурах обычно следует четко определенному рабочему процессу, который включает в себя несколькоключевых этапов. Первый шаг включает в себя определение конкретного гена или генетической области, которые необходимо модифицировать для достижения желаемого признака. Во-вторых, разрабатывается стратегия редактирования генов, включающая выбор подходящей системы редактирования генов (например, CRISPR-Cas9 или CRISPR-Cas12) и разработку специфических направляющих РНК для направления эндонуклеазы к целевому участку. В-третьих, система редактирования генов затем встраивается в вектор доставки, который используется для введения механизма редактирования в клетки растений. Эти векторы могут быть комплексами ДНК, РНК или рибонуклеопротеинов (РНП). Впоследствии векторы редактирования генов доставляются в клетки растений с использованием различных методов, включая агробактериальную трансформацию, бомбардировку частицами или электропорацию. Трансформированные растительные клетки немедленно культивируются в соответствующих условиях для получения генетически отредактированных каллусов или эмбриогенных тканей. Затем эти ткани регенерируются в целые растения с помощью методов культивирования тканей. Регенерированные растения подвергаются строгой молекулярной характеристике для подтверждения наличия желаемых генетических изменений.

Предыдущая статья Tsakirpaloglou et al.14 дает широкий обзор процесса редактирования генов, от векторного дизайна до генерации отредактированных саженцев, но не углубляется в детальный анализ специфических признаков, связанных с целевым геном, или последующую оценку агрономической эффективности или функциональной валидации отредактированных культур. Мы пошли дальше простой демонстрации возможности редактирования гена в рисе. В нашей работе всесторонне оценивается влияние этой правки на биохимические, молекулярные и агрономические признаки отредактированных линий риса. Это включает в себя оценку состава крахмала, критического фактора, влияющего на качество зерна и пищевую ценность, который не был широко изучен в предыдущих исследованиях редактирования генов.

Рисовый крахмал обычно состоит из ~20% амилозы и ~80%амилопектина-15. SBEIIb является ферментом, необходимым для синтеза амилопектина и экспрессируется в эндосперме16. Нокдаун OsSBEIIb шпилечной РНК (РНК) и экспрессия микроРНК увеличивали содержание резистентного крахмала 17,18. Резистентный крахмал — это субстратный крахмал, который не может быть переварен и всасывается в тонком кишечнике, но способен расщепляться на короткоцепочечные жирные кислоты и газы некоторыми пищеварительными бактериями в кишечнике. Поскольку он не может быть быстро расщеплен, он имеет более низкий гликемический индекс по сравнению с другими крахмалами и не вызывает быстрого повышения сахара в крови в течение короткого периода времени после еды, что может в определенной степени облегчить диабет в диете19. Кроме того, резистентный крахмал выполняет больше физиологических функций, таких как снижение реакции на инсулин, регулирование функции кишечника, предотвращение накопления жира, облегчение контроля веса и содействие усвоению ионов минералов. Поэтому он широко рассматривается в качестве нового вида пищевых волокон20.

Чтобы преодолеть эти проблемы и успешно использовать технологии редактирования генов для выведения функциональных сортов риса, мы усовершенствовали и оптимизировали операционные протоколы для риса. Наша цель заключалась в тщательном анализе дизайна целевых генных локусов, тщательном выборе наиболее подходящих инструментов редактирования генов и проведении тщательного фенотипического анализа на протяжении всего процесса селекции. В качестве доказательства мощности и эффективности этих технологий мы представляем тематическое исследование, демонстрирующее быструю разработку функционального сорта риса, обогащенного высокостойким крахмалом. Этот пример подчеркивает потенциал редактирования генов в ускорении селекции функционального риса, решая проблему текущего недостатка исследований в этой области.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследование проводилось в компании Bellagen Biotechnology Co. Ltd в Китае в соответствии с рекомендациями комитета по этике исследований на человеке. Перед началом участия протокол исследования был подробно разъяснен испытуемым, которые дали информированное согласие.

1. Проектирование sgRNA и строительного вектора (сроки 5-7 дней)

Примечание: Двоичный вектор был использован для выражения системы CRISPR/Cas-SF0121. Не менее 3 нуклеотидов (nt) не должны совпадать с потенциальным сайтом для sgRNA, не являющимся мишенью. Адаптер sgRNA должен дополнять липкий конец, который образуется в результате расщепления фермента Bsa I редактирующего вектора. Выбор программного обеспечения был основан на высокой эффективности и специфичности программного обеспечения в рисе14, а также на его простоте использования и доступности для исследовательской группы.

  1. Перейдите на веб-сайт NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), чтобы получить ген OsSBEIIb (LOC4329532) у японцев. Загрузите и получите доступ к референсному геному в программном обеспечении SnapGene.
  2. Проанализируйте вставки/делеции (InDel) и однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) в последовательности экзона OsSBEIIb из разновидности X134, сравнив ее с референсным геномом. Используйте NCBI Primer Blast22 для проектирования грунтов, фланкирующих области экзонов (дополнительная таблица 1).
  3. Для валидации экзонной последовательности гена OsSBEIIb в X134 методом секвенирования по Сэнгеру готовят реакцию следующим образом: 10 мкл полимеразного смешанного буфера с 1 мкл прямого праймера, 1 мкл обратного праймера, 1 мкл гДНК из тканей X134 и 7 мкл дистиллированной воды. Запустите программу ПЦР следующим образом: 95 °C, 3 мин; (95 °C, 20 с-56 °C, 30 с-72 °C, 60 с) за 35 циклов, и 72 °C, 5 мин.
  4. Спроектируйте sgRNA на экзонной последовательности OsSBEIIb X134, придерживаясь протокола Tsakirpaloglou et al.14и гарантируя, что последовательность PAM является TTN.
  5. Модифицируйте последовательность sgRNA, добавив -ACAC-олиголигоны на 5'-конце прямого праймера и -GGCC-олиголигоны на 5'-конце обратного праймера. Коммерчески синтезировать прямые/обратные праймеры (для sgРНК).
  6. Растворите прямой и обратный праймеры до концентрации 10 мкмоль/л, возьмите по 1 мкл каждого и добавьте к 8 мкл отжигающего буфера (буфер Tris-EDTA + 50 мМ NaCl) и перемешайте с помощью пипетирования. Поместите в ПЦР-машину и запустите программу отжига следующим образом на ПЦР-машине: замедлите процесс охлаждения от 95 °C до 16 °C при 0,1 °C/с.
  7. Соберите sgRNA в вектор редактирования генома. Реакцию готовят следующим образом: 20 мкл смешанного буфера с 0,5 мкл T4 ДНК-лигазы, 1 мкл Bsa I, 2 мкл 10x рестриктазного буфера, 2 мкл 10x T4 ДНК-лигазного буфера, 2 мкл отжиговых праймеров, 2,5 мкл вектора (его объем регулируется в соответствии с соотношением) и 10 мкл дистиллированной воды. Во всех случаях используйте соотношение вставки к вектору 2:1 для достижения эффективности сборки. Запустите программу сборки ПЦР как (37 °C, 2 мин; 16 °C, 3 мин) с 30 циклами и 55 °C, 30 мин.
  8. Преобразуйте полученный вектор в клетки E. coli, как описано23.
  9. Дизайн-праймеры фланкируют сайт вставки гРНК в плазмиде. Используя эти праймеры, выполните амплификацию ПЦР на отдельных колониях для скрининга успешных вставок. Выполните секвенирование по Сэнгеру продуктов ПЦР для подтверждения успешного клонирования и выделения плазмиды24.

2. Трансформация агробактерии (сроки 4 дня)

  1. Размораживание EHA105 Agrobacterium Competent Cell на льду. Добавьте 1-2 мкл плазмидной ДНК (содержащей ~100-200 нг ДНК) в клеточную суспензию и аккуратно перемешайте.
  2. Проведите преобразование теплового шока, поместив трубку на лед на 5 минут, жидкий азот на 5 минут, тепловой шок при температуре 37 °C на 5 минут, а затем в ледяную баню на 5 минут.
  3. Добавьте в пробирку 700 μл среды пептона дрожжевого экстракта (YEP) без антибиотика и аккуратно перемешайте. Восстановите клетки в встряхивающем инкубаторе при температуре 28 °C, 200-250 об/мин, в течение 2-3 часов.
  4. Центрифугируйте культуру при давлении 2 800 x g в течение 1 минуты. Отбросьте большую часть надосадочной жидкости, оставив около 100 μл, и повторно суспендируйте клетки. Распределите клетки на агаровых планшетах YEP, содержащих 1% антибиотиков (канамицин и рифампицин) для выбора плазмид. Инкубируйте планшет при температуре 28 °C в течение 24-48 часов.
  5. Промакните пластину YEP (с устойчивостью к антибиотикам) с наконечником пипетки, содержащей одну колонию агробактерий , содержащую CRISPR/Cas, и перенесите клетки в 5 мл жидкой среды YEP с соответствующими антибиотиками. Инкубируйте жидкость при температуре 28 °C в течение 3 дней.
  6. Храните трансформированные штаммы Agrobacterium в виде запасов глицерина при температуре -80 °C для дальнейшего использования.

3. Трансформация риса с помощью агробактерий (сроки 3 месяца)

Примечание: Сообщалось о нескольких методах трансформации растений для доставки и экспрессии последовательности чужеродной ДНК в растительной клетке25. Учитывая интеграцию в одну копию и низкую частоту DSB в геноме, агробактериальная трансформация является методом выбора для интеграции фрагмента экспрессирующей ДНК в хромосомы риса.

  1. Проведите агробактериально-опосредованную трансформацию риса в соответствии с протоколом через25. Активно растущие каллусы (желтовато-белые, относительно сухие, 1-3 мм в диаметре) являются ключевым моментом для эффективного преображения. Выбросьте семена с развитием рассады или коричневой каллус, прежде чем заразить каллус агробактерией.

4. Генотипирование трансгенных растений и сбор семян (сроки 8 месяцев)

ПРИМЕЧАНИЕ: Два поколения риса будут культивироваться для достижения гомозиготной мутации и линий без чужеродной ДНК.

  1. Отбор проб рассадной ткани: Пересадите трансгенные растения в горшки и выращивайте их в течение 1 месяца в теплице. Чтобы определить тип мутации, соберите по 2-3 мг свежих листьев с каждого куста одного саженца и объедините их в один образец.
  2. Экстракция геномной ДНК: Следуйте установленному протоколу экстракции ДНК генома растений26.
  3. Разработка мутационных праймеров (Дополнительная таблица 1): Разработка ПЦР-праймеров для амплификации области гена SBEIIb, окружающей сайт-мишень sgРНК14. Амплифицированный фрагмент имеет длину 493.о.
  4. Генотипирование мутации: Секвенируйте фрагменты ПЦР напрямую или клонируйте их в вектор Т-клонов и секвенируйте с помощью метода Сэнгера для идентификации мутаций14.
  5. Сбор семян: Выберите линии E0 с гомозиготными мутациями со сдвигом рамки считывания и посадите их в теплицу для получения семян.
  6. Разработка праймеров для идентификации Т-ДНК: Разработка трех специфичных праймеров для кассеты с гигромицином, кассеты UBI и кассеты Cas конструкции для идентификации линий без чужеродной ДНК среди мутаций (дополнительная таблица 1).
  7. Подтверждение отсутствия чужеродных линий Т-ДНК: Соберите листья с 2-недельных сеянцев и извлеките ДНК генома растения, как описано в шаге 4.2. Провести геномную ПЦР по следующей программе: 95 °С, 3 мин; (95 °C, 20 с-56 °C, 30 с-72 °C, 60 с) за 35 циклов, и 72 °C, 5 мин. Это позволяет обнаруживать гигромицин, UBI и Cas-кассету в геноме растения.
  8. Проанализируйте продукты ПЦР с помощью гель-электрофореза и выберите линии, которые не имеют полос, указывающих на то, что они являются линиями Е1 без трансгенов. Соберите семена с этих выбранных линий.

5. Измерение содержания стойкого крахмала (сроки 4 суток)

  1. Соберите семена мутантных растений и растений X134 и дайте им высохнуть естественным образом при комнатной температуре, поддерживая содержание влаги примерно на уровне 13%-15%. Определите содержание резистентного крахмала с помощью методики панкреатической α-амилозы/амилоглюкозидазы (AMG), описанной ниже.
  2. Активируйте шелушительную машину и введите 10 г рисовых зерен в питатель, чтобы эффективно удалить оболочку клевы, в результате чего образуются обработанные семена риса.
  3. Переложите очищенные семена риса в рисовую мельницу и используйте ее в течение 60 с, чтобы удалить алейроновый слой, дающий шлифованный рис.
  4. Поместите шлифованный рис в тканевую мельницу, регулируя частоту помола на 60 Гц. Запустите кофемолку в течение 15 с, повторяя цикл 2 раза, чтобы получить рисовый порошок.
  5. Положите молотый рисовый порошок в чашку Петри и поставьте в разогретую духовку. Установите температуру 37 °C и дайте ему высохнуть в течение 12 часов.
  6. Точно взвесьте 100 мг ± 5 мг образцов и вылейте непосредственно в микроцентрифужную пробирку объемом 2,0 мл. Аккуратно постучите по пробирке, чтобы образец осел на дне.
  7. Добавьте в пробирку 180 μЛ очищенной воды и прокипятите образцы в течение 20 минут на водяной бане.
  8. Дайте образцам остыть до комнатной температуры, затем введите в каждую пробирку 4 мл AMG (3 ЕД/мл), содержащей α-амилазу поджелудочной железы (10 мг/мл).
  9. Надежно закройте пробирки, смешайте их на вихревом осцилляторе и инкубируйте пробирки при температуре 37 °C в течение 16 ч при непрерывном перемешивании.
  10. Добавьте 4 мл этанола и перемешайте с помощью вортекса. Центрифугируйте пробирку при давлении 1 500 x g в течение 10 минут.
  11. Сцедите надосадочную жидкость, добавьте 2 мл 50% этанола, а затем 6 мл 50% IMS и перемешайте с помощью вортекса и центрифуги.
  12. Осторожно слейте надосадочную жидкость и переверните трубку, чтобы слить лишнюю жидкость. Поместите пробирки на ледяную баню, добавьте 2 мл 2 М KOH в каждую пробирку и перемешивайте образцы в течение 20 минут, чтобы восстановить хлопья и растворить стойкий крахмал.
  13. Добавьте 8 мл 1,2 М буфера ацетата натрия (pH 3,8) в каждую пробирку и перемешайте с помощью магнитной мешалки.
  14. Немедленно ввести 0,1 мл АМГ (3300 Ед/мл), тщательно перемешать, и инкубировать в течение 30 мин на водяной бане при температуре 50 °С с прерывистым перемешиванием с помощью вихря. Затем центрифугируйте пробирку при давлении 1 500 x g в течение 10 минут.
  15. Перенесите 0,1 мл надосадочной жидкости в стеклянную пробирку, добавьте 3 мл реагента глюкозооксидаза/пероксидаза (GOPOD) и инкубируйте при 50 °C в течение 20 минут. Приготовьте заготовку реактива, смешав 0,1 мл 100 мМ буфера ацетата натрия и 3 мл реагента GOPOD. Приготовьте стандарты, смешав 0,1 мл D-глюкозы с 3 мл реагента GOPOD.
  16. Тщательно пипетируйте 200 мкл каждого пустого раствора, испытуемого раствора и стандартного раствора в 96-луночный планшет.
  17. Измерьте поглощение каждого образца при 510 нм по отношению к пустому раствору и рассчитайте содержание резистентного крахмала по предоставленной формуле.
    Резистентный крахмал (г/100 г) = ΔA × вес/вес ×9,27
    Где ΔA = абсорбционная способность, считанная на бланке реагента; F = перевод из абсорбции в микрограммы (определяется абсорбция, полученная для 100 мкг D-глюкозы в реакции GOPOD); W = сухой вес анализируемого образца.

6. Постпрандиальная реакция крови на уровень глюкозы (сроки 5 дней)

  1. Используйте следующие критерии включения участников: здоровые взрослые азиаты китайского происхождения в возрасте от 18 до 60 лет, некурящие, индекс массы тела (ИМТ) от 18,5 до 25 кг/м2 и нормальное артериальное давление (< 140/90 мм рт. ст.). Используйте следующие критерии исключения: метаболические заболевания (такие как диабет, гипертония и т. д.), желудочно-кишечные расстройства, аномалии эндокринной системы или психические заболевания. Всего было отобрано и набрано 10 участников.
  2. Процедура тестовой сессии (в течение двух дней подряд)
    1. День 0 (День подготовки): Попросите участников поддерживать регулярный режим сна и нормальное питание в течение первых 3 дней перед тестом. Вечером накануне теста (после 20:00) попросите участников воздержаться от пищи с высоким содержанием клетчатки и сахара. Энергичные физические упражнения не рекомендуются утром 1-го дня.
    2. День 1 (Тестовый день): Приготовьте белый рис, измельчив семена риса, затем промойте белый рис 2 раза. Наполните кастрюлю 1,5 частями воды на 1 часть белого риса. Отваривайте рис до полного впитывания воды. Выключите огонь, накройте кастрюлю крышкой и дайте ей отдохнуть 10 минут.
    3. Случайным образом распределите 10 участников на две равные группы: одну тестовую группу для кормления устойчивым крахмалом белого риса и одну контрольную группу для кормления белым рисом X134. Попросите участников отдохнуть в течение 10 минут перед началом тестирования.
    4. Кончики пальцев простерилизовать 75% медицинским спиртом. Аккуратно прижмите ланцетное устройство к кончику пальца и отпустите пружину, чтобы уколоть кожу. Осторожно сожмите палец, чтобы образовалась маленькая капля крови, и коснитесь этой капли кровопоглощающим концом тест-полоски в метре. Глюкометр автоматически втягивает кровь и начинает процесс тестирования. Подождите, пока не отобразятся показания уровня глюкозы в крови.
    5. Употребление риса и забор крови: Дайте участникам 50 г готового риса с 200 мл воды и попросите их есть это в удобном темпе в течение 5-10 минут. После еды соберите образцы венозной крови в следующие сроки: 15 минут, 30 минут, 60 минут, 90 минут и 120 минут с начала приема пищи. Выполните анализ уровня глюкозы в крови, как описано в шаге 6.2.4.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящем исследовании были продемонстрированы все процедуры селекции функционального риса с помощью редактирования генома для получения устойчивых устойчивых сортов крахмального риса. Мы интегрировали sgРНК, нацеленную на SBEIIb , в CRISPR/Cas-SF01 (дополнительный рисунок 1), инфильтрировали рис с помощью трансформации Agrobacterium и получили растения поколения E0 после стадий скрининга и укоренения. Растения с потерей функции гена проводили скрининг, и определяли содержание резисте...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В процессе создания нокдаун-векторов на основе CRISPR/Cas-SF01 решающее значение имеет тщательный отбор однонаправляющих РНК (sgRNA). Это обуславливает необходимость использования последовательностей, которые демонстрируют высокую эффективность редактирования с минимальными нецелевыми эффектами. Кроме того, синтез таргетных праймеров включает в себя короткие олигосеты адаптера, соответствующие сайтам сплайсинга вектора, обеспечивая бесшовную интеграцию. Примечательно, что в отличие от пр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана финансированием от Biological Breeding-Major Projects (2023ZD04074).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2 x Taq Plus Master Mix IIVazyme Biotech Co., LtdP213  Обнаружение однонуклеотидного полиморфизма (SNP) генов
2,4-дихлорфеноксиуксусной (2,4-D) кислоты SolutioPhyto TechnologyD309
AAM mediumShandong Tuopu Biol-engineering Co., LtdM9051C
BsaI-HFНовая Англия биолабораторииR3535Bsa I фермент расщепления вектора
редактирования Карбенициллиновые антибиотикиApplygenAPC8250-5Выбор  среда, среда для регенерации
CasaminoacidBBI-Life Sciences CorporationA603060-0500Среда для индукции каллуса, среда для совместного культивирования, среда для отбора, среда для регенерации
DH5 и альфа; Химически компетентная клеткаWeidi Biotechnology Co., Ltd.DL1001E. coli компетентные клетки
D-сорбитBBI-Life SciencesCorporationA610491-0500
ЭДТА, динатриевая соль, дигидратАлмазA100105-0500CTAB буфер
EHA105 Химически компетентная клеткаWeidi Biotechnology Co., Ltd.AC1010Agrobacterium компетентные клетки
FastPure Plasmid Mini KitVazyme Biotech Co.,LtdREC01-100Плазмидные
изолированные гигромициновые антибиотикиYeasen60224ESСреда для совместного культивирования, селекционная среда, среда регенерации и корневая среда
Канамициновые антибиотикиYeasen60206ES10Селекционная агробактерия
KOHMacklinP766798CTAB буфер
L-GlutaminePhyto TechnologyG229Индукционная среда Callus, среда для совместного выращивания, среда для отбора, среда для регенерации
L-ProlinePhyto TechnologyP698Среда для индукции каллуса, среда для совместного выращивания, среда для отбора, среда для регенерации
Mautre сухие семена риса (Xiushui134)--Japonica для Селекция RS рисовая
мельницаMARUMASUMHR1500AДля производства белого риса
Murashige SkoogPhyto TechnologyM519Корневая среда, регенерационная среда
Myo-inositolPhyto TechnologyI703Регенерационная среда
NaClMacklinS805275For  YEP media
NB Basal MediumPhyto TechnologyN492Индукционная среда Callus, среда для совместного культивирования, селекционная среда, среда для регенерации
Peptone SolarbioLA8800для  YEP media
PhytogelShanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdS24793
Pot Компания Midea group Co.MB-5E86Для приготовления риса
ХолодильникHaierBCD-170Хранение среды
Набор для анализа резистентного крахмалаMegazymeK-RSTARИзмерение и анализ резистентного крахмала
Антибиотики рифампицинаSigmaR3501-250MGСелекционная агробактерия
Раствор гипохлорита натрияMacklinS817439Для стерилизации семян
СахарозаShanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdB21647Среда индукции каллуса, среда для совместного культивирования, среда отбора, среда для регенерации
T4 DNA LigaseБиолаборатории Новой АнглииM0202Присоединение sgRNA к вектору CEISPRY/Cas-SF01
Монитор глюкозыМедицинское оборудование и Supply Co., LtdXuetang 582Определение уровня глюкозы в крови
Tris-HCLMacklinT766494буфер CTAB
дрожжевые дрожжи AgarSolarbioLA1370For  YEP media
YEP media-Выращивание агробактерий
сорта рисовая машина

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huang, X., Huang, S., Han, B., Li, J. The integrated genomics of crop domestication and breeding. Cell. 185 (15), 2828-2839 (2022).
  2. Labroo, M. R., Studer, A. J., Rutkoski, J. E. Heterosis and hybrid crop breeding: A multidisciplinary review. Front Genet. 12, 643761(2021).
  3. Khalil, A. M. The genome editing revolution: review. J Genet Eng Biotechnol. 18 (1), 68(2020).
  4. Mojica, F. J., Díez-Villaseñor, C., García-Martínez, J., Soria, E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol. 60 (2), 174-182 (2005).
  5. Rath, D., Amlinger, L., Rath, A., Lundgren, M. The CRISPR-Cas immune system: biology, mechanisms and applications. Biochimie. 117, 119-128 (2015).
  6. Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Patron, N. J., Nekrasov, V. Editing plant genomes with CRISPR/Cas9. Curr Opin Biotechnol. 32, 76-84 (2015).
  7. Koonin, E. V., Makarova, K. S. Mobile Genetic Elements and evolution of CRISPR-Cas systems: All the way there and back. Genome Biol Evol. 9 (10), 2812-2825 (2017).
  8. Zhang, Y., et al. Analysis of the functions of TaGW2 homoeologs in wheat grain weight and protein content traits. Plant J. 94 (5), 857-866 (2018).
  9. Svitashev, S., Schwartz, C., Lenderts, B., Young, J. K., Mark Cigan, A. Genome editing in maize directed by CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Comm. 7, 13274(2016).
  10. Li, Z., et al. Cas9-guide RNA directed genome editing in Soybean. Plant Physio. 169 (2), 960-970 (2015).
  11. Li, M., et al. Reassessment of the four yield-related genes Gn1a, DEP1, GS3, and IPA1 in rice using a CRISPR/Cas9 system. Front Plant Sci. 7, 377(2016).
  12. Karlson, C. K. S., Mohd-Noor, S. N., Nolte, N., Tan, B. C. CRISPR/dCas9-based systems: Mechanisms and applications in plant sciences. Plants. 10 (10), 2055(2021).
  13. Hua, K., et al. Perspectives on the application of genome-editing technologies in crop breeding. Mol Plant. 12 (8), 1047-1059 (2019).
  14. Tsakirpaloglou, N., Septiningsih, E. M., Thomson, M. J. Guidelines for performing CRISPR/Cas9 genome editing for gene validation and trait improvement in crops. Plants. 12 (20), 3564(2023).
  15. Jeon, J. S., Ryoo, N., Hahn, T. R., Walia, H., Nakamura, Y. Starch biosynthesis in cereal endosperm. Plant Physio Biochem. 48 (6), 383-392 (2010).
  16. Crofts, N., et al. Amylopectin biosynthetic enzymes from developing rice seed form enzymatically active protein complexes. J Exp Bot. 66 (15), 4469-4482 (2015).
  17. Butardo, V. M., et al. Impact of down-regulation of starch branching enzyme IIb in rice by artificial microRNA- and hairpin RNA-mediated RNA silencing. J Exp Bot. 62 (14), 4927-4941 (2011).
  18. Baysal, C., et al. Inactivation of rice starch branching enzyme IIb triggers broad and unexpected changes in metabolism by transcriptional reprogramming. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (42), 26503-26512 (2020).
  19. Keenan, M. J., et al. Role of resistant starch in improving gut health, adiposity, and insulin resistance. Adv Nutr. 6 (2), 198-205 (2015).
  20. Shen, L., Li, J., Li, Y. Resistant starch formation in rice: Genetic regulation and beyond. Plant Comm. 3 (3), 100329(2022).
  21. Duan, Z., et al. An engineered Cas12i nuclease that is an efficient genome editing tool in animals and plants. Innovation (Camb). 5 (2), 100564(2024).
  22. Ye, J., et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinform. 13, 134(2012).
  23. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  24. Ehrt, S., Schnappinger, D. Isolation of plasmids from E. coli by alkaline lysis. Meth Mol Biol. 235, 75-78 (2003).
  25. Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice. Nat Protoc. 1 (6), 2796-2802 (2006).
  26. Aboul-Maaty, N. A. F., Oraby, H. A. S. Extraction of high-quality genomic DNA from different plant orders applying a modified CTAB-based method. Bull Natl Res Cent. 43, 25(2019).
  27. Li, P., et al. Genes and their molecular functions determining seed structure, components, and quality of rice. Rice. 15 (1), 18(2022).
  28. Huang, X., et al. Structural basis for two metal-ion catalysis of DNA cleavage by Cas12i2. Nat Commun. 11 (1), 5241(2020).
  29. Lv, P., et al. Genome editing in rice using CRISPR/Cas12i3. Plant Biotechnol J. 22 (2), 379-385 (2024).
  30. Čermák, T., et al. A Multipurpose toolkit to enable advanced genome engineering in plants. Plant Cell. 29 (6), 1196-1217 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CRISPR CasSBE2b

Похожие статьи